一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒

本发明涉及转基因植物快速检测技术领域，具体地，涉及一种快速检测转基因玉 米PAT的引物及试剂盒。

玉米是我国重要的粮食作物之一，在我国的农业生产中占有重要地位，也是保证 我国粮食安全的一大功臣。转基因玉米虽然在我国还没有批准生产，但是相关的科研人员 已在玉米转基因育种中取得的许多成果，当然，不能避免有转基因玉米通过不法渠道流入 市场中。

目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR 检测方法》中规定了对玉米MON810、Bt11、Evebt176、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因成 分的定性检测，这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法，但常规PCR方法需要PCR扩增后 进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光染料，毒性较大 的荧光染料威胁科研人员的身体健康。

针对现有技术上的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测转基因玉米PAT的 引物对；本发明的另一个目的是提供一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案得以实现：

一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因 引物对；

内参引物对：

上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；

下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；

外源基因引物对：

上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；

下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。

一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对 包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的 HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/ L的下游引物ZeinR 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为 0.5pmol/L的下游引物PATR 0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；

所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；

所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；

所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；

所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。

相对于现有技术，本发明的有益效果：

1、本发明的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因 高粱的Zein基因和PAT基因；

2、采用本发明的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基因和外源基因 PAT本发明的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以上，引物特异性 更高，检测结果更客观。

3、综合实验例1和2的结果，表明本发明的检测引物，试剂盒及方法；其检测的灵敏 度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系 R2≥0.96，本发明的检测结果的准确度高达98％左右，由于本发明的PCR结束后，不用再转 入其他分析装置分析，实现闭管操作，简化的操作步骤，避免由于操作过程复杂引起的交叉 污染，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施 例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是本发明的结构示意图。

结合以下实施例对本发明作进一步描述。图1是本发明的快速鉴定抗除草剂的转 基因高粱纯合植株的方法的流程示意图。

一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因 引物对；

内参引物对：

上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；

下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；

外源基因引物对：

上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；

下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。

一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对 包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的 HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/ L的下游引物ZeinR 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为 0.5pmol/L的下游引物PATR 0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；

所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；

所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；

所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；

所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。

优选地，以上所述的快速检测转基因玉米PAT的试剂盒；

其中，试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul， 终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 1ul，终 浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 1ul，DNA模板 1ul，去离子水补齐至25ul。

一种用以上所述的试剂盒的快速检测转基因玉米PAT方法，包括以下步骤：

S1.提取样品DNA；

S2.利用权利要求2或3所述的试剂盒，对步骤S1中的样品DNA进行PCR扩增；

S3.扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。

本发明的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高 粱的Zein基因和PAT基因；采用本发明的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基 因和外源基因PAT本发明的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以 上，引物特异性更高，检测结果更客观。

在合适的实施例中，本部分对以上的快速检测转基因玉米PAT方法中步骤S1做出 详细说明，

优选地，所述提取样品DNA过程包括以下步骤：

S1.取适量经石英砂和干冰研磨后的样品中加入2mL的离心管，随后快速加入 1.5mL DNA提取缓冲液并上下颠倒混匀，混匀3分钟；

S2.将所有混合液转移到注射器中，轻轻推动注射器，混合液经过海绵和微孔滤膜 的过滤后，滤液流到吸附柱的硅胶膜上，室温下静置5分钟；

S3.取新的注射器连接至吸附柱上，推动注射器，硅胶膜上的清液会缓慢的经过硅 胶膜而流到柱子下面连接的离心管中，此时DNA分子会吸附在硅胶膜上；

S4.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗液A后在室温下静置3分钟，推动注射器让 洗液A洗脱硅胶膜上的蛋白质以及RNA；

S5.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗液B后在室温下静置1分钟，推动注射器让 洗液B洗脱硅胶膜上残留的蛋白质以及RNA；

S6.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗脱液Ⅰ后在室温下静置3分钟，推动注射器 让洗脱液Ⅰ对硅胶膜进行洗脱，去除残留的有机溶剂；

S7.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗脱液Ⅱ后在室温下静置1分钟，推动注射 器让洗脱液Ⅱ对硅胶膜进行洗脱，进一步除残留的有机溶剂；

S8.换新的注射器，推动注射器对空管的硅胶柱进行推气干燥3次，然后室温干燥3 分钟；

S9.换新的2mL的离心管，加入50uL贮存液，后在室温下静置5分钟，轻轻推动注射 器，离心管中便能收集得到高质量的DNA。

更优选地，所述DNA提取缓冲液成分为5M异硫氰酸胍，10mM 2-巯基乙醇，50mM Tris，20mM EDTA，21.3mM聚乙二醇辛基苯基醚，pH 6.8；

更优选地，所述吸附柱的硅胶膜为特殊硅基质吸附材料，可以特异性吸附DNA，排 斥RNA和蛋白质；

更优选地，所述过滤层为大孔径的海绵过滤层和超小孔径的微孔滤膜层；所述过 滤层海绵为耐酸耐碱的材料；所述过滤层微孔滤膜为耐酸耐碱的陶瓷膜，孔径为0.8nm～1μ m。

使用本方法与两种不同品牌的商业试剂盒，所提取的基因组DNA的OD260/280值和 OD260/230值，显示大体一致的良好范围，表明本试剂盒大体上能达到一般商业试剂盒的水 平，本发明的试剂盒提取产量稍微低于两种商业试剂盒，但对于监测部门的现场快速检测， DNA的量完全满足检测需要。

实验例1

采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源；将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前 述反应体系，采用0.1％标准品对其进行灵敏性实验。

结果显示，本发明的检测阈值达到0.1％，重复实验显示检测样品具有很好的重复 性，稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96。说明该方法具有较好 的精确度和良好的稳定性。

实验例2

为了验证采用本发明的方法及试剂盒，检测转基因玉米的准确度及效率；我们使 用传统PCR和本发明的方法，对同一批次的转基因玉米进行检测，每个处理检测100待测样 品，每个处理重复3次，结果取平均值；最后两种的检测结果分别与二代测序的结果对比，比 较每一种方法的准确率，检测结果如表1所示；

表1

玉米品种 本发明检测方法 传统PCR

华农866 97.9％ 84.8％

申玉17号 98.1％ 83.9％

从实验例2结果表明，本发明的检测方法，其检测结果准确度更高，高达98％，传统 PCR检测结果准确度在84％左右。

综合实验例1和2的结果，表明本发明的检测引物，试剂盒及方法；其检测的灵敏度 更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2 ≥0.96，本发明的检测结果的准确度高达98％左右，由于本发明的PCR结束后，不用再转入 其他分析装置分析，实现闭管操作，简化的操作步骤，避免由于操作过程复杂引起的交叉污 染，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。