一步法检测Z/S亚型埃博拉病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其试剂盒

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种一步法检测Z/S亚型埃博拉病 毒的实时荧光定量RT‑PCR方法及其试剂盒和引物与探针。

埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever，EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的，主要以人和非人类灵长类动物为易感动物的急性出血 性传染病。该病1976年首次发生于埃博拉河流域的刚果民主共和国(前扎 伊尔)，因感染者全身呈出血症状，故命名为埃博拉出血热。据推测最初人 类感染EBOV主要是因为人类接触感染了病毒的动物宿主或者间接宿主的 身体。在这之后人与人之间通过直接接触已经感染了病毒的人的身体进行传 播。在经历一段2‑21天的潜伏期之后，感染病毒的病人就会出现一些发热 的症状。EHF的主要特征是迅速发热，寒冷，头痛和肌肉疼痛，之后会产生 咽喉肿痛，恶心，呕吐，腹泻以及腹痛。大约一半的病人会出现出血症状， 例如从鼻孔出血，出现血尿或者是胃肠出血和阴道出血。EHF目前为止主要 呈现地方性流行，绝大部分集中于非洲。非洲以外地区偶有病例报道，均属 于输入性或实验室意外感染，未发现有EHF流行。EBOV已经被证实是通 过体液传播的，如口腔和结膜接触传播，这在非人灵长类动物试验已确证。 自然界的动物各种行为和其它因素都有可能造成EBOV的爆发。为了防止 EBOV进入我国，对我国的经济以及人身安全造成严重的损失，目前我国急 需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。

EHF的病原是EBOV，属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属(Filovirus) 成员，是非分节段的单股负链RNA病毒。目前已鉴定的埃博拉病毒有5种 亚型，分别是：EBOV‑扎伊尔型(Ebola‑Zaire，简称EBOV‑Z)，EBOV‑苏丹 型(Ebola‑Sudan简称EBOV‑S)，EBOV‑本迪布焦型(Ebola‑Bundibugyo，简 称EBOV‑B)，EBOV‑科特迪瓦型(Ebola‑Ivory Coast，简称EBOV‑C)，EBOV‑ 莱斯顿型(Ebola‑Reston，简称EBOV‑R)。感染EBOV‑Z，EBOV‑S和EBOV‑B 的致死率大约在25％‑90％。目前，EHF大爆发几乎都是由EBOV‑Z和EBOV‑S 引起的。这两种亚型病毒的所造成的死亡人数占由EBOV所造成的死亡人数 的98％以上，所以对Z/S两种亚型的检测方法建立成为EBOV防控的重点。

荧光定量RT‑PCR具有快速、敏感和高通量的特点，一步法荧光定量 RT‑PCR方法还能降低残留污染，并且荧光定量RT‑PCR方法已作为多种病 毒的检测方法。在EBOV的检测方法研究领域，IgG‑捕获ELISA和IgM‑捕 获ELISA是仅有的两类常用检测方法，建立一种敏感、特异的荧光定量 RT‑PCR方法对EBOV的防控具有重要的实践意义。

经对现有技术的文献检索发现，国内没有EBOV检测技术的专利公布。

本发明要解决的技术问题是针对没有EBOV荧光定量PCR检测技术的 问题，提供一种在一次检测中即可对Z/S两种亚型埃博拉病毒进行检测的实 时荧光定量RT‑PCR的检测方法及其试剂盒。该方法检测的敏感性可达到100 个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检测小于1.5个小时，操作简易， 可以进行高通量的样品检测。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明的技术方案一为，一种特异性扩增Z/S亚型埃博拉病毒的引物对， 所述的引物长度25±5nt，其中一条引物含有一个简并碱基，该简并碱基分 别和Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点相同，该引物 中该简并碱基以外的序列与Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志序列相 同；另一条引物也含有一个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S两种亚型EBOV 的特异性遗传标志序列的差异位点互补，该引物中该简并碱基以外的序列与 Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志序列互补；该引物对的扩增片段为 70‑300bp，优选196bp。

