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使用测序选择核酸配体的制作方法

使用测序选择核酸配体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年12月21日提交的并且名称为“selecting aptamers using sequencing”的美国临时专利申请号63/128,669的权益，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。

背景技术：

3.例如，生物样本中可存在的特定核酸序列的检测已被用作鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症相关联的遗传变化、研究对疾病的遗传易感性，以及测量对各种类型的的反应的方法。与特定靶分子结合的核酸序列可被称为“核酸配体”，并且可以是合成的或者可来自生物样本。用于检测无论是合成的还是来自生物样本的特定核酸序列的常用技术是核酸测序。
4.核酸测序方法已从maxam和gilbert所使用的化学降解方法以及sanger所使用的链伸长方法得到了发展。现在使用了允许在单个流动池上并行处理数百万个或者甚至数十亿个核酸的若干种测序方法。一些平台包括基于珠粒的格式和微阵列格式，其中二氧化硅珠粒用探针进行官能化，这取决于此类格式在包括测序、基因分型或基因表达谱分析在内的应用中的应用。一些测序系统(无论是用于“边合成边测序”还是用于基因分型)利用包括多个承载用于测序操作的不同试剂的不同贮存器的基板。

技术实现要素：

5.本文提供的示例涉及使用测序选择核酸配体。公开了用于进行此类选择的设备和方法。
6.本文的一些示例提供了一种从多种核酸配体候选物中选择核酸配体的方法。该方法可包括在设置在衬底内的多个孔中的每个孔内耦合靶标。该方法可包括使这些孔中的每个孔与包含多种核酸配体候选物的流体接触。该方法可包括，在这些孔中的至少一个孔内，使对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与靶标耦合。该方法可包括除去未与靶标耦合的任何核酸配体候选物。该方法可包括在孔内对除去之后剩余的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对靶标具有选择性的任何核酸配体。
7.在一些示例中，在该多个孔中的每个孔内耦合靶标包括在这些孔中的每个孔内耦合第一部分；使多个第二部分与这些靶标中的相应靶标耦合；以及在这些孔中的每个孔内使第二部分与第一部分耦合。在一些示例中，第一部分包括链霉亲和素，并且第二部分包括生物素。在一些示例中，第一部分通过捕获引物在这些孔中的每个孔内耦合。在一些示例中，在进行测序之前从捕获引物分离第一部分。
8.在一些示例中，衬底包括用于对除去之后剩余的核酸配体候选物进行测序的检测电路。
9.在一些示例中，该多个孔包括流体平行流过的流通池。
10.在一些示例中，对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物具有当与靶标耦合时改
变的三级结构。
11.在一些示例中，该方法进一步包括产生对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子。在一些示例中，产生对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子包括：从靶标解耦核酸配体候选物；以及使用聚合酶链式反应(pcr)以使用该核酸配体候选物产生扩增子。在一些示例中，pcr在与孔不同的扩增室中进行。在一些示例中，该方法进一步包括使这些孔中的每个孔与包含扩增子的流体接触；在这些孔中的每个孔内，使对靶标具有选择性的任何扩增子与靶标耦合；以及除去未与靶标耦合的任何扩增子。在一些示例中，被测序的任何核酸配体候选物包括在除去未与靶标耦合的任何扩增子之后剩余的任何扩增子。在一些示例中，该方法进一步包括产生对靶标具有选择性的任何扩增子的另外的扩增子。
12.在一些示例中，对任何核酸配体候选物进行测序包括：使除去之后剩余的任何核酸配体候选物与设置在孔内的捕获引物耦合；以及在孔内进行扩增以产生与捕获引物耦合的扩增子；以及对与捕获引物耦合的扩增子进行测序。在一些示例中，靶标经由捕获引物中的相应捕获引物在孔内耦合。在一些示例中，捕获引物在孔内与第一部分耦合，并且第二部分在孔内与第一部分和靶标耦合。在一些示例中，捕获引物与靶标分开地与孔耦合。在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括与相应捕获引物互补的第一衔接子和第二衔接子。在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物进一步包括设置在第一衔接子和对靶标具有选择性的候选物的区域之间的第一间隔区，以及设置在第二衔接子和对靶标具有选择性的候选物的区域之间的第二间隔区。
13.在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括寡核苷酸。
