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制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法及其用途与流程

制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途，更具体地，本发明涉及一种sgrna分子、表达载体、试剂盒、crispr/cas9系统、药物组合物、改造细胞的方法、制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途。

背景技术：

2.近年来，免疫在肿瘤领域取得了令人瞩目的进展，尤其是以抗ctla-4和抗pd-1或pd-l1抗体为代表的免疫卡控点阻断疗法，通过阻断t细胞表面抑制性受体与其配体的结合，阻断抑制性信号的传递，纠正免疫抑制性微环境所介导的免疫抑制，恢复肿瘤微环境t细胞的抗肿瘤能力，在多种转移性晚期癌症(包括转移性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等)方面取得了较高的应答率，使众多原本已经失去机会的对放化疗无效的晚期癌症患者有了重新的希望。
3.然而，并非所有的恶性肿瘤患者对pd-1或pd-l1或ctla-4阻断有效，对pd-1或pd-l1抗体的应答率只有20％左右，改善临床响应及克服耐药机制是该领域面临的挑战。因此，探究肿瘤对免疫卡控阻断不应答的机制，寻其他影响免疫细胞功能的免疫调控卡点，成为肿瘤免疫领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法，该方法制备的nk细胞。
5.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
6.自然杀伤细胞(nk细胞)位于机体抗癌的第一道防线，是识别杀伤肿瘤的“天然职业杀手”，具有应答迅速和泛特异性识别的特点，在肿瘤细胞发生变异的早期可迅速识别并启动对肿瘤细胞的杀伤。nk细胞具有杀伤谱广、反应速度快、副作用小、潜在风险较低、细胞来源广泛等优势，因此，基于nk细胞的肿瘤免疫已成为细胞免疫研发领域的热点，已开展多项nk细胞过继免疫用于各种血液瘤和实体肿瘤的临床试验。然而，nk细胞实体瘤面临的难题之一是nk细胞容易受肿瘤免疫抑制微环境影响。
7.nkg2a作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在nk细胞表面，在nkt细胞和某些cd8+t细胞亚亦有表达。nkg2a与cd94以异源二聚体的形式表达在细胞表面，主要识别非经典mhc-i类分子hla-e，向nk细胞传递抑制性信号，抑制nk细胞的效应功能，即为肿瘤微环境高表达的nkg2a会削弱nk细胞的活化和抗肿瘤功能。而目前逆转肿瘤微环境导致免疫细胞耗竭的方法通常是制备针对免疫检查点分子的单克隆抗体(又称免疫检查点阻断疗法)，如采用抗nkg2a抗体阻断nkg2a与其配体的结合而恢复nk细胞的功能来唤醒强大的抗肿瘤免疫。但是，临床上免疫检查点阻断疗法的应答率偏低，只有20％-30％，且容易产生耐药。
8.基于此，发明人在试验过程中发现，采用本发明的sgrna分子靶向沉默nk细胞的nkg2a基因的编辑效率较高，且获得的沉默nkg2a基因的nk细胞可直接阻断或取消其与配体
hla-e的结合，该nk细胞具有肿瘤杀伤活性强和ifn-γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤生长和延长小鼠的生存期。
9.在本发明的一个方面，本发明提出了一种sgrna分子。根据本发明的实施例，所述sgrna分子包括：具有如seq id no：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一。根据本发明实施例的sgrna分子可靶向敲低细胞(尤其是nk细胞)中的nkg2a基因，尤其是可靶向沉默nk细胞的nkg2a基因，获得沉默nkg2a基因的nk细胞，该沉默nkg2a基因的nk细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和ifn-γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期，可用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症。并且，发明人经过实验意外发现，该sgrna分子的应用还可以进一步降低细胞(尤其是nk细胞)pd-1和tim-3等其他抑制性受体的表达，从而可进一步消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，以及预防和/或肿瘤或癌症。
10.gaagctcattgttgggatcc(seq id no：1)；
11.aacaactatcgttaccacag(seq id no：2)；
12.tgaacaggaaataacctatg(seq id no：3)。