优选的，所述的引物对中，一条是SEQ ID NO：16所示序列的核苷酸， 另一条是SEQ ID NO：17所示序列的核苷酸。

本发明的技术方案二为，一种检测Z/S亚型埃博拉病毒的探针，所述的 探针长度为18±5nt，该探针含有一个简并碱基，该简并碱基分别和本发明 的引物对在Z、S两种亚型EBOV的扩增产物的序列的差异位点相同，该探 针中该简并碱基以外的序列与本发明的引物对在Z、S两种亚型EBOV的扩 增产物的序列相同；或者，该简并碱基分别和本发明的引物对在Z、S两种 亚型EBOV的扩增产物的序列的差异位点互补，该探针中该简并碱基以外的 序列与本发明的引物对在Z、S两种亚型EBOV的扩增产物的序列互补。

优选的，所述的探针为Taqman探针。更优选的，所述的探针为MGB 探针。

优选的，所述的探针的序列为SEQ ID NO：18。

本发明的技术方案三为，一种检测Z/S亚型埃博拉病毒的实时荧光定量 RT‑PCR试剂盒，该试剂盒包括如上所述的的本发明引物对以及探针。

优选的，所述的试剂盒还包括：阳性对照品、阴性对照品、RNA提取 试剂、和荧光定量反应液。

优选的，所述的荧光定量反应液包括PCR缓冲液、dUTPs溶液、Taq DNA 聚合酶、AMV酶、无菌双蒸水和MgCl2溶液。

本发明的技术方案四为，一种一步法检测Z/S亚型埃博拉病毒的实时荧 光定量RT‑PCR方法，包括以下步骤：

1)提取待检样品的RNA；

2)将上述RNA加入荧光定量反应液中，采用本发明所述的引物对以及 探针，用实时荧光PCR仪进行扩增检测；

3)通过比较待检样品和标准品的循环阈值而对待检样品的其实拷贝数 进行定量。

本发明的技术方案五为，如上所述的试剂盒在常规非生物安全P4级实 验室中检测Z/S两种亚型埃博拉病毒的应用。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明采用的EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR检测方法， 具有以下优点：(1)特异性高。由于MGB探针荧光定量RT‑PCR使用核酸 杂交原理，具有很高的特异性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，提高 了特异性，降低假阳性；(2)灵敏度高。荧光定量RT‑PCR利用扩增产物的 积累和荧光信号建立对应关系，计算机辅助设备接受荧光信号并判定结果。 检测敏感性比常规RT‑PCR更高。(3)操作简单、高通量、防污染。使用一 步法荧光定量RT‑PCR检测，不需要打开反应管盖进行琼脂糖电泳，不易污 染后续待检测样品。扩增和检测一步完成，操作简单，适合高通量大规模样 品检测。(4)节约时间。采用一步法荧光定量RT‑PCR，使RT反应和PCR 反应过程在同一个反应管中进行，简化了实验操作，整个实验可以更快速完 成。(5)安全性高。本发明中采用的阳性对照是根据EBOV五种亚型病毒NP 基因、MARV NP基因、XHFV NP基因、DHV NP基因序列体外转录的一段 273nt的RNA分子，相对于以灭活病毒液作为阳性对照的检测，增加了安 全性，体外转录的RNA分子还可以大量制备，阳性对照来源稳定、可靠， 避免了灭活病毒株在每次实验中带来的可能生物安全风险。(6)EBOV属于 我国必须严密监控其传播入我国的急性烈性外来人兽共患传染病，本发明建 立的敏感性高、特异性强、安全性好，能够同时检测Z/S两种最常见亚型的 EBOV的检测方法对我国EBOV的防控工作具有重要意义。(7)本发明是一 种通用检测方法，在一次PCR检测中就可以检测Z、S两种亚型EBOV。只 要待检样品中有Z、S两种亚型EBOV中的任何一种存在或者两种同时都存 在，就能检测出来阳性。

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是引物和探针与EBOV、MARV、XFHV、DHFV相应基因比对结 果。

