血管发生相关分子

技术领域

本发明涉及血管发生领域，更具体地涉及新的诸如蛋白质和肽的 分子，由此可开发新的抗血管发生物质。本发明还涉及开发这类物质 的方法。

背景

几乎所有的哺乳动物机体组织均含有极细血管的细小网络，每个 血管均比人发更细。通常，由于覆盖血管的内皮细胞分化缓慢，这些 血管的数目和大小实际上长达数年也不增加。例外的情况是例如，在 创伤愈合以及月经期间，该情况中血管生长迅速。但是，这仅发生在 有限的期间，此后细胞分裂停止。

从已有细胞中产生新血管被称为血管发生。已知血管发生与癌症 及肿瘤形成以及其它疾病相关，诸如糖尿病性视网膜病、类风湿性关 节炎甚至一些炎性疾病。因此，全球范围内已进行了相当大量的研究 以出预防和抑制血管发生过程的方法。如果可能，则可控制肿瘤生 长，可开发出针对上述疾病的有用的方法。

已有大量证据显示，多种肿瘤依赖于血管的从头形成以扩增至大 于数立方毫米的物质。血管发生由肿瘤细胞分泌的多种因子引发。现 已发现，肿瘤通过不受约束的蛋白质分解活性产生显示抗血管生成活 性的肽片段。一个例子是制管张素分子，其是纤溶酶原的片段。

纤溶酶原是血浆中的一种物质，其激活时形成纤溶酶或纤维蛋白 溶酶，该酶参与血液凝集。纤溶酶原自身缺乏任何可检测到的抗血管 生成活性。已发现此内源性蛋白质的一部分，更具体地，其前四个 kringle结构域能阻止内皮细胞分裂(Judah Folkman等，哈佛医学院 (Harvard Medical School)，Boston)。此纤溶酶原部分已被命名为 制管张素，本领域中大量研究集中于此分子。现有技术显示，制管张 素尤其在体外抑制内皮细胞，且体内阻断血管发生。用制管张素皮下 注射地系统性在SCID小鼠中诱导大范围肿瘤的体内休眠(O’Reilly 等，自然杂志医药分册(Nature Med.)，2卷，689页，1996)。即使 在数月的后也未在这些动物中检测到任何可检测的毒性。制管张 素显示两种水平的特异性：体外其特异性诱导内皮细胞中的细胞凋亡 (Claesson-Welsh等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci； USA)，卷95，5579页，1998)，并且仅在体内血管发生中影响内皮细 胞的活性。目前尚未显示在已有血管中对细胞有副作用。

制管张素的确显示出一些有利的性质，尤其是它是一种内源性物 质。但是，与其用于可能的医药用途相关的不利之处不能忽视。一个 是其半寿期非常短，其可能以小时计，由此需要频繁给药。由此显示 其效率相当低，这一事实要求其大剂量施用。这两个不利之处本身强 烈激发了针对寻替代性的、更小和/或更有效的分子作为药物的研 究。

发明概述

本发明通过提供一种称为“ABP-1”的人类蛋白质解决了与上述 制管张素相关的问题，所述蛋白质由其结合纤溶酶原片段(优选其前 四个Kringle结构域(K1-K4))的能力定义，所述片段的特征为抗血管 发生生物学活性。

ABP-1包含与SEQ ID NO.2所示基本上类似的氨基酸序列。本发 明也涵盖ABP-1的变体和片段。

本发明还涵盖了其它种属尤其是其它哺乳动物中的ABP-1同系 物。

又一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码ABP-1的 序列或编码与ABP-1基本上类似的多肽，包括其变体、片段和同系 物。

本发明又一方面提供了核酸探针，其序列衍生自SEQ ID NO.1； 这些探针可用作研究工具以及用于诊断方法中，例如检测和测量组织 和细胞中ABP-1生物合成。

相应的，本发明的一个方面是提供用于在组织和细胞中检测 ABP-1或其变体和片段存在与否及数量的诊断方法。

本发明也包括了用于鉴定能够与ABP-1或其变体及片段相互作用 的化合物之筛选方法。筛选方法可为任何本领域周知的形式。

本发明的又一方面提供了用所述筛选方法鉴定的且能够调节 ABP-1或其变体和片段的生物学活性之化合物。

本发明的又一方面提供了含有用上述筛选方法鉴定的化合物作为 活性成分的药物组合物。

本发明的又一方面提供了针对ABP-1或其变体和片段中存在的表 位之抗体，以及产生抗体的细胞。

本发明的又一方面提供了含有ABP-1或其变体和片段的核苷酸序 列之载体。

本发明的又一方面提供了含有上述载体的细胞。

定义

本发明中，以下述定义使用如下术语。

如此处所用，术语“血管发生”涉及新血管在组织或器官中的产 生。如上述，在正常生理条件下，人和动物仅在非常特别限定的情况 下经历血管发生。例如，在创伤愈合、胚胎发育和黄体及胎盘形成中 可观察到血管发生。