14.本文的一些示例提供了一种用于从多种核酸配体候选物中选择核酸配体的系统。该系统可包括衬底，该衬底包括多个孔。该系统可包括靶标，该靶标在这些孔中的每个孔内耦合。该系统可包括流体，该流体包含多种核酸配体候选物并接触这些孔中的每个孔，其中对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与靶标耦合。该系统可包括检测电路，该检测电路对这些孔内的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对靶标具有选择性的任何核酸配体。
15.在一些示例中，第一部分在这些孔中的每个孔内耦合。在一些示例中，多个第二部分与靶标中的相应靶标耦合。在一些示例中，第二部分在这些孔中的每个孔内与第一部分耦合，以在这些孔中的每个孔内与靶标耦合。在一些示例中，第一部分包括链霉亲和素，并且第二部分包括生物素。在一些示例中，第一部分通过捕获引物在这些孔中的每个孔内耦合。在一些示例中，第一部分可从捕获引物分离。
16.在一些示例中，该多个孔设置在检测电路上。
17.在一些示例中，该多个孔包括流体平行流过的流通池。
18.在一些示例中，对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物具有当与靶标耦合时改变的三级结构。
19.在一些示例中，扩增子由对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物产生。在一些示例中，使用包括以下步骤的步骤产生对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子：从靶标解耦该核酸配体候选物；以及使用聚合酶链式反应(pcr)以使用该核酸配体候选物产生扩增子。在一些示例中，该系统包括与孔不同的扩增室以进行pcr。
20.在一些示例中，该系统进一步包括流体，该流体包含扩增子并接触这些孔中的每
个孔，其中对靶标具有选择性的任何扩增子与靶标耦合。在一些示例中，被测序的任何核酸配体候选物包括在除去未与靶标耦合的任何扩增子之后剩余的任何扩增子。在一些示例中，该系统进一步包括对靶标具有选择性的任何扩增子的另外的扩增子。
21.在一些示例中，该系统进一步包括设置在孔内并与除去之后剩余的任何核酸配体候选物耦合的捕获引物；和与捕获引物耦合的核酸配体候选物的扩增子。检测电路可对与捕获引物耦合的扩增子进行测序。在一些示例中，靶标经由捕获引物中的相应捕获引物在孔内耦合。在一些示例中，捕获引物在孔内与第一部分耦合，并且第二部分在孔内与第一部分和靶标耦合。在一些示例中，捕获引物与靶标分开地与孔耦合。在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括与相应捕获引物互补的第一衔接子和第二衔接子。在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物进一步包括设置在第一衔接子和对靶标具有选择性的候选物的区域之间的第一间隔区，以及设置在第二衔接子和对靶标具有选择性的候选物的区域之间的第二间隔区。
22.在一些示例中，这些核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括寡核苷酸。
23.应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
附图说明
24.图1a至图1i示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的工艺流程中使用的示例设备和操作的示例。
25.图2a至图2f示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的另选工艺流程中使用的示例设备和操作。
26.图3示意性地示出了用于设备或工艺流程的示例核酸配体候选物，如参考图1a至图1i或图2a至图2f所述。
27.图4示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的工艺流程中的示例操作。
具体实施方式
28.本文提供的示例涉及使用测序选择核酸配体。公开了用于进行此类选择的设备和方法。
29.一些核酸配体是以高选择性结合靶分子的寡核苷酸链，诸如酶、抗体、单细胞或任何其他感兴趣的分子靶标。在这种选择性结合期间，核酸配体可获得三级结构。selex或通过指数富集的配体系统进化是选择核酸配体的过程。先前已知的selex过程通常在常规固相衬底上进行，诸如包含靶标耦合的介质的谱柱。使包含核酸配体候选物的流体流过衬底。对靶标具有选择性的任何核酸配体与靶标耦合，而其他核酸配体不耦合，因此流出衬底。然后从靶标解耦对靶标具有选择性的核酸配体并使用聚合酶链式反应(pcr)例如在96孔板中对其进行扩增。pcr产物可再次流过衬底并扩增，以提供进一步的富集。然后对扩增的核酸配体进行测序以鉴定与靶标耦合并因此最“成功”的核酸配体。这些过程可能是时间和劳动密集型的。
