一种高效筛选、设计和改造电子载体的实现方法

一种高效筛选、设计和改造电子载体的实现方法

技术领域

本发明涉及一种高效电子载体的筛选、设计和改造方法，属于生物电化学催化领域。

背景技术

当前，环境与能源问题已成为影响人类生存发展的核心问题。随着化石能源的使用，我们正面临着巨大的能源危机和环境污染问题，如何兼顾环境与能源需求并实现可持续发展是我们当前面临的前沿和热点问题。近年来，生物电化学系统(Bioelectrochemicalsystem，BES) 作为一种有效回收能源和资源的新兴技术，已经受到广泛关注，并具有巨大的发展潜力。生物电化学系统最常见的形式是以产电或污水处理为目标的微生物燃料电池，但是生物电化学系统在产品合成以及生物修复方面也展现了广阔的发展前景[1]。微生物电合成是生物电化学系统的一个重要研究方向，它以微生物燃料电池为基础发展而来。微生物电合成以微生物作为催化剂，通过外部施加一定的电压，能够驱动微生物代谢，在电化学系统中进行生物合成，如固定CO2还原产生乙酸和丁酸，延胡索酸还原为琥珀酸，还能提高谷氨酸发酵的产量等。目前，实现微生物电合成的物质种类很多，包括甲烷、乙酸、甲酸、丁醇、乙醇、丁二酸等多种有机物[2]。此外，微生物电合成还能够进行生物修复，如去除污染物中的高氯酸盐，对污水进行脱氮处理或硝酸盐还原等[3,4]。

在微生物电合成中，需要解决的核心问题是电活性微生物与生物电极间的电子传递过程，该过程决定了微生物电合成的速率和效率[5]。研究证实，电子载体能够加速电极与微生物之间的电子转移，提高微生物从阴极获得电子的效率。电子载体(Electronshuttle，ES)，又称为电子穿梭体、电子传递媒介或氧化还原中介体，是指能够接收电子、储存电子并将电子传递给其他物质从而自身发生氧化还原反应的一类物质[6]。许多文献报道，利用这些电子载体可以加快生物电极的电子传递能力，例如蒽醌-2,6-二磺酸钠(AQS)作为电子载体，能够加快谷氨酸棒状杆菌和电极之间的电子转移，从而提高甲酸和乙酸产量；甲基紫精作为电子载体，能够提高电子传递速率，能使菌株生产乙醇的产量提高等[4,7,8]。

但是，电子载体在实际应用中仍存在着许多问题。电子载体介导的胞外电子传递过程受很多因素影响，如电子载体的溶解度、电子载体的氧化还原电势、微生物种类、环境条件、电子载体的转移能力、电子载体的浓度等。理想的电子载体应具备的条件为[9]：(1)氧化态和还原态电子载体在溶液中应具有良好的可溶性和扩散性，易于在溶液中快速迁移；(2)电子载体的氧化还原电势应与要发生介导电子传递的反应体系相匹配，其氧化还原电势必须处于合适的电位范围内，才能发挥出传递的最好效果；(3)电子载体的电子承载能力、电子接收能力和电子给出能力都比较强，并能快速的发生氧化还原反应，缩短电子传递的反应时间； (4)电子载体应选用价廉质优的一类电子载体，在溶液中性质稳定，不易被光解或分解，不能被微生物代谢利用；(5)电子载体对细胞应无毒性或毒性很小，不会抑制微生物生长，不会影响微生物正常的生理代谢活动。

鉴于电子载体仍存在着许多问题，如不同电子载体的效率差异较大，多数电子载体对微生物具有细胞毒性，电子载体介导微生物的胞外电子传递机制尚不清晰等，都严重限制了微生物电合成的发展。因此，筛选对微生物具有电子传递效应的电子载体，设计改造电子载体提升系统利用效率，有助于突破微生物胞外电子传递效率低下瓶颈，促进微生物和电极之间的高效电子传递，实现电能向化学能的高效转化，推动微生物电合成的发展。

参考文献：

1.Bajracharya S,Sharma M,Mohanakrishna G,et al.An overview onemerging bioelectrochemical systems(BESs):Technology for sustainableelectricity,waste remediation,resource recovery, chemical production andbeyond.Renewable Energy,2016,98 153-170.

