一种同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片

本发明涉及基因芯片和致病菌检测技术领域，具体地，涉及一种同时检测化妆品 中多种致病菌的基因芯片。

由于化妆品中含有氨基酸、蛋白质、脂肪、维生素、无机盐和胎盘液等营养成分，是 细菌、真菌等各种致病菌的生长、繁殖的理想环境，因此，化妆品保存方式尤为关键，稍有不 注意就很容易收到微生物的污染。另外，化妆品的生产、运输及使用都是在室温，而室温也 是微生物滋生和繁殖的适宜温度，化妆品的湿度也是非常适宜微生物生长的。如果污染的 微生物是致病菌，在使用的过程中，还会感染消费者，严重危害身体健康。致病菌生长过程 中会产生代谢产物和各种毒素，这些产物在人体免疫系统的识别下，可以变成刺激源和变 应原，使使用者产生过敏或者受到感染，引起各种各样的皮肤病，比如肤异常、接触性和 光感性皮炎，掉头发，头发粗糙，痤疮等皮肤病。

传统的病原菌鉴定主要是生化鉴定和血清型分型，这些方法可以很准确的鉴定微 生物，但是操作时间太长，操作也比较复杂，需要耗费大量的人力和物力。随着技术的发展， 也有一些新的技术涌现，包括实时定量聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析、单链构 象多态性分析、荧光原位杂交、质谱技术、免疫技术等，这些方法与传统方法比，操作更简 单，更快速；这些方法虽然在准确度和精度上有了很大的进步，但这些方法通常需要使用到 大型仪器，检测前也需要对样品进行复杂的预处理，一般只有条件较好的实验室才能开展 此类实验。

针对现有技术上的不足，本发明提供一种同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯 片，以弥补现有检测化妆品中常见致病菌的缺陷，提高检测的灵敏度和特异性，降低劳动强 度和缩短检测周期。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案得以实现：

一种同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载 体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针包括从大肠埃希氏菌、金黄葡萄球菌金黄 亚种、铜绿假单胞菌、沙门氏菌IV和生孢梭菌的18S-28S rDNA间区，所述的寡聚核苷酸探针 如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:5所示。

相对于现有技术，本发明的有益效果：

本发明将基因芯片技术引入化妆品中常见致病菌检测领域，建立了一种可以同时 检测5中致病菌的基因芯片，本发明的基因芯片具有快速、灵敏、准确性高、重复性强等特 点，利用本发明的基因芯片可以达到检测化妆品中常见的致病菌的目的，由于操作简便，准 确性高，重复性强，本发明的基因芯片的灵敏度为0.085ng/μL，同时检测5种致病菌；无论对 于如出入境检验检疫部门对化妆品的检验检疫还是环境监测局对化妆品中致病菌的安全 检验都有重要的应用价值。

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施 例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是本发明的结构示意图。

其中：A-点阵区，A1-点样区，B-标签区域。

结合以下实施例对本发明作进一步描述。

图1是根据一示例性实施例示出的一种同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片， 如图1所示，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针 包括从大肠埃希氏菌、金黄葡萄球菌金黄亚种、铜绿假单胞菌、沙门氏菌IV和生孢梭菌的 18S-28S rDNA间区，所述的寡聚核苷酸探针如SEQ ID NO:1–SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述寡聚核苷酸探针包括阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针；所述 阳性对照探针选自细菌16s rDNA保守区中选取的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。

优选地，所述阳性对照探针为SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:7；所述阴性对照探针为 SEQ ID NO:8；所述荧光探针为SEQ ID NO:9。

优选地，在制备检测大肠埃希氏菌、金黄葡萄球菌金黄亚种、铜绿假单胞菌、沙 门氏菌IV和生孢梭菌试剂盒中的应用。

本发明选择的多条长度在32bp±2bp、Tm72℃±2℃的探针，并通过多次杂交实验 进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.6的探针序列选自所有真菌的 18s rDNA，编号为NO.7的探针序列选自所有细菌的16s rDNA，作为阳性对照用来检测是否 有真菌、细菌；编号为NO.8的探针为多聚T片段，用作阴性对照，50％的DMSO，用作空白对照； 编号为NO.9的探针作为荧光探针。