30.相比之下，如本文所提供的，本发明的设备和方法可通过使用测序使selex过程精简和简化。更具体地，在一些示例中，用于核酸配体选择和测序两者的操作可在相同的孔内进行，例如在测序系统内的衬底的孔内。在其上进行选择过程的衬底可包括用于对核酸配体进行测序的检测电路。例示性地，可在这些孔中的每个孔内耦合靶标，并且多个核酸配体流入这些孔中的每个孔内。对靶标具有选择性的任何核酸配体可与靶标耦合，并且可除去任何其他核酸配体。对靶标具有选择性的核酸配体可被扩增，然后可在孔内进行测序，例如，使用也在这些孔中的每个孔内耦合的捕获引物。因此，与先前已知的selex过程相比，本发明的设备和方法可提供显著精简和简化的过程，材料使用和浪费显著减少。
31.首先，将简单地解释本文中所使用的一些术语。然后，将描述用于使用测序选择核酸配体的一些示例方法和相关设备。
32.术语
33.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其它形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其它形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
34.贯穿本说明书使用的术语“基本上(substantially)”、“大约(approximately)”、和“约(about)”用于描述和说明如归因于加工中的变化的较小的波动。例如，它们可以指小于或等于
±
10％、如小于或等于
±
5％、如小于或等于
±
2％、如小于或等于
±
1％、如小于或等于
±
0.5％、如小于或等于
±
0.2％、如小于或等于
±
0.1％、如小于或等于
±
0.05％。
35.如本文所用，“杂交(hybridize)”打算意指第一多核苷酸与第二多核苷酸沿那些聚合物的长度非共价缔合以形成双链“双螺旋体(duplex)”。举例来说，两个dna多核苷酸链可通过互补碱基配对而缔合。第一与第二多核苷酸之间的缔合强度随着那些多核苷酸内核苷酸序列之间的互补性而增加。多核苷酸之间的杂交强度可以通过50％的双螺旋体彼此解离的解链温度(tm)表征。
36.如本文所用，术语“核苷酸(nucleotide)”打算意指包含糖和至少一个磷酸酯基团，并且在一些示例中还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基(abasic)”的。核苷酸包含脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、经修饰的磷酸糖主链核苷酸、和它们的混合物。核苷酸的示例包含单磷酸腺苷(amp)、二磷酸腺苷(adp)、三磷酸腺苷(atp)、单磷酸胸苷(tmp)、二磷酸胸苷(tdp)、三磷酸胸苷(ttp)、单磷酸胞苷(cmp)、二磷酸胞苷(cdp)、三磷酸胞苷(ctp)、单磷酸鸟苷(gmp)、二磷酸鸟苷(gdp)、三磷酸鸟苷(gtp)、单磷酸尿苷(ump)、二磷酸尿苷(udp)、三磷酸尿苷(utp)、单磷酸脱氧腺苷(damp)、二磷酸脱氧腺苷(dadp)、三磷酸脱氧腺苷(datp)、单磷酸脱氧胸苷(dtmp)、二磷酸脱氧胸苷(dtdp)、三磷酸脱氧胸苷
(dttp)、二磷酸脱氧胞苷(dcdp)、三磷酸脱氧胞苷(dctp)、单磷酸脱氧鸟苷(dgmp)、二磷酸脱氧鸟苷(dgdp)、三磷酸脱氧鸟苷(dgtp)、单磷酸脱氧尿苷(dump)、二磷酸脱氧尿苷(dudp)、和三磷酸脱氧尿苷(dutp)。
37.如本文所用，术语“核苷酸”也打算涵盖任何核苷酸类似物，该核苷酸类似物是包含与天然存在的核苷酸相比经修饰的核碱基、糖、和/或磷酸酯部分的类型的核苷酸。示例性经修饰的核碱基包含肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。如本领域中已知，某些核苷酸类似物无法并入到多核苷酸中，例如如5
’‑
磷酰硫酸腺苷的核苷酸类似物。核苷酸可以包含任何适合数目的磷酸酯，例如三个、四个、五个、六个、或多于六个磷酸酯。
38.如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”是指包含彼此结合的核苷酸序列的分子。多核苷酸为聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包含脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、和它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列，如rna或单链dna；核苷酸的双链序列，如双链dna；或可以包含核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链dna(dsdna)包含基因组dna、以及pcr和扩增产物。单链dna(ssdna)可以转化成dsdna并且反之亦然。多核苷酸可以包含非天然存在的dna，如对映异构体dna。多核苷酸中核苷酸的精确序列可为已知或未知的。以下为多核苷酸的示例：基因或基因片段(例如探针、引物、表达的序列标签(est)或基因表达系列分析(sage)标签)、基因组dna、基因组dna片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、前述任一者的核酸探针、引物、或扩增复本。
