犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用。

背景技术：

2.犬尿氨酸，又称kynurenine，kyn，是氨酸的代谢物，是犬尿酸、和3-羟基犬尿氨酸(3-hk)以及其他沿犬尿氨酸途径形成的下游代谢物的直接前体(marszalek-grabska m et al.,2021.pharmacology&therapeutics 225:107845)。哺乳动物kyn主要来源是其在肝脏中的产生，其中3种分解代谢酶，即氨酸2,3-双加氧酶(tdo)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido1)和吲哚胺2,3-双加氧酶2(ido2)参与kyn的合成(cheong et al.,2018.trends in pharmacological sciences 39(3):307-325)。
3.目前研究发现犬尿氨酸在中枢神经系统和免疫系统中发挥重要作用，具有神经活性和氧化还原特性，被用作多种神经系统疾病的生物标志物。在肿瘤免疫中，kyn作为芳基烃受体(aryl hydrocarbonreceptor，ahr)的内源性配体，可通过促进ahr活化抑制抗肿瘤免疫反应(liu et al.,2018.cancer cell 33(3):480-494)。发明人的研究发现犬尿氨酸在特发性肺纤维化和干燥综合征所致肺纤维化患者血清中水平显著升高，但尚不清楚犬尿氨酸在肺纤维化的发病进程中发挥的作用。
4.研究表明，巨噬细胞是组织损伤修复，再生和纤维化的关键调节剂，在肺纤维化发病中起着决定性作用。巨噬细胞具有高度可塑性，受微环境的调控而发生表型功能的转变，根据不同表征可分为经典活化的巨噬细胞(m1 like)或可替代的活化巨噬细胞(m2 like)(wynn et al.,2016.immunity44(3):450-462)。在纤维化进程中，巨噬细胞向m2型极化导致m2的聚集和过度活化，一方面其可通过释放ccl18，il-13，il-10等多种趋化因子和细胞因子，以募集成纤维细胞和其他炎性细胞来调节纤维的产生；另一方面，活化的m2产生大量促纤维化相关介质(如tgf-β，pdgf)，以诱导成纤维细胞激活并促进肌成纤维细胞增殖迁移，并通过上调基质金属蛋白酶组织抑制剂产生来抑制细胞外基质降解，最终导致大量细胞外基质累积(zhang et al.,2018.respiratory research 19(1):170；hesketh et al.,2017.international journal of molecular sciences,18(7)；wang et al.,2021.theranostics；11:7110-7125)。尽管目前研究表明m2型巨噬细胞在肺纤维化进程中发挥着重要的作用，但是目前仍缺少可以临床应用的有效阻断m2巨噬细胞过度活化，进而阻止或逆转肺纤维化进程的药物。
5.目前，肺纤维化的手段主要包括药物及器官移植。器官移植作为肺纤维化患者仅能选择的最终手段，其应用推广受限于供体获取困难、手术风险高、手术费用昂贵。而现有药物无法逆转肺纤维化病程，其临床效果和安全性均无法满足需求。因此，亟需深入研究肺纤维化发生机制，寻新的靶点，充分结合创新的医药发展趋势，开发新型的可有效肺纤维化且安全性高的药物。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用，解决现有技术中难以通过药物有效肺纤维化的技术问题。
7.为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用。
8.进一步地，所述肺纤维化为特发性肺纤维化。
9.进一步地，所述肺纤维化为结缔组织疾病所致肺纤维化。
10.进一步地，犬尿氨酸降低纤连蛋白和i型胶原蛋白的转录和表达。
11.进一步地，所述犬尿氨酸降低羟脯氨酸的表达。
12.进一步地，所述犬尿氨酸通过抑制巨噬细胞向m2型活化，进而减缓肺纤维化。
13.进一步地，所述肺纤维化的患者为哺乳动物。
14.进一步地，所述哺乳动物为小鼠。
15.进一步地，所述犬尿氨酸的结构式为：
[0016][0017]
进一步地，所述药物为注射类药物或者雾化用药物。
[0018]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的犬尿氨酸在对于肺纤维化问题有显著的改善作用。
附图说明
[0019]
图1为实施例1气道注射犬尿氨酸或pbs的小鼠的肺组织的h&e、天狼星红、马松三法染结果图；
[0020]
图2为实施例1气道注射犬尿氨酸或pbs小鼠的肺纤维化的阿什克罗夫特得分结果，其中，****p《0.0001；
[0021]