13.在本发明的另一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前所述的sgrna分子。根据本发明实施例的表达载体可靶向敲低细胞中的nkg2a基因，尤其是可靶向沉默nk细胞的nkg2a基因，获得沉默nkg2a基因的nk细胞，该沉默nkg2a基因的nk细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和ifn-γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期，可用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症。并且，发明人经过实验意外发现，该sgrna分子的应用还可进一步降低细胞(尤其是nk细胞)pd-1和tim-3等其他抑制性受体的表达，从而可进一步消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，以及预防和/或肿瘤或癌症。
14.根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括编码cas9分子的核酸。
15.在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒5包括：前述的sgrna分子或前述的表达载体。由前所述，sgrna分子和表达载体可靶向
16.敲低细胞(尤其是nk细胞)中的nkg2a基因，以及可降低细胞(尤其是nk细胞)表面pd-1和tim-3等其他抑制性受体的表达。由此，采用包含前述sgrna分子和表达载体的试剂盒，可用于制备沉默nkg2a基因的细胞(尤其是nk细胞)，以及用于进一步降低细胞(尤其是nk细胞)pd-1和tim-3等其他抑制性受体的表达。
17.0根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括编码cas9分子的核酸。
18.在本发明的又一方面，本发明提出了一种crispr/cas9系统。根据本发明的实施例，所述crispr/cas9系统包括：前述的sgrna分子。由前所述，sgrna分子可靶向敲低细胞(尤其是nk细胞)中的nkg2a基因，由此，采用包含前述sgrna分子的crispr/cas9
19.系统可靶向沉默细胞(尤其是nk细胞)的nkg2a基因，获得沉默nkg2a基因的细胞5(尤其是nk细胞)。
20.根据本发明的实施例，所述crispr/cas9系统进一步包括编码cas9分子的核酸。
21.在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的sgrna分子或前述的表达载体。根据本发明实施例的药物组合物可
22.用于沉默nk细胞的nkg2a基因，提高nk细胞杀伤肿瘤细胞的能力，可用于消除或减
0轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症。
23.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
24.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括编码cas9分子的核酸。
25.在本发明的又一方面，本发明提出了一种改造细胞的方法。根据本发明的实施例，所
26.述方法包括：将前述的sgrna分子以及编码cas9分子的核酸引入待改造细胞。由前所述，5sgrna分子可靶向敲低细胞(尤其是nk细胞)中的nkg2a基因。由此，采用本发明的方法可沉默细胞的nkg2a基因，获得沉默nkg2a基因的改造细胞。
27.根据本发明的实施例，所述细胞为表达nkg2a的细胞。
28.根据本发明的实施例，所述方法包括：将携带有所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸的表达载体导入所述待改造细胞。
29.0根据本发明的实施例，所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸设置于同一个或不
30.同的表达载体中。
31.根据本发明的实施例，将导入有所述表达载体的所述待改造细胞进行培养处理。
32.根据本发明的实施例，所述培养处理的时间为24～72h。
33.根据本发明的实施例，所述表达载体为真核细胞表达载体。
34.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备敲除nkg2a基因的nk细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前述的sgrna分子以及编码cas9分子的核酸引入nk细胞。由前所述，sgrna分子可靶向敲低nk细胞中的nkg2a基因，由此，采用本发明的方法可沉默nk细胞的nkg2a基因，获得沉默nkg2a基因的nk细胞。
35.需要说明的是，本发明中的“nk细胞”的来源不受具体限制，包括但不限于nk-92细胞、外周血nk细胞、脐带血nk细胞、ipsc来源nk细胞、nk-92等不同来源的nk细胞，也适用于car-nk细胞、car-t细胞、car-nkt细胞和car-γδt细胞。
36.根据本发明的实施例，所述方法包括：将携带有所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸的表达载体导入所述nk细胞。
37.根据本发明的实施例，所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸设置于同一个或不同的表达载体中。
38.根据本发明的实施例，将导入有所述表达载体的所述nk细胞进行培养处理。
39.根据本发明的实施例，所述培养处理的时间为24～72h。
