收稿日期 Received: 2014-03-26 接收日期 Accepted: 2014-04-17*国家自然科学基金项目（81173095）和四川省国际合作计划（2013HH0014）资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (81173095) and the International Cooperation Program of Sichuan, China (2013HH0014)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:*************)
Wnt 蛋白拮抗剂Frzb 的cDNA 克隆、重组慢病毒构建 马玉玲 裴 哲 王 晶 魏 枭 曾中秋 陈雨文 唐亚雄**
中国科学院成都生物研究所 成都 610041
Wnt 信号通路的异常活化与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关，为探索作为Wnt 蛋白拮抗剂sFRP （Secreted frizzled related protein ）家族成员之一的Frzb/sFRP3在肝癌细胞中的抗癌潜力，本研究主要通过RT-PCR 以及慢病毒表达系统进行了Frzb 的cDNA 克隆、重组慢病毒构建以及肝癌稳定表达细胞株的建立. 从人正常肝细胞HL-7702中提取总RNA ，通过RT-PCR 获得Frzb cDNA 片段并经测序证实；与此同时，将Frzb cDNA 分别构建至以绿荧光蛋白或嘌呤霉素抗性为报告基因的慢病毒真核表达载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 及pLVX-Puro-Frzb ，通过酶切和测序获得正确的慢病毒重组表达质粒；其次，通过Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems 将慢病毒重组表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G 共转染HEK293T 细胞，48 h 后制备重组慢病毒悬液，随后感染HEK293T 细胞，分别通过荧光显微镜观察绿荧光蛋白的表达以及Western blot 验证了Frzb （FLAG 标签）在细胞中的正确表达；最后，将Frzb 重组慢病毒悬液感染肝癌HepG2细胞，经2 µg/mL 嘌呤霉素筛选成功地获得了稳定表达Frzb 的细胞株. 以上结果表明慢病毒表达体系对Wnt 信号通路的分子靶向药物研究具有重要价值. 图4 参14 Frzb ；肝癌细胞HepG2；克隆；重组慢病毒；稳定细胞株CLC Q78 : R966
cDNA cloning, lentiviral expression construction and stable HepG2 cell line establishment of Wnt Antagonist Frzb *
MA Y uling, PEI Zhe, W ANG Jing, WEI Xiao, ZENG Zhongqiu, CHEN Y uwen & TANG Yaxiong **
Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences , Chengdu 610041, China
Aberrant activation of the Wnt signaling pathway is closely linked to tumorigenesis in a variety of major human malignant tumors. However, the anticancer potential of Frzb/sFrp3, one of the secreted frizzled related protein (sFRP) families, in hepatocellular carcinoma is poorly understood. This research aimed to study the cDNA cloning, lentiviral expression construction and stable HepG2 cell li
ne establishment of Wnt antagonist Frzb. The Frzb cDNA fragments were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) from the total RNA of normal human liver HL-7702 (L02) cells, which were verified by the direct sequencing of PCR products. Secondly, the Frzb cDNA fragments were subcloned into the pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb or pLVX-Puro-Frzb , containing a fluorescent marker (GFP) or a puromycin resistance gene respectively; and the recombinant lentiviral expression plasmids were further confirmed by double digestion and sequencing. Thirdly, HEK293T cells were co-transfected with the lentiviral expression plasmid, plus packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G by using Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems to obtain recombinant lentiviral particles at 48 hours after transfection; then the overall titers were evaluated by fluorescence microscopy of GFP expression, and the expression of Flag-tagged Frzb successfully detected by Western blot in the infected HEK293T cells. Finally, HepG2 cells were infected with the recombinant lentiviral particles expressing Frzb and the stable Frzb-transducted HepG2 cell line was successfully established by antibiotic selection with puromycin (2 μg/mL). These findings help to lay a foundation for studies about anticancer activities and molecular mechanisms of Frzb in hepatocellular carcinoma. Frzb ; HCC HepG2; cloning; recombinant lentivirus; stable cell line
776应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol /
Wnt蛋白拮抗剂Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及稳定...... 5期
肝癌严重威胁人类健康，目前仍缺乏有效药物. 肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma ，HCC ）是我国高发恶性肿瘤，每年约有13万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的40%. 尽管肝癌的方法包括手术等多种方案，但效果迄今仍然十分有限，尚未显著延长病人的生存期，而针对VEGFR 、RAF 等多靶点的激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib ）目前已成为晚期肝癌病人的首个临床药物，再次表明针对肿瘤细胞特异信号转导网络调控的靶向分子具有显著的临床疗效和研究价值[1].
