一种蝗虫微孢子虫及其悬浮培养方法和应用

本发明涉及一株蝗虫微孢子虫，还涉及一种体外培养该蝗虫微孢子虫的培养基 和培养方法，本发明属于农业生物技术领域。

蝗虫是影响农牧业生产的害虫，在我国牧区，严重危害草场，为了杀灭蝗虫， 长年大量使用化学农药，但化学农药不仅费用昂贵，而且污染环境，造成畜产品中 农药残余，同时杀伤蝗虫天敌，造成落功能恶化。因此通过使用昆虫致病微生物 作为生物杀虫剂能够大大减少对自然环境的破坏。

微孢子虫是蝗虫致病微生物中的一种，微孢子虫病由微孢子虫引起，在感染的 宿主细胞中通过裂殖体、孢子期繁殖。由于微孢子虫在调节昆虫种发挥重要作用。 将蝗虫微孢子虫病原引入害虫种，引起微孢子虫疾病流行，有助于蝗虫间题的解 决,并有可能较长期发挥其自然控制的作用。

蝗虫微孢子虫是属于微孢子虫门(Microspora)、微孢子虫纲(Microsporea)、微孢 子虫目(Microsporida)、微孢子虫属(Nosema)的单细胞原生动物，营细胞内寄生生活。 典型阶段是休眠期的孢子，孢子内有一团孢原质和一根螺旋状盘绕的极丝，当寄主 吞食孢子后在中肠碱性消化液的作用下，孢子内部盘绕的极丝快速外翻，刺穿寄主 的围食膜和肠上皮，同时孢原质通过空心的极丝管注入寄主中肠细胞成为小变形 体。一部分变形体就在中肠细胞内发育，而大部分变形体通过血淋巴到达感受性 组织，随后经裂殖生殖产生分裂体，而后进入孢子形成期，经过双核产孢体和孢 子母细胞阶段，细胞进一步分化最后形成椭圆形的成熟孢子。微孢子虫体内不含有 线粒体。

蝗虫微孢子虫在自然界中的传播方式有两种，即水平传播和垂直传播。一是 由于寄主吞食了被孢子污染的食物或同类相残而使个体之间相互感染，二是由于组 织发生过程中，分裂体或产孢体感染了卵巢或孢子污染了卵的表面使病原体从亲代 直接传递到子代。蝗虫感染后主要表现为取食异常、生长不规律、互残、生殖力和 寿命降低。由于细胞破坏和营养消耗的结果导致虫体死亡。病症的大小取决于感 病的程度和范围以及受感染寄主的发育阶段。

在国内外蝗虫微孢子虫对脊椎动物的安全性曾被广泛研究，研究结果均表明： 蝗虫微孢子虫对脊椎动物是安全的，同时对蜜蜂亦不具感染性，因此，蝗虫微孢子 虫成为商品化的微孢子虫杀虫剂得以推广使用。

近20年来，在我国各地经常发现一些与典型的蝗虫微粒子病病原—蝗虫微孢 子虫(Nosemabombycis，Nb)的形态、大小不同的异型微孢子虫。这些异型微孢子 虫主要来源于野外亚洲飞蝗(LocustamigratoriaL.)，而且蝗虫微孢子虫病发生率 的上升与野外亚州飞蝗微孢子虫对蝗虫的交叉感染有关。调查发现很多种野外优势 蝗虫也具有很高的微孢子病自然感染率，其中从野外亚洲飞蝗体内收集到的1株微 孢子虫对蝗虫都具有一定的食下感染力。

微孢子虫传统分类方法主要依据其生活史、超微结构、血清学关系、宿主范围、 寄主组织特异性、孢子形态大小等。分子生物学技术的发展，从分子水平对蝗虫病 原进行系统进化研究和分类鉴定已得到广泛应用。微孢子虫的SSUrRNA、rRNAITS 基因序列具有高度保守性，因而成为开展微孢子虫的分子生物学分类和系统发育研 究的一种重要辅助工具。微孢子虫的SSUrRNA基因适合用于分析微孢子虫属间的 亲缘关系，在属的水平上确定微孢子虫的分类地位。rRNAITS在生物种和亚种间 变异较大，可用于微孢子虫种的水平上的分类。本发明对从新疆野外亚洲飞蝗体内 收集的1株微孢子虫进行生物学特性研究，基于SSUrRNA、rRNAITS基因序列进 行微孢子虫的分子系统发育分析，为其分类鉴定以及追踪蝗虫微孢子虫病的感染来 源，以及有效控制蝗虫危害提供依据。

蝗虫微孢子虫作为生物杀虫剂用于生物治蝗，首先要解决其生产问题，目前唯 一可靠的方法是活体繁殖，但是用蝗虫蝗蝻繁殖微孢子虫，面临许多挑战，如繁重 的劳动强度，需要蝗蝻的大量饲养、破碎、蝗蝻其他疾病的预防。而直接用适宜培 养基培养或适宜昆虫细胞培养蝗虫微孢子虫的体外培养方法尚处于探索阶段。

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种经分离获得的，且能够适用于体外 悬浮培养的蝗虫微孢子虫株系；

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种能够直接用于培养蝗虫微孢子虫 的培养基以及体外培养方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人从新疆阿勒泰地区布尔津县的野外亚洲飞蝗体内分离到1株微孢 子虫，研究发现其具有微孢子属(Nosema)的生物学特性：显微镜下观察虫体形状 均呈卵圆形，与蝗虫微孢子虫(Nosemalocustae)无明显差异。主要寄生在蝗虫的脂 肪体细胞和血细胞中，所有阶段核为双核。成熟孢子为卵圆形，新鲜涂片上的微孢 子虫大小为4.5±0.16μm×2.2±0.07μm(n＝10)，超薄切片上电镜观察大小为 3.3±0.06μm×1.4±0.07μm(n＝10)。超微结构和蝗虫微孢子虫最相似。微孢子生活史 大多阶段为双核，内含许多电子致密体。吉姆莎染的涂片和超薄切片面也偶然观 察到单核的孢子，在孢子发育后期有单核期。极丝与孢子长轴斜角为60-70度，极 丝倾斜角与蝗虫孢子虫有差异。超微结构表明分离的微孢子属于蝗虫微孢子属。

以蝗虫2日龄蝗蝻为宿主，观察该株微孢子虫在蝗虫(LocustamigratoriaL.)幼 虫中肠内的生活史发育过程。结果发现：其生活史的大多数阶段为双核，孢子发育 后期呈现单核，是进行有丝二分裂的结果。孢子裂殖期(sporogony)为双核，产生 单一形态的孢子。各个发育阶段都在宿主的细胞质中。孢子形态为卵圆形或卵圆柱 形，内壁厚度200–300nm，外壁厚度40–60nm。成熟孢子含3–12极丝圈，孢子后 端有大量空泡。在未成熟的孢子外，有电子致密物质包裹，侧面起伏，带有二侧壳 层的胞质体(紧密包裹在前端和后端的壳层)；胞质体位于双核中央或双核稍微靠 后处。极丝管圈数15–20，1-2行排不规则排列。该株微孢子虫孢子的内部结构与蝗 虫微孢子一样具有双核和相近的极丝圈数，但其极丝倾斜角60-70度，均比蝗虫孢 子虫小。该株微孢子虫的生活史和蝗虫孢子虫非常相近，都能在脂肪组织发现，生 活史发育起始期有单核阶段、含外壁和内壁的单一形态孢子。生活史所有阶段直接 和宿主细胞质接触，以二分裂方式增殖，最后形成双核成熟孢子。

分离的微孢子虫能与抗蝗虫孢子虫血清发生凝聚反应，说明与蝗虫孢子虫具有 相同的表面抗原。

分离的微孢子虫从形态、生活史观察初步判定属于蝗虫微孢子属。

分离该微孢子的SSUrDNA和蝗虫微孢子虫N.locustae以及Antonospora scoticae的SSUrDNA序列进行比对，发现该微孢子和蝗虫微孢子虫N.locustae之间 有5％的不同，和Antonosporascoticae有10％不同。微孢子虫SSUrRNA序列建立的 系统发育树证实该株微孢子虫属于Nosema属。SSUrRNA序列的相似性和遗传距 离分析表明这株微孢子虫与蝗虫微孢子虫的亲缘关系很近。rRNAITS基因序列的 相似性和遗传距离分析表明该株微孢子虫与蝗虫微孢子虫的相似性较高，分化度较 小。综合以上研究结果，推断该株微孢子虫与蝗虫微孢子虫为同属异种微孢子虫。