40.根据本发明的实施例，所述表达载体为真核细胞表达载体。在将上述sgrna分子连接到载体上时，可以将sgrna分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制sgrna分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，sgrna分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞(例如待改造细胞)后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的sgrna分子在细胞内的表达。
41.在本发明的又一方面，本发明提出了前述的sgrna分子、前述的表达载体、前述的药物组合物、依据前述的方法制备的nk细胞在制备药物中的用途，所述药物用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症。
42.在本文中，术语“癌症”或“肿瘤”均可以是任何不受调控的细胞生长。示例性地，可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑素瘤、头颈鳞状细胞癌、宫颈癌、皮肤癌、神经胶质瘤、食道癌、口腔鳞状细胞癌或胃癌等等。
43.根据本发明的实施例，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。其中，实体瘤包括但不限于非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌或肉瘤、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑素瘤、头颈鳞状细胞癌、宫颈癌、皮肤癌、神经胶质瘤、食道癌、口腔鳞状细胞癌或胃癌、白血病、淋巴瘤。
44.在本发明的又一方面，本发明提出了一种消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的前述的sgrna分子、前述的表达载体、前述的药物组合物、依据前述的方法制备的nk细胞。如前所述，根据前述的sgrna分子、表达载体、药物组合物、依据前述的方法制备的nk细胞可直接阻断或取消nk细胞的nkg2a与配体hla-e的结合，消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，且能够有效抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞，从而用于预防和/或肿瘤或癌症。此外，在合适条件下，表达载体能够表达sgrna分子，进一步地，包含上述物质的药物组合物能够有效消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制以及抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞。由此，该方法可消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症。
45.本发明所述的sgrna分子、表达载体、药物组合物、依据前述的方法制备的nk细胞的有效量可随给药的模式和待的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
46.本发明的sgrna分子、表达载体、药物组合物、依据前述的方法制备的nk细胞可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物中。这些药物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)或冻干粉。典型的药物为注射溶液或输注溶液形式。
47.在本发明的又一方面，本发明提出了前述的sgrna分子或前述的表达载体在制备试剂中的用途，所述试剂用于降低细胞pd-1和/或tim-3表达。由此，将前述的sgrna分子或前述的表达载体导入至细胞中，不仅可直接降低nkg2a的表达，后续还可进一步降低细胞pd-1和/或tim-3表达。例如，在科学研究中，用于降低细胞nkg2a、pd-1和/或tim-3等多种抑制性受体的表达，获得符合目标的细胞，以进行后续研究。
48.根据本发明的实施例，所述细胞表达pd-1和/或tim-3。示例性地，所述细胞为nk细
胞或t细胞。
49.在本发明的又一方面，本发明提出了一种降低细胞pd-1和/或tim-3表达的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前述的sgrna分子以及编码cas9分子的核酸引入细胞。根据本发明实施例的方法将前述的sgrna分子或前述的表达载体导入至细胞中，不仅可直接降低nkg2a的表达，后续还可进一步降低细胞pd-1和/或tim-3表达。例如，在科学研究中，用于降低细胞nkg2a、pd-1和/或tim-3等多种抑制性受体的表达，获得符合目标的细胞，以进行后续研究。
50.根据本发明的实施例，所述细胞表达pd-1和/或tim-3。示例性地，所述细胞为nk细胞或t细胞。
51.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
52.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
