用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于肿瘤靶向药相关基因 VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法。

血管生成是实体肿瘤细胞生长和转移的必要条件。血管内皮细胞生长因子 (Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)通过多种机制促进肿瘤血管生成与血流量 增加，其结合并激活3种结构类似的Ⅲ型酪氨酸激酶受体即血管内皮细胞生长因子受体 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR)，VEGFR家族包含有3种亚型，即 VEGFR1(F1t-1)，VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR3(Flt-4)。其中VEGFR1调节肿瘤血管的生成并 影响微血管的数量；VEGFR2参与介导对内皮细胞的增殖过程，诱导肿瘤血管的形成；VEGFR3 可调节肿瘤淋巴管的形成。因此VEGF和VEGFR特别是VEGFR1和VEGFR2是抗血管生成靶向治 疗的主要靶标。

抑制肿瘤细胞诱导的血管生成是近年来寻新型抗肿瘤药物的重要研究方向。贝 伐单抗(Bevacizumab)是第1个VEGF靶向药物抗VEGF单克隆抗体，其药物作用机理主要是通 过抑制肿瘤细胞介导的血管生成来达到阻止肿瘤的生长、转移和复发的目的。临床研究已 证实，VEGFR可作为结肠癌病人使用贝伐单抗联合方案临床疗效独立的预测因子：即 VEGFR基因表达水平高的患者的中位无进展生存期较长，而VEGFR基因表达水平低的患者中 位无进展生存期较短。

目前FDA批准的此类药物还包括舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)。索 拉非尼既能抑制Raf激酶，还能抑制VEGFR，包括VEGFR-2、VEGFR-3、血小板衍生生长因子 (PDGFR)等。舒尼替尼是一种小分子TKI，能和VEGFR酪氨酸残基磷酸化后结合，抑制信号传 导。有研究表明，肝癌患者在使用索拉非尼时，VEGFR表达较强者具有更好的疗效。因 此，VEGFR mRNA表达水平检测对患者接受靶向有明显的指导意义。

目前，在临床疾病标志物实际的检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染)、流 式细胞技术、免疫放射法等，技术普及性好、观察直观且相对传统，但存在实验过程过于繁 琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大等缺点，一定程度上限制了该方法临床上的 进一步应用。近年来，Real Time-PCR凭借检测时间短、检测敏感性高(是免疫组织化学染 法的10倍以上)，而且能对PCR进行实时在线检测，反应基因在组织中的初始含量，试验节约 了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方 法。常见方法有SYBR GreenI染料法、双探针杂交法及Taqman探针技术；其中SYBR GreenI法 由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法及Taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判 断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。

综上所述，本发明采用TAQMAN探针技术与实时荧光PCR技术相结合的检测试剂盒， 适用于临床推广和产业化。

为了解决免疫组化法检测临床生物标志物时存在实验过程过于繁琐，需要试剂种 类繁多，结果读取主观影响较大的技术问题，本发明提供一种操作简单、检测时间短、检测 敏感性高及特异性好的用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂 盒及方法。

本发明提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组， 包括分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：

VEGFR1-RF上游引物：

5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'(SEQ ID NO.1)；

VEGFR1-RR下游引物：

5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'(SEQ ID NO.2)；

VEGFR1-RP探针：

5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'(SEQ ID NO.3)；

VEGFR2-RF上游引物：

5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'(SEQ ID NO.4)；

VEGFR2-RR下游引物：

5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCTC-3'(SEQ ID NO.5)；

VEGFR2-RP探针：

5'FAM-ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG-TRAMA-3'(SEQ ID NO.6)；

Actin-RF上游引物：

5'-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3'(SEQ ID NO.7)；

Actin-RR下游引物：

5'-AGGATGGAGCCGCCGAT-3'(SEQ ID NO.8)；

Actin-RP探针：

5'FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3'(SEQ ID NO.9)。

本发明还提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的试剂 盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的 特异性引物及探针，如下：