分离的微孢子虫的特征：(1)微小单位rDNA序列和其他微孢子属的簇差异小 于10％，与裳卷蛾变形微孢子虫(Nosema/Vairimorpha)的差异最大，达到50％； (2)在生活史中，单一孢子形态，具有幼孢子阶段；(3)形态特征：(i)出现发育裂殖 体和母孢子体(meront/sporont)阶段，在核内有电子致密物；(ii)孢子极丝圈3-12； 蝗虫虫微孢子属的极丝圈3-12；(iii)孢子后端有大量的空泡，蝗虫微孢子属空泡少； (iv)孢子外壁含电子致密物；(4)组织特异性，专寄生于上皮细胞；宿主为直翅目蝗 虫，痂蝗和蝗虫。

分离到蝗虫微孢子虫，经口接种感染蝗虫后，初期无明显外部症状，待蝗蝻发 育至老龄或成虫期，病虫体才开始由灰白变为红褐,严重感病虫体呈粉红， 腹部发软，略肿胀，有时皮脱不下来，翅皱缩。后期病虫表现发育迟缓、生育 期延长、体形缩小、最后死亡。解剖后只从脂肪体内分离到孢子。可见微孢子虫主 要感染脂肪组织。逐日连续解剖经接种的蝗虫病虫尸体，3龄接种到5日龄多数可 分离到孢子，3日龄接种到成虫期多数也可分离到孢子。5日龄接种在成虫后期能看 到孢子。最早于接种后7-10天开始产生孢子，2周左右可见成熟孢子，25天左右 孢子大量生成。成熟孢子圆形，大小不整齐，平均大小为4.5×2.2μm。表明该微孢子 虫可感染蝗虫，并在其体内增殖产生大量孢子。起初蝗虫增殖寄主在初期单头产孢 量不高，但是针对其增殖特性，通过摸索出适宜的病原接种浓度、寄主虫龄和收获 时间后，能够使单头产孢量提高到6×109个孢子以上。采用30cm×40cm×50cm的 养虫笼单笼可养500-700头，20个饲养笼可饲养蝗虫10000-140000头，平均单头孢子 产量由4×109个孢子提高到6×109个孢子。

将上述本发明发明人从亚洲飞蝗中分离得到的蝗虫微孢子虫，在蝗虫体内传至 10代后，然后采用培养基体外培养传至10代，得到的蝗虫微孢子虫命名为XJ-20， 分类命名为蝗虫微孢子虫(Nosemalocustae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏时间是：2015年11月3日，保藏地址是北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCCNo11170。

用培养基培养体外培养蝗虫微孢子虫取决于适宜培养基的成份是否满足蝗虫 孢子虫的生活史不同发育阶段要求。

当分离后的蝗虫微孢子虫在用蝗虫体内传至10代、鉴别后，合成和选择适宜 培养基装入培养瓶或生物反应器，培养30-50天，使微孢子数达到一定数目，然后 稀释继续培养，以达到使用要求浓度。

进一步的，本发明还提出了所述的蝗虫微孢子虫在制备生物杀虫剂中的用途。

本发明的另一方面是提供了一种能够在体外培养蝗虫微孢子虫的培养基和方 法，使微孢子虫在培养器皿的表面能够完成其生活史并进行分裂增殖，进而达到繁 殖增殖的目的。

本发明发明人通过对微孢子虫的生活史各步骤检验和分析，选择和调节培养基 的组成，提出了该用于微孢子虫体外培养的培养基，其中含某些蛋白提取物和粘度 补充试剂，以适合蝗虫微孢子虫完成生活史和培养。

发明人检测和分析了不同细胞外基质包被的细胞培养器皿是否适合微孢子虫 的生活史和增殖，结果发现培养器皿表面包被昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁 质时，增强了微孢子在培养器皿表面上的粘附性，并能够促进微孢子的分裂增殖。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于培养蝗虫微孢子虫的培养 基，所述培养基包含：

1)无机盐或其混合物、糖或其混合物、氨基酸或其混合物以及维生素或其混 合物；

2)作为细胞外基质的昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁质；

3)蛋白提取物；以及

4)作为粘性补充剂的聚乙烯吡咯烷酮，优选为聚乙烯吡咯烷酮K-90；

将各成分充分溶于纯水中，调节培养基pH值为6.0-7.0，优选6.2-6.5，无菌过 滤后即得；

其中，所述的昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁质的含量为0.01-10g/L培 养基，较优选为0.1-10g/L培养基，最优选为1-10g/L培养基；

其中，所述的蛋白提取物包含水解乳蛋白、酵母提取物以及胰蛋白磷酸盐肉
汤，其含量均为500-3000mg/L培养基，较优选含量为1000-3000mg/L培养基，
最优选含量为1000-2000mg/L培养基；

其中，所述的聚乙烯吡咯烷酮的含量为100-1000mg/L培养基，较优选为 100-500mg/L培养基，最优选为200-500mg/1L培养基。

在本发明中，昆虫源性、水溶性的几丁质(以下简称水溶性几丁质)，进行了 去乙酰化的唯一修饰。该几丁质可取之任何昆虫，优选蝗虫蜕掉的皮。

根据本发明，所述的水溶性几丁质有以下几种获得方式：

为制备作为细胞外基质使用的昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁质，选择亲 水性的几丁质，优选内部表面积为180m2/g或更大的几丁质。从蝗虫蜕皮提取的 几丁质有较大内部面积和高吸热性。因此蝗虫蜕皮、特别是东方飞蝗蜕皮可作为细 胞外基质使用。

用1N盐酸浸泡蝗虫蜕掉的皮，在有氮气的环境中，100℃处理20分钟。然后 倒掉盐酸，用1N氢氧化钠溶液，80℃处理36小时移去蛋白质，制成几丁质或几丁 壳。为制备水溶性几丁质，室温下用碱溶液溶解几丁质，高度粘性碱几丁质水溶液 在室温下放置长时间使随机除去乙酰基团，去乙酰化达45-55％时，得到的去乙酰化 达几丁质(即壳聚糖)溶于水。

上述水溶性的几丁质用碱或酸处理可除去乙酰基团，涉及加热。也可用一些反 应如Clemmenssen还原反应除去乙酰基团。本发明优选用一定浓度碱处理，且保 证只有去乙酰化修饰，而没有其他如羟甲基化、甲苯磺酰化的化学修饰。去乙酰化 在均一的可溶性的碱溶液中进行。采取上述方法使去乙酰化达到40-60％，优选 45-50％而使几丁质和水有高亲和力。

获得的昆虫来源水溶性几丁质经过唯一的化学修饰去乙酰化，含40-60％的几丁 质，有40-60％壳聚糖结构。换句话讲，昆虫源水溶性几丁质经过唯一化学修饰去乙 酰化对水有了高度亲和性，40-60％是几丁质，40-60％是壳聚糖。由于蝗虫微孢子虫 表面带有负电荷，微孢子虫能够吸附在壳聚糖正电荷氨基上进行分裂和复制。

其中水溶性几丁质的使用方法有两种：

1、将得到的水溶性几丁质按0.01–10g/L溶于水，倒进体外培养器皿，使包被 到微孢子虫的培养面，自然晾干。然后加入本发明培养基中的其他成分用于微孢子 虫培养；在本发明中，0.5毫升几丁质水溶液包被细胞培养瓶表面积优选为200平 方毫米。

2、将得到的水溶性几丁质按0.01–10g/L溶于培养基，将含有水溶性几丁质的 培养基加入到体外培养器皿中用于微孢子虫培养。

在本发明中，微孢子虫体外培养器皿包括细胞培养瓶、转瓶、培养皿、培养碟， 培养器皿表面包被水溶性几丁质，通过水溶性几丁质微孢子虫粘连在细胞培养瓶上 可进行生长和分裂。

在本发明中，优选的，所述的蛋白提取物还进一步包含胎球蛋白、细胞素C、 肌酐以及牛血浆白蛋白V；

其中，胎球蛋白的含量为1-100mg/L培养基，较优选为1-50mg/L培养基， 最优选为5-15mg/L培养基；细胞素C的含量为1-500mg/1培养基，较优选 为1-100mg/L培养基，最优选为10-100mg/L培养基；肌酐的含量为1-500mg/L 培养基，较优选为1-200mg/L培养基，最优选为10-200mg/L培养基；牛血浆白 蛋白V的含量为1000-10000mg/L培养基，较优选为100-10000mg/L培养基，最 优选为1000-10000mg/1L培养基。

