一种猪精液长时间保存方法

一种猪精液长时间保存方法

技术领域

本发明属于现代生物技术领域，尤其涉及一种猪精液稀释液制备方法以及低温超 长时间保存技术。

背景技术

随着我国国民经济的飞速发展，生活质量不断的提高，猪肉已成为人们日常生活 中不可或缺的肉类食品。由于人们对猪肉需要量的增加，使得中国养猪行业迅猛发展。养猪 业的稳定发展对促进整个畜牧业的发展有种极为重要的意义。随着我国养猪业不断集约 化、专业化、生态化和科技化，猪的人工授精技术在现代养猪业中受到越来越多科研工作者 的关注。

人工授精技术的广泛应用使得精液保存技术的改良显得尤为重要。精液保存技术 既可以延长精子的贮存时间，又便于长途运输，同时还可以扩大精液的使用范围，提高公猪 的配种效能。冷冻精液虽然可以不受地域和时间的限制且可长时间保存，但其解冻后精子 存活率较低，且受胎率较低，目前猪的精液保存主要以低温液态保存为主。但从当前应用的 猪精液稀释液来看，精液低温保存时间通常为4-6d，无法满足一些偏远地区的养猪生产，因 此，开发一种长效的低温猪精液稀释液对促进偏远地区的养猪业具有重要作用。

发明内容

为了克服现有猪精液保存技术的不足，有必要对猪精液低温保存技术(包括猪精 液稀释液的配方和精液保存前处理方法)进行探索研究，本发明公开一种猪精液稀释液制 备方法及保存前处理技术。本发明中稀释液配方如下表：

猪精液稀释液配方

注：按上述配方称量后，加双蒸水定容至100mL。

基于本单位发明的猪精液稀释液，在猪的试验中加以调整，对猪精液稀释液前处 理技术加以改良，获得更显著的效果。将按照上述配方配置好的稀释液移至密封罐中，利用 加压装置冲入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.15个标准大 气压，保持15min后，继续冲入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1.15个标准大气增 加到1.2个标准大气压，保持15min后，恢复至正常大气压。所得稀释液为本发明猪精液低温 保存稀释液。

本发明所述的1min指的是55秒到60秒之间。

本发明中的稀释液及保存前处理技术能有效的延长精子存活时间、提高精子活 率、提高精子顶体完整性、降低精子畸形率。利用本发明可大大延长精子的贮存时间，又便 于长途运输，同时还可以扩大精液的使用范围，提高公猪的配种效能。

具体实施方案

配制精液稀释液：称取2g海藻糖、2.8g蔗糖、150mg脱脂牛奶粉、120mgL-精氨酸、 200mg半胱氨酸、600mg维生素C、2.8g柠檬酸、5mg超氧化物歧化酶、量取20mL卵黄、5mL乙二 醇、加入20万单位青霉素、20万单位链霉素，加双蒸水定容至100mL。将采集到的公猪精液与 在35℃预热后的本发明稀释液按重量比为1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃ 冰箱，2h内缓慢降温至4℃并转移至密封罐中，利用加压装置冲入4℃空气，在1min内将该密 封罐中大气压由1个标准大气增加到1.15个标准大气压，保持15min后，继续冲入4℃空气， 在1min内将该密封罐中大气压由1.15个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min后， 恢复至正常大气压，即：恢复到1标注大气压或者接近1标注大气压。所得稀释液为本发明猪 精液低温保存稀释液。

试验介绍

选择3头体质健康、性欲旺盛、体型大小相似的成年长白种公猪。采精前将集精杯 预热至35-37℃，以发情的母猪诱导成年公猪爬跨，待公猪阴茎伸出后，用手握法采精。采精 后选择中段浓份精液，测定种公猪精液射精量，用显微镜观察精子活力，立即进行常规品质 评定，按照国标要求原精液活力在0.7以上，无异常气味，泽乳白，用于低温保存，活力低 于0.7则废弃。