2.Rabaey K,Rozendal R A.Microbial electrosynthesis-revisiting theelectrical route for microbial production.Nat Rev Microbiol,2010,8(10):706-716.

3.Thrash J C,Van Trump J I,Weber K A,et al.Electrochemicalstimulation of microbial perchlorate reduction.Environ Sci Technol,2007,41(5):1740-1746.

4.Xafenias N,Kmezik C,Mapelli V.Cathodes enhance Corynebacteriumglutamicum growth with nitrate and promote acetate and formateproduction.Bioresour Technol,2016,216 105-113.

5.Shi L,Dong H L,Reguera G,et al.Extracellular electron transfermechanisms between microorganisms and minerals.Nat Rev Microbiol,2016,14(10):651-662.

6.Watanabe K,Manefield M,Lee M,et al.Electron shuttles inbiotechnology.Curr Opin Biotechnol, 2009,20(6):633-641.

7.Choi O,Um Y,Sang B I.Butyrate production enhancement by Clostridiumtyrobutyricum using electron mediators and a cathodic electrondonor.Biotechnol Bioeng,2012,109(10):2494-2502.

8.Harrington T D,Mohamed A,Tran V N,et al.Neutral red-mediatedmicrobial electrosynthesis by Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,andZymomonas mobilis.Bioresour Technol,2015,195 57-65.

9.马金莲,马晨,汤佳,等.电子穿梭体介导的微生物胞外电子传递:机制及应用.化学进展.2015(12).

发明内容

本发明目的是提供一种用于电子载体高效筛选、设计和改造的方法，采用本发明可以快速获得对特定电活性微生物具有高效电子传递能力的新型电子载体，有助于突破生物电化学系统中电活性微生物与生物电极间电子传递效率低下的瓶颈，实现电能向化学能的高效转化。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

(1)电能生物反应器的设计组装及测试；

(2)微生物胞外电子获得和传递效率的测量方法及评价指标的建立和完善；

(3)高效电子载体的挖掘和筛选

(4)电子载体衍生物的理性设计和修饰改造

(5)电子载体衍生物的性能表征分析

本发明的有效效益是以希瓦氏菌Shewanella onesidensis MR-1为电活性菌株，成功建立了用于电子载体高效筛选、设计和改造的方法。通过本方法，快速筛选获得多个优良的候选电子载体，其中蒽醌-2,6-二磺酸钠(AQS)综合表现最佳，根据理性设计和修饰改造原理，降低 AQS电子载体的氧化还原电势，有助于提高希瓦氏菌的生物阴极电子摄取能力。本发明将为改造提升生物电化学系统中电子载体利用效率提供新思路和方案。