术语“内皮”涉及作为浆液腔、淋巴管和血管衬里的扁平上皮细 胞薄层。术语“内皮抑制活性”涉及抑制内皮毛细管内皮细胞的生长 的能力。

术语“一种血管发生相关蛋白质”涉及一种能够在血管发生中相 互作用的蛋白质，诸如受体结合抗血管发生物质。

术语“基本上类似”当用于指SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4时，意思是一种与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4具有高度序列同源性的氨基酸序列。高度同源性是指至少大 约80％氨基酸同源性，优选至少大约90％氨基酸同源性，更优选至少 大约95％氨基酸同源性，最优选至少大约98％氨基酸同源性。

术语“与…特异性杂交”是指当序列存在于一种DNA或RNA的复 杂混合物(如，总细胞DNA或RNA)中，在严格条件下一个分子仅仅 与特定核苷酸序列结合、形成双链或杂交。术语“严格条件”是指探 针会与其靶序列杂交但不会与其它序列杂交的条件。严格条件取决于 序列，在不同环境条件中各不相同。较长的序列在较高温度下特异性 杂交。一般而言，选择比在一定离子强度和pH下的特定序列之热融 化温度(Tm)低大约5℃的严格条件。Tm是(在一定离子强度、pH 和核酸浓度下)50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交达到平衡的温 度。(一般靶序列的存在过量，在Tm下，平衡时50％的探针被占 据)。通常，严格条件是指在盐浓度小于约1.0M钠离子，一般约0.01 至1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0至8.3，对于较短探针(如，10- 50核苷酸)温度低于约30℃，对于较长探针温度至少约60℃的那些条 件。严格条件也可通过去稳定剂(如甲酰胺)的添加实现。

附图简述

图1显示体外125I-标记的制管张素和纤溶酶原与牛微毛细管内皮细 胞的结合。横坐标的单位分别表示未标记的制管张素及纤溶酶原的摩 尔过量倍数。

图2显示分离制管张素结合蛋白质的方法。

图3显示在选择条件下阳性酵母菌落的生长。

图4比较了重组“Big-3”分别与制管张素和纤溶酶原的结合。

图5是“Big-3”的图谱。

图6显示编码本发明制管张素受体的基因之开放阅读框(框架 2)。其它可能的框架不产生任何推定的蛋白质。

图7显示胚胎及成年mRNA以及内皮细胞的表达模式。

图8显示在不同组织中ABP-1基因的相对定量。更详细的内容见 实验部分。

图9阐明(A)在瞬时转染的HeLa细胞中GFP标记的ABP-1受体之 细胞定位，和(B)在与制管张素温育后GFP标记的ABP-1重新排列 (reorganization)。图9C显示制管张素与ABP-1的结合。更详细的内 容见实验部分。图9D是在人脐带内皮细胞(HUVE)中的ABP-1免疫 染与针对带有罗丹明标记的鬼笔环肽的肌动蛋白的染。ABP-1位 于病灶粘附处和膜波缘处(箭头)。

图10阐明加入制管张素后ABP-1相关激酶活性的下调。

图11是SDS-PAGE的放射自显影，显示ABP-1介导制管张素诱导 的病灶粘附激酶活性。更详细的内容见实验部分。

发明详述

本发明涉及一种分离的人血管发生相关蛋白质，其能结合纤溶酶 原的片段，优选为N-末端片段，如kringle结构域1-4和/或kringle 5。 由此，本发明的蛋白质起着纤溶酶原片段的受体作用，特别是制管张 素和/或纤溶酶原kringle 5结构域的受体的作用。本发明的蛋白质可通 过生物或化学方法合成(如，重组基因表达和肽合成)。重组技术包 括基因克隆或通过体外方法扩增，如聚合酶链反应(PCR)、连接酶 链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)或自持续的序列复制 系统(SSR)。本领域普通技术人员周知多种克隆和体外扩增方法。 这些技术的例子有，如Berger和Kimmel，分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)，酶学方法(Methods in Enzymology)，152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)中 所述。本发明包括含有基本上与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中所示的那些类似的氨基酸序列之蛋白质。SEQ ID NO.2蛋 白质序列与所有可得数据库中的序列进行比较，显示与 Caenorhabditis elegans的假拟(hypotetical)蛋白质有23.7％同源性， 所述蛋白质由位于该生物染体III上中央簇中的推定开放阅读框编码 (见R.Wilson等，自然(Nature)，卷368，3月，1994，32-38所 述)。未推定此假拟蛋白质任何功能。