在本发明中，优选的，所述的无机盐或其混合物、糖或其混合物、氨基酸或其 混合物以及维生素或其混合物来源于购买得到的已知无机盐、糖、氨基酸、维生素 含量的昆虫细胞培养基，在此基础上加入2)-4)中的组分。

在本发明中，优选的，所述的无机盐或其混合物中包含NaH2PO4·2H2O， NaHCO3，KCl，CaCl2·2H2O，CuCl2·H2O，CoCl2·6H2O，FeSO4·7H2O，MgCl2·4H2 O，MgSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，NaCl，NaH2PO4·4H2O，(NH4)6(Mo7O24)·4H2O 以及ZnCl2中一种或两种以上；

所述的糖或其混合物中包含D-葡萄糖，果糖，蔗糖，苹果酸，alpha-酮戊二酸， 琥珀酸，延胡索酸以及麦芽糖中的一种或两种以上；

所述的氨基酸或其混合物中包含L-alpha-丙氨酸，beta-丙氨酸，L-盐酸精氨酸， L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨 酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-胱氨酸二钠，L-羟脯氨酸，L-盐酸赖氨酸，L-甲硫 氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，DL-氨酸，L-苏氨酸，L-氨酸，L-酪氨酸，L- 酪氨酸二钠，L-缬氨酸以及L-组氨酸中的一种或两种以上；

所述的维生素或其混合物中包含生物素，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，I-肌醇， 烟酸，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12以及对氨基苯甲酸中的一种 或两种以上。

在本发明中，优选的，所述的培养基中还进一步包含体积百分含量为10-30％ (v/v)的动物血清，所述的动物血清为胎牛血清或蝗虫淋巴液。

在本发明中，优选的，所述的培养基含有以下成分：

1)昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁质10g/L；

2)蛋白提取物：

包含水解乳蛋白1500mg/L，酵母提取物1500mg/L，胰蛋白酶磷酸盐肉汤
1500mg/L，胎球蛋白10mg/L，细胞素C50mg/L，肌苷100mg/L以及牛血清
白蛋白V5000mg/L；

3)粘度补充剂聚乙烯吡咯烷酮K-90250mg/L；

4)无机盐混合物：

包含NaH2PO4·2H2O507mg/L；NaHCO3300mg/L；KCl1720mg/L； CaCl2·2H2O750mg/L；CuCl2·H2O0.1mg/L；CoCl2·6H2O0.03mg/L；FeSO4·7 H2O0.28mg/L；MgCl2·4H2O1140mg/L；MgSO4·7H2O3269mg/L；MnCl2·4 H2O0.01mg/L；NaCl1425mg/L；NaH2PO4·4H2O580mg/L；(NH4)6 (Mo7O24)·4H2O0.02mg/L以及ZnCl20.02mg/L；

5)糖混合物：

包含D-葡萄糖2917mg/L；果糖20.9mg/L；蔗糖11865mg/L；苹果酸306 mg/L；alpha-酮戊二酸169mg/L；琥珀酸27.4mg/L；延胡索酸25.2mg/L； 麦芽糖500mg/L；

6)氨基酸混合物：

包含L-alpha-丙氨酸131.5mg/L；beta-丙氨酸234mg/L；L-盐酸精氨酸692 mg/L；L-天冬酰胺797mg/L；L-天冬氨酸797mg/L；L-半胱氨酸10.5mg/L； L-谷氨酸1000mg/L；L-谷氨酰胺750mg/L；甘氨酸371mg/L；L-组氨酸1142 mg/L；L-异亮氨酸396mg/L；L-亮氨酸157mg/L；L-胱氨酸二钠60mg/L； L-羟脯氨酸400mg/L；L-盐酸赖氨酸610mg/L；L-甲硫氨酸521mg/L；L-苯 丙氨酸562mg/L，L-脯氨酸396mg/L；DL-氨酸559mg/L；L-苏氨酸173 mg/L；L-氨酸91.5mg/L，L-酪氨酸21mg/L；L-酪氨酸二钠，180mg/L； L-缬氨酸，292mg/L以及L-组氨酸1142mg/L；

7)维生素混合物：

包含生物素0.123mg/L；D-泛酸钙0.89mg/L；氯化胆碱10.85mg/L；叶 酸0.125mg/L；I-肌醇0.285mg/L；烟酸0.165mg/L；盐酸吡哆醇0.285mg/L； 核黄素0.125mg/L；盐酸硫胺素0.125mg/L；维生素B120.12mg/L以及对氨 基苯甲酸0.245mg/L；

8)体积百分含量为20％或30％的胎牛血清；

调节培养基pH至6.3，无菌过滤后即得。

在本发明中，所述的水解乳蛋白、酵母提取物、磷酸胰蛋白肉汤可从Difco
公司购买获得。胎球蛋白来自胎牛血清，细胞素C来自马肝，可从Sigma公司购
买。已知无机盐、糖、氨基酸、维生素含量的昆虫细胞培养基可以从商用公司购买，
并加入以上成份。

研究表明，本发明的培养基可培养蝗虫微孢子虫，特别适合蝗虫的胚胎组织、 脂肪体组织、生殖或卵巢组织和消化系统组织，这些是蝗虫微孢子虫完成生活史且 含有丰富的组织，因而用培养基模拟蝗虫组织、细胞发育的液体营养环境可培养繁 殖蝗虫微孢子。

本发明的再一方面是提供一种蝗虫微孢子虫的悬浮培养方法，其包括以下步 骤：

(1)向生物反应器中加入权利要求2-7任一项所述的培养基，然后加入干燥情 况下平均直径为50-300μm的微载体，微载体的起始终浓度达到0.1-3g/L；

(2)向步骤(1)得到的含有微载体的培养基中，加入蝗虫微孢子虫，所述的 蝗虫微孢子虫，命名为XJ-20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号为CGMCCNo.11170；

(3)调节控制参数pH7.0-7.2，PO2为25％，温度为28-30℃，维持不低于40 rpm进行搅拌，每隔10天用新鲜的步骤(1)中的培养基换液；

(4)在培养的第50天，微载体沉降分离后，向截留的培养液中加入含胰蛋白 酶的柠檬酸钠溶液，适度搅拌，每隔15-30分钟显微镜下观察确认孢子虫脱离微载 体的情况，用胰酶抑制液终止反应，即得；

其中，优选的，培养用生物反应器的容积为3-30L，优选为10L。

用蝗虫传代所分离的蝗虫微孢子经过繁殖，无菌操作分离微孢子，加入装有本 发明培养基的细胞培养瓶，培养条件为温度28-30℃，培养时间为50天，期间完成 分裂增殖的微孢子虫移入新的装有本发明培养基细胞培养瓶亚培养扩增。通过培养 和亚培养，微孢子虫数目不断增加。经微载体悬浮培养的微孢子虫数能够达到起始 培养的60倍。

图1为不同工作体积生物反应器培养微孢子虫生长曲线。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1蝗虫微孢子虫分离和初步鉴定

1材料与方法

1.1微孢子虫的分离和纯化

野外亚洲飞蝗微孢子虫从新疆维吾尔自治区阿勒泰地区布尔津县分离获得，试 验室饲养的3日龄蝗蝻(n＝50)，室温30±1℃，以玉米叶掺入少量麦麸为饲料，将 分离的微孢子虫感染组织匀浆制成孢子悬液，用血细胞计数板计数悬液的微孢子 虫，每只喂食105或107孢子，涂于玉米叶上，晾干后饲喂4-5龄蝗蝻。取食24小 时后，更换新鲜玉米叶。病虫饲养在装有4瓦日光灯、昼夜光照，温度为30±1℃ 的接种室内。待蝗蝻发育至老龄或成虫期，收集病死虫尸，加入适量蒸馏水捣碎， 差速离心，得沉淀孢子。将孢子再悬浮于蒸馏水中，置于-20℃冰箱中保存备用。

蝗蝻用磷酸盐缓冲液(Phosphate-bufferedsaline，PBS)挤压，取2毫升悬液放 入2毫升含有25％、50％、75％Percoll的PBS梯度液上，2000g离心30min，从管 低收集孢子虫，反复用PBS离心洗涤，放入无菌蒸馏水，匀质液用吸附棉过滤，900g 离心5分钟，反复用蒸馏水离心洗涤。