53.图1为本发明实施例1中crispr nkg2ako质粒图谱；
54.图2为本发明实施例1中不同sgrna序列的编辑效率；
55.图3为本发明实施例2中nk-92和nkg2a
low nk-92中nkg2a的表达水平；
56.图4为本发明实施例2中nk-92和nkg2a
low nk-92中pd-1和tim-3的表达水平；
57.图5为本发明实施例2中a1847、ho8910和a2780细胞表面的hla-e的表达情况；
58.图6为本发明实施例2中nk-92和nkg2a
low nk-92对不同靶细胞的杀伤效率；
59.图7为本发明实施例2中nk-92和nkg2a
low nk-92的颗粒酶b和穿孔素的分泌水平；
60.图8为本发明实施例2中nk-92和nkg2a
low nk-92的ifn-γ分泌能力；
61.图9为本发明实施例3中卵巢癌a1847细胞进行皮下荷瘤的流程图；
62.图10为本发明实施例3中nk-92组和nkg2a
low nk-92组的小鼠肿瘤体积；
63.图11为本发明实施例3中nk-92组和nkg2a
low nk-92组的小鼠生存期。
具体实施方式
64.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
65.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
66.在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
67.在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
68.在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
69.在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
70.在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
71.在本文中，术语“”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是性的。本文使用的“”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“”涵盖将药物或化合物给予个体以、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
72.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
73.实施例1：nkg2a
low-nk细胞的制备
74.1.crispr nkg2a ko质粒的构建
75.本发明设计的敲低nkg2a的方法，首先采用基因突变检测的方法筛选有效沉默nkg2a的sgrna序列，然后构建沉默nkg2a的crispr/cas 9载体(lenticrispr-nkg2a-ko)。crispr nkg2ako质粒图谱见图1。
76.其中，sgrna1的核苷酸序列如序列表中seq id no：1所示；sgrna2的核苷酸序列如序列表中seq id no：2所示；sgrna3的核苷酸序列如序列表中seq id no：3所示。
77.通过synthego网站设计靶向nkg2a的sgrna，将sgrna进行退火和磷酸化，用esp3i限制性核酸内切酶对lent crispr v2载体进行酶切，然后将磷酸化的nkg2a-sgrna与线性化载体进行连接，经转化、涂板，挑取单克隆菌落进行摇菌实验，菌液送测序公司测序，证明插入基因片段序列正确，结果说明成功构建了lenticrispr-nkg2a-ko载体。
78.nkg2a-sgrna序列的筛选：为了筛选出沉默nkg2a效率最高的sgrna序列，将lenticrispr-nkg2a-ko质粒转染至293t细胞中，12h换液，48h收集细胞，提取基因组。使用常规的pcr技术对包含sgrna靶向位点的特定区域进行扩增，得到的pcr产物退火之后，由于
发生突变的单链与未发生的野生型链之间不能完全互补配对，在发生突变的位置产生突起，进而被t7e1识别并切割，形成断裂的两条短链。使用imagine j对琼脂糖凝胶电泳实验得到的条带进行灰度分析，结果参见图2。结果发现，相较于sgrna1和sgrna3，sgrna2的编辑效率较高，采用sgrna2序列构建的慢病毒载体进行后续实验。
79.2.慢病毒的包装及病毒液浓缩
80.取处于对数生长期的293t细胞5
×
106接种于10cm的培养皿中，加入10ml dmem培养基，在37℃、5％ co2的培养箱中培养过夜。待293t细胞密度达到80％时，更换10ml新鲜的dmem培养基，继续置于37℃、5％ co2的培养箱中进行培养。配制慢病毒包装体系：将6μg pspax2质粒，3μg pmd2.g质粒与6μg lenticrispr-nkg2a-ko质粒加入至体积为250μl无血清dmem培养基中，混合均匀，配制dna混合液；将15μl加到体积为235μl的无血清dmem培养基中，混合均匀。将混合液一次性加入到dna混合液中，静置混匀，室温孵育15min。将混合液加入293t细胞培养皿中。24h后进行换液。将培养皿放回37℃、5％ co2的培养箱中。48h后收取细胞上清，400
×
g离心5min，去除细胞碎片，将上清用0.45μm的滤头过滤至新的50ml离心管中。加入5
×