39.如本文所用，“聚合酶(polymerase)”打算意指具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合引发的单链靶多核苷酸，并且可以将核苷酸依序添加到生长引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补复制(complementary copy)”多核苷酸。接着，另一聚合酶或相同聚合酶可以通过形成该互补复制多核苷酸的互补复本形成靶核苷酸的复本。此类复本中的任一者可在本文中被称作“扩增子(amplicon)”。dna聚合酶可以结合到靶多核苷酸并且然后沿靶多核苷酸向下移动，将核苷酸依序添加到生长多核苷酸链(生长扩增子)的3’端处的游离羟基基团。dna聚合酶可以自dna模板合成互补dna分子并且rna聚合酶可以自dna模板合成rna分子(转录)。聚合酶可以使用短rna或dna链(引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶可以称为链移位的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链移位活性的示例性聚合酶包含但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus，bst)聚合酶、外-克列诺(exo-klenow)聚合酶、或测序级t7外-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换
前方链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3’核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。
40.如本文所用，术语“引物(primer)”是指核苷酸可以通过游离3’oh基团添加到上面的多核苷酸。引物长度可以是任何适合数目个碱基的长度，并且可以包含天然和非天然核苷酸的任何适合组合。靶多核苷酸(诸如但不限于核酸配体)可包含“衔接子(adapter)”，该衔接子可与引物杂交(具有与引物互补的序列)，并且可扩增以便通过将核苷酸添加到引物的游离3’oh基团来产生互补复制多核苷酸。引物可与衬底耦合。彼此“互补”的引物可以基本上沿着它们的整个长度彼此杂交，而彼此“正交”的引物基本上不彼此杂交，它们的扩增子也基本上不彼此杂交。“捕获引物”旨在表示耦合到衬底并且可与靶多核苷酸的第一衔接子杂交的引物，而“正交捕获引物”旨在表示耦合到衬底并且可与该靶多核苷酸的第二衔接子杂交的引物。第一衔接子可具有与捕获引物的序列互补的序列，并且第二衔接子可具有与正交捕获引物的序列互补的序列。捕获引物和正交捕获引物可具有彼此不同且独立的序列。
41.在一些示例中，捕获引物是可从illumina公司(illumina,inc)商购获得的p5或p7引物。p5和p7引物是彼此正交的引物的非限制性示例。在一些示例中，p5和p7引物序列可以具有以下序列：
42.配对读段组：
43.p5：5'-aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3'
44.p7：5'-caagcagaagacggcatacgag*at-3'
45.单个读段组：
46.p5：5'-aatgatacggcgaccaccga-3'
47.p7：5'-caagcagaagacggcatacga3'
48.其中g*是g或8-氧代鸟嘌呤。
49.在一些示例中，所连接的寡核苷酸(如引物或者p5或p7引物)在5'末端处包括连接子或间隔区。可以包括此类连接子或间隔区，以便允许化学或酶促裂解，或者赋予一些其他期望的特性，例如以实现与聚合物或固体载体的共价连接，或充当间隔区以将裂解位点定位成与固体载体相距最佳距离。在某些情况下，10个间隔区核苷酸可以定位于p5或p7引物与聚合物或固体载体的连接点之间。在一些示例中，使用polyt间隔区，但也可以使用其他核苷酸以及它们的组合。在一个示例中，间隔区是6t至10t间隔区。在一些示例中，连接子包括可裂解核苷酸，该可裂解核苷酸包含可化学裂解的官能团，如邻二醇或烯丙基t。
50.如本文所用，术语“扩增子(amplicon)”当关于多核苷酸使用时打算意指复制多核苷酸的产物，其中产物具有与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制造多核苷酸的扩增子的工艺。靶多核苷酸的第一扩增子可以是互补的复本。额外扩增子为在产生第一扩增子之后从靶多核苷酸或从第一扩增子产生的复本。后续扩增子可具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上一致的序列。应理解，当产生多核苷酸的扩增子时，可出现该多核苷酸的少量突变(例如由于扩增伪影)。
51.如本文所用，术语“衬底(substrate)”是指用作本文所描述的组合物的支撑物的