1.2微孢子虫的大小和形态观测

蝗虫微孢子虫购自美国M&RDurango公司。蝗虫样本取自2013年新疆地区牧 场，样本数n＝315，腹部切开除去组织和器官样本。

在相差显微镜下观察。除去组织和器官的新鲜蝗虫用研磨器匀浆，检测是否感 染或制备成转染的微孢子虫悬液。新鲜的微孢子悬液也可从疑似感染的蝗虫的粪中 制备。这二种悬液可用蒸馏水或1/4离子强度的Ringer’s溶液混合在显微镜下直接 观察，也可用甲醇固定、吉姆莎染或CalcoXuorWhiteM2R染或CalcoXuor和 DAPI双重染观察核。

为进行投射电镜观察，感染组织用2.5％(V/V)戊二醛和0.1M可卡酸(pH7.4)4℃ 固定1小时，再用1.％(W/V)OsO4固定后，1％醋酸铀染，样品包埋在Spurr’s树 脂中，用浓度递增的丙酮脱水。为病理观察，0.5–1μm切片放置于玻片，用亚甲蓝 染，用尼康E—600显微镜观察。如进行投射电镜观察，超薄切片用柠檬酸铅染 ，用HitachiH—300和JEM100CX显微镜在80–100kV观察。

1.3微孢子虫与蝗虫微孢子虫的血清学关系测定

单克隆抗体包被的胶体珠M11和M12购自日本东京Yakult公司。8微升胶体 珠和8微升孢子悬液混合滴到玻片孔中，2对照玻片只含孢子液和包被珠。当50％孢 子吸附珠凝集成块，则为阳性。90％孢子不吸附珠子，则为阴性。

将蝗虫微孢子虫用9g/LNaCl溶液稀释成浓度为1×109个/mL的孢子液，加福 氏完全佐剂注射免疫雄性家兔，1×109个/mL孢子液加弗氏不完全佐剂在第一次免 疫2、3周后各加强免疫一次，最后免疫的1周后取血制取Nb免疫抗体血清。试验时 用9g/LNaCl溶液按1∶32体积比稀释。用玻片凝集法将1株微孢子虫的孢子液与 抗Nb血清进行血清学反应，观察凝聚反应情况，同时以正常家兔血清作阴性对照。

1.4微孢子虫的生活史观察和感染蝗虫

取接种15-20天的感病蝗蝻，解剖取出小块脂肪体，涂于盖片上，用95％甲醇 固定，吉姆莎染，光镜观察。将提纯的孢子稀释至1×108孢子/mL，滴于盖片上， 用25％戊二醛固定，乙醇系列脱水、喷金，H600(Hitachi，Tokyo，Japan).扫描电镜 观察拍片。取感病后期脂肪组织，用戊二醛一饿酸双固定，环氧树脂包埋，LKB超 薄切片机切片，醋酸铀一柠檬酸酸铅双染，AE1EM-801透射电镜观察拍片。

将孢子液稀释至lx107孢子/毫升，饲喂2-5日龄蝗蝻，每组处理30头，逐日统 计病死虫数，再将病死虫尸分别捣碎，制水压片，逐个镜检，查出有孢子者为感病 虫尸。

孢子量测定:对每头病死虫尸提取孢子液，纯化后用血球计数板计数。

用吉姆萨染方法观察。来自野外亚洲飞蝗的5微孢子虫和蝗虫微孢子虫的发育生 活史。用日2龄东亚飞蝗蝻接种1株野外亚洲飞蝗微孢子虫，于感染后不同时间 取中肠后部组织涂片，用95％甲醇固定3min，Giemsa染10min，油镜下观察， 拍照。

1.6野外亚洲飞蝗微孢子虫的分子系统发育分析

1.6.1孢子虫DNA制备

含5×106孢子悬液900g离心2min，沉淀重悬于5μl蒸馏水和200μlofSTE液 (100mMNaCl、100mMTris–HCl、pH8.0，1mMEDTA)中，涡旋震荡，800g离心1 min。沉淀用150mg玻璃珠(SigmaG-8772，425–600μm直径)和150μlSTE液涡旋震 荡30秒，加入2微升浓度10毫克/ml蛋白酶K溶液，55℃孵育2小时，放入95℃孵育5 min，放入离心管17，500g离心2min，10倍体积上清液加入1倍体积3M醋酸钠， 乙醇/酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA、再用乙醇漂洗，溶于TE缓冲液(10mMTris–HCl， pH8.0，1mMEDTA)。

1.6.2孢子虫PCR扩增SSUrRNA

引物：

(1)KAI-01＝5’-GAATTCAAGCTTGTAGTAGAGACCCAAATATC-3’和KAI-02 ＝5’-GAGCTCGCATGCACTGTTCAGATATGGTCCTTATCG-3’

(2)VN001F＝5’-CTGCAGGTACCACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’和 VN001R＝5’GAGCTCGCATGCGGTTTACCTTGTTACGACTT-3’，

KAI-01和KAI-02是孢子虫小亚单位rRNA引物(smallsubunitrRNA，SSU rRNA)。VN001F和VN001R是SSUrRNA保守序列引物。PCR反应体积100微升， 含各自引物5pm，0.2mM各dNTP，2.5单位TaqDNA多聚酶，10ngDNA模板，PCR 缓冲液(10mMTris–HCl、pH8.4，50mMKCl、1.5mMMgCl2)，滴入矿物油封闭， 在热循环仪(Astec，ProgramTempControlSystemPC-700)进行40个循环反应，反 应条件：94℃1min，55℃2min，72℃30s。

3-μlPCR产物与5μlTE、2μl含0.5％溴酚蓝40％蔗糖液混合，加入0.7％的琼脂 糖胶电泳，DNA标记(购自宝生物TakaraShuzoCo公司.)同时电泳。电泳胶用溴乙 锭染。

以引物ILSUF(5'-TGGGTTTAGACCGTCGTGAG-3')和 S33R(5'-ATATAGCGTCTACGTCAGGCAG-3')用于微孢子虫rRNAITS序列的扩 增，反应体系为25μL。反应条件为：94℃预变性8分钟，94℃1分钟，56℃分 钟，72℃1分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产 物。将1株野外亚洲飞蝗微孢子虫SSUrRNA序列和rRNAITS序列的PCR产物送 大连宝生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.6.3孢子虫SSUrRNA测序

-20℃贮存的微孢子含108孢子/ml，融化移入1.5-ml的微离管，加入

150μLTAE(40mMTris–acetate，2mMEDTA)重悬，加入150mg玻璃珠(0.5mm 直径)，在玻璃珠振荡器(购自美国Biospec公司)摇动50s，加热3min，取1-5μL作 为标准PCR的模板。16SrRNA基因用V1f和1492r引物扩增。扩增条件：94℃ 变性3min，35次循环：94℃45s，45℃30s，72℃90s。72℃延伸5分钟。. 分离PCR产物进行测序。

V1f(18f)(5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3’)；1492r(5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’)；350f(5’-CCAAGGA(T/C)GGCAGCAGGCGCGAAA-3’)；350r (5’-TTTCGCGCCTGCTGCC(G/A)TCCTTG-3’)；530f (5’-GTGCCAGC(C/A)GCCGCGG-3’)；530r(5’-CCGCGGC(T/G)GCTGGCAC-3’)； 1047r(5’-AACGGCCATGCACCAC-3’)；1061f(5’-GGTGGTGCATGGCCG-3’).以 上PCR产物在DNA序列分析软件上拼接，获得SSUrDNA全基因组序列。

1.6.4系统发育分析

将分离微孢子虫SSUrRNA基因序列与基因库登录的N.locustae(AY305324)、 N.whitei(AY305323、)Antonosporascoticae(AF024655)、Vairimorphanecatrix (Y00266)序列进行比对，用MEGA5软件的邻位相连(Neighbor-Joining)构建各种 野外昆虫微孢子虫SSUrRNA的系统发育树。用SSUrRNA基因序列作为外，进 行1000次重复，再分别将分离微孢子虫的SSUrRNA基因序列和rRNAITS基因 序列与从NCBI上下载的部分同源序列进行相似性和分化度分析。

2结果

脂肪体是初次感染位点，也可在雌性、雄性性腺、血细胞中发现，也可在心包 腔观察到微孢子虫。微孢子虫生活史中，有许多和宿主细胞反应的性态，从裂殖体 期到孢子形成，微泡、宿主内质网潴泡、线粒体和寄生虫靠近。在裂殖体期，可见 宿主微管和寄生虫质膜相连。当进入第二裂殖体期，在宿主细胞质出现“管状结 构”。在裂殖体期，寄生虫(孢子)的大量复制导致宿主细胞体积减小和核的萎缩。 从裂殖体期向孢子期转化、孢子形成引起脂肪组织进行式损伤，最后脂肪体被大量 孢子取代。