原癌基因Wnt 信号通路在胚胎发育、干细胞、免疫系统以及肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要作用. 作为生物医学领域前沿方向之一的Wnt 信号通路与结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤等多种人类肿瘤的发生发展密
切相关[2]. 研究证实，
Wnt 信号通路在肝脏发育、肝脏正常生长、肝细胞再生、肝脏代谢等生理过程中发挥着重要作用，该通路异常持续激活与多种慢性肝病以及肝肿瘤的进展显著相关. 转基因小鼠肝癌模型及人体肝癌细胞组织学研究已经证实肝癌癌变过程Wnt 通路中ß-catenin 、APC 、Axin1以及Axin2等基因突变，而且Wnt 与Frizzled 受体元件失调可能也是肝癌早期现象之一[3-6]. 此外，乙型、丙型肝炎病毒与Wnt 通路密切关联，乙肝病毒HBV X 蛋白能激活Wnt 通路参与肝癌的形成，丙型肝炎病毒HCV 核心蛋白刺激
肝细胞生长过程的至少部分与Wnt-1的介入密切相关，丙型肝炎病毒致癌过程中ß-catenin 突变机会与频率比乙肝更高[7-8]. 因此，抑制或者阻断Wnt 信号通路的蛋白拮抗剂或化学小分子可为肝癌的防治提供新的分子靶向策略.
分泌型的frizzled 相关蛋白（Secreted frizzled-related protein ，sFrp ）是Wnt 信号通路的天然拮抗剂，Frzb 作为sFrp 的家族成员之一，在前列腺癌及软组织肉瘤的形成和转移中扮演重要角并显著抑制肿瘤细胞的成瘤性和肺转移能力[9--10]，但其在肝癌中的作用却知之甚少. 因此，本文通过研究了Wnt 蛋白拮抗剂Frzb 的cDNA 克隆、重组慢病毒构建以及肝癌稳定表达细胞株的建立，旨在为研究Frzb 在肝癌中的生物学功能奠定基础.
1.1 质粒、细胞培养与生化试剂
慢病毒表达及包装载体pLVX-IRES-ZsGreen1、pLVX-Puro 、psPAX 2、pMD 2.G 等购自Clontech 公司并经本实验室
改造修饰. 人胚胎肾细胞HEK293T 、人肝癌细胞系HepG2以及人正常肝细胞HL-7702 (L02)购自中国科学院上海细胞生
物研究所细胞库，由本实验室保存，在37 ℃，
5% CO 2条件下常规培养，大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞由本实验室制备.
限制性内切酶Xho I 、Xba I 、Pme I 、
T4 DNA 连接酶以及cDNA 合成试剂盒购自Fermentas 公司，质粒小提与凝胶回收试剂盒购自Qiagen 公司，DMEM 细胞培养基、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、TRIzol ® Reagent 等购自Life Technologies
公司，
Flag 、α-tubulin 及HRP 偶联的羊抗兔/鼠IgG 等抗体购自Cell Signaling Technology 公司，其余试剂为国产分析纯.
1.2 蛋白质提取与Western blot
采用RIPA 裂解法提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，
Western blot 参见文献[11]. 简而言之，50-100 μg 总蛋白在95 ℃变性5 min ，经12%的SDS-PAGE 电泳后转移到硝酸纤维素NC 膜上，5%的脱脂牛奶封闭1 h ，一抗4 ℃孵育过夜，HRP 偶联的二抗室温孵育1 h ，通过ECL 底物发光法检测目标蛋白的表达，
α-tubulin 作为内参蛋白定量. 1.3 cDNA 克隆
从G e n B a n k 中查F r z b 的c D N A 序列，根据慢病毒载体p LV X -I R E S -Z s G r e e n 1、p LV X -P u r o 多克隆位点，设计的引物分别为：#1 F o r w a r d p r i m e r : 5’-CTAGCTCGAGCCGCGGCCCCAGAAGTCTTA-3’(Xho I)，#1 Reverse primer: 5’-CTAGTCTAGATTACTTGTCATCGTCGTCCT-3’(X b a I )；#2 For wa rd p r i me r: 5’-CTAGTCTAGACC -GCGGCCCCAGAAGTCTTA-3’(Xba I)，#2 Reverse primer: 5’-CTAGGTTTAAACTTACTTGTCATCGTCGTCCT-3’(Pme I). 其中#1引物分别添加Xho I/ Xba I 酶切位点，
#2引物分别添加Xba I/Pme I 酶切位点，以上引物由上海生工生物工程有限公司合成.