材料。示例性衬底材料可包含玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸酯(例如，多面体有机倍半硅氧烷(poss))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(cmos)、或它们的组合。poss的示例可以是描述于kehagias等人，《微电子工程改造(microelectronic engineering)》86(2009)，第776-778页中的poss，该文献以全文引用的方式并入。在一些示例中，本技术中使用的衬底包含二氧化硅类衬底，如玻璃、熔融硅石、或其它含二氧化硅材料。在一些示例中，衬底可以包含硅、氮化硅、或氢化硅酮。在一些示例中，本技术中使用的衬底包含塑料材料或组分，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例性塑料材料包含聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、和环烯烃聚合物衬底。在一些示例中，衬底为或包含二氧化硅类材料或塑料材料或它们的组合。在具体示例中，衬底具有至少一个包括玻璃或硅类聚合物的表面。在一些示例中，衬底可包含金属。在一些此类示例中，金属为金。在一些示例中，衬底具有至少一个包括金属氧化物的表面。在一个示例中，表面包括氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮、或丙烯酸酯也可用作衬底材料或组分。其它衬底材料可包含但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物、和共聚物。在一些示例中，衬底和/或衬底表面可以是或包含石英。在一些其它示例中，衬底和/或衬底表面可为或包含例如gaas或ito的半导体。前述列表旨在说明但不限于本技术。衬底可包括单一材料或多种不同材料。衬底可以是复合物或层合物。在一些示例中，衬底包括有机硅酸酯材料。衬底可以是平坦的、圆形的、球形的、杆状的、或任何其它适合的形状。衬底可以是刚性的或柔性的。在一些示例中，衬底为珠粒或流通池。
52.在一些示例中，衬底包含图案化表面。“图案化表面(patterned surface)”是指在衬底的暴露层中或上的不同区域的布置。举例来说，区域中的一者或多者可以是其中存在一个或多个捕获引物的特征部。特征部可以由其中不存在捕获引物的间隙区域分隔开。在一些示例中，图案可为成行和成列的x-y形式的特征部。在一些示例中，图案可以是重复布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，图案可为随机布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，衬底在表面中包含孔(凹陷)的阵列。孔可由基本上竖直的侧壁提供。孔可如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造，这些技术包含但不限于光刻、压印技术、模制技术、和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道，所使用的技术将取决于阵列衬底的组成和形状。
53.衬底的图案化表面中的特征部可包含玻璃、硅、塑料、或(多种)其它适合材料上的孔阵列中的孔(例如微孔或纳米孔)，其中具有图案化的共价连接凝胶，如聚(n-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)。该工艺产生用于测序的凝胶垫，该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可为稳定的。聚合物与孔的共价连接可有助于在多种用途期间的结构化衬底的整个寿命期间将凝胶保持为结构化特征部。然而，在许多示例中，凝胶不需要共价连接到孔。举例来说，在一些条件下，不共价连接到结构化衬底的任何部分的无硅烷丙烯酰胺(sfa)可用作凝胶材料。
54.在具体示例中，结构化衬底可通过以下方法来制造：将适合材料图案化为具有孔(例如，微孔或纳米孔)，用凝胶材料(例如，pazam、sfa或它们化学改性的变体，如sfa的叠氮化形式(叠氮-sfa))涂覆图案化材料，并且例如通过化学或机械抛光来抛光已涂覆凝胶的材料的表面，从而将凝胶保持在孔中，但从孔之间的结构化衬底的表面上的间隙区域去除
基本上所有凝胶或使基本上所有凝胶失活。引物可以连接到凝胶材料。包含多种靶多核苷酸(例如片段化人类基因组或它的部分)的溶液接着可与抛光衬底接触，使得个别靶多核苷酸将通过与连接到凝胶材料的引物的相互作用来对个别孔接种；然而，由于不存在凝胶材料或凝胶材料无活性，靶多核苷酸将不占据间隙区域。因为间隙区域中不存在凝胶或凝胶无活性可以阻止生长丛集的向外迁移，所以靶多核苷酸的扩增可以限制于孔中。该工艺可方便地制造、可扩展、且利用常规微型或纳米制造方法。
