一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种由枯草芽孢杆菌诱变株分泌的凝乳酶的基因 序列及其蛋白序列与应用。

在食品加工领域，尤其是奶酪加工领域，凝固酶是必不可少的添加剂。凝乳酶不仅可 以使牛奶凝固，而且在奶酪成熟中具有不可忽视的作用(Kumar et al.，2005)。小牛皱胃凝乳酶 首次被发现是一个偶然的机会，人们用动物的皮保存牛奶时，牛奶有时会出现凝固，之后小 牛皱胃凝乳酶就被广泛应用在奶酪加工领域。自从1961起，由于世界乳酪业的高速发展，使 得小牛凝乳酶供应持续短缺，科学家不断寻能够替代小牛皱胃凝乳酶的蛋白酶。

之后，人们发现了一些蛋白酶具有类似的凝乳效果。这些凝乳酶广泛分布在不同的生 物和组织内(Chitpinityol and Crabbe，1998)。因此，由于各类蛋白酶具有不同的理化性质、水 解活性和凝乳活性，所以其用途就各不相同。人们通过向不同来源的奶液(奶牛，牦牛，山 羊以及骆驼)中添加凝乳酶，并采用不同的加工手段，最终获得口味各异的奶酪。

青藏高原(Qinghai‑Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原，气候环境恶劣，因此其拥 有许多独特的生物质资源。牦牛，就是其中最典型的一种(Zi，2003)。牦牛常年以丰富的、无 污染的草料为食，因此可以为当地居民提供大量的洁净的食物(牦牛乳，肉，酥油)。藏民 们通常会将牦牛乳加工成各种乳制品，牦牛奶酪就是其中最主要且最常见的一种。牦牛乳在 总蛋白含量，脂肪含量，酪蛋白组成方面与牛奶具有明显的差异(Brunner，1981；Li et al.，2010)， 尤其特别的是牦牛乳中含有大量的β‑casein，使传统凝乳酶的凝乳速度大大降低；其次，在牦 牛乳奶液的pH通常在6.0‑8.0之间，而传统的动物源和真菌源的凝乳酶在pH＜5.0情况下具有最 大活性，那么在中性环境下具有高凝乳活性的凝乳酶非常适合牦牛乳奶酪的生产；第三，高 温处理是牦牛乳制作奶酪之前的必要步骤，如果高温处理后立即添加凝乳酶，那么就缩短了 前处理时间，在奶酪制备过程中，高温环境不仅可以提高酶的反应效率，而且会减少酶的用 量，节约成本。然而，传统的凝乳酶通常只能在50℃以下的环境中保持活性的稳定(Ageitos et  al.，2007；Kumar et al.，2005；Nouani et al.，2009)，而在高温环境下会迅速失活，无法满足牦牛 奶酪加工的需要。综上所述，传统的凝乳酶不再适用于牦牛乳奶酪的生产过程。因此，亟须 开发出一种具有热稳定性的、高效凝结牦牛乳的凝乳酶。迄今为止，没有文献或专利报道过 具备牦牛乳特异性、热稳定性、并在pH6.0‑8.0保持高活性的微生物源凝乳酶，更没有明确这 类蛋白质或其编码蛋白质的基因序列。

Ageitos，J.M.，Vallejo，J.A.，Sestelo，A.B.，Poza，M.，and Villa，T.G.(2007).Purification and characterization of a  milk‑clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13.J Appl Microbiol 103，2205‑2213.

Brunner，J.(1981).Cow milk proteins：twenty‑five years of progress.J Dairy Sci 64，1038.

Chitpinityol，S.，and Crabbe，M.(1998).Chymosin and aspartic proteinases.Food Chem 61，395‑418.

Kumar，S.，Sharma，N.，Saharan，M.，and Singh，R.(2005).Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae： purification and characterization.Process Biochem40，1701‑1705.

Li，H.M.，Ma，Y.，Dong，A.，Wang，J.，Li，Q.，He，S.，and Maubois，J.‑L.(2010).Protein composition of yak milk.Dairy  Sci Technol 90，111‑117.

Nouani，A.，Belhamiche，N.，Slamani，R.，Belbraouet，S.，Fazouane，F.，and Bellal，M.(2009).Extracellular protease  from Mucor pusillus：purification and characterization.Int J Dairy Technol 62，112‑117.