根据上述定义，应当理解所有编码能够结合纤溶酶原片段并具有 与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少约80％序列同源 性，优选约90％序列同源性，更优选约95％序列同源性，最优选约 98％序列同源性之氨基酸序列的多肽，均被构思包含在本发明中。这 些变体可例如来自相同来源生物不同组织中不同地表达或不同地剪 接。变体形成的特征可以是例如氨基酸插入、删除或替换。优选的 ABP-1变体形式示于SEQ ID NO.3(见下)。

一种本发明特别优选的实施方案是下面进一步详述的被称为Big-3 的ABP-1片段，其包括ABP-1的制管张素结合结构域(SEQ ID NO.4)。

在又一实施方案中，本发明提供了含有至少约5个优选至少约10 个连续SEQ ID NO.2的氨基酸残基或其任何变体或片段之肽。但是， 肽的最有利的大小取决于其使用目的，本发明并不局限于上述氨基酸 残基数。

也包括在本发明中的是在其它种属，特别是其它哺乳动物中的 ABP-1和Big-3同系物。术语“同系物”是指与本发明的蛋白质发挥基 本上相同的生物学功能的蛋白质，无论相应的氨基酸序列之间是否存 在同源性。

另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码本发明蛋白 质和肽的序列，包括如上述的变体、片段和同系物。在一个优选实施 方案中，核酸分子具有SEQ ID NO.1的序列。此序列存在5’(从核苷 酸1-核苷酸796)以及3’(从核苷酸2825-核苷酸6463)非翻译区。在 另一个优选实施方案中，核酸分子具有从SEQ ID NO.1核苷酸797至 核苷酸2824的序列。在另一个优选实施方案中，核酸分子编码称为 Big-3的ABP-1片段(示于SEQ ID NO.4)，其包括从SEQ ID NO.1的 位置2180至位置2608的核苷酸序列。所有编码本发明多肽且以遗传密 码简并性方式与SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其片段不同的核苷酸序 列均认为是本发明的一部分。序列分析揭示，SEQ ID NO.1中1199- 1201密码子存在可能的多态性，其中可存在Asn、Ser或Asp的密码 子；发现相应于SEQ ID NO.1的核苷酸位置1238-1246的区域编码三肽 Glu-Leu-Ala或三肽Thr-Trp-Pro。这些ABP-1的氨基酸序列的变体示 于SEQ ID NO.3，其构成了本发明的另一个优选蛋白质。也包括在本 发明的是编码ABP-1或其片段的同系物之核苷酸分子。

本发明还包括在严格条件下能与任何上述本发明的核酸分子特异 性杂交的核酸。

当本发明的核酸用作探针时，常常期望用可检测的标记来标记该 序列。这类标记可包括任何可被分光光度计、光化学、生物化学、免 疫化学、电学、光学或化学方法检测的组分。标记可通过任一本领域 技术人员周知的方法掺入。检测这类标记的方法也为本领域周知并公 开于文献中。探针用于诊断性应用，如检测和测量组织和细胞中 ABP-1的生物合成。

另一方面，本发明提供了筛选方法或检验方法，所述方法用来筛 选显示与制管张素和/或kringle 5相同性质的分子。在一般的筛选方法 中，通过高通量的基于细胞的筛选鉴定能够激活制管张素信号转导途 径的化合物。这类筛选依赖于稳定转染入制管张素应答性细胞系之制 管张素应答性元件驱动的报告分子基因。应答性元件与报告分子基因 如萤光素酶连接，化合物一旦与本发明的蛋白质结合，即激活细胞内 途径，由此引起可检测到的报告分子基因活性的增加。

通过此处所述的筛选方法鉴定的化合物在本发明的范围之内。这 类化合物优选为低分子量的肽类或非肽类分子。得益于其小分子量， 与制管张素相比，其更具有作为药物用途的实用性。这些分子和其用 途的进一步详述如下。

本发明的蛋白质和肽可利用标准化学肽合成技术合成。对于固相 合成，见如Barany和Merrifield，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，3-284页中“肽：分析、合成生物学(The Peptides： Analysis，Synthesis Biology)”，卷2：“肽合成的特殊方法(Special Methods in Peptide Synthesis)，A部”。