图2是EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR检测方法扩增曲 线。

图3是EBOV Z、S亚型一步法MGB探针荧光定量RT‑PCR检测方法敏 感性扩增曲线。

本发明人经过深入而广泛的研究，从埃博拉病毒的NP基因中发现较合 适的扩增序列。其中，NP为主要的核衣壳蛋白。NP蛋白对于核衣壳组成至 关重要。核衣壳是病毒吸附、侵入宿主细胞的主要功能者，与致病性关系重 大，也是影起宿主细胞抗体反应的关键。因此，选择这一NP基因序列作为 引物，具有很好的特征性。

由于埃博拉病毒的传染性和致病性极强，埃博拉病毒的实验必须在生物 安全4级实验室内操作。目前世界上具备上述条件的实验室为数不多。本发 明发现埃博拉病毒NP基因的某一片段是埃博拉病毒的特征序列，可以代表 埃博拉病毒而与其他病毒区分开来。而这一核苷酸片段没有任何传染性或致 病性，可以在普通实验室中应用，而不必在生物安全4级实验室内操作。由 此本发明建立了一种在世界上非P4级实验室可以用的检测方法，可应用于 调查我国人或动物是否感染了EBOV。

目前埃博拉病毒共有Z、S、B、C、R五种亚型，该五种亚型的多个埃 博拉病毒株的NP基因进行同源性比较结果表明，5种亚型间基因序列同源 性大于65％，亚型内部毒株序列同源性95％以上，亚型间的差异区域集中在 固定的点。

虽然通过同源性比较，NP基因的全长基因中有多个区域可以作为5种 亚型埃博拉病毒的各个亚型的特异性标志区域。但是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列是特 别优选的分别适合作为EBOV Z、S、B、C、R的特异性遗传标志的序列。 因此，基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，本发明提供了各型埃博拉病毒的阳性标准分子。还提供了特异性 扩增这些阳性标准分子的引物对，所述的引物长度25‑38个核苷酸，且一个 与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5 所示序列相同，另一个相应的与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5所示序列互补，并且扩增产物的长度为 50‑300bp，较佳的如297bp、196bp。例如，SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：1所 示的序列相同，而另一个引物SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：1所示的序列互 补，且扩增产物的长度为297bp。这些引物序列优选SEQ ID NO：6～15所示。

虽然共有五种亚型的埃博拉病毒，分别为EBOV‑Z，EBOV‑S，EBOV‑B， EBOV‑C，EBOV‑R。但是目前埃博拉出血热大爆发几乎都是由EBOV‑Z和 EBOV‑S两种引起的。这两种亚型病毒的所造成的死亡人数占由EBOV所造 成的死亡人数的98％以上。其它三种亚型病毒也就感染动物，如猪等引起发 病。所以对Z/S两种亚型的检测方法建立成为EBOV防控的重点。

因此，本发明基于埃博拉病毒特异性标志片段SEQ ID NO：1‑5，本发明 提供了一种利用PCR扩增NP基因检测Z、S两种亚型埃博拉病毒的方法。 还提供了一种快速定量检测Z、S两种亚型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂 盒。本发明的检测中，最具有特的是一次可以同时检测Z、S两种亚型EBOV 中的任何一种或者两种。只要待检样品中有Z、S两种亚型EBOV中的任何 一种，或者两者同时存在，就能检测出来阳性，表示待检样品中含有Z、S 两种亚型EBOV中的任何一种或者两种RNA。其中最关键的是使用了特殊 的的引物对。

引物对

本发明人根据5种亚型埃博拉病毒的NP基因特异性标志片段，利用他 们之间序列上的共同点及其差异，设计了引物对。该引物对在EBOV‑Z和 EBOV‑S的标准株中扩增出相应的DNA片段，而在其他的埃博拉亚型病毒 EBOV‑B，EBOV‑C，EBOV‑R的标准株中不能扩增出相应的DNA片段，也 未在其他相关病毒，包括马尔堡病毒、新疆出血热病毒、登革热病毒、乙型 脑炎病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒中扩增出相应 片段，说明以NP基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。 并且该引物对可以在一个反应体系中同时对两种亚型埃博拉病毒EBOV‑Z 和EBOV‑S进行检测。在一次PCR反应中，就可以鉴定EBOV‑Z和EBOV‑S 两种病毒。只要待检样品中有Z、S两种亚型EBOV中的任何一种存在或者 两种同时存在，就能检测出来阳性。