2.1分离微孢子虫形态、发育过程以及超微结构

在新疆地区2011-2014年收集了592头蝗虫蝻，2011年的流行率为80.6％(n＝151)； 2012年流行率70％(n＝40)；2013年流行率53.8％(n＝300)；2014年的流行率58.8％ (n＝101)；微孢子虫大量存在于感染蝗虫的粪便中。

这些微孢子虫孢子与蝗虫微孢子虫具有相同的折光性，但孢子形状均偏长，呈 长卵圆形，与蝗虫微孢子虫无明显差异。分离微孢子虫在蝗虫中肠内的生活史的各 个阶段的形态基本相同，发育几乎同步:感染20h后可见球形双核裂殖体，之后裂 殖体以二分裂方式增殖，48-72h为分裂旺盛期，裂殖体分裂成孢子芽母细胞，孢 子芽母细胞二分裂产生2个双核孢子芽，最后形成2个双核的成熟孢子。该株亚洲 飞蝗微孢子虫的发育周期为96h左右，比蝗虫微孢子虫的发育周期(84h)稍长，发 育模式符合Nosema属的特征。

在感染蝗虫幼虫涂片中，主要是圆形的双核期孢子。卵圆形，新鲜孢子大小 4.5±0.16μm×2.2±0.07μm(average±SE，n＝10)，甲醇固定和吉姆莎染孢子大小 4.3±0.20μm×2.00±05μm(n＝10)。涂片使极丝脱去，脱去极管的最大长度200μm。 DAPI染展示了孢子和孢原体中核的排列。在吉姆莎染的涂片上多为双核时期 的孢子，有未分裂的4对核的孢子，偶然有密度较大的一核细胞、2核或4核期的孢 子。孢子母细胞和孢子的区别在于大小，孢子母细胞较长。

电镜观察分离孢子，孢子在发育期为圆形或卵圆形细胞，直径为4.4±0.18μm(n ＝13)，处于发育期的孢子通常被单一的细胞质膜包裹(厚度7-9nm)，与其他时期 的孢子一样，和宿主细胞质直接接触。裂殖体(meront)细胞质含许多核糖体和几 个粗面内质网潴泡，似乎从核周腔延伸而来。分裂间期的双核有均一的核质，且核 膜上有核孔。裂殖体发育期(Merogony)是分离孢子生活史中主要增殖或繁殖期。 孢子细胞分裂以前，裂殖体拉长，在核膜上出现微管组织中心(圆锥状的斑。二核 孢子细胞染体数不超过8个。由于核分裂迟于细胞质分裂，所以可常见拉长带有 双核的孢子。

在孢子虫中胞质内主要是空泡，含电子密度高的物质和折叠的膜系统。在孢子 体内有简单的质膜和有表面外衣的早期孢子。核含单一密度的染物质，在分裂时 有电子密度螺旋空斑。孢子母细胞呈圆形含大量内质网液泡。孢子母细胞带有极管 的孢子有2种排列。一些不规则簇上有3-12个极丝圈，在切面上显示20长度的“纤丝”， 有些孢子母细胞含单一16个极丝圈。在分裂期的4核孢子少见，双核期孢子占大多 数。揭示核分离后胞质立即分裂。子分裂体孢子在胞外为圆球状，在胞内长圆形， 指出分裂子孢子质膜的可塑性。子分裂体孢子胞质可不均一染，有时染重，有 时染轻。和在胞质的清亮区域，显示为压缩的红点或染体组装的线性迷团。

位于孢子中部有2个细胞核，两侧为内质网。孢子后端有一个后极孢，孢子 前端极丝两侧有称为极体的多层膜状结构。在刚刚死亡的虫体内控内可观察到很多 释放极丝的孢子。极丝从孢子一端翻出，长度为120-130微米，不少极丝前端有一 小块孢原质。

透射电子显微镜观察分离的微孢子虫的内部结构均与蝗虫微孢子虫一样，具有 沿纵轴方向排列的双核，孢子壁均由3层构成，从外至内依次为外壁、内壁和原生 质膜:外壁较薄，着深；内壁较厚，约占孢子壁的3/4，着浅；质膜层薄，着 深。各微孢子虫的极丝圈数和极丝倾斜角大于30度。极丝圈数在3-12圈之间，极丝 倾斜角但其极丝倾斜角60-70度，和蝗虫孢子虫无显著差异。

经逐渐转化，裂殖体变成第二裂殖体。这个时期为单核，可进行同性孢子融合。 这个时期没能观察到圆锥状斑和是否发生有丝分裂，孢子细胞大小和裂殖体相同， 但和裂殖体有区别，区别在于：(i)在核质中有直径50-100nm电子致密颗粒，起初 在双核孢子细胞出现，后在单核和双核孢子中都出现颗粒。(ii)孢子细胞质中大量 光滑内质网潴泡、空泡、薄片层堆积。iii)在内质网潴泡附近有泡状样膜薄片层堆积， 直径30-60nm。

靠近核，紧密排列的小微管组成1-2个大圆弧结构。小微管通常被光滑内质网 包裹。这个时期所有裂殖体经历细胞分裂，不完全分裂的细胞和孢质含2-4个单核， 而不是双倍核。核膜界限不清，也无圆锥形斑、也无微管和染体。偶尔可以观察 到位于内部核糖体和内质网潴泡。转化期的质膜厚约10-12nm，有不太规则的外翻 结构，起初观察到质膜外表面电子致密不规则的“补丁”，后形成电子致密物质膜包 裹寄生物细胞，这意味向孢子期转化。孢子母细胞(Sporonts)大小为 4.73±0.17×3.56±0.19μm(n＝12)，膜为电子致密物质，厚约30nm(外壁)，形状拉长延 伸，细胞二端有堆积的粗面内质网。该时期的双倍体超微结构和裂殖体(Meront)类 似。孢子母细胞进行二分裂。

二分裂后的细胞逐渐转化成幼小孢子。小微管(CSTs，clustersofsmalltubules) 占据细胞的大部分，最后分化成微管网酪形成特别微孢子跨高尔基体。在跨高尔基 体上孢子期的极丝蛋白成熟。幼小孢子大小5.74±0.14μm×2.12±0.08μm(n＝5)，进 一步拉伸和极化。极化是极丝顶端出现和细胞后端电子致密极丝物组成的小囊泡， 是幼小孢子区别其他时期孢子的特征。在幼小孢子胞质中除了极丝前体，大量的空 泡、管状网酪、微管和扩展的内质网包围中央位置的双核。起初，幼小孢子被质膜 和电子致密物(外壁)包裹。幼小孢子外壁在此期是多层结构，最少三层。未成熟 孢子特征：突然缩小，在外壁和质膜之间增加额外层，外壁上有许多管状结构，用 还原性锇染后端有电子致密体和未成熟极管螺旋。成熟孢子的额外层转化成电子 透明的末端孢子。

孢子固定、投射电镜下，孢子大小为3.3±0.06μm×1.43±0.07μm(n＝10)。电子透 明末端孢子厚约0.3–0.5μm。在孢子顶端末端孢子厚度减小到0.05–0.2μm.。外壁 3-40nm厚，在二电子密度层含一电子透明层。在外壁下有10-12nm厚的质膜。孢质 体释放，在空的孢子膜里仍含细胞质膜。极丝呈现多层结构，不规则排列成1-2层， 含15-18圈。极丝长度为孢子的2/5，极丝与孢子长轴斜角为60-70度。极质体前端腔 室区，含紧密排列的膜；后端含疏松排列的膜且后端无空泡。释放的胞质体为圆形， 在涂片上的大小为3×6μm。在胞质体内有2独立的核，胞质电子透明并含圆形的膜。

2.2野外亚洲飞蝗微孢子虫的血清学反应

和抗SES-NU单克隆抗体反应阴性，与M11和M12单抗反应阴性，小于10％的 孢子虫结合NB单抗包被珠。蝗虫孢子虫多抗与感染18天蝗蝻分离的孢子反应阳性。

分离微孢子虫能与蝗虫孢子虫抗血清发生凝聚反应，说明它们和蝗虫微孢子虫 有相同表面抗原，证明这株野外亚洲飞蝗微孢子虫与蝗虫微孢子虫的亲缘关系很 近。

2.3微孢子虫的分子系统发育分析

使用引物KAI-01和KAI-02引物扩增分离微孢子虫获得一1250bp片段。分离 孢子SSUrDNA序列为1337bp，N.locustae、N.whiteiSSUrDNA序列1335bp和 1337bp，分离孢子SSUrDNA序列和N.locustae同源性为95–97％。三序列的GC 含量均为65％，类似Antonosporascoticae(62％)，但比N.bombycis高(33％)。进 化树分析分离孢子、N.locustae、N.whitei同处于进化树内，其关系仍然不清楚。 简约性揭示分离孢子最接近蝗虫孢子虫(N.locustae)。ML显示分离孢子与N.whitei 最相近，与邻接分析结构一样。所有结果说明分离孢子、N.locustae、N.whitei对 Antonosporascoticae形成以新的妹簇，与含N.bombycis的蝗虫微孢子簇序列不 相关。