优选地，利用重组DNA技术合成本发明的蛋白质类、肽类和多肽 类，该技术通常包括制备编码蛋白质或肽的DNA序列，将该DNA序列 在特定启动子的控制下置于一种表达盒中，在宿主中表达蛋白质或 肽，分离表达的蛋白质或肽，如需要，复性该产物。一旦表达，可根 据本领域标准方法纯化重组肽类或蛋白质类。因此，本发明另一方面 是一种载体，如病毒或质粒，其包含本发明的核酸。此外，本发明还 涵盖用所述载体转化或转染的重组细胞，其表达本发明的蛋白质或 肽，以及表达在下面详细定义的本发明抗体的重组细胞。编码根据本 发明的肽类和蛋白质类的载体可用于表达这类分子，以为制备抗体提 供免疫原。本发明的载体也可用于体外或体内转化细胞，以表达本发 明的肽类和蛋白质类。表达任一本发明核酸(如由SEQ ID NO.1定义 的基因)之细胞可用于多种用途，且均在本发明的范围之内。这类细 胞可为真核或原核的。

本发明的蛋白质和肽可用作抗原用来诱导产生针对该抗原的抗 体。因此，本发明也包括特异性结合根据本发明的肽之抗体。这类抗 体可用于免疫分析检定，如用于肽类或多肽类的分离。根据本发明的 肽类还可用于诸如扩增特异性分析、免疫鉴定等分析检定中。

根据本发明的抗体可为单克隆或多克隆的，包括独立的、等位片 段、菌株或种属变体、或其片段，均可为其天然存在(全长)形式和 重组形式。此外，诱导产生的针对本发明的肽或多肽之抗体可为天然 构型或非天然构型。也可产生抗独特型抗体。本领域技术人员周知许 多制备抗体的方法。制备单克隆抗体的技术，见例如，Stiites等 (编)，基础与临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)(第4 版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，及其中所引用的 文献。对于涉及在噬菌体或类似载体中筛选重组抗体文库的技术，见 例如Huse等，(1989)科学，246：1275-1281。

根据本发明的分子可用于药物制剂，尤其是用于和/或预防 血管发生相关疾病。因此，本发明涉及根据本发明的肽、多肽、蛋白 质或抗体用作药物，以及所述分子用于制备针对血管发生相关疾病或 病症的药物的用途。本发明还涉及一种含有根据本发明的分子以及药 学可接受的载体的药物制剂。用作根据本发明的药物的分子可为上述 肽类、多肽类、蛋白质类或抗体类的任一种，以及在利用上述分子和 所述方法的筛选方法中鉴定的任何新物质。

因此，本发明分子的最优选的用途是用在筛选新物质的分析检定 中。可鉴定这样的化合物，其显示与制管张素和/或kringle 5类似的抗 血管发生作用，但是该化合物更小，更有效且优选在人或动物体内有 较长的半寿期。较长的半寿期可由于被蛋白酶降解的趋势较低。当设 计有机化合物时，本发明的分子用作一种“先导”化合物。设计与已 知药物活性化合物的模拟物是基于这类“先导”化合物的药物开发中 周知的方法。一般使用模拟物设计、合成及测试来避免在大量分子中 随机筛选目标性质。

因此，这类新分子优选地用作可以以大大低于制管张素的剂量施 用的药物，且其可以以较低的频率施用，如每14天施用一次，其将与 大约短10倍的制管张素半寿期相比较。在一特定实施方案中，通过本 发明的筛选方法鉴定的新分子为低分子量有机分子，其中可由此制备 用于口服摄入的药物制剂，诸如片剂。

然而，根据本发明的药物制剂可制备成用于任一给药途径，例 如，口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内或腹膜内。载体或其它 配料的性质可取决于给药的特定途径(用于本发明的技术和方法的例 子尤其参见雷明顿药物科学，第16版，Osol，A(编)，1980)。

这些低分子量化合物的剂量取决于待的疾病或病症的状况， 以及其它临床因素，诸如体重和人或动物的状况，以及化合物的给药 途径。对于人或动物的，可在约0.5mg化合物/Kg体重至500mg化 合物/Kg体重之间施用。

本发明的化合物和方法有利地用于所有种类的与血管发生相关的 疾病和/或病症，诸如肿瘤疾病、糖尿病、类风湿性关节炎和甚至一 些炎症疾病如干癣，慢性肠道炎症、哮喘等。还提示这些分子可用于 处理、或防止肥胖。

在一个特定实施方案中，本发明的分子可用于基因。基因治 疗方法的综述见，例如Anderson，科学，(1992)256：808-813。

本发明的又一有利用途是开发在机体中调节本发明的制管张素和 /或kringle 5受体的信号传导之方法，因此，本发明还涉及患有血 管发生相关疾病或病症的人或动物患者的方法，以及防止这些疾病的 方法。