Zi，X.(2003).Reproduction in female yaks(Bos grunniens)and opportunities for improvement.Theriogenology 59， 1303‑1312.

本发明的目的是提供一种凝乳酶基因。

本发明的另一个目的是提供一种本发明的基因编码的蛋白质。

本发明的所述的凝乳酶，是指来自可高产凝乳酶的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) YB‑3菌株的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。该菌种已经于2009年4月17日保藏于 中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，电话(027)68754052， 传真(027)68754833，E‑mail：cctcc@whu.edu，其保藏号为CCTCC NO：M209075。

本发明的再一个目的是提供一种本发明的蛋白质的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明对菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶进行了纯化：

(1)乙醇分级沉淀法初步纯化凝乳酶。将粗酶液置于冰浴中，经过30‑60％乙醇分级沉淀后， 12,000g 30min离心获得的蛋白沉淀复溶于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。经检测，沉淀 中的凝乳酶活力回收达到71.4％。(2)分子筛层析法进一步纯化凝乳酶。通过SDS‑PAGE电泳 分析，表明：经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42±1kDa；最终， 凝乳酶纯化倍数(表1)为9.5，回收率为19.1％，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二 烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±1kDa。

菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶具备牦牛乳特异性，可以用于生产牦牛乳乳酪 和牛乳乳酪中的应用。

这里所说的牦牛乳特异性是指，当以不同哺乳动物奶液为底物时，菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶对牦牛乳的凝乳活性最高，使牦牛乳最快凝固。

菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶在pH5.0‑8.0时，具有较高的凝乳活性，其最适 反应pH是6.0。该酶在pH5.0‑8.0放置一小时保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳活性大幅 度下降。该酶在40℃‑80℃内都具有较高的凝乳活性，在70℃活性最强，在0‑50℃放置一小 时后，仍然能保留初始活力的100％，较稳定。当温度大于等于60℃时，该酶活力随着放置时 间的变化迅速失活。

Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作 用。

丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂β‑Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑 制剂抑肽剂(pepstatin)对该酶活力几乎无抑制作用，而EDTA对该酶凝乳活性有显著抑制作 用。

本发明分离克隆了菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶，所述凝乳酶具有SEQ ID  NO：2所示的氨基酸序列。该凝乳酶的编码基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

LC/MS/MS(HPLC‑mass spectrometryanalysis)分析结果显示，该凝乳酶属于金属蛋白酶家族。 在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilis metalloprotease gene(Bacillus  subtilis金属蛋白酶基因)同源性为98.97％，有16个碱基不同。CDS区域编码基因对应的氨基 酸比对结果发现相似度为99.03％，有五个氨基酸不同。

本发明的优点为，1、该种凝乳酶，具有牦牛乳特异性，可以加速牦牛乳凝固，在 牦牛乳酪生产领域具有广阔的应用前景。2、该种凝乳酶具备热稳定性，并在中性环境下保 持高凝乳活性，所以与小牛皱胃凝乳酶相比，更适用于牦牛乳奶酪的制备。3、该酶也可以同 时应用于普通牛奶的凝乳。

图1是凝乳酶的SDS‑PAGE电泳分析，其中1‑标准分子量蛋白，2‑粗酶液，3‑乙醇分级 沉淀后凝乳酶液，4‑分子筛层析后凝乳酶液；

图2表示纯化凝乳酶的最适反应温度、pH和温度、pH稳定性，其中图2a表示凝乳酶的 最适反应温度，图2b表示凝乳酶的温度稳定性；图2c表示凝乳酶的最适反应pH，图2d表示凝 乳酶的pH稳定性。

图3表示Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶(MCE from Bacillus subtilis)对于牛奶(cow  milk)和牦牛奶(yak milk)的凝乳活性。其中以小牛皱胃凝乳酶Maxiren 1800和真菌源凝乳 酶MCE from Rhizomucor pusillus作为对照凝乳酶。

图4表示纯化Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶制备牛乳乳酪和牦牛乳乳酪

图5表示Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶的指纹图谱与Bacillus pumilus金属蛋白酶 (gi56405351)匹配结果。下划线为一致性序列。