用MEGA5软件的邻位相连法(Neighbor-Joining)构建该株微孢子虫 SSUrRNA的系统发育树。在进化树中，该株野外亚洲飞蝗微孢子虫均位于Nosema 属的类中，说明是Nosema属微孢子虫，据此将该株野外亚洲飞蝗微孢子虫定名 为Nosemasp-XJ-10，选取20条微孢子虫SSUrRNA基因序列进行相似性和遗传距离 分析，发现Nosemasp-XJ-10与Nosema属模式种蝗虫微孢子虫(N.locustae， AY305324)具有很高的相似性，相似度为95％，与N.locustae的遗传距离均很小。因 此说明这种野外亚洲飞蝗微孢子虫均属于Nosema属，而且与蝗虫微孢子虫 (N.locustae)的亲缘关系密切。选取15条微孢子虫rRNAITS基因序列进行相似性 和遗传距离分析，发现这种野外亚洲飞蝗微孢子虫与蝗虫微孢子虫的相似度均低于 75％，分化度也较大，说明这种亚洲飞蝗微孢子虫与蝗虫微孢子虫(N.locustae)为 Nosema属的不同种，是Nosema属不同种的微孢子虫，与Antonosporascoticae和N. bombycis的遗传距离分别达到21.3和11.5。证实是不同种微孢子虫。

实施例2.分离蝗虫微孢子虫体内繁殖

1.材料和方法

1.1材料：Nosemasp-XJ-10，经亚洲飞蝗增殖。蝗虫系采自新疆维吾尔自治区 阿勒泰地区蝗卵，室内传代饲养做试虫。

1.2试验方法

1.2.1蝗虫微袍子虫的大量增殖

1)寄主致死时间与病原发育阶段的关系

将微孢子虫孢子液稀释至1×108孢子/mL，取10微升滴于直径10mm麦苗叶片 上，凉干后喂饲本室传代饲养的蝗虫4龄蝗蝻，每头一片，共约10头。24h后将 麦苗叶片全部吃光的蝗蝻用做试虫，置于大塑料筒内饲养，30±1，湿度70％，昼 夜光照，以麦苗加麦麸为饲料，每天观察记载死亡虫数，在接种后第10天收集病 死虫尸，并在相差显微镜下检查病死虫尸中病原物发育情况。

2)接种病原浓度与致死时间和孢子产量的关系

1×105孢子/mL、1×106孢子/mL、1×107孢子/mL、1×108孢子/mL微孢子虫 液分别用微量吸液器吸取10微升滴于麦苗叶片上，凉干后单头喂饲4龄蝗蝻，将 叶片吃光者做试虫，置于小塑料筒内单头饲养。饲养条件同1)，每处理接种20头 分为3组，每天观察记载病死虫，单头称体重，用血球计数板测孢子产量。

3)寄主虫龄与致死时间和孢子产量的关系

选取2、3、4、5日龄蝗蝻，单头喂饲lx106孢子/mL，方法同2)，每日观察记 载病死虫，单头称体重，测孢子产量。

4)收获期与孢子产量的关系

采用lx106孢子/ml喷于麦叶片上，凉干后喂饲4-5日龄蝗蝻，24小时后换 新鲜饲料喂饲，在长方形铁纱养虫笼中(30cm×30cm×50cm)，200-300头/笼，每批 4000头，恒温30±1摄氏度，湿度70％，昼夜光照。10-40天收集病死虫尸，在-20℃ 冰箱贮存。

孢子提取：冷冻病虫尸用绞肉机碾碎，经尼龙沙布过滤后差速离心即得粗提纯 孢子，经血球计数板计数测孢子产量微孢子虫的纯化感染蝗蝻用磷酸盐缓冲液 (Phosphate-bufferedsaline，PBS)挤压，取2毫升悬液放入2毫升含有25％、50％、 75％Percoll的PBS梯度液上，2000g离心30min，从管低收集孢子虫，反复用PBS离 心洗涤，放入无菌蒸馏水，匀质液用吸附棉过滤，900g离心5分钟，反复用蒸馏水 离心洗涤，-20C保存。

2结果

用微孢子虫感染亚洲飞蝗，初期无明显外部染病特征，当蝗蝻进入老龄或成虫 期后，感病严重的虫体腹部发软、肿胀、呈红褐；皮脱不下来或死于脱下的皮蜕 内，翅皱缩，发育期拖长，最后死亡。健虫脂肪体黄透明，片伏，病生脂肪体则 变得不透明，呈乳白，其中充满大量孢子。

2龄蝗蝻接种微孢子虫，大多数个体死于5龄前。3龄蝗蝻接种后，则有少 数个体可发育到成虫。4-5，龄蝗蝻接种后大部分能发育到成虫，但多成为带病成 虫。

用不同浓度的微孢子虫饲喂4龄蝗蝻，经10-15天在寄主体内出现成熟孢子。 25-30天可见大量孢子产生。单头蝗虫可产生4xl09孢子。表明，蝗虫微孢子虫 Nosemasp-XJ-10能在蝗虫体内增殖，产生大量孢子。

2.1微孢子虫在体饲养蝗虫中的增殖特性

2.1.1寄主致死时间与病原发育阶段的关系

4日龄蝗蝻接种lxl06孢子/头28天后全部死亡。接种后第10天开始收病死 虫，共收79头，其中16天以前死亡38头，占总死亡虫尸的48.1％，镜检病原正处于 裂殖生殖时期，孢子极少或不成熟。第18-22天死亡的虫尸15头，占19.0％，全部为 成熟孢子，裂殖体和不成熟孢子极少。可见早期病死虫尸体内病原多处于裂殖生殖 时期，产生袍子量少，而病虫死亡时间拖后，体内产生的病原则处于孢子成熟 期，产生孢子量多。

2.1.2接种病原浓度与致死时间和孢子产量的关系

接种1x106-1×108孢子/头，平均单头产孢量随接种病原浓度降低而增高的趋 势。接种病原浓度愈低，平均致死时间也愈长，从平均致死时间为12.6-34.5天，接 种浓度与致死时间呈负相关(r＝0.9121)。致死时间拉的愈长，虫体重也增高，平 均体重0.54-2.01克/头，二者呈正相关(r＝0.9021)，在一定致死时间范围内(11.1 一21.2天)，虫体重与孢子产量呈正相关(r＝0.9657)。因此接种浓度影响寄主致死时 间，因而影响产抱量，本实施例结果表明，接种浓度为lxl06个孢子/ml能获得 较高产孢量。用相同孢子液接种2-4日不同虫龄，其平均单头产饱量有随虫龄增高而 增大的趋势。虫龄愈小对微孢子虫愈敏感，因而平均致死时间缩短、体重减轻、孢 子产量也低。5日龄虫由于对微孢子敏感性降低，虽然平均致死时间拉长，体重有 所增加，但产孢量反而下降，因此，选择4日龄虫接种较易得到较高孢子产量。

2.1.3收获期与孢子产量的关系

大量增殖蝗虫微孢子虫在何时收集病死虫尸是获得较高孢子产量一重要因素。 检查两批不同时期收获的病死虫尸并测定其产抱量。接种后10-20天收获的病虫尸 产孢量较低。20天以上收获病虫尸的产孢量较高(4-7×109袍子/头)，30-40天 收获的产抱量最高(5-7×109孢子/头)。

2.2田间应用效果

在内蒙草场上，2011-2015年连续4年进行小面积和大面积田间试验，结果显示 不同孢子用量治蝗效果不同，高于0.65×109饱子/亩，校正虫口减退率可达60％ 左右。