就敏感性而言，本发明以NP基因特异性标志片段为基础设计的PCR反 应系统能够检测到102个阳性标准分子/μl。本发明检测的敏感性可达到100 个拷贝的病毒RNA分子(体外转录获得)，对于单个样本检测小于2个小时， 操作简易，可以进行高通量的样品检测。

本发明的引物对对于Z、S两种亚型EBOV中的任何一种都可以特异性 扩增得到产物，而对其他序列不能特异性扩增，从而可以一次性检测出待检 样品中是否含有Z、S两种亚型EBOV中的任何一种或者两种。该引物对中， 引物长度25±5nt，优选20±2nt，其中一条引物含有一个简并碱基，该简 并碱基分别和Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点相同， 该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志 序列相同；另一条引物也含有一个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S两种 亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点互补，该引物中该简并碱基以 外的序列与Z、S两种亚型EBOV的特异性遗传标志序列互补；该引物对的 扩增片段为70‑300bp，优选196bp。优选的，所述的引物对中，一条是SEQ ID NO：16所示序列的核苷酸，另一条是SEQ ID NO：17所示序列的核苷酸。

本发明所述的特异性扩增埃博拉病毒的引物以及检测用探针，可根据本 发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO：1～5)进行设计，并通过常规的DNA 合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。

本发明的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或者其他 化学发光物质进行标记。

本发明所述的引物和探针具有很好的亚种特异性。用本发明的引物进行 常规RT‑PCR反应，结果能从含有Z和/或S亚型埃博拉病毒RNA材料中扩 增出大小196bp的产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过 判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速的检测埃博拉病毒，而且所 需的样品量很少。

探针

为了减少假阳性，还可以对扩增产物用埃博拉病毒特异性探针进行杂 交。优选Taqman探针，更优选MGB探针，它可在PCR反应中直接实时的 通过荧光信号反应扩增产物的存在与否以及数量的高低。MGB探针是一种 新型TaqMan探针，具有特异性好、灵敏度高、稳定性好、优化步骤简单、 结果精确、分辨率高等优点。探针3’端连接的是非荧光性的淬灭基因——淬 灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。MGB 探针比普通的TaqMan探针背景荧光信号更低，检测效果明显优于普通 TaqMan探针。同时，MGB探针审计的长度较普通Taqman探针更短，可小 于20bp。MGB探针可提高配对与非配对模板间的Tm值差异，当非配对模 板与配对模板间有一个碱基的差异时，该探针即不与其结合而不能进行PCR 扩增，从而大大提高检测的特异性。

本发明的探针在扩增产物的基础上设计，长度为18±5nt，最佳的是 17nt。本发明的探针含有一个简并碱基，该简并碱基分别和本发明的引物对 在Z、S两种亚型EBOV的扩增产物的序列的差异位点相同，该探针中该简 并碱基以外的序列与本发明的引物对在Z、S两种亚型EBOV的扩增产物的 序列相同；或者，该简并碱基分别和本发明的引物对在Z、S两种亚型EBOV 的扩增产物的序列的差异位点互补，该探针中该简并碱基以外的序列与本发 明的引物对在Z、S两种亚型EBOV的扩增产物的序列互补。优选的，探针 序列为SEQ ID NO：18。

试剂盒

将本发明的引物与探针技术结合，便得到了本发明的埃博拉病毒的实时 荧光定量RT‑PCR检测方法及其试剂盒。这种方法不仅克服了常规RT‑PCT 方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

在一优选例中，一种检测Z/S亚型埃博拉病毒的实时荧光定量RT‑PCR 试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增埃博拉病毒遗传标记分子的引物和荧光探 针。优选的如引物序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，荧光探针序列为 SEQ ID NO：18。