实验

下面，将参照附图更详细地公开本发明。

所有本发明中公开的和上述的内容中文献均引入本申请。

制管张素结合内皮细胞的证据

通过制管张素与血管发生因子VEGF和bFGF之间的竞争性结合分 析，本发明人证实制管张素不影响这些分子的配体-受体相互作用。 在未标记的制管张素存在或不存在时可检测到相同的结合水平。因 此，可排除制管张素通过封闭血管发生因子与内皮细胞相互作用来起 作用。

制管张素和其前体纤溶酶原的直接结合已通过结合检定分析加以 研究，该方法利用碘化蛋白质，并分析其与牛微毛细血管内皮细胞的 相互作用，见图1。

具体地，人制管张素(kringle结构域1-4)或纤溶酶原可根据制 造商的方法(Pierce Inc.)通过Iodogen方法用碘125标记。然后在G50 Sepharose柱(Pharmacia Inc.)上纯化标记的蛋白质。据估计比活性 为90 000cpm/ng蛋白质。为了结合检定分析，将牛毛细内皮细胞在12 孔板中生长至铺满。用含有1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗 涤细胞。然后将细胞与10ng/ml放射性标记的制管张素或纤溶酶原一 起温育。结合与浓度增加的未标记配体竞争。将细胞在冰上温育2小 时。然后用PBS+1mg/ml BSA洗涤五次。用PBS中1％Triton X100裂 解细胞，在γ计数器中测定放射性。利用RBINDING程序(van Zoelen E，分析生物化学杂志(J.Anal.Biochem.)1992年2月1；200(2)：393- 9)估计解离常数和受体数目。

利用酵母双杂交系统鉴定制管张素结合分子

甚至在还原后制管张素仍保留活性，提示其三维折叠对于结合和 活性并不重要。这有利于这样的筛选方法，其中尽管蛋白质的再折叠 可能不甚正确，仍可大量筛选克隆。

利用酵母双杂交系统筛选可结合纤溶酶原kringle1-4结构域的分 子。下面结合图2进一步描述。筛选了大约2×106个来自人足月胎盘的 双杂交cDNA文库(Stratagene)。在下列方法中鉴定了阳性克隆：

(1)在选择性条件下(His-，Leu-和Trp-)筛选产生了酵母菌株 CG1945中的37个阳性克隆。

(2)与ONPG(SIGMA)在30℃温育2小时后，37个克隆中有7个 显示高β-半乳糖苷酶活性。

(3)纯化含有高β-gal活性的7个克隆之DNA，再转染入酵母菌株 Y190。在新酵母菌株中7个克隆有3个保留了活性。这些克隆的序列测 定分析显示，它们来自相同基因。

(4)在50mM 3-氨基三唑存在下生长(图3)，在Big 3克隆中鉴 定β-gal活性(见下表)，并与阳性和阴性对照。

Big-3(制管张素结合结构域)的序列

从胎盘酵母双杂交文库(Stratagene，Inc.)中分离big-3克隆，我们 用GAL4 AD测序引物直接测定pGAD活化结构域载体的cDNA插入序 列的序列。利用来自适配接头的EcoRI位点将cDNA插入序列再次克隆 入pUC18载体，利用通用和反向引物重复测序。在ALF自动化测序仪 中分析序列(Pharmacia)。Big-3的序列示于SEQ ID NO.4。

Big3及Big3-GST融合蛋白质的表达及纯化

Big3已经以与来自Schistosoma japonicum的谷胱甘肽S-转移酶 (GST)结构域的融合蛋白质形式在大肠杆菌中表达。

载体构建

利用pUC18-Big3质粒作为模板通过PCR扩增获得Big3片段(429 bp)。引物序列为：

BamHI-NH2  5’TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3’(SEQ ID NO.5)

XhoI-COOH  5’ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGC CA 3’(SEQ ID NO.6)

使用的循环方案为：

94℃ 3’，60℃ 1’，72℃ 1’1个循环

94℃ 30”，60℃ 1’，72℃ 2’30个循环

94℃ 30”，60℃ 1’，72℃ 5’1个循环

Taq聚合酶：天然Pfu DNA聚合酶(Stratagene)。

用BamHI和XhoI消化PCR片段，纯化并连接入已经用相同限制 性酶消化的PGEX-6P-2质粒(Pharmacia Biotech)。连接混合物用于转 化XL1-Blue细胞(Stratagene)。通过限制性酶切分析和自动化测序验 证重组质粒。