附图说明

说明书附图1为电能生物反应器；

说明书附图2为电子载体-循环伏安曲线图；

说明书附图3为电子载体的筛选和表征描述图；

说明书附图4为AQS化学结构和电子传递机理分析图；

说明书附图5为AQS衍生物氧化还原电势理论计算分析图。

说明书附图6为AQS衍生物性能表征描述图。

具体实施方法

以下通过具体的实施例来说明本发明具体实施方法，但是这些实施例不构成对本发明方式、范围和效果的限定。

一种筛选、设计和改造电子载体的实现方法，按以下步骤进行实施：

实施步骤1、电能生物反应器的设计组装及测试

本方法中共搭建了两种生物电化学系统，包括单室生物电化学系统(single-chamber bioelectrochemical system，SBES)和双室生物电化学系统(double-chamberbioelectrochemical system，DBES)。SBES分为三电极体系和反应器装置两部分，其中三电极体系选用1×1cm碳布(与钛丝相连)为工作电极(WE)、铂丝为辅助电极(CE)、Ag/AgCl电极为参比电极(RE)；反应器装置由玻璃电解杯和电极帽组成，电极帽上开有5个孔，其中3个放置电极，另外2 个为气体进出口，玻璃电解杯的最大容积为10mL。DBES也分为三电极体系和反应器装置两部分(图1)，三电极体系选用2×2cm碳布(与铂电极夹相连)为工作电极、铂丝为辅助电极、Ag/AgCl电极为参比电极；反应器装置分为左右两室，两室之间由密封圈和5×5cm正方形Nafion 117质子交换膜隔开，辅以不锈钢圆夹固定；其中左室为阳极室，左室顶部为蓝盖瓶，蓝盖瓶上开有1个孔，用于放置辅助电极，右室为阴极室，右室顶部为蓝盖瓶，蓝盖瓶上开有4个孔，其中2个孔用于放置工作电极和参比电极，另外2个孔为气体进出口，取样口和气体进口共用，两室最大容积为135mL。

生物电化学系统SBES体积较小，主要用于生物电化学系统条件优化和电子载体性能表征测定等实验；生物电化学系统DBES体积较大，主要用于后续电子载体筛选实验。两种系统搭建完成后，分别进行电化学参数测定，主要包括时间-电流曲线和循环伏安曲线测试。通过测试发现，两种电化学系统中M9缓冲液的背景电流平稳，装置稳定运行；电子载体RF的氧化还原峰明显，无杂峰，说明系统电化学参数测试正常。

实施步骤2、微生物电子传递检测方法的建立

(1)测试希瓦氏菌对不同电子受体的电能响应能力

希瓦氏菌是革兰氏阴性菌，能够利用多种物质作为末端电子受体，如延胡索酸、硝酸盐、亚硝酸盐、二甲基亚砜等。为了选取合适的电子受体进行电子传递能力的评价，通过搭建生物电化学系统对这些电子受体进行测试。因此，从中选取了延胡索酸、硝酸盐和二甲基亚砜 3种电子受体进行还原测试。利用SBES进行3种电子受体的电流响应试验。工作电极选用碳布，希瓦氏菌离心后重悬到SBES中，菌浓为1.0。将恒电位仪检测技术调至i-t曲线，电位设置为-0.65V(vs Ag/AgCl)，运行0.5h后，系统中电流趋于稳定，在3-10μA之间，以此作为系统背景电流，分别向SBES中加入0.1mM延胡索酸、0.1mM硝酸盐和0.1mM二甲基亚砜，SBES中响应电流立刻上升，电流分别上升到26μA、33μA、55μA，这说明在SBES中，希瓦氏菌能够以电极作为电子供体，以延胡索酸、硝酸盐和二甲基亚砜作为电子受体，进行电子传递。由于硝酸盐和二甲基亚砜在后续试验中检测比较复杂，且试剂本身属于危险化学品，而延胡索酸易检测分析，试剂安全性高。因此，在进行后续电子载体筛选中，优先选择延胡索酸作为电子受体。

(2)核黄素介导希瓦氏菌还原延胡索酸的电流响应

核黄素能够介导希瓦氏菌的胞外电子传递过程，也是被利用最多的电子载体。因此在以延胡索酸作为电子受体时，电子载体核黄素应该能够提高希瓦氏菌还原延胡索酸的能力。为了验证这个猜想，我们先向生物电化学系统中添加电子受体延胡索酸，待体系中产生的电流稳定后，再向体系中添加电子载体核黄素，观察希瓦氏菌对延胡索酸的电流是否有进一步增强，从而确定核黄素等电子载体是否能够介导希瓦氏菌的延胡索酸还原。选取DBES进行试验，希瓦氏菌培养后离心重悬，菌浓为1.0。电位控制在-0.65V(vs Ag/AgCl)，运行10min后，电流趋于稳定，电流在10μA以下，加入40mM延胡索酸后，出现电流响应，电流维持在50μA 左右，随后加入50μM电子载体核黄素，响应电流立刻上升到8mA左右，而未添加核黄素的对照组，电流仍旧维持在50μA附近。同时对其进行循环伏安曲线分析(图2)，结果发现添加核黄素后的循环伏安曲线上有明显的还原波形，而未添加核黄素的循环伏安曲线还原波形很小。这些数据说明核黄素能够介导希瓦氏菌还原延胡索酸。