实施例3.蝗虫微孢子虫体外培养基、细胞外基质制备和蝗虫微孢子虫的体外适 应培养

3.1自制蝗虫微孢子虫培养基MX，体积1L，下列各物质加入纯水。

无机盐混合物：NaH2PO4·2H2O507mg/L；NaHCO3300mg/L；KCl1720mg /L；CaCl2·2H2O750mg/L；CuCl2·H2O0.1mg/L；CoCl2·6H2O0.03mg/L； FeSO4·7H2O0.28mg/L；MgCl2·4H2O1140mg/L；MgSO4·7H2O3269mg/L； MnCl2·4H2O0.01mg/L；NaCl1425mg/L；NaH2PO4·4H2O580mg/L；(NH4)6 (Mo7O24)·4H2O0.02mg/L以及ZnCl20.02mg/L。

糖混合物：D-葡萄糖2917mg/L；果糖20.9mg/L；蔗糖11865mg/L；苹 果酸306mg/L；alpha-酮戊二酸169mg/L；琥珀酸27.4mg/L；延胡索酸25.2mg /L；麦芽糖500mg/L。

氨基酸混合物：L-alpha-丙氨酸131.5mg/L；beta-丙氨酸234mg/L；L-盐酸 精氨酸692mg/L；L-天冬酰胺797mg/L；L-天冬氨酸797mg/L；L-半胱氨酸 10.5mg/L；L-谷氨酸1000mg/L；L-谷氨酰胺750mg/L；甘氨酸371mg/L； L-组氨酸1142mg/L；L-异亮氨酸396mg/L；L-亮氨酸157mg/L；L-胱氨酸二 钠60mg/L；L-羟脯氨酸400mg/L；L-盐酸赖氨酸610mg/L；L-甲硫氨酸521 mg/L；L-苯丙氨酸562mg/L，L-脯氨酸396mg/L；DL-氨酸559mg/L；L- 苏氨酸173mg/L；L-氨酸91.5mg/L，L-酪氨酸21mg/L；L-酪氨酸二钠， 180mg/L；L-缬氨酸，292mg/L以及L-组氨酸1142mg/L。

维生素混合物：生物素0.123mg/L；D-泛酸钙0.89mg/L；氯化胆碱10.85 mg/L；叶酸0.125mg/L；I-肌醇0.285mg/L；烟酸0.165mg/L；盐酸吡哆醇 0.285mg/L；核黄素0.125mg/L；盐酸硫胺素0.125mg/L；维生素B120.12mg /L以及对氨基苯甲酸0.245mg/L。

蛋白提取物组合：水解乳蛋白1500mg/L，TC-yeastolate1500mg/L，胰蛋白酶
磷酸盐肉汤1500mg/L，胎球蛋白10mg/L，细胞素C50mg/L，肌苷100mg/L
以及牛血清白蛋白V5000mg/L；

粘性补充剂聚乙烯吡咯烷酮K-90，250mg/L。

进一步加入10％、20％以及30％胎牛血清制成培养基MX10、MX20以及MX30 培养基。用氢氧化钾调节pH至6.3，无菌过滤后贮存备使。

3.2昆虫源性、水溶性、去乙酰化的几丁质的制备

3.2.1从蝗蛹蜕皮中制备水溶性几丁质

(i)制备过程

5克蝗蛹脱下的皮加入盛有300mL1N盐酸的容器，在充有氮气环境下。100℃ 加热20分钟，用温水和蒸馏水冲洗中性，真空干燥。干燥的蝗蛹退下皮浸入300 毫升1N氢氧化钠溶液，80℃加热、搅拌36小时除去蜕皮上的蛋白质获得0.9克几 丁质。

(ii)对水亲和性评估

在饱和溶液中，通过BET等式间接测定各几丁质吸收水分后相对湿度分析几丁 质的亲水性。由于制备几丁质有大量内部面积和高热吸收性，因此几丁质具有对水 高的亲和性。

(iii)几丁质去乙酰化

上述方法制备几丁质3克加入40％氢氧化钠溶液，25℃放置70小时以便形成 均一溶液系统。约有74％几丁质去乙酰化。用红外光谱仪检测，去乙酰化程度为 45-48％，在室温下溶于水。在饱和气压下，去乙酰化几丁质吸附水超出以前上述未 乙酰化几丁质的6.3倍，对水具有高亲和性。可做外蝗虫微孢子细胞外基质。

3.3微孢子虫的体外培养

(1)实施例2繁殖的微孢子虫Nosemasp-XJ-10取出后，放入37℃水浴30秒 到1分钟，用无菌Carlson's溶液(penicillin100000U/100mL、0.05％gentamicin、 0.05％antiformin)洗涤三次；

(2)转入15毫升离心管中，1000-1500rpm离心10-20分钟；

(3)移去上清液，沉淀中加入平衡盐溶液，如艾氏液或Hanks’Hanks’液， 1000-1500rpm离心10-15分钟，沉淀含大量的微孢子，同时取样计数。

(4)从蝗蛹制备的含10g/L的去乙酰、水溶性几丁质溶液，涂于培养瓶壁表 面，室温自然干燥，用无菌生理盐水洗涤二次。

(5)培养基MX30移入表面包被几丁质的培养瓶，加入终浓度为 1×105-1×106/mL的微孢子，进行静止培养，培养温度28-30℃，CO2浓度为3-5％。

(6)培养10天后，用1半体积的新鲜培养基MX30换液，第20天用一半体 积的新鲜培养基MX20换液，第30天用一半体积的新鲜培养基MX10换液，30天 后微孢子虫大量生长繁殖，直到40天，微孢子虫数目达到最大。在30-40天，微孢 子虫从培养表面漂浮，可收获液体离心获得体外培养的第一代微孢子虫，适应10％ 胎牛血清培养基。以此10％胎牛血清培养基可进行蝗虫微孢子虫培养和繁殖。

采用10％胎牛血清培养基对蝗虫微孢子虫Nosemasp-XJ-10进行体外传代培养， 将体外传代培养得到的第10代蝗虫微孢子虫命名为XJ-20，分类命名为蝗虫微孢子 虫(Nosemalocustae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏时间是：2015年11月3日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏号CGMCCNo11170。

实施例4.蝗虫微孢子虫的体外摇瓶培养

1.材料和方法

1.1微孢子虫株：实施例3获得的在蝗虫体内传至10代，在体外传至10代，命名 为Nosemasp-XJ-20(简称XJ-20)的蝗虫微孢子虫，保藏号CGMCCNo11170。培养 基制备如实施例3。

1.2采用摇瓶进行微孢子虫体外繁殖方法

(1)配制含10％胎牛血清、含10g/L乙酰化水溶性几丁质的蝗虫微孢子虫培养 基MX10；(2)接种Nosemasp-XJ-20，接种浓度优选1×105-1×106孢子/mL；(3)培养条 件：培养温度28-30℃，CO2浓度为3-5％，培养时间30-50天，摇瓶转速60rpm/min。 每隔10天，测定OD600值和微孢子数。采用转瓶体积分别为0.5L、1.5L。

同时配制不含有乙酰化水溶性几丁质的蝗虫微孢子虫培养基作为对照，其余成 分与上述步骤(1)中的培养基相同。

1.3电镜观察

在培养的的10、20、30、40、50天分别取样，用2.5％戊二醛(PBS配制)在37℃ 孵育15分钟，4℃贮存24小时，包埋在1毫米长2％琼脂糖方块上切片，在100mM磷 酸溶液(pH7.4)中用1％固定后，冰上放置1小时，切片用双蒸水洗涤，在 4℃用1％醋酸双铀处理1小时，乙醇和包埋在环氧树脂中脱水，用1％醋酸双氧铀、 柠檬酸铅溶液染，PhilipsCM10电镜上60kV、30微米光圈观察。

2.结果

2.1蝗虫微孢子虫摇瓶培养

培养基中含和不含去乙酰水溶性几丁质培养微孢子虫情况如表1。培养10天， 蝗虫微孢子虫的密度为1.3×106孢子/mL，培养20天为1.4×106孢子/mL，培养30 天为1.8×106孢子/mL，培养40天为2.7×106孢子/mL，培养50天为3.6×106孢子/mL.。 相较于不含去乙酰水溶性几丁质的培养基均有所提高。而用蝗蝻喂食繁殖微孢子虫 接种后10-20天，收获的病虫尸产孢量较低。20天以上收获病虫尸的产孢量较高， 达到4-7×109袍子/头，30-40天收获的产孢量最高，达到5-7×109孢子/头。 可见相较于体内繁殖的方法的方法，采用体外培养可一次性获得更大数量的蝗虫微 孢子虫。

表1.发明的培养基(含10g/L去乙酰水溶性几丁质)和不含去乙酰水溶性几丁质 的培养基转瓶培养微孢子虫的密度(×106孢子/mL)