表达及纯化

用一个经验证的称为pGEX-Big3的克隆转化DH5α细胞 (Clontech)，用0.1mM IPTG室温下诱导6小时。

于4000转/分离心发酵培养液15分钟，将细胞沉淀重悬于10％w/v 裂解缓冲液(50mM TRIS-HCl pH 8.0，100mM NaCl，20mM DTT， 1mM EDTA，蛋白酶抑制剂混合物)中，超声裂解。于4℃下15000g 离心总裂解物20分钟。将澄清上清液上样于经裂解缓冲液预平衡过的 谷胱甘肽-Sepharose柱(每20ml裂解物用1ml)。树脂用10倍柱体积 (CV)的裂解缓冲液洗涤，用3倍CV的洗脱缓冲液(100mM TRIS- HCl pH8.0 20mM还原的谷胱甘肽)洗脱融合蛋白质。

通过将谷胱甘肽-Sepharose结合的融合蛋白质与20ul/ml树脂的 PreScission蛋白酶PS溶液(其中含有50mM TRIS.HCl pH7.0，100 mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF)温育，切割 GST-Big3蛋白质。

洗脱的蛋白质在rp-HPLC(10-90％梯度的乙腈水溶液加 0.1％TFA)表现为单一峰，显示通过质量分析(电喷射)所预期的分 子大小和正确的NH2序列。在SDS-PAGE中于表观MW为80kD处显示 有污染，经证实为陪伴分子DnaK，其可通过HiTrapQ柱的离子交换 层析除去。

从1升发酵液中获得的产率为约10mg GST-Big3融合蛋白质和约 3mg的切割的Big3。

体外重组GST-标记的Big3与制管张素的结合

用于结合的方法描述如下。

一个pGEX-Big3转化子的菌落接种入10ml添加氨苄青霉素的LB培 养液，于37℃生长过夜。

将过夜培养物以1∶10稀释入100ml新鲜培养液，于37℃培养1小时 后，将IPTG加入至终浓度为0.5mM，继续温育3-7小时。

然后于5000g将培养物离心10分钟，细胞沉淀重悬于3-5ml冰冷的 PBS中，超声裂解细胞。加入Triton X100至终浓度0.5-1％，将1.5 ml上清液等份于14000转/分离心10分钟。

向上清液中加入0.1-0.3ml的50％谷胱甘肽琼脂糖珠浆液，于4℃混 合3-5小时。离心收集珠，用冰冷的PBS洗涤5次，用组成为50mM Tris pH7.5，150mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM DTT和1mM PMSF 的结合溶液(B.S.)洗涤2次。

结合检定分析：将0.7ml B.S.，0.1％牛血清，500ng制管张素与30- 50μl的50％固定化Big3-谷胱甘肽琼脂糖珠浆液在4℃下混合。

树脂用冰冷的B.S.洗涤5-7次，然后用于利用抗人纤溶酶原抗体 (Dako Inc.)进行的Western印迹分析。

图4显示，纯化的重组Big3如何体外结合制管张素。有趣的是，也 可检测到纤溶酶原的结合，但是仅仅在用DTT处理的二硫键还原之 后。

全长序列的克隆

图5显示，克隆ABP-1全长序列的方案。通过用Big-3探针(去除 了重复序列)筛查胎盘cDNA噬菌体文库，以及利用来自人脐带内皮 细胞的mRNA进行5’RACE PCR(Gibco)，克隆了完整基因。cDNA 克隆的全长序列示于SEQ ID NO.1，而编码的蛋白质示于SEQ ID NO.2。实验方法的细节如下述。

利用Big-3的HinfI片段作为探针筛查了胎盘λ噬菌体文库 (Stratagene，Inc)的10×106克隆。根据现有的方法进行DNA分离和 Southern印迹实验(Sambrook等，1989)。我们分离到5个带有与 Big-3重叠的序列之克隆(7-1，7-2，8-2，9-3，9-5)。7-2克隆的5’序 列用来设计用于5’RACE PCR的基因特异性引物(GSP)(Gibco Life technologies，Inc.)从人脐带内皮细胞分离的mRNA用于鉴定5’序 列。

用于第一次RACE PCR的引物：

引物：GSP1-(5′-3′)GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT(SEQ ID NO. 10)

GSP2-(5′-3′)CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA(SEQ ID NO. 11)

GSP3-(5′-3′)TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG(SEQ ID NO. 12)

RACE方法已被用于扩增和克隆GSP2和GSP3以及ABP-1mRNA 5′端之间的未知序列。此序列随后用于设计下一次RACE PCR的新引 物：

引物：GSP1-(5′-3′)GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC(SEQ ID NO. 13)

GSP2 GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA(SEQ ID NO.14)

GSP3 GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA(SEQ ID NO.15)