(3)确立微生物电子传递的测量指标

确立合适的测量指标，可以系统分析电子载体的性能。在微生物电子传递过程中，有许多指标可以描述其性能，如功率、电流、产物形成速率、库伦效率、污染物去除速率等，在这些指标中，我们选取了电流密度、还原当量和库伦效率3个指标对电子载体的性能进行评价。第一个评价指标是电流密度，也称为电子传递速率，是指单位时间里通过某一单位面积的电子量，是衡量电子转移数目的重要参数。这个指标主要是利用i-t曲线而得，而i-t曲线可以通过多通道恒电位仪进行测定。第二个评价指标是还原当量，即还原产物的形成量。还原当量不仅反映了还原产物的总量，还能反映单位时间内产物的形成速率。第三个评价指标是库伦效率，也称为电荷传递效率或电子回收率，用于衡量产物回收电量占消耗总电量的比例。除了上述3个电化学评价指标外，还挑选了细胞毒性作为第四个评价指标。由于电子载体都是化学小分子，当电子载体的浓度上升时，会对微生物造成细胞损伤和生长抑制，影响微生物电子传递过程。

实施步骤3、人工电子载体的挖掘和初步筛选

(1)电子载体对希瓦氏菌的细胞毒性

在本发明中，将希瓦氏菌在含有不同浓度电子载体的培养基中进行培养，根据细胞浓度分析电子载体对希瓦氏菌的细胞毒性。根据电子载体对希瓦氏菌的细胞毒性，可将电子载体分为三类：无毒性或毒性较小、有一定毒性和毒性较大。

第一类电子载体为甲基紫精(MV)、铁(PH)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、茜素红(AR)、腐殖酸(HA)、2,6-二叔丁基苯醌(DTBBQ)和蒽醌-2-磺酸钠(AQS)这7种电子载体，这类电子载体对细胞无毒性或毒性较小。以MV和AQS为例，当电子载体浓度在0.5mM以下时，希瓦氏菌都能够正常生长；当电子载体浓度超过0.5mM时，才对菌株产生一定的抑制作用。第二类电子载体为中性红(NR)、2,6-二氯靛酚(DCPIP)、核黄素(RF)、苄基紫精(BV)和亚甲基蓝(MB)这5种电子载体，这类电子载体对细胞有一定毒性。以NR为例，当电子载体浓度在0.05-0.5mM范围内，希瓦氏菌的生长受到抑制；当电子载体浓度超过0.5mM时，希瓦氏菌不能生长。第三类电子载体为硫堇(LV)和吩嗪硫酸甲酯(PMS)这 2种电子载体，这类电子载体对细胞的毒性较大。以PMS为例，当电子载体浓度为0.01mM时，希瓦氏菌生长能力下降，当电子载体浓度为0.05mM时，希瓦氏菌已完全不能生长，说明这类电子载体对细胞的毒性较大。由于电子载体对希瓦氏菌的细胞毒性大小不一，为了对比电子载体的性能，需要在相同电子载体浓度的条件下进行电子传递能力测试。因此，选取0.05mM作为反应体系中电子载体的终浓度，在此浓度下，大多数电子载体对细胞无毒性或毒性较小。

(2)电子载体的电流响应

如果电子载体能够介导希瓦氏菌还原延胡索酸，当向反应体系中加入电子载体后，会出现明显的电流响应。因此，可利用电子载体的电流响应现象对电子载体进行初步筛选。选取 14种电子载体进行筛选，发现7种电子载体电流响应十分明显，分别是NR、MV、AR、RF、BV、AQS和PMS。当向体系中加入40mM延胡索酸后，希瓦氏菌出现电流响应，电流大小在50μA左右，此时电流为希瓦氏菌还原延胡索酸产生；当向体系中加入0.05mM电子载体后， 7种电子载体电流出现响应，电流从50μA上升到1-8mA，如中性红，电流响应强度为8mA，响应电流提高了160倍，即希瓦氏菌延胡索酸还原能力提高了160倍。通过本试验，初步筛选出7种电子载体能够介导希瓦氏菌还原延胡索酸。