VEGFR1-RF上游引物：

5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'；

VEGFR1-RR下游引物：

5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'；

VEGFR1-RP探针：

5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'；

VEGFR2-RF上游引物：

5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'；

VEGFR2-RR下游引物：

5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCTC-3'；

VEGFR2-RP探针：

5'FAM-ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG-TRAMA-3'；

Actin-RF上游引物：

5'-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3'；

Actin-RR下游引物：

5'-AGGATGGAGCCGCCGAT-3'；

Actin-RP探针：

5'FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3'；

所述PCR反应液还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶及超纯水。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品、阴性对照 品和空白对照品。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述阳性对照品分别为含 VEGFR1和VEGFR2基因的溶液；所述阴性对照品为不含VEGFR1和VEGFR2基因的溶液；所述空 白对照品为超纯水。

本发明还提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的方法， 包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提mRNA，将样本mRNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA作为模 板；

步骤二：提供上述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述模 板混匀；

步骤三：利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并分别 以VEGFR1和VEGFR2标准基因作为阳性对照构建标准曲线，根据样本的Ct值计算出样本的底 物浓度；比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，最终判断待检测样本中 的mRNA表达水平。

在本发明提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应条 件为：95℃预变性5min；95℃15sec，60℃30sec，捕捉荧光信号，循环40次。

相较于现有技术，本发明提供的用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检 测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：

一、通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光探针，再配置成使用方便、检测结 果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、 检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用；

二、通过在引物设计及试剂盒中增加Actin基因为参考基因，基于该内参基因具有 mRNA表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行 校正，从而提高本发明方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠；

三、基于本发明具有的上述优点，可以使得本发明在临床上具有很好的经济和社 会效益，特别是对临床肿瘤靶向药物(如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、拉帕替尼)的个体化用药 有着很好的知道意义，可为临床精准用药提供重要的参考依据，降低药物不合理使用的情 形，降低全社会的医疗成本，节约社会医卫资源。

图1为临床同一样本检测时的Actin mRNA的PCR扩增曲线图；

图2为临床同一样本检测时的VEGFR 1mRNA的PCR扩增曲线图；

图3为临床另一样本检测时的Actin mRNA的PCR扩增曲线图；

图4为临床另一样本检测时的VEGFR 2mRNA的PCR扩增曲线图。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对 本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin(序列参见NCBI数据库公开的 人类全基因组序列)，使用Primer Premier 3.0及Methyl Primer Express v1.0软件，分别 设计特异性引物及探针，探针采用5'-FAM及3'-TRAMAMGB标记。

特异性引物及探针序列，如下表所示：

二、对照品选择

阳性对照品分别为含VEGFR1和VEGFR2基因的溶液；阴性对照品为不含VEGFR1和 VEGFR2基因的溶液；空白对照品为超纯水。

三、PCR反应液组成

包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括检测VEGFR1基 因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针；还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶 及超纯水。

其中，所述PCR buffer、dNTP、HS Taq酶及超纯水均购自大连宝生物(宝生物(大 连)工程有限公司)；所述超纯水为(Nuclease-Free Water)用DEPC(Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水；HS Taq酶(TaKaRa Taq Hot Start Version)是针对普通Taq DNA聚合酶灵敏度高，易产生非特异性条带的情况，专 门研制的高特异性嗜热DNA聚合酶产品。

四、PCR反应体系配置

实施例2：利用上述试剂盒进行临床肿瘤靶向药物(如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、拉 帕替尼)的个体化用药相关基因表达水平检测的方法

一、生物样本

本发明所采用的生物材料均来自广东大臻医学检验所。为2016年1-12月期间在广 东大臻医学检验所检测的100例剩余组织样本。

二、取待检测样本抽提mRNA，将样本mRNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA作为模板：

样本mRNA提取试剂盒为QIAGEN miRNeasy FFPE Kit试剂盒(石蜡包埋组织样本 RNA提取)(凯杰生物技术有限公司(上海))及QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒(新鲜组织样 本RNA提取)(凯杰生物技术有限公司(上海))；

样本mRNA逆转录试剂盒为Takara-PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒(宝生 物工程(大连)有限公司)。