实施例一

Bacillus subtilis YB‑3的培养及发酵液的制备。

Bacillus subtilis YB‑3的摇瓶发酵在100ml三角瓶中进行，其中包含30ml的发酵培养基。 发酵培养基由10g/L酪蛋白，3g/L牛肉膏，5g/LNaCl，5g/LNa2HPO4·12H2O组成，初始pH 7.0。 上述培养基接种1ml的对数期的菌液，37℃，150转/分钟振荡培养。发酵结束后，发酵液离 心5分钟除去菌体，离心力3020g，上清液即为粗酶液。

实施例二

凝乳酶蛋白水解活性测定和凝乳活性的测定。

凝乳酶测定方法参照IDF的方法157A：1997。

蛋白水解活性测定方法参照改良的Lorry法。

实施例三

菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的纯化程序。

首先，粗酶液经过30‑60％乙醇分级沉淀后，12,000g 30min离心获得的蛋白沉淀复溶 于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。

上述复溶的酶液通过Waters protein pak i‑125分子筛层析柱(7.5x300mm)进一步分 离纯化，上述层析柱预先用50mM pH6.0磷酸缓冲液(含有0.15M Na2SO4)平衡。分离过程 中，样品检测波长为OD280，流动相采用相同的缓冲液，流速1.0ml/min，每1.0ml洗脱液作 为一个组分，分部收集。

收集活性组分并通过Amicon Ultra(Milipore)超滤浓缩及脱盐。最终获得的酶浓缩液进 行SDS‑PAGE电泳分析(图1)。：

经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42±1kDa；最终，凝乳 酶纯化倍数(表1)为9.5，回收率为19.1％，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二烷 基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±1kDa。

表1Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的纯化步骤及结果

注：蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定。

实施例四

纯化的菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的酶学性质。

(1)最适温度、pH和温度、pH稳定性

通过测定菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶在10‑80℃时的凝乳活性来确定温度对 其凝乳活性影响。菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶热稳定性的测定过程如下所示：将浓 度相同的凝乳酶溶液在0到60℃水浴中温浴1小时，每隔10分钟测定酶溶液剩余凝乳活性。

通过测定菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶在pH范围5.0‑11.0的凝乳活性，确定其最 适反应pH。菌株Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的pH稳定性的测定过程如下所示：将等量的 凝乳酶溶于不同pH值(2.0‑12.0)的缓冲液中，室温静置1小时，测定剩余的凝乳活性。缓冲 体系：100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0‑6.0)，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0‑7.5)，100mM Tris‑HCl缓冲液(pH 8.0‑8.5)，100mM甘氨酸‑NaOH缓冲液(pH 9.0‑11.0)，and 100mM KCl‑NaOH缓冲液(pH 12.0).

如图2a所示，菌株Bacillus subtilis YB‑3产生的凝乳酶在pH5.0‑8.0时，具有较高的凝乳 活性，其最适反应pH是6.0。如图2b所示，该酶在pH5.0‑8.0放置一小时保持较高的稳定性，在 此范围外，其凝乳活性大幅度下降。如图2c所示，该酶在40℃‑80℃内都具有较高的凝乳活 性，在70℃活性最强。如图2d所示，在0‑50℃放置一小时后，仍然能保留初始活力的100％， 较稳定。当温度大于等于60℃时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。

(2)金属离子对凝乳酶活力的影响

通过将10mM的单价离子(Na+，K+，Li+)，二价离子(Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Mg2+， Co2+)和三价离子(Al3+)加入到反应混合液中，研究各种金属离子对Bacillus subtilis YB‑3 凝乳活性的影响。未加入任何金属离子的反应液作为空白对照(表2)。

Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作 用。

表2金属离子对Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的凝乳活性的影响

(3)蛋白酶抑制剂对Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的凝乳活性的影响

研究了phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)， β‑mercaptoethanol和pepstatin等酶抑制剂对纯化Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶凝乳活性的影 响。将纯化的Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶与不同浓度的上述抑制剂混合，于25℃静置 30min，测定反应液的凝乳活性。未加入抑制剂的酶液作为空白对照(表3)。

丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂β‑Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑 制剂抑肽剂(pepstatin)对该酶活力几乎无抑制作用，而EDTA对该酶凝乳活性有显著抑制作 用。