(3)系统电流密度

通过向DBES中添加电子载体介导希瓦氏菌还原延胡索酸，体系运行8h。试验结束后，记录试验电流，分析电流密度和电子传递累积电荷量。本实验中工作电极为2×2cm碳布，因此对试验产生的电流进行计算后，便能得出电子载体介导希瓦氏菌还原延胡索酸的电流密度；对电流进行积分后，便是电子载体在还原试验中电子传递累积电荷量。希瓦氏菌对照组电流密度最大只有0.021mA/cm2，累积传递电子电量2.4C；添加7种电子载体后，电流密度均有明显提高，其中电流密度最大的是AQS，为2.1mA/cm2，是对照组的100倍，且在还原过程中其电流密度始终高于其他电子载体，累积传递电子量为188.9C；电流密度最小的是PMS，为0.4mA/cm2，累积传递的电子量为41.6C，但是也明显高于对照组电流密度和电子电量。这说明随着电子载体的加入，希瓦氏菌的电流密度显著增强，其胞外电子传递能力也显著增强。

(4)库伦效率

根据还原当量和电流累积的电子量可以计算电子载体介导希瓦氏菌还原延胡索酸的库伦效率。由于希瓦氏菌对照组在电还原下生成的还原当量很小，电流累积传递的电子量也很小，库伦效率不再计算，只讨论7种电子载体在电子传递过程中的库伦效率。在这7种电子载体中，库伦效率均超过了70％，其中库伦效率最高的是BV，库伦效率达到97.6％，其次是AR，库伦效率为89.5％，RF和NR库伦效率接近，分别为82.2％和81.3％，MV库伦效率为78.0％， AQS库伦效率为77.4％，库伦效率最低的是PMS，为75.2％。

综上所述，在电子载体介导希瓦氏菌胞外电子传递过程中，共筛选出7种具有电子传递效应的电子载体，并从细胞毒性、电流密度和电子电量、还原当量和库伦效率等性能指标进行了分析，其中AQS、MV和AR对细胞毒性较小，AQS电流密度和累计传递电量最大，AQS、RF和BV还原当量较高，而BV库伦效率最高(图3)。结果说明，外源添加适合的电子载体可以显著增强希瓦氏菌胞外电子传递能力。

实施步骤4、AQS电子载体的理论设计和修饰改造

在电子载体的筛选中，我们发现电子载体氧化还原电势和库伦效率可能存在着关系：电子载体氧化还原电势更低，其库伦效率可能更高。氧化还原电势是影响电子载体转移电子的重要因素，为了获得电子传递效率更高的电子载体，综合细胞毒性、电流密度和库伦效率等因素，对AQS进行了设计改造。

(1)电子载体的氧化还原表征分析

延胡索酸还原为琥珀酸的最低氧化还原电势为-0.227V(vs Ag/AgCl)，因此只有电子载体的氧化还原电势比它要低，才能发生延胡索酸的还原过程。电子载体如果想参与某一还原反应，其氧化还原电势必须处于施加电势和发生这个还原反应所需的最小氧化还原电势之间。一般情况下，在合适的电位范围内，当电子载体的氧化还原电势更低时，其库伦效率可能越高。在筛选的7种电子载体中，AQS对细胞无毒性，电流密度最高，还原当量较高，但库伦效率稍低，因此，为了获得更高电子传递效率的电子载体，选取AQS进行改造，使其氧化还原电势降低，从而有助于提高其库伦效率。