1)取接收合格的临床检测样本(同一患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一 份)；

2)从mRNA提取试剂盒中取出提取mRNA所需要用到的试剂，提取正常组织样本和肿 瘤组织样本的mRNA；

3)提取的mRNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存；

4)从mRNA逆转录试剂盒中取出逆转录mRNA所需要用到的试剂，将步骤3)中提取的 mRNA逆转录为cDNA，并以cDNA作为模板。

三、提供本发明的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述模板 混匀；

1)从试剂盒中取出荧光定量PCR反应液、Taq酶、引物、探针，室温融化并振荡混匀 后，2000rpm离心10sec；

确定检测反应管数为n(n＝样本数+4管不同浓度梯度的标准品+阴性对照)按下述 单个检测反应体系配制表计算反应体系(40ul)各试剂的用量，加入一适当体积离心管，充 分混匀，2000rpm离心10sec后分装入每个PCR反应管中，38μl/管；注意避免产生气泡，盖好 管盖后转移至样本处理室。

单个检测反应体系配制表：

2)将样本RNA逆转录产物取出，置室温解冻，2000rpm离心10sec；在PCR反应管中分 别加入正常样本RNA逆转录产物、病变样本RNA逆转录产物及试剂盒中不同浓度梯度的标准 品2μl；阴性对照管中加入2ul灭菌超纯水；应将样本直接加入反应液内，避免样本粘附在管 壁上，盖紧管盖充分混匀后低速离心10sec，转移至扩增区。

3)将PCR反应管排好放入ABI7500荧光定量PCR仪内(美国AppliedBiosystems公 司)；设置PCR反应参数；

循环条件设置：

反应体系为40μl。仪器检测通道选择：荧光信号收集：Fam荧光素；收集温度：60℃。 (应严格确保同一患者的正常样本与病变样本的扩增条件一致)

四、PCR结果判定：

打开荧光定量PCR仪的结果分析软件，导入保存的实验数据；使用样点拟合法，进 行结果分析，构建标准品的标准曲线；进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的 荧光信号。阈值可根据仪器噪音容限来调整。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对 照品扩增曲线的最高点为准；避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为3-10个循环荧光信 号观察分析Ct值，如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为3-15个循环的荧光信号进 行结果分析。

质控标准：阴性对照的检测结果应为阴性；空白对照的Ct值应等于40.0；否则，此 次实验视为无效。标准曲线的相关系数大于0.99；否则，此次试验视为无效。

结果判断：

根据标准品构建的标准曲线，并根据样本的Ct值计算出样本的底物浓度。

比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，可以判断患者病变组织 样本中的mRNA表达水平。

比较结果 VEGFR1、VEGFR2mRNA表达水平

正常样本浓度低于病变样本浓度 病变组织mRNA为高水平表达

正常样本浓度高于病变样本浓度 病变组织mRNA为低水平表达

临床意义：

临床诊断发现，VEGFR1、VEGFR2基因mRNA表达水平对癌症患者接受靶向的疗 效具有明显的指导意义，高表达的患者使用索拉非尼、舒尼替尼时具有更好的疗效，低 表达的患者使用索拉非尼、舒尼替尼时疗效不明显。

基于本发明的临床样本mRNA表达水平检测结果，参见图1-图3，其中图1-2为临床 同一样本检测时的Actin mRNA的PCR扩增曲线图及VEGFR1mRNA的PCR扩增曲线图；图3-4为 临床另一样本检测时的Actin mRNA的PCR扩增曲线图及VEGFR 2mRNA的PCR扩增曲线图。

本发明提供的用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂 盒及方法的有益效果在于：

一、通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光探针，再配置成使用方便、检测结 果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、 检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用；

二、通过在引物设计及试剂盒中增加Actin基因为参考基因，基于该内参基因具有 mRNA表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行 校正，从而提高本发明方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠；

三、基于本发明具有的上述优点，可以使得本发明在临床上具有很好的经济和社 会效益，特别是对临床肿瘤靶向药物(如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、拉帕替尼)的个体化用药 有着很好的知道意义，可为临床精准用药提供重要的参考依据，降低药物不合理使用的情 形，降低全社会的医疗成本，节约社会医卫资源。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包 括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 广东大臻医学检验所有限公司

<120> 用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法

<130> 2017

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatccttcct aaacccaatg acttc 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacgtgatg cattgggtga tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgctccaac ccccgccacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaccagacaa gcggctacca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accggtttgc actccaatct c 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcactccga tgacacagac accaccg 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgacaggat gcagaaggag 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggatggagc cgccgat 17

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcaagatca ttgctcctcc tgagcgc 27