分离了带有重叠序列的克隆A2-2，A2-1和A1-C。其中A2-1用作探 针用于胎盘噬菌体文库的第二次筛选。通过此次筛选我们分离了另外 两个克隆(7-10和6-5)。如图6所示，6个可能的框架中仅有的产生完 整开放阅读框的一个是框架2，产生675个氨基酸残基的推定蛋白质。

mRNA表达模式

探查了市售(Clontech，Inc.)多种人成年及胚胎组织(#7760-1和 #7756-1)mRNA印迹(2mg mRNA/孔)中的ABP-1。根据制造商的方 法用ExpressHyb杂交溶液(Clontech，Inc.)杂交印迹。用7-25’PstI片段 探查印迹。图7显示试验结果，大小为9.5和7.5kb。

也在人脐带、牛主动脉和牛微毛细内皮细胞中检测到ABP-1。在 永生化内皮细胞系EaHy926和人胚胎成纤维细胞中几乎检测不到或未 检测到表达。这些细胞系不应答制管张素，也不显示任何FITC标记 的制管张素的结合。

实时RT-PCR

5’核酶分析鉴定(TaqMan分析检定)使用了非延伸寡核苷酸杂交 探针(TaqMan探针)。TaqMan探针构成一种具有5’报告分子染料和 3’淬灭染料的寡核苷酸。当探针完整时，报告分子染料与淬灭染料邻 近，导致报告分子荧光的抑制，主要是由于Foster型能量转移。在 PCR过程中，正向和反向引物与靶DNA的特定序列杂交。TaqMan探 针与PCR产物内的靶序列杂交。Taq聚合酶用其5’-3’核酶活性切割 TaqMan探针。一经切割，报告分子染料与淬灭染料分离，导致报告 分子的荧光增加。

实时RT-PCR分析

RNA制备

利用Ultraspec RNA分离系统(Biotex)从如下列出的组织和细胞 中分离并纯化总RNA。

cDNA合成

利用TaqMan逆转录试剂(PE Applied Biosystems)以随机六聚 体作为RT引物进行RT反应。逆转录步骤的反应体积为100μl，样品总 RNA量为1μg。

利用如下循环参数进行RT：

25℃ 10’

48℃ 45’

95℃ 5’

PCR反应

引物浓度优化后，利用TaqMan通用PCR Master Mix(PE Applied Biosystems)和下面的寡核苷酸对10ng DNA进行PCR。

ABP-1正向引物：5’GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3’(SEQ ID NO.7)，终浓度300nM

ABP-1反向引物：5’CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3’(SEQ ID NO.8)，终浓度900nm

ABP-1 TaqMan探针：

5’(FAM染料)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA dye)3’(SEQ ID NO.9)，终探针浓度200nM

循环方案为：

50℃2’；95℃ 10’1个循环

95℃15”；60℃ 1’40个循环

基因表达的相对定量

比较方法使用数学公式无需标准曲线即可得到相对定量结果。

示于图8的结果表明，与显示靶的最低表达水平之样品的校准物 相比，样品X中表达的靶序列相对于校准物的倍数。在本试验中， EaHY926样品被选为校准物。

针对Big-3的抗体

为免疫接种新西兰白兔，将100微克Big-3-GST融合蛋白质溶于 1ml磷酸缓冲盐液(PBS)中，与1ml弗氏完全佐剂(Gibco)混匀。 于第0天皮下注射所得乳液，于第15和第28天重复上述处理。于第35 天从兔中取血，4℃下凝结，将得到的血清于-20℃贮存。

为了特定抗体的纯化，如下制备树脂固定化配体：将Big-3多肽以 总体积2ml中5mg/ml的浓度稀释入0.1M碳酸氢钠，0.5M NaCl， pH8.3。将其室温下与2ml溴化氰活化的Sepaharose CL-4B树脂(Sigma Chemical Co.St Louis，MO)反应两小时。反应后，树脂用10倍体积 的100mM Tris，500mM NaCl，pH7.5洗涤3次。将免疫血清与亲和 树脂4℃下温育两小时，其后将树脂在5ml玻璃层析柱(Bio-Rad， Richmond CA)用25体积的100mM Tris，500mM NaCl，pH7.5洗 涤。以1ml等份用100mM甘氨酸/HCl，pH2.8洗脱特定抗体。抗体洗 脱后在280nM(OD280)处检测光密度，收集OD280大于1的级分，于4 ℃对1升PBS透析36小时(Slide-A-lyzer cassettes，Pierce)，更换缓冲 液三次。

制管张素经ABP-1蛋白质的结合与信号传递

图9A和图9B显示了FITC标记的制管张素与ABP-1转染的HeLa结 合，和与用对照载体转染的EaHy926细胞的结合。具体地，图9A显 示，在瞬时转染的细胞中，融合于绿荧光蛋白(GFP)的ABP-1的 细胞定位。可在内质网和细胞膜上检测到该蛋白质。DABP-1在基因 的5’端含有500bp的缺失，其破坏了先前描述的ABP-1的定位。