表1

序号 序列

SEQ ID NO:1 TAATAGAAATGAAATGGTGTGTTGCA

SEQ ID NO:2 GGCCATCAGGATACAATACTAAACTT

SEQ ID NO:3 GAATAACTTAATTCAAATGAGTTATCTT

SEQ ID NO:4 ACATTGTTGGTGTGCTGCGTGATC

SEQ ID NO:5 CGCGACACGTGGGTGTTTTACGAA

SEQ ID NO:6 ATTATGCGACCGCCCGGCTAAT

SEQ ID NO:7 GTACACACCGCCCGTCACACCATb

SEQ ID NO:8 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTc

SEQ ID NO:9 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy3d

本发明所用菌株的直接来源如下表2：

表2

本发明的基因芯片集约化程度较高，可以同时检测多达5中常见致病菌，这无论是 对于消费者还是生产厂家，都节约检测成本，节约成本的同时可以提高检测的频次，保证生 产或者使用的产品更加质量更加放心，规范化妆品市场的良性发展。

一种上述的同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：

S1.样品稀释液培养，培养基为YPD、BHI或者SCDLP；

S2.提取基因组DNA；

S3.扩增靶序列；标记靶序列；

S4杂交；

S5扫描；用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所 用参数如下：软件及版本：GenePix Pro 6.0；official name:575DF35；PMT Gain：550；扫描 分辨率：10μm。

作为优选的实施例，下面具体介绍步骤S2提取基因组DNA的方法：

S1.取适量经石英砂和干冰研磨后的样品中加入2mL的离心管，随后快速加入 1.5mL DNA提取缓冲液并上下颠倒混匀，混匀3分钟；

S2.将所有混合液转移到注射器中，轻轻推动注射器，混合液经过海绵和微孔滤膜 的过滤后，滤液流到吸附柱的硅胶膜上，室温下静置5分钟；

S3.取新的注射器连接至吸附柱上，推动注射器，硅胶膜上的清液会缓慢的经过硅 胶膜而流到柱子下面连接的离心管中，此时DNA分子会吸附在硅胶膜上；

S4.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗液A后在室温下静置3分钟，推动注射器让 洗液A洗脱硅胶膜上的蛋白质以及RNA；

S5.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗液B后在室温下静置1分钟，推动注射器让 洗液B洗脱硅胶膜上残留的蛋白质以及RNA；

S6.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗脱液Ⅰ后在室温下静置3分钟，推动注射器 让洗脱液Ⅰ对硅胶膜进行洗脱，去除残留的有机溶剂；

S7.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗脱液Ⅱ后在室温下静置1分钟，推动注射 器让洗脱液Ⅱ对硅胶膜进行洗脱，进一步除残留的有机溶剂；

S8.换新的注射器，推动注射器对空管的硅胶柱进行推气干燥3次，然后室温干燥3 分钟；

S9.换新的2mL的离心管，加入50uL贮存液，后在室温下静置5分钟，轻轻推动注射 器，离心管中便能收集得到高质量的DNA。

本发明的基因芯片具有快速、灵敏、准确性高、重复性强等特点，利用本发明的基 因芯片可以达到检测化妆品中常见的致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强， 本发明的基因芯片的灵敏度为0.085ng/μL，同时检测5种致病菌。

实验例灵敏度和多菌同时鉴定实验：

1、对本发明制备的同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片的灵敏度进行鉴定如 下：

使用上述的基因组提取方法，提取5中致病菌的基因组DNA，将5种致病菌基因组进 行一系列稀释，包括100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，分别进行PCR，然后杂交试验，对 比实验结果，确定本实验能够检测出致病菌的最低模板浓度为0.085ng/μL。

2、对本发明制备的同时检测化妆品中5种致病菌的基因芯片的多种菌进行鉴定如 下：

检测化妆品中常见的致病菌，在实际情况中，一种化妆品中可能存在不止一种检 测范围内的致病菌，可能1种或者多种，所以为了证明本芯片能同时检测不止一种致病菌， 本实验将致病菌的基因组2个或者多个混合，做多重PCR，然后杂交芯片，查看结果，证明了 本芯片可以同时检测5种致病菌。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。