图3示出了经博来霉素诱导纤维化后，气道注射犬尿氨酸或pbs小鼠中纤连蛋白(fibronectin)、1型胶原(collagen1)的rt-pcr结果，其中，*p《0.05；***p《0.001；****p《0.0001；
[0022]
图4示出了il-4刺激24h后，犬尿氨酸预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞中m2型标记物甘露糖受体(cd206)和精氨酸i(arginine 1，简写为arg1)的westernblot结果，*p《0.05，**p《0.01；
[0023]
图5示出了il-4刺激24h后，犬尿氨酸预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞中m2型标记物甘露糖受体(cd206)，精氨酸i(arginine 1)和fizz-l的定量rt-pcr结果，其中，*p《0.05。
[0024]
图6示出了il-4刺激24h后，犬尿氨酸预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞中m2型巨噬细胞比例的流式细胞检测结果，*p《0.05。
具体实施方式
[0025]
本具体实施方式提供了一种犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用。
[0026]
进一步地，所述肺纤维化为特发性肺纤维化。
[0027]
进一步地，所述肺纤维化为结缔组织疾病所致肺纤维化。
[0028]
进一步地，犬尿氨酸降低纤连蛋白和i型胶原蛋白的转录和表达。
[0029]
进一步地，所述犬尿氨酸降低羟脯氨酸的表达。
[0030]
进一步地，所述犬尿氨酸通过抑制巨噬细胞向m2型活化，进而减缓肺纤维化。
[0031]
进一步地，所述肺纤维化的患者为哺乳动物。
[0032]
进一步地，所述哺乳动物为小鼠。
[0033]
进一步地，所述犬尿氨酸的结构式为：
[0034][0035]
进一步地，所述药物为注射类药物或者雾化用药物。
[0036]
肺纤维化：在本发明中，肺纤维化包括特发性肺纤维化和结缔组织病所致肺纤维化。
[0037]
肺纤维化主要病理特点包括肺组织间充质细胞增殖、细胞外基质增生沉积及肺实质的重构等。目前主要采用抗炎、抗氧化、抗成纤维细胞增殖和胶原沉积及肺移植等措施肺纤维化。
[0038]
犬尿氨酸：在本发明中，犬尿氨酸是指氨酸经犬尿氨酸途径的主要中间代谢产物或化学合成产物。
[0039]
个体：在本发明中，术语“个体”指哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人。
[0040]
预防和：本发明所述“预防”是指在可能的促纤维因素的存在下，使用后防止或降低纤维化的产生。本发明所述“”是指降低纤维化的程度，或者治愈纤维化使之正常化，或者减缓纤维化的进程。
[0041]
本发明人通过以下实施例证实了通过给予犬尿氨酸可显著抑制巨噬细胞向m2型活化。其中，m2型巨噬细胞活化和聚集在肺纤维化的发病中发挥了极其重要的作用。
[0042]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043]
实施例1犬尿氨酸对肺纤维化程度的影响；
[0044]
实验动物及材料：
[0045]
1、实验动物：
[0046]
来源、种系、品系：从江苏集萃药康生物科技股份有限公司订购的野生型小鼠(wt，c57bl/6)，饲养于同济医院动物房；
[0047]
育龄：8～10周龄；
[0048]
2、实验材料：
[0049]
博来霉素：购自mce(medchemexpress)公司；
[0050]
钠：上海斯信生物科技有限公司；
[0051]
犬尿氨酸：购自sigma公司
[0052]
3、实验方法：
[0053]
采用钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉野生型小鼠，随后通过气道注射终浓度1.5u/kg的博来霉素，该博来霉素溶于50μl的pbs中，使用气道注射相同体积pbs的小鼠用作对照。在施用博来霉素或生理盐水14天后每天给予犬尿氨酸(由pbs配置，2.5mg/kg)或等体积pbs气道注射，每天一次，21天后处死小鼠，分析各小鼠肺部纤维化程度。由两位病理学家使用阿什克罗夫特评分系统以盲评的方式对每个连续区域的间质纤维化严重程度进行独立评估。
[0054]
4、实验结果：
[0055]
具体的，气道注射犬尿氨酸或pbs小鼠的h&e、天狼星红、马松三法染结果如图1所示可见，h&e染结果显示经博来霉素诱导后小鼠肺组织中肺泡结构破坏，大量炎症细胞浸润，masson染示胶原纤维聚集，sirius red染表明肺泡间隔胶原纤维增多，而经过犬尿氨酸处理之后，小鼠肺损伤和纤维化显著减轻，胶原纤维聚集减少。