peg8000溶液，上下颠倒离心管混合均匀，放于4℃冰箱中过夜。然后在4℃、4000
×
g的条件下离心20min，弃上清，加适量无血清dmem重悬病毒沉淀，分装至ep管中，得到病毒浓缩液，放于-80℃冰箱中保存。
81.3.慢病毒感染人nk细胞
82.取处于生长对数期的nk-92细胞，加入2mlα-mem培养基重悬细胞，将nk-92细胞的细胞密度调整为5
×
105个/ml。在24孔板中接入5
×
105个nk-92细胞、1μl鱼精蛋白(终浓度8μg/ml)和1ml步骤2获得的病毒浓缩液。置于37℃、5％ co2的培养箱中培养，培养24h后，观察细胞状态，换液，得到感染细胞。将感染细胞转移入ep管中，在100
×
g条件下离心5min，加入少量新鲜α-mem培养基重悬细胞，将感染细胞转入细胞培养瓶中，加入10ml新鲜α-mem培养基和il-2(终浓度为200iu/ml)继续培养。待感染细胞扩增后，将感染细胞转移入流式管中，加入3ml 1
×
pbs重悬细胞，100
×
g条件下离心5min，弃上清，弹起细胞沉淀，重复一次。流式仪检测nkg2a的表达率。继续扩大培养，调整感染后nk-92细胞的状态。经流式分选，感染后nk-92细胞纯度接近99％。
83.4.nkg2a
low nk细胞的获得
84.将lenticrispr-nkg2a-ko载体包装得到的慢病毒感染nk-92细胞进行筛选、分选，得到nkg2a阴性的nk-92细胞，简称nkg2a
low nk细胞。
85.实施例2：nkg2a
low nk细胞的生物学功能鉴定
86.1.nkg2a
low nk细胞中nkg2a的表达水平及其他抑制性受体的表达
87.发明人采用流式细胞术检测比较nkg2a敲低前后nk-92细胞nkg2a的表达水平，结果参见图3。结果发现，经crispr/cas9技术基因敲除后，nk细胞表达nkg2a的水平明显降低。
88.同时观察了沉默nkg2a的同时是否也会影响其他耗竭相关分子的表达，将nk-92细胞与卵巢癌细胞a1847以1:1的比例共孵育72小时后，收集nk细胞，流式检测nk细胞表面pd-1、tim-3、tigit等抑制性受体的表达，结果参见图4。结果可见，与nk-92细胞相比，nkg2a
low nk-92细胞pd-1和tim-3的表达明显降低，tigit的表达没有明显差异。因此，结果进一步说明了，采用本发明的方法沉默nk细胞表面nkg2a的表达会削弱pd-1和tim-3等其他抑制性受体的表达，促进nk细胞活化受体与抑制性受体的平衡向活化分析倾斜，从而提高活化和功
能，并增强nk细胞对肿瘤微环境诱导耗竭的抵抗。
89.2.nkg2a敲低后nk-92细胞的体外杀伤
90.2.1nkg2a配体hla-e在肿瘤细胞表达的验证
91.已有研究表明卵巢癌组织以及多种卵巢癌细胞表面高表达nkg2a配体hla-e。发明人通过流式细胞术检测了人卵巢癌细胞系a1847、ho8910、a2780细胞表面的hla-e的表达情况，结果如图5所示。结果显示，ho8910细胞表达高水平的hla-e(阳性率为95.5％)，a1847细胞为中水平表达(阳性率为36.0％)，而a2780细胞表达hla-e的水平较低(阳性率为17.4％)(图5)。因此，发明人选择ho8910和a1847细胞作为hla-e阳性的靶细胞，a2780细胞作为hla-e阴性的靶细胞。
92.2.2nkg2a敲低后nk-92细胞的体外杀伤验证
93.以nk-92和nkg2a
low nk-92为效应细胞，以卵巢癌细胞系a1847、ho8910、a2780作为靶细胞，设置效靶比为10:1、5:1和2.5:1，将效应细胞与靶细胞共孵育5h，ldh释放法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率，结果参见图6。结果表明，当效靶比为10:1时，nkg2a
low nk-92细胞对中等表达nkg2a配体hla-e的a1847细胞的杀伤效率为46.23
±
2.62％，nk-92组(37.60
±
1.50％)；nkg2a
low nk-92对高表达hla-e的ho8910细胞的杀伤效率为46.23
±
2.62％，显著高于nk-92组(30.20
±
0.95％)，说明敲低nkg2a可明显提高nk细胞对hla-e阳性肿瘤细胞的杀伤能力；而两组效应细胞对低表达hla-e的a2780细胞的杀伤效率无明显差异。
94.另外，发明人还检测了nkg2a敲低与否是否影响nk细胞释放杀伤相关脱颗粒的情况。将各种效应细胞分别卵巢癌细胞以效靶比为10:1共孵育5h，收集细胞培养上清，通过elisa检测上清中颗粒酶b(granzyme b)和穿孔素(perforin)的分泌水平，结果参见图7。结果可见，与中等表达hla-e的a1847细胞及高表达hla-e的ho8910细胞共孵育后，nkg2a
low nk-92细胞分泌granzyme b和perforin的水平明显均明显高于car-nk-92组和nk-92组。因此，上述实验进一步验证了敲低nkg2a可明显提高nk细胞对hla-e阳性肿瘤细胞的脱颗粒水平和杀伤功能。
95.3.nkg2a敲低后nk-92细胞的ifn-γ分泌水平
96.通过elisa技术检测nkg2a敲低后nk-92细胞的ifn-γ分泌能力变化，将nk细胞与卵巢癌细胞共孵育5h，效靶比为10:1，收集细胞培养上清，通过elisa检测上清ifn-γ的水平，结果参见图8。结果可见，与高表达hla-e的ho8910细胞及中等表达hla-e的a1847细胞共孵育之后，nkg2a