该试剂盒较佳的还包括阳性对照品，阴性对照品。其中，阳性对照品是 Z、S两种亚型埃博拉病毒的遗传标记核苷酸，优选SEQ ID NO：1、2所示序 列核苷酸中的任何一种。阴性对照品是马尔堡病毒、新疆出血热病毒、或者 登革热病毒的NP基因为基础的遗传标记核苷酸。或者是乙型脑炎病毒、猪 瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖或呼吸综合征病毒的培养物。该试剂盒较佳的 还包括定量校准品。本发明中所述的定量标准品是阳性对照分子SEQ ID NO：1(选择本发明所述的5种亚型病毒阳性对照分子都可以)，定量时采用 SEQ ID NO：1的10倍梯度水稀释液，稀释度从10‑1、10‑2、10‑3、10‑4、10‑5、 10‑6、10‑7、10‑8。在荧光定量PCR中，由于每个稀释度中RNA分子不同， 得到的Ct值就不同，根据定量标准品(梯度稀释的阳性对照分子)Ct值定 量样品中的病毒RNA分子。

该试剂盒较佳的还包括常规的实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒所包含 的成分，如包括RNA提取试剂、实时荧光定量RT‑PCR检测试剂。其中较 佳的，RNA提取试剂含有Trizol、RNA酶抑制剂。实时荧光定量RT‑PCR检 测试剂含有荧光定量反应液，其中包括PCR缓冲液、dUTPs溶液、Taq DNA 聚合酶、AMV酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液。

本试剂盒采用了荧光探针法进行Real Time PCR的专用试剂，可快速对 目的基因进行定量检测。较佳的，本试剂盒提供的实时荧光定量RT‑PCR检 测试剂中含有反应液荧光定量组合物，其包含了引物、探针、Taq酶等所有 组份。使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。

荧光可以被定量PCR仪内的荧光剂检测，荧光量的增加与PCR产物的 积累量成正比例关系。对埃博拉病毒的定量可以通过与定量校准品的循环阈 值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累 超过基底萤光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小， 起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度力定量校准 品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起 始拷贝数。

本发明的检测埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，通过对各组分，如 引物浓度、荧光探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，反复实验，试剂 盒完全可以满足快速特异检测Z、S两种亚型埃博拉病毒的实际需求。

检测方法

本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒检测埃博拉病毒的方法，该方 法包括以下步骤：

1)提取待检样品的RNA；

2)将上述RNA加入荧光定量反应液中，采用本发明所述的引物对以及 探针，用实时荧光PCR仪进行扩增检测；

3)通过比较待检样品和标准品的循环阈值而对待检样品的其实拷贝数 进行定量。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为 25℃。

以下实施例中，埃博拉病毒荧光定量RT‑PCR引物和MGB探针由上海基 康生物技术有限公司合成。连接T7启动子结合序列的引物由上海英俊生物 技术有限公司合成。T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒，dNTPs、 dUTP、Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DL2000 Marker购自大连宝生物工程有 限公司。10×Ex Taq Buffer，AMV酶、dATP、dAUP、dAGP、dACP，TaKaRa Ex Taq(5U/μl)购自大连宝生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装 或国产分析纯。荧光定量PCR仪是Mactercycler ep realplex 4(Effendorf Inc.)。ND‑1000微量紫外可见分光光度计购自NanoDrop Technologies， Inc.。

实施例1引物和探针设计

一、实验步骤

埃博拉病毒荧光定量RT‑PCR引物指的是：长度25±5nt的寡核苷酸链， 其与EBOV Z、S亚型病毒共有的NP基因的序列完全相同或者互补。埃博拉 病毒荧光定量RT‑PCR探针指的是：长度长度18±5nt的寡核苷酸链，其5’ 端标记着荧光激发基团，3’端标记着MGB(minor groove binder)；其与EBOV Z、S亚型病毒共有的NP基因的序列完全相同或互补。