实施例5在单一2L生物反应器连续培养扩增蝗虫微孢子虫

5.1所使用材料

生物反应器:2.4升工作体积可处理生物反应器，购自美国密理博公司，装有 pH、pO2、温度探头和搅拌桨。

干燥情况下平均直径为50-300μm的微载体Cytodex3圆珠购自美国GE公司， 用磷酸缓冲液PBS(pH7.4)水化24小时后，用PBS洗涤三次，在PBS中高压灭菌后， 加入微孢子虫培养液，使微球黏附表面积达4400cm2/g。

微孢子虫：蝗虫微孢子虫XJ-20，保藏号CGMCCNo11170。

培养基制备如实施例3。

5.2在传代培养过程中起始微载体作用浓度和微孢子虫保护试剂评估操作程序

微孢子虫第一次传代培养时，采用微载体浓度0.1g/L和0.3g/L评估非常低浓 度微载体对微孢子虫生长影响。

含0.6g微载体的2L培养基MX10(含去乙酰化几丁质，见实施例3)中加入 微孢子虫XJ-20，使其终浓度达到5.0×106孢子/mL，混合后导入第一生物反应器(Bio 1)，使黏附面积达到25000孢子/cm2，起始微载体浓度0.3g/L。调节控制参数pH 7.0-7.2，PO2为25％，温度为28-30℃。含0.2g微载体、2L培养基MX10(含去乙 酰化几丁质)中加入微孢子虫XJ-20，使其终浓度达到5.0×106孢子/mL，混合后导 入第二生物反应器(Bio2)，使黏附面积达到25000孢子/cm2，起始微载体浓度 0.1g/L。调节控制参数pH7.0-7.2，PO2为25％，温度为28-30℃。

在培养50天，微孢子虫按以下程序进行酶处理：微载体沉降分离后，生物反 应器约有300mL培养液截留，加入300mL含600mg胰蛋白酶的0.025M柠檬酸钠 溶液(PBS，不含钙离子和镁离子)，适度搅拌，每隔15-30分钟显微镜下观察确 认孢子虫实际脱离微载体，用300mL胰酶抑制液(含1mg/mL抑制剂，购自美国 Sigma公司)终止反应。微孢子虫细胞计数后，移出孢子虫悬液，在2L生物反应器 中分别加入2.4g微载体(Bio1)或0.6g微载体(Bio2)，调整微孢子数使黏附面积 达到25000/cm2进行第二次传代培养。培养期间，经2次换液，第一次换液时间为 加入裸微载体后的4-6小时，第二次换液为第20天。在第50天收获后计数评估微 孢子虫的生长情况。采用同样程序检测去乙酰化几丁质和聚乙烯吡咯烷酮对微孢子 虫的保护作用。

5.3在传代培养过程中牛血清作用的评估程序

程序如上述5.2，检测培养基为实施例3培养基MX10，微载体起始浓度0.3g/L， 分别在第5和第8天进行胰蛋白酶处理。酶处理前微载体用600mL洗液(PBS)洗 涤三次除去血清。

5.4结果

为评估微孢子虫生长参数的作用，在一定时间从生物反应器悬液中采集复样， 用细胞计数仪检测微孢子虫浓度、积累的产出的微孢子虫数。

5.4.1"起始微载体浓度"参数

在连续微孢子虫培养中，"起始微载体浓度"为0.1g/L最低，但微孢子虫数翻倍 时间最快。积累的微孢子虫数在测试时都较高。第一次传代培养时，微载体浓度是 0.1g/L时，对微孢子虫生长没有负面影响。在较高微载体浓度的生物反应器中，微 孢子虫生长有活跃自我复制趋势。结果如表2所示：

表2.微孢子虫连续三次培养中起始微载体不同浓度的效果

5.4.2"微孢子虫保护试剂"参数

PVP和水溶性乙酰化几丁质在微孢子虫连续培养中，能够增加微孢子虫对微载 体的粘附作用。

5.4.3"血清"参数

血清在微孢子虫连续培养中，具有增加微孢子虫对微载体的粘附作用和增殖作 用。

实施例6.用生物反应器培养蝗虫微孢子虫

6.1所用材料

生物反应器:工作体积2L、5L、10L生物反应器(德国Sartorius产品)，装有pH、 pO2、温度探头和搅拌桨，其余材料和实施例5一样。校准后高压消毒备用。

干燥情况下平均直径为50-300μm的微载体Cytodex3圆珠购自美国GE公司， 用磷酸缓冲液PBS(pH7.4)水化24小时后，用PBS洗涤三次，在PBS中高压灭菌后， 加入微孢子虫培养液，使微载体黏附表面积达4400cm2/g。

培养基为含10％小牛血清、含10g/L去乙酰化水溶性几丁质的培养基MX10， 按照实施例3方法制备。

蝗虫微孢子虫：蝗虫微孢子虫XJ-20，保藏号CGMCCNo11170。

6.2操作程序：

6.2.1用10L生物反应器培养蝗虫微孢子虫

4升含有10％小牛血清、含去乙酰化水溶性几丁质的培养基MX10和4g微载体 Cytodex3加入生物反应器，微孢子虫冻融后计数，调整个数后加入培养基，使其终 浓度为1×105孢子/mL，加入培养液使微载体起始浓度在加入微孢子虫种后为0.5 g/L。调节控制参数pH7.0-7.2，PO2为25％，温度为28℃，转速40rpm使微载体 悬浮于培养基中。维持不低于40rpm进行搅拌。每隔10天用新鲜的含10％小牛血 清、去乙酰化水溶性几丁质培养基MX10换液。第70天，按以下程序进行酶解： 停止搅拌、停止调节控制PO2、pH，保持温度调控。微载体沉降后，约有500毫升 培养液在罐中，加入800毫升含600mg胰蛋白酶的0.025M柠檬酸钠溶液(PBS， 不含钙离子和镁离子)，适当搅拌液体，每隔15-30分钟显微镜下观察确认孢子虫 实际脱离微载体，用800mL胰酶抑制液(含1mg/mL抑制剂，购自美国Sigma公司) 终止反应。培养期间每隔5天，测定微孢子密度。

6.2.2用10L生物反应器培养蝗虫微孢子虫

4升含有10％小牛血清、含去乙酰化水溶性几丁质的培养基MX10和7g微载 体Cytodex3加入生物反应器，微孢子虫冻融后计数，调整个数后加入培养基，使其 终浓度为1×105孢子/mL，加入培养液使微球浓度为1.4g/L。调节控制参数pH 7.0-7.2，PO2为25％，温度为28℃，转速40rpm使微载体悬浮于培养基中。维持 不低于40rpm进行搅拌。每隔10天用新鲜的含10％小牛血清、去乙酰化水溶性几 丁质培养基MX10换液。第70天，按以下程序进行酶解：停止搅拌、停止调节控 制PO2、pH，保持温度调控。微载体沉降后，约有800毫升培养液在罐中，加入1000 毫升含600mg胰蛋白酶的0.025M柠檬酸钠溶液(PBS，不含钙离子和镁离子)， 适当搅拌液体，每隔15-30分钟显微镜下观察确认孢子虫实际脱离微载体，用 1000mL胰酶抑制液(含1mg/mL抑制剂，购自美国Sigma公司)终止反应。培养期 间每隔5天，测定微孢子密度。

6.2.3用2L生物反应器培养蝗虫微孢子虫

0.5升含有10％小牛血清、含去乙酰化水溶性几丁质的培养基MX10和0.6g微 载体Cytodex3加入生物反应器，微孢子虫冻融后计数，调整个数后加入培养基，使 其终浓度为1×105孢子/mL，加入培养液使微载体在加入微孢子虫种后浓度为0.3 g/L。调节控制参数pH7.0-7.2，PO2为25％，温度为28℃，维持不低于40rpm进 行搅拌。每隔10天用新鲜的含10％小牛血清、去乙酰化水溶性几丁质培养基MX10 换液。第70天，按以下程序进行酶解：停止搅拌、停止调节控制PO2、pH，保持 温度调控。微载体沉降后，约有400毫升培养液在罐中，加入500毫升含600mg胰 蛋白酶的0.025M柠檬酸钠溶液(PBS，不含钙离子和镁离子)，适当搅拌液体， 每隔15-30分钟显微镜下观察确认孢子虫实际脱离微载体，用500mL胰酶抑制液(含 1mg/mL抑制剂，购自美国Sigma公司)终止反应。培养期间每隔5天，测定微孢子 密度。

6.3结果

为检测微孢子虫生长，培养过程中定时取微载体悬液复样，用细胞计数仪系统 计数，取复样平均值，见图1。