(2)电子载体修饰改造的理论计算依据

AQS活性基团主要位于9位和10位上的羰基，AQS在溶液中的电子转移机制最有可能是电子耦合质子转移反应，即分子在发生电子转移的过程中必然伴随着质子的转移(图4)。 AQS的还原主要通过不完整的1e-/1H+过程生成自由基或通过完整的2e-/2H+过程生成稳定的二氢化合物AQSH2。因此，AQS有3种氧化态：完全氧化的AQS，带有1个电子不稳定的阴离子自由基AQS-和带有2个电子的阴离子AQS2-，每种氧化态都有相对应的质子形式。AQS·-结合质子(step2)可以转变为自由基AQS·，或再接受1个电子(step5)生成AQS2-；AQS的一氢化合物阴离子AQSH-可以通过AQS·接受1个电子或AQS2-结合1个质子生成；一氢化合物AQSH-结合1个质子可转变为二氢化合物AQSH2。基于密度泛函理论，利用VASP软件对AQS 衍生物在电子传递过程中产生的标准吉布斯自由能变进行了计算，由于AQS在还原过程中，可被还原为一氢化物(2e-/1H+)和二氢化物(2e-/2H+)，因此分别计算这两种条件下的标准吉布斯自由能变化。由于AQS在7个位置均可以发生取代反应，因此对这7个位置分别进行基团取代，共选择了6种基团，包括甲基(-CH3)、醛基(-CHO)、酰胺基(-CONH2)、羧基(COOH)、氨基(-NH2)和羟基(-OH)。

(3)AQS衍生物的酸解离常数

由于AQS衍生物在发生电子传递的过程中，溶液中的pH值会影响AQS衍生物一氢化物和二氢化物的形成和解离。因此，计算AQS衍生物的酸解离常数pKa，将十分重要。AQS衍生物的酸解离常数根据pKa＝-ΔG/2.303RT计算，其中ΔG为AQS衍生物二氢化物AQSH2解离为一氢化物AQSH-的标准吉布斯自由能变，R为气体常数(8.314J/mol/K)，T为25℃或298K 的绝对温度。在电子载体的筛选中，溶液的pH均为7，若计算的AQS衍生物酸解离常数pKa <7，则溶液中的AQS衍生物还原态主要以一氢化物存在，则其标准吉布斯自由能变则为一氢化物AQSH-(2e-/1H+)标准吉布斯自由能变，若酸解离常数pKa>7，则溶液中AQS衍生物还原态以二氢化物为主，则其标准吉布斯自由能变为二氢化物AQSH2(2e-/2H+)标准吉布斯自由能变。结果发现，绝大多数AQS衍生物的酸解离常数小于7，即在pH＝7条件下AQS衍生物主要以一氢化物AQSH-为主。

(4)AQS衍生物的标准氧化还原电势

电子载体的氧化还原电势可以通过能斯特方程来推测。根据氧化还原电对的吉布斯自由能变化，求其标准氧化还原电势。计算公式为E＝-ΔG/nF-EH，其中E(vs SHE)为标准氧化还原电势，ΔG为氧化还原电对发生电子转移的吉布斯自由能变化，n为1分子底物发生电子转移的个数，F为法拉第常数(23.06kcal/V/mol)，EH为正常氢电极的标准还原电势，为4.28V。综合AQS衍生物的氧化还原电势结果，发现在AQS的1位和4位进行修饰改造后，其氧化还原电势变化明显，其他5个取代基进行修饰改造后，对AQS氧化还原电势的影响很小。以AQS 在1位发生取代反应后的标准氧化还原电势为例(图5)，AQS-1-OH和AQS-1-COO-的标准氧化还原电势相比AQS更高，而AQS-1-NH2和AQS-1-COOH的标准氧化还原电势则更低一些，其他取代基的标准氧化还原电势则无明显变化。由于在化学合成中，AQS在4位改造难度较大，不易获得高纯度产品，因此，从1位发生取代的AQS衍生物中，选取了AQS-1-OH(氧化还原电势更高)和AQS-1-NH2(氧化还原电势更低)2种物质，直接进行化学合成。