根据NCBI基因数据库中公布的EBOV和MARV、XFHV、DHFV NP基因序列 (参考毒株信息见表1)，利用引物和探针设计软件Primer Express 2.0(美 国应用生物系统公司)设计了对于Z、S亚型EBOV特异性的荧光定量PCR引 物和探针。引物及探针序列见表2，表2中引物基因位置指在Zaire Ebola virus strain Mayinga(NCBI登录号AF499101.1)基因上位置。设计的引物 和探针与EBOV、MARV、XFHV、DHFV相应基因序列比对结果见图1。

表1.设计引物和探针参考的毒株信息

表2.EBOV Z、S亚型一步法MGB探针荧光定量RT‑PCR的引物和探针

二、实验结果

该设计的引物探针中，各引入了一个简并碱基，能保证特异性的扩增Z、 S亚型EBOV基因序列。设计的引物和探针序列与EBOV B、C、R亚型，MARV、 XHFV、DHFV相应序列都存在3个以上的碱基错配，理论上不能有效扩增这些 病毒的序列。引物和探针序列经NCBI blast比对，与EBOV NP基因以外序 列同源性低于65％，保证不会对EBOV NP基因以外序列非特异扩增。

实施例2 RNA阳性标准分子和阴性标准分子的制备

一、实验步骤

1、5种亚型EBOV、以及马尔堡病毒(marburgvirus，MARV)、登革热病 毒(dengue virus，DHFV)、新疆出血热病毒(xinjiang hemorrhagic fever virus，XHFV)(参考的毒株见表3)，按照登录号所示的序列，由南京金思 特科技有限公司完全人工合成它们的全长NP基因cDNA。MARV、XHFV、DHFV 作为阴性标准分子。

表3.人工合成全长NP基因cDNA参考的毒株信息

2、根据实施例1设计合成的引物(见表1)，沿EBOV NP基因序列上引 物扩增区域分别向外延长至273nt，设计上游引物和连接T7启动子序列的下 游引物。引物序列见表4。该引物序列在Zaire Ebola virus strain Mayinga (登录号AF499101.1)基因上位置见图1。

2、以人工合成的五种亚型EBOV、以及XHFV、DHFV的全长NP基因cDNA 为模板，用表4的引物PCR扩增分别得到各病毒297bp(含T7启动子序列) 的NP基因DNA片段。

表4.病毒NP基因片段体外转录引物序列

注：双划线字体为T7启动子序列。

4、在扩增得到的20.0μL PCR产物中加入5.0μL高压灭菌的3M醋酸 钠(pH5.2)，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于‑20℃放置10min， 12000r/m离心10min，弃去上清液，用1000μL 70％乙醇洗涤沉淀，弃去上 清液，沉淀于室温干燥10min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50μL充分溶 解沉淀，用紫外分光光度计测定DNA浓度。用以体外转录。

5、按T7 RiboMAXTM Express RNAi System说明书进行体外转录，DNA 模板加入量2μg，体外转录反应体系配制见表5。

表5.T7转录体系的配制

 组分   体积

 RiboMAX TM Express T72×Buffer   10.0μl

 DNA片段   4.0μL(2μg)

 无RNA酶的水   4.0μl

 Enzyme Mix，T7 Express   2.0μl

 总体积   20.0μl

按如下体外转录：37℃反应1h，加入无RNA酶的DNA酶1.0μl(1U)， 37℃30min。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，加入等体积的异丙醇， 混匀后冰浴5min，14000×g离心10min，小心吸去上清液，500μl 70％乙 醇洗涤沉淀，吸去上清液，沉淀于室温干燥10‑15min，加入100μl水充分 溶解沉淀，紫外分光光度计测定RNA浓度，计算每微升溶液中RNA分子拷贝 数。测定方法为：体外转录RNA分子长273nt，每个碱基平均分子量是330， 阿伏伽德罗常熟(每mol的微粒数)6.02×1023个/mol，已知浓度的RNA单 位体积中模板数公式为：分子数(个/μl)(RNA浓度×6.02×1023个/mol) /[273bp×330g(mol×bp)]。测定含量后小份分装，‑80℃保存备用。即 为5种亚型EBOV、以及MARV、DENV、XHFV由NP基因而来的273nt长的RNA 分子，作为以下实验的阳性标准分子和阴性标准分子。