采用TRIzol 法提取人正常肝细胞L02总RNA ，
RNA 的反转录和cDNA 的合成（RT-PCR ）按照试剂盒实验指南进行，PCR 反应条件为95 ℃预变性2 min ，95 ℃ 30 s 、55 ℃ 30 s 、72 ℃ 1 min （35个循环），72 ℃延伸5 min. PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收后直接送上海生工生物工程有限公司测序.
1.4 慢病毒表达质粒的构建
PCR 产物及pLVX-IRES-ZsGreen1、pLVX-Puro 慢病毒载体分别经限制性内切酶Xho I/Xba I 或Xba I/Pme I 酶切、0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收，回收产物在T4 DNA 连接酶作用下室温连接2 h ，连接产物经转化、扩增、酶切鉴定后测序.
1.5 重组慢病毒的制备
接种对数生长期的HEK293T 细胞于10 cm 培养皿中，细胞贴壁后，将7.5 μg psPAX2、2.5 μg pMD2.G 及10 μg pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 或pLVX-Puro-Frzb 进行共转染. 质粒与Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂以1:3的比例混合后缓慢滴加到细胞中，
48 h 后收集含病毒颗粒的上清，4 ℃ 2 000 × g 离心10 min 并经0.45 μm 滤器过滤后分装于-80 ℃冻存备用.
1.6 重组慢病毒的鉴定
将Frzb 重组慢病毒悬液感染HEK 293T 细胞，加入的Polybrene 终浓度为10 μg/mL. 分别采用以下两种方式鉴定48 h 感染后的重组慢病毒，对于含GFP 标签的重组慢病毒，通过倒置荧光显微镜镜检观察绿荧光的强弱；对于含Flag 标签的重组慢病毒，提取病毒感染后的细胞总蛋白，通过Western blot 检测Flag 融合蛋白的表达强弱.
1.7 HepG2稳定细胞株的筛选
首先通过预实验确定HepG2嘌呤霉素致死浓度. Frzb 重组慢病毒悬液感染He p G 2细胞，48 h 后加嘌呤霉素筛选，经筛选1-2周后，收集阳性克隆，提取细胞总蛋白，通过Western blot 检测Flag 融合蛋白的表达. 冻存鉴定的稳定细胞株以备用.
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20卷 马玉玲等/ Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
2.1 Frzb cDNA 克隆
为了研究Wnt 蛋白拮抗剂Frzb 在肝癌细胞中的功能，首先需从正常肝细胞LO2中通过RT-PCR 克隆出Frzb cDNA 片段. 扩增的Frzb 产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1所示，该片段大小为1.2 kb ，与预期一致，经测序证明其序列完全正确，无突变位点
.
图1 人Frzb cDNA 克隆. M ：
1 kb Plus DNA Ladder ；1：Frzb cDNA.Fig. 1 cDNA cloning of human Frzb cDNA. M: 1 kb Plus DNA Ladder; 1: Frzb cDNA.
2.2 Frzb 重组慢病毒表达质粒的构建
慢病毒结合了腺病毒和逆转录病毒的优点，目的基因可长期整合到细胞基因组中从而为基因功能的研究提供了非常理想的研究手段. 因此，我们将获得的Frzb cDNA 片段分别亚克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和pLVX-Puro 上（图2A & 2B ）. Xho I/Xba I 及Xba I/Pme I 两组酶切鉴定结果如图2C 所示，泳道1、2代表的阳性克隆经酶切后均得到1.2 kb 的
目标条带及8.2 kb 的空载体两条带，泳道3、
4分别为相应的空载体对照质粒. 此外，目标条带随后的测序结果确证了Frzb 重组慢病毒表达质粒pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 和pLVX-Puro-Frzb 的正确构建.
2.3 Frzb 重组慢病毒的制备与鉴定
在HEK293T 细胞中共转染Frzb 重组慢病毒表达质粒pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 或pLVX-Puro-Frzb 以及慢病毒包
装质粒psPAX2、pMD2.G ，
48 h 后收集重组慢病毒悬液，通过病毒悬液感染HEK293T 细胞进行Frzb 重组慢病毒的鉴定. 对于含GFP 标签的重组慢病毒感染，荧光显微镜下观察到HEK293T 细胞中GFP 蛋白的大量表达，结果如图3A 所示. 与此同时，与空载体重组慢病毒相比，含Flag 标签的Frzb 重组慢病毒感染后的HEK293T 细胞中经Western blot 检测到分子量（M r ）约36 × 103的Flag 融合蛋白的大量表达（图3B ）. 以上实验清晰地显示Frzb 重组慢病毒已成功获得
.