表三凝乳酶抑制剂对Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的凝乳活性的影响。

(4)Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的底物特异性实验

0.5ml纯化后的Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶(1mg/ml)分别加入到5ml的10％的牛 奶和复原牦牛奶中，于37℃反应并记录凝乳时间。除此之外，将1mg/ml小牛皱胃凝乳酶 Maxiren 1800chymosin和真菌凝乳酶MCE from Rhizomucor pusillus作为空白对照，重复上述操 作。如图3所示，当以牛奶为底物时，Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶源凝乳酶的凝乳活性略 低于对照；然而当牦牛奶为底物时，Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的凝乳活性比以牛奶为 底物高175％。这表明与传统的动物来源和真菌来源的凝乳酶相比，Bacillus subtilis YB‑3所产 凝乳酶对牦牛乳具有特异性。

实施例五

Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶在制备乳酪中的应用

乳品选择：巴斯德灭菌牛奶和牦牛奶，性状稳定。

发酵剂准备：纯化后的Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶。

乳酸菌准备：双歧杆菌，保加利亚乳杆菌。

奶酪制备：采用500ml离心瓶制备奶酪，离心瓶需经过110摄氏度灭菌10分钟，所有 步骤均采用无菌操作。离心瓶中加入400ml的32摄氏度上述脱脂牛奶(80％)，在牛奶中加入 2％(v/v)的发酵剂和3ml的凝乳酶。混匀上述溶液，放置与32摄氏度的水浴中，待牛奶凝固 后，继续放置于水浴中，以获得硬度适宜的凝块。用无菌不锈钢器具切割凝块，并用其缓慢 搅拌10分钟(10rpm)。之后，离心瓶用320g室温离心10分钟除去大部分水。用圆柱形器皿 收集凝块，重新在1400g下30摄氏度离心1小时。再取出凝块(除去大部分乳清)，再次在1400 g下30摄氏度离心30分钟。离心后，获得直径6厘米，厚2厘米的圆柱状凝块。上述凝块在32 摄氏度水浴中静置，直到pH达到5.2。之后在12摄氏度下，用35ml的无菌盐水(330g/LNaCl， pH 5.4)浇筑。5分钟后，除去盐水，将凝块放在无菌滤网上，除去乳清。如图4所示，制备 得到牛乳乳酪(左)牦牛乳乳酪(右)。

如图4所示，Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶制备的牦牛乳乳酪和牛乳乳酪颜和硬度 均达到要求。

Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶还可以用于除了奶酪之外的其它乳制品，例如酸奶和 干酪素等。

实施例六

Bacillus subtilis YB‑3所产凝乳酶的LC/MS/MS分析以及其编码基因的克隆程序。

纯化的凝乳酶经变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS‑PAGE)检测，切取蛋白质单一条带(42 kDa)经10ng/μl测序级修饰膜蛋白质酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)30摄 氏度、pH7.5，酶解30min～1h，采用基质辅助激光解析电离‑飞行时间质谱(MALDI‑TOF‑MS) (Thermo Fisher Scientific Inc.，MA，USA)获得该蛋白质的多个肽段序列，总计近150个氨基酸 长度，这些序列和质谱库中的Bacilluspumilus金属蛋白酶(gi56405351)序列相匹配，覆盖了 其44.67％的序列(图5)。

根据质谱测序结果和基因序列比对设计引物：

5′‑ATG GGT TTA GGT AAG AAA TTG TCT‑3′

5′‑TTA CAA TCC AAC AGC ATT CCA GGC‑3′

，并以Bacillus subtilis YB‑3总DNA为模板，进行PCR (94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃ 1min，30个循环；72℃5min；4℃保温)。扩增出1557bp的DNA片段，该基因的顺序如SEQ ID NO：1所示。

在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilis metalloprotease gene (Bacillus subtilis金属蛋白酶基因)同源性为98.97％，有16个碱基不同。

CDS区域编码基因编码514个氨基酸，该氨基酸的顺序如SEQ ID NO：2所示。

在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶氨基酸序列与Bacillus subtilis metalloprotease氨基 酸序列比对结果发现相似度为99.03％，有五个氨基酸不同。