low nk-92细胞分泌ifn-γ的水平均显著高于nk-92组。因此，上述实验进一步说明敲低nkg2a可明显提高nk细胞与hla-e阳性肿瘤细胞接触时的ifn-γ分泌能力。
97.实施例3：nkg2a
low nk-92细胞体内抗肿瘤能力及荷瘤小鼠生存期
98.以hla-e阳性的卵巢癌a1847细胞采用常规方法进行皮下荷瘤，建立卵巢癌异种移植模型。选择4周龄雌性裸鼠，腋下皮下荷瘤，荷瘤剂量为每只小鼠2
×
106个a1847细胞。一周后，待肿瘤体积达到100mm3左右时开始采用nkg2a
low nk-92进行，具体参见图9。将小鼠随机分为对照组、nk-92组和nkg2a
low nk-92细胞组。组小鼠采用尾静脉注射nk细胞1
×
107个/只，对照组注射等体积的1
×
pbs，每隔一周注射一次，每隔3天腹腔注射il-2(5
×
104iu/只)。每三天测量小鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存期曲线，结果参见图10和图11。
99.结果显示，与荷瘤对照组相比，nk-92和nkg2a
low nk-92组均明显抑制肿瘤的生长，而以nkg2a
low nk-92细胞组效果最佳，肿瘤体积明显小于nk-92组(图10)；而且，nkg2a
low nk-92细胞组的小鼠生存期明显长于nk-92组(图11)。因此，上述实验说明nkg2a 敲低的nk细胞具有更强的体内杀瘤效果，可以抵抗肿瘤微环境的抑制作用，抵抗功能耗竭，发挥更强大的抗肿瘤作用。
100.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
101.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：

1.一种sgrna分子，其特征在于，包括：具有如seq id no：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一。2.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求1所述的sgrna分子以及任选地编码cas9分子的核酸。3.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgrna分子或权利要求2所述的表达载体；以及任选地编码cas9分子的核酸。4.一种crispr/cas9系统，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgrna分子和任选地编码cas9分子的核酸。5.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgrna分子或权利要求2所述的表达载体；以及任选地药学上可接受的载体或辅料；任选地编码cas9分子的核酸。6.一种改造细胞的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的sgrna分子以及编码cas9分子的核酸引入待改造细胞。7.一种制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的sgrna分子以及编码cas9分子的核酸引入nk细胞。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将携带有所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸的表达载体导入所述待改造细胞或所述nk细胞；任选地，所述sgrna分子以及编码cas9分子的核酸设置于同一个或不同的表达载体中；任选地，将导入有所述表达载体的所述待改造细胞或所述nk细胞进行培养处理；任选地，所述培养处理的时间为24～72h；任选地，所述表达载体为真核细胞表达载体。9.权利要求1所述的sgrna分子、权利要求2所述的表达载体、权利要求5所述的药物组合物、依据权利要求7～8任一项所述的方法制备的nk细胞在制备药物中的用途，所述药物用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或肿瘤或癌症；优选地，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。10.权利要求1所述的sgrna分子或权利要求2所述的表达载体在制备试剂中的用途，所述试剂用于降低细胞pd-1和/或tim-3的表达；任选地，所述细胞包括选自nk细胞、t细胞、nkt细胞或γδt细胞中的至少之一。

技术总结

本发明提出了一种sgRNA分子和制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法。所述sgRNA分子包括：具有如SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一；所述方法包括将前述的sgRNA分子以及编码Cas9分子的核酸引入NK细胞。该sgRNA分子可靶向敲低NK细胞中的NKG2A基因，获得沉默NKG2A基因的NK细胞，该沉默NKG2A基因的NK细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和IFN-γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期。生存期。