第1组将采集到的种公猪精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比为1： 3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐 中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.05 个标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。

第2组将采集到的种公猪精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比为1： 3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐 中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.15 个标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。

第3组将采集到的种公猪精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比为1： 3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐 中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中气压由1个标准大气压增加到1.2个 标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。

第4组将采集到的种公猪精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比为1： 3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐 中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.05 个标准大气压，保持15min，继续充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1.05个标准 大气增加到1.15个标准大气压，保持15min，恢复至正常气压，于6℃保存。

第5组将采集到的种公猪精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比为1： 3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐 中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.15 个标准大气压，保持15min，继续充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1.15个标准 大气增加到1.2个标准大气压，保持15min，恢复至正常气压，于6℃保存。

试验方法

1.精子存活率

精子活率检测：将稀释精液摇匀后，取10μL中层精液滴于经预热的37℃恒温板载 玻片上，盖片后置于显微镜下放大400倍，检查精子约1000个左右，分别计算呈直线运动精 子数和总精子数。每间隔48h镜检精子活率一次。

2.顶体膜完整性检验

精子顶体膜完整性利用SYBR-14/PI双染法测定。将5μL SYBR-14和2.5μL PI加入 50μL复苏精液中，37℃水浴孵育8min，8000rpm离心3min，收集沉淀，用4-羟乙基哌嗪乙磺酸 液(Hepes)洗涤两次，最后用50μL Hepes溶解沉淀，轻轻吹打混匀后取15μL均匀涂在载玻片 上，在荧光显微镜下计数约200个精子，并记录染成不同颜精子的数量，分析顶体完整性。

3.畸形率

用商品化Diff－Quik染液染检测畸形率。将精液从冰箱中取出，用液器吹打混 匀并随机吸取100μL于1mL3.7％的多聚甲醛溶液中固定10min，1000r/min离心8min，去除上 清，加入1mL PBS溶液使沉淀悬浮，摇匀，1000r/min离心8min，去除上清，加入适量PBS液制 成精子悬液。取10μL涂片，自然风干。把风干后的载玻片按照Diff－Quik染液的说明书，依 次放入染液一、二、三中进行染，最后用自来水冲洗，自然风干。在400×普通光学显微镜 下观察精子形态，每次至少数200个精子。

4.统计分析

每组实验重复3次，所得数据以平均值±标准误表示。

测定结果如下所示：

精液外观呈浓稠的乳白，无异味。分别于0d,2d,4d,6d,8d,10d和12d比较各组公 猪鲜精低温保存活率。各组猪精液低温保存活率如表1所示，第5组(即本发明猪精液稀释 液)于10d精子活力为0.73，精液活率仍保持在70％以上。

表1各组猪精液低温保存活率比较

分别在0d,2d,4d,6d,8d,10d和12d比较各组猪精液低温保存顶体完整性。各组猪 精液低温保存顶体完整性如表2所示，第6组处理(即本发明猪精液稀释液)于10d保存顶体 完整性较其他组最佳。

表2各组猪精液低温保存顶体完整性比较

分别在0d,2d,4d,6d,8d,10d和12d比较各组精子畸形率。各组猪精液低温保存精 子畸形率如表3所示，相比其他组，第5组(即本发明猪精液稀释液)在10d精子畸形率最低。

表3各组猪精液低温保存精子畸形率比较

通过本发明中的稀释液，可大大延长猪精液的低温保存时间，提高精子顶体完整 性以及降低精子畸形率。本发明的猪精液超长时间低温保存技术可以对猪精子起到更好的 保护作用，使优质种公猪的精液低温保存时间长达10d，且于10d精子活率仍保持在0.73以 上，且提高了精子体完整性，同时还能够降低精子畸形率。本发明的猪精液稀释液的配方以 及精液保存前处理保存技术，值得在生产中广泛应用。