实施例3样本RNA的提取

一、实验步骤

组织样品处理：取待检组织样品(如肝脏、肾脏)100mg左右置研磨器 中加入1000μL DEPC水研磨。取100μL已研磨好的待检组织上清，置1.5mL 灭菌离心管中，加入1000μL Trizol，混匀，静置10min。

液体样品处理：取待检液体样品(如血液、鼻部拭子的生理盐水稀释物、 呼吸道分泌物的生理盐水稀释液)100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入 1000μL Trizol，混匀，静置10min。加入200μL，强力摇震15s， 室温静置2～3min，4℃，12000g离心15min。小心吸取上层清液450μL至另 一洁净无DNA酶无RNA酶的1.5mL离心管内，加入650μL异丙醇，上下颠倒 几次，室温静置10分钟。4℃，12000g离心15分钟。弃去上清液，加入4℃ 预冷的750μL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心6分钟，弃去上清，沉淀 室温干燥至近似透明。加入DEPC水20μL(含RNA酶抑制剂20U)溶解RNA， ‑80℃保存或继续PCR。

实施例4MGB探针荧光定量RT‑PCR检测方法的建立和优化

一、实验步骤

将实施例2所得的EBOV‑Z的273nt长的RNA分子用无RNA酶水梯度稀 释，取含有RNA分子数103‑104的样品作为模板。采用实施例1设计的引物 和探针(见表2)，进行一步法MGB探针荧光定量RT‑PCR。通过100‑1000nM 范围内各个浓度的引物和探针的组合，寻具有较优反应效率和曲线的反应 体系和反应条件。每个样品3个重复，阴性对照模板以MARV的NP基因体外 转录的273nt RNA分子代替，空白对照模板以水代替。

二、结果

1、结果分析条件设定

阈值设定原则以阈值线刚好高于阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显 示为准。或可以根据仪器噪音情况进行调整。

2、质控标准

(1)阴性对照无Ct值，且无规则扩增曲线。

(2)阳性对照Ct值应＜35.0，扩增曲线典型。否则，此次实验无效。

3、结果判定

(1)阴性

无Ct值并且无规则扩增曲线，表示样品中无Z、S亚型EBOV基因组。

(2)阳性

Ct值≤35.0，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在Z、S亚型EBOV 基因组。

(3)有效原则

Ct值＞35.0的样品须重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

4、实验结果

经过优化，EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR检测反应体 系见表6，反应条件见表7。

表6.优化后EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR检测的反应体系

  反应体系成份 体积

  10×Ex Buffer 5μl

  dNTP(2.5mM) 4μl

  AMV(10U/μl) 0.4μl

  EBOV‑F(10μM) 1.6μl

  EBOV‑R(10μM) 1.6μl

  EBOV‑P(5mM) 2μl

  MgCl 2(50m M) 2μl

  RNA酶抑制剂(5U/μl) 2μl

  模板RNA 1μl

  Ex Taq(5U/μl) 0.2μl

  总体积 补充无RNA酶水至50μl

表7.优化后EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR检测的反应条件

实施例5 MGB探针荧光定量RT‑PCR检测的特异性

一、实验步骤

1、其他病毒的RNA提取

乙型脑炎病毒(JEV，SA14‑14‑2疫苗毒株)，购买自辽宁成大生物技术 有限公司乙型脑炎病毒疫苗，按照说明书加生理盐水稀释。猪瘟病毒(CSFV， HCLV疫苗毒株)，购买自哈尔滨维科生物技术开发公司疫苗，按照说明书加 生理盐水溶解。猪流感病毒(SIV，疫苗毒株)，购买自Intervet公司的End ‑FLUence(with Imugen)疫苗，直接用于本实施例。猪繁殖与呼吸综合征 病毒(PRRSV，CH‑1R疫苗毒株)，购买自哈尔滨维科生物技术开发公司疫苗， 按照说明书加生理盐水溶解。将该4种病毒按实施例3中液体样品的提取步 骤提取RNA。