实施步骤5、电子载体衍生物性能表征分析

AQS-1-OH和AQS-1-NH2两种AQS衍生物合成后，利用恒电位仪对其进行循环伏安法测定，以测试改造后的AQS衍生物氧化还原电势是否符合预期。同时以AQS和AQDS氧化还原电势作对照。AQDS也是一种常见的电子载体，其结构和AQS类似，在6位取代基上比AQS多一个磺酸基团，其标准氧化还原电势比AQS更高。结果发现，处于中间位置的是AQS，其氧化还原电势为-0.459V(vs Ag/AgCl)，AQS-1-NH2的氧化还原峰位于AQS左侧，其氧化还原电势更低，大小为-0.551V(vs Ag/AgCl)，氧化峰电位为-0.541V，还原峰电位为-0.561V；在AQS 右侧的是AQS-1-OH和AQDS的CV图，其氧化还原电势更高一些，AQS-1-OH氧化还原电势大小为-0.438V(vs Ag/AgCl)，其氧化峰电位为-0.424V，还原峰电位为-0.452V；AQDS氧化还原电势大小为-0.402V(vs Ag/AgCl)，其氧化峰电位为-0.356V，还原峰电位为-0.448V。这说明通过对AQS侧链基团进行修饰改造后，其氧化还原电势确实发生了变化，且变化结果符合计算预期。

随后，对几种AQS衍生物进行了电子传递能力测试，通过细胞毒性、电流响应、电流密度和累计传递电子量、还原当量和库伦效率等性能指标进行分析(图6)。在细胞毒性方面， 4种电子载体对细胞基本无毒性，当电子载体浓度上升为1mM时，AQDS表现出一定毒性，其他3种电子载体无明显毒性，当电子载体浓度进一步上升到5mM时，这3种电子载体对细胞的生长才表现出一定的抑制作用。在电流响应方面，4种电子载体在加入系统中后均出现了明显的电流响应现象，其中AQS-1-OH、AQS和AQS-1-NH2电流响应强度都超过了6mA， AQDS电流响应较弱，最大响应电流不到5mA。在电流密度和累计传递电子量方面，除AQDS 电流密度较低外，其他3种电子载体电流密度很接近，最大电流密度约在2mA/cm2附近， AQS-1-OH传递的电子电量最高，为192.3C，AQS传递的电子电量次之，为188.9C，AQS-1-NH2传递的电子电量为184.2C，AQDS传递的电子电量最少，为124.3C。在还原当量方面， AQS-1-NH2产生的还原产物最多，为5.94mM，其次为AQS，AQS-1-OH还原产物量为5.54mM， AQDS还原当量最少，为3.41mM。在库伦效率方面，AQS-1-NH2的库伦效率最高，为83.7％，其次为AQS的77.4％，AQS-1-OH的库伦效率为75.1％，AQDS库伦效率最低为71.5％。

通过对筛选出的电子载体进行氧化还原表征，发现在设定电位-0.65V和延胡索酸最低还原电位-0.227V之间，当电子载体的氧化还原电势更低时，其库伦效率可能越高。针对这个现象，提出了电子载体氧化还原电势和电子传递能力之间关系的假设。为了提高电子载体的库伦效率，对AQS进行了设计改造，在了解了AQS电子传递机理后，通过在AQS侧链7个取代基位置上添加6种化学基团，模拟AQS衍生物的标准氧化还原电势，最终选取了氧化还原电势更高的AQS-1-OH和氧化还原电势更低的AQS-1-NH2进行化学合成，通过对4种AQS衍生物进行氧化还原表征和电子传递能力测定后，发现其氧化还原电势符合理论计算预期，成功验证了假设：在一定的电位范围内，电子载体的氧化还原电势更低，其库伦效率更高。

因此，在微生物电合成中，由于电子载体的差异，可优先选择电流密度更大，氧化还原电势更低的电子载体，也可对电子载体进行设计改造，降低电子载体氧化还原电势，提升电子载体库伦效率，实现电能向化学能的高效转化。