图3 Frzb 重组慢病毒感染的产生与鉴定. A ：含GFP 标签的Frzb 重组慢病毒的
产生与荧光鉴定；B ：含Flag 标签的Frzb 重组慢病毒的产生与Western blot 鉴定. Fig. 3 Production and identification of recombinant lentivirus of Frzb in HEK293T cells. A: Production and fluorescent identification of recombinant lentivirus of GFP-tagged Frzb in HEK293T cells: B: Production and identification of recombinant lentivirus of Flag-tagged Frzb by Western blot
in HEK293T cells.
图2 pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 和pLVX-Puro-Frzb 重组慢病毒表达质粒的构建. A ：
pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 质粒图谱；B ：pLVX-Puro-Frzb 质粒图谱；C ：重组质粒酶切鉴定电泳图. M ：1 kb Plus DNA Ladder ；1：pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb 经Xho I/Xba I 酶切；2：pLVX- Puro-Frzb 经Xba I/Pme I 酶切；3：pLVX-IRES-ZsGreen1经Xho I/Xba I 酶切；4：pLVX-Puro 经Xba I/Pme I 酶切.
Fig. 2 Construction of lentiviral expression plasmids for pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb and pLVX-Puro-Frzb. A: Plasmid map of pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb; B: Plasmid map of pLVX-Puro-Frzb; C: Restriction analysis of recombinant plasmids. M: 1 kb Plus DNA Ladder; 1: Recombinant plasmid pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb digested by Xho I/Xba I; 2: Recombinant plasmid pLVX- Puro-Frzb digested by Xba I/Pme I; 3: Plasmid pLVX-IRES-ZsGreen1 digested by Xho I/Xba I; 4: Plasmid pLV
X- Puro digested by Xba I/Pme I.
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Wnt蛋白拮抗剂Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及稳定...... 5期
2.4 Frzb 稳定表达的肝癌HepG2细胞株的建立
为了在体内外更方便地研究Frzb 蛋白及其他相关蛋白在肝癌细胞中的功能，我们将获得的含Flag 标签的Frzb 重组慢病毒以及空载体重组慢病毒感染肝癌HepG2细胞，经嘌呤霉素筛选后，收集阳性细胞克隆的总蛋白，通过Western blot 检测Frzb 蛋白的表达. 实验结果如图4所示，与空载体重组慢病毒相比，感染了含Flag 标签Frzb 重组慢病毒的HepG2细胞能大量表达Frzb 蛋白，以上实验表明通过慢病毒表达体系已成功地获得Frzb 稳定表达的肝癌HepG2细胞株，为后续Frzb 的体内外抗肝癌活性与分子机制研究奠定了基础
.
图4 Frzb 稳定表达的肝癌HepG2细胞株的建立.
Fig. 4 Stable expression of human Frzb in HepG2 cells.
以Wnt 信号通路调控分子为靶点可提供新的肿瘤预防与方法. Wnt 信号途径非常复杂，含有19个不同的Wnt 配
体、10个Frizzled 受体、若干辅助受体以及众多下游靶标蛋白，备受生物医学研究人员的密切关注. Wnt 信号通路大体可分为经典Wnt/ß-catenin 途径与非经典途径如Wnt/Ca 2+通路、Wnt/PCP 通路及其它通路，这两大类途径因相互作用而倍加
复杂. 至于具体途径则取决于不同细胞类型WNTs 、
SFRPs 、WIF1、DKKs 、Frizzled 、辅助受体以及细胞浆内Wnt 信号调节子的活性调节[12]. 可喜的是，研究表明针对Wnt 信号通路的单克隆抗体anti-WNT1和anti-WNT2在体外试验中具有较好的抗癌活性，而目前全世界越来越多的研究小组正着手通过Wnt 报告基因体系TOP Flash 筛选化合物库，以及基于Wnt 信号组份蛋白间相互作用模拟设计新的化学小分子用于抗癌药物. 近期研究结果表明，抑制Wnt 信号活性可显著抑制膀胱癌、直肠癌、肝癌等肿瘤细胞生长[13-14]. 因此，基于Wnt 信号转导
通路，筛选抑制或者阻断Wnt 信号途径的蛋白拮抗剂或化学小分子策略将是今后抗肝癌的新途径之一.
本研究充分运用慢病毒表达载体的强大效能，在肝癌细胞中成功建立了Wnt 蛋白拮抗剂Frzb 的稳定表达细胞株，可为进一步探讨Frzb 的抗肝癌活性与分子机制，进而发展针对Wnt 信号通路的抗肿瘤蛋白质药物奠定基础. 1
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