图9B显示用ABP-1GFP转染的HeLa细胞。0℃下与2.5mg制管张素 温育60分钟随后于37℃下温育15分钟，诱导ABP-1-GFP的内化。

图9C显示制管张素与ABP-1的结合。我们已证实，荧光素异硫氰 酸胍(FITC)标记的制管张素特异性结合内皮细胞(数据未给 出)。我们用ABP-1表达构建体或对照载体(p RC/CMV， Vitrogen，Inc.)转染了HeLa细胞。我们在0℃于DMEM+10％胎牛血 清中温育活HeLa细胞FITC-标记的制管张素(10ug/ml)60分钟。然 后在37℃下温育细胞15分钟，以聚集结合的制管张素。用荧光显微镜 分析结合情况。在ABP-1转染的细胞中检测到制管张素的结合，在载 体对照的情况中未检测到结合。

图9D显示在人脐带内皮细胞(HUVE)中的ABP-1免疫染以及 用罗丹明标记的鬼笔环肽针对F肌动蛋白的染。

免疫染方法：

在4％甲醛中固定HUVE细胞，用PBS洗涤并于5％马血清中预封 闭。除去封闭溶液，并用针对制管张素结合结构域Big-3的兔多克隆 抗体(稀释于5％马血清)替换。用荧光素标记的第二抗体(Dako， Inc.)显示阳性染。同时用第二抗体(在用1％triton X100通透化1 分钟)染罗丹明偶联的鬼笔环肽。针对绿荧光蛋白的兔多克隆抗 体用作阴性对照。此外，在人成纤维细胞中未检测到任何阳性染。

如图9D中可见，ABP-1定位于病灶粘附和膜波缘(箭头)。

体外激酶数据

将Huve细胞于5cm培养皿中铺板至亚铺满。于其后的不同时间以 2.5mg/ml加入制管张素。所有培养皿包括对照均同时收获。在冰冷的 PBS中洗涤细胞，在1ml裂解缓冲液中温育。将细胞转移入eppendorf 管中，4℃下于14000转/分离心5分钟。上清液移入另一个eppendorf管 中，加入2μgABP-1兔多克隆抗体。4℃温育样品60分钟，随后加入 50μl的蛋白A Sepharose(Pharmacia，Inc.)浆液，在搅拌温育器中再温 育60分钟。短暂离心收集免疫沉淀，用裂解缓冲液洗涤两次，于洗涤 缓冲液中洗涤一次，于激酶缓冲液中洗涤一次。经虹吸吸去残余缓冲 液。每管中加入25μl激酶缓冲液以及1μCiγATP(Amersham，Inc.)。 样品于室温下温育20分钟。加入2xSDS PAGE样品缓冲液终止反应。 在变性条件下煮沸样品，随后用SDS PAGE分析。

图10显示的数据表明，加入制管张素在30分钟内下调ABP-1相关 激酶活性。这是制管张素影响由ABP-1介导的信号传递途径的直接证 据。

ABP-1介导制管张素诱导的病灶粘附激酶活性

图11的数据显示，加入2.5μg/ml制管张素在加入后1小时内上调 FAK活性。

将EaHy926细胞于5cm培养皿中铺板至亚铺满。于其后的不同时间 以2.5μg/ml加入制管张素。所有培养皿包括对照均同时收获。在冰冷 的PBS中洗涤细胞，在1ml裂解缓冲液中温育。将细胞转移入 eppendorf管中，4℃下于14000转/分离心5分钟。上清液移入另一个 eppendorf管中，加入1μgFAK单克隆抗体(Transduction Lab. Inc.)。4℃温育样品60分钟，随后加入兔抗小鼠IgG+50μl的蛋白A Sepharose(Pharmacia，Inc.)浆液，在搅拌温育器中再温育60分钟。 短暂离心收集免疫沉淀，用裂解缓冲液洗涤两次，于洗涤缓冲液中洗 涤一次，于激酶缓冲液中洗涤一次。经虹吸吸去残余缓冲液。每管中 加入25μl激酶缓冲液以及1μCiγATP(Amersham，Inc.)。样品于室温 下温育20分钟。加入2xSDS PAGE样品缓冲液终止反应。在变性条件 下煮沸样品，随后用SDS PAGE分析。

如图11中可见，制管张素的加入在1小时内上调FAK活性。应当注 意，如逆转录PCR分析证实，EaHy926细胞不表达ABP-1。