[0056]
阿什克罗夫特评分结果如图2所示(生理盐水组评分为0.1，0.35，0.4，0.2，0.4；博来霉素组分别为7.5，6.5，7，6.5，5.5；kyn组分别为0.1，1，0.5，0.3，0.4；kyn+博来霉素处理组分别为3.5，2.5，3.7，2.8，3.8)，由图2可知，犬尿氨酸组小鼠的阿什克罗夫得分较野生型更低，这说明其肺纤维化的程度大大减轻。
[0057]
实施例2犬尿氨酸对纤连蛋白和i型胶原的mrna的水平的影响；
[0058]
为进一步评价各小鼠经博来霉素注射后的纤维化程度，本发明通过rt-pcr方式检测了各小鼠肺组织中纤连蛋白和i型胶原的mrna的水平。
[0059]
具体的是收集实施例1实验后小鼠肺组织，通过trizol裂解液提取组织中的rna，并使用sybr premix ex taq(takara)进行荧光定量rt-pcr，并以β-肌动蛋白作为内参，标准化每个目的基因(如纤连蛋白和i型胶原)的相对表达，结果如图3所示，与博来霉素处理组相比，犬尿氨酸处理可显著降低博来霉素所引起的纤维化相关指标纤连蛋白和i型胶原的转录水平。而每个目的基因所对应的引物列于下表1中。其中，具体测试测试表达方法如hu et al.,nat commun.2022；13:114中记载。
[0060]
表1目的基因所对应的引物列表
[0061][0062]
结合图3可知，在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化中，犬尿氨酸可显著减轻小鼠肺纤维化。
[0063]
实施例3犬尿氨酸对巨噬细胞活化的影响；
[0064]
通过实验，越来越多的证据表明，m2型巨噬细胞的过度活化和聚集对于肺纤维化的发生发展是必须的。因此本发明进一步检测了犬尿氨酸对于经il-4刺激后的巨噬细胞向m2型活化的影响。
[0065]
结合图4和图5，westernblot及rt-pcr结果表明，相较于pbs处理的细胞，犬尿氨酸处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞，在il-4刺激(10ng/ml)后表现出甘露糖受体cd206、精氨酸1和fizz-1的表达下降。
[0066]
结合图6，流式细胞术检测结果表明，相较于pbs处理的细胞，犬尿氨酸处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞，在il-4刺激(10ng/ml)后表现甘露糖受体cd206表达下降，m2型巨噬细胞数量显著下降。
[0067]
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：

1.一种犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化为特发性肺纤维化。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化为结缔组织疾病所致肺纤维化。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述犬尿氨酸降低纤连蛋白和i型胶原蛋白的转录和表达。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述犬尿氨酸降低羟脯氨酸的表达。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述犬尿氨酸通过抑制巨噬细胞向m2型活化，进而减缓肺纤维化。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肺纤维化的患者为哺乳动物。8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为小鼠。9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述犬尿氨酸的结构式为：10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为注射类药物或者雾化用药物。

技术总结

本发明公开一种犬尿氨酸在制备预防和/或肺纤维化的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明提出的犬尿氨酸在对于肺纤维化问题有显著的改善作用。问题有显著的改善作用。问题有显著的改善作用。

技术研发人员：

王从义 王宜

受保护的技术使用者：

华中科技大学同济医学院附属同济医院

技术研发日：

2022.08.22

技术公布日：

2022/11/25