2、分别以实施例2所得的阳性标准分子(EBOV‑Z，EBOV‑S的NP基 因体外转录的273nt长的RNA)、阴性标准分子(EBOV‑B，EBOV‑C，EBOV‑R， XHFV，DHFV的NP基因体外转录的273nt长的RNA)、以及上述4种病毒(乙 型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒)的RNA为 模板，进行MGB探针荧光定量RT‑PCR。其中，采用实施例1所得的引物和探 针(见表2)，采用实施例4所得的经过优化的反应体系(见表6)和反应条 件(见表7)。每个样品2个重复，空白对照组模板以水代替。

二、结果

1、阈值设定原则、质控标准、阴性阳性判定方法、有效原则同实施例4。

2、实验结果

(1)分别检测如下样品：阳性标准分子(EBOV‑Z，EBOV‑S的NP基 因体外转录的273nt长的RNA)、阴性标准分子(EBOV‑B，EBOV‑C，EBOV‑R， XHFV，DHFV的NP基因体外转录的273nt长的RNA)、乙型脑炎病毒(JEV， SA14014‑2疫苗毒株)、猪瘟病毒(CSFV，HCLV疫苗毒株)、猪流感病毒(SIV， 疫苗毒株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，疫苗毒株)，扩增曲线见图2。

(2)从扩增曲线可知，EBOV Z、S亚型一步法MGB荧光定量RT‑PCR 能特异性的检测Z、S亚型EBOV阳性标准分子，检测结果为阳性。其它样 品没有规则扩增曲线，检测结果为阴性。

实施例6 MGB探针荧光定量RT‑PCR检测的敏感性

一、实验步骤

1、将实施例2所得的EBOV‑Z的NP基因体外转录的273nt RNA分子用 无RNA酶水10倍梯度稀释，从101‑1010，每个稀释度中含有RNA分子数分别 为1010‑101个RNA分子/μl，得到稀释的阳性标准分子。

2、分别以稀释的阳性标准分子为模板，进行MGB探针荧光定量RT‑PCR 检测。其中，采用实施例1所得的引物和探针(见表2)，采用实施例4所得 的经过优化的反应体系(见表6)和反应条件(见表7)。阴性对照模板以MARV 的NP基因体外转录的273nt RNA分子代替，空白对照模板以水代替。

二、结果

1、阈值设定原则、质控标准、阴性阳性判定方法、有效原则同实施例4。

2、实验结果

(1)能够检测到102个阳性标准分子，其Ct值小于35。101个RNA分 子组和空白对照组无规则扩增曲线。全部样品扩增曲线见图3。

实施例7 MGB探针荧光定量RT‑PCR在流行病学调查中的应用

一、实验步骤

将实施例2所得的EBOV‑Z的NP基因体外转录的273nt长的RNA分子用 无RNA酶水10倍梯度稀释，取含有RNA分子数106的样品作为强阳性对照， 102个RNA分子的样品作为弱阳性对照。

采集野生动物，野猪、猴子血液样品，鼻部拭子的生理盐水稀释样品， 呼吸道分泌物的生理盐水稀释液，或病、死野猪、猴子解剖取肝脏、肾脏等 组织样品，按照实施例3提取RNA(所用研磨器及所有接触到临床样品的实 验器材都高压消毒)。

以提取的临床样品的RNA为模板，用上面稀释后的RNA分子作为模板， 进行MGB探针荧光定量RT‑PCR。其中，采用实施例1所得的引物和探针(见 表2)，采用实施例4所得的经过优化的反应体系(见表6)和反应条件(见 表7)。阴性对照模板以MARV的NP基因体外转录的273nt RNA分子代替，空 白对照模板以水代替。

二、结果

1、阈值设定原则、质控标准、阴性阳性判定方法、有效原则同实施例4。

2、实验结果

阴性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。