55.图案化衬底可包含例如蚀刻到载片或芯片中的孔。孔的蚀刻的图案和几何形状可呈多种不同形状和大小，并且此类特征部可在物理上或功能上与彼此分开。具有此类结构特征部的尤其有用的衬底包含可以选择如微球体的固体粒子的大小的图案化衬底。具有这些特性的示例图案化基板是与珠粒阵列技术(加利福尼亚州圣地亚哥illumina公司(illumina,inc.,san diego,calif.))结合使用的蚀刻基板。
56.在一些示例中，基板形成流动池的至少一部分或位于流动池中或联接到流动池。流通池可包含划分成多个泳道或多个分区的流动腔室。本文所阐述的方法和系统中可以使用的示例性流通池和用于制造流通池的衬底包含但不限于可购自illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)的那些。
57.如本文所用，术语“多个(plurality)”打算意指两个或更多个不同成员的体。多个数目可在小、中、大到极大的大小范围内。小的多个数目的大小可在例如几个成员到数十个成员的范围内。中等大小的多个数目可在例如数十个成员到约100个成员或数百个成员的范围内。大的多个数目可在例如约数百个成员到约1000个成员、到数千个成员、和多达数万个成员的范围内。极大的多个数目可在例如数万成员到约几十万、一百万、几百万、几千万、和多达或超过数亿成员的范围内。因此，多个数目可以在两个到远超过一亿成员的大小以及如通过成员的数目所测量的所有大小范围内、在以上示例性范围之间、且超过以上示例性范围。示例性多核苷酸多个数目包含例如约1
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105或更多、或1
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106或更多不同多核苷酸的体。因此，术语的定义打算包含大于二的所有整数值。多个数目的上限可以例如通过样本中多核苷酸序列的理论多样性来设置。
58.术语“多核苷酸(polynucleotide)”和“寡核苷酸(oligonucleotide)”在本文中可互换地使用。除非另外具体地指示，否则不同术语并不意图表示大小、序列、或其它特性的任何具体差异。为了描述清楚起见，当描述包含若干多核苷酸物类的具体方法或组合物时，术语可用于区分一种多核苷酸物类与另一种物类。
59.如本文所使用，术语“测序系统”是指被配置为确定多核苷酸序列的系统。多种测序系统是可商购获得的。例示性地，测序系统可以是或包括可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购获得的iseq
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100测序系统。iseq
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100测序系统是台式系统，该台式系统使用包括储存不同测序试剂的贮存器的预填充筒执行边合成边测序。测序系统的其他非限制性示例包括可从illumina公司商购获得的cbot 2、novaseq 6000和miniseq系统，以及来自其他来源的测序系统。
60.如本文所用，“核酸配体”旨在表示具有三级结构的寡核苷酸，该三级结构导致该寡核苷酸对靶标具有选择性，而“核酸配体候选物”旨在表示可能对靶标具有选择性的寡核苷酸。对靶标具有“选择性”旨在表示与该靶标耦合而不与不同的靶标耦合。因此，在给定的多种核酸配体候选物中，一种或多种核酸配体候选物可能对给定靶标具有选择性，因此可
能是针对该靶标的核酸配体。然而，应当理解，任何给定的多种核酸配体候选物不必一定包括用于给定靶标的核酸配体。可使用操作将核酸配体候选物鉴定为对靶标具有选择性的核酸配体，这些操作包括将核酸配体候选物与靶标(表明选择性)耦合和对核酸配体候选物进行测序。核酸配体候选物的扩增子本身可以是核酸配体候选物，无论该扩增子是核酸配体候选物的拷贝还是互补拷贝。核酸配体的扩增子本身可以是核酸配体，例如，其中该扩增子是核酸配体的拷贝(与核酸配体的互补拷贝相反，该互补拷贝可以是核酸配体候选物，但不一定是核酸配体)。核酸配体可包括任何合适类型的寡核苷酸，例如dna、rna和/或核酸类似物，诸如本文其他地方所示例的。核酸配体可通过相互作用的任何合适的组合(例如，通过静电相互作用、疏水相互作用和三级结构的形成的任何合适的组合)与靶标耦合。
61.如本文所用，“靶标”旨在表示期望为其选择核酸配体的化学元素。靶标可包括不是核苷酸的化学实体。示例靶标是蛋白质靶标。蛋白质包括折叠成结构的多肽序列。另一个示例靶标是代谢物靶标。代谢物靶标是在代谢期间形成或使用的化学元素。另外的示例靶标包括但不限于碳水化合物、脂肪酸、糖(诸如葡萄糖)、氨基酸、核苷、神经递质、磷脂和重金属。在本公开中，可在任何合适的应用的上下文中检测对靶标具有选择性的分析物，诸如分析疾病状态，分析代谢健康，分析微生物组，分析药物相互作用，分析药物反应，分析毒性或分析传染病。例示性地，代谢物可包括响应于疾病而上调或下调的化学元素。靶标的非限制性示例包括激酶、丝氨酸水解酶、金属蛋白酶、疾病特异性生物标记物诸如特定疾病的抗原以及葡萄糖。
62.如本文所用，具有“三级结构”的寡核苷酸旨在表示被折叠成三维三级结构的寡核苷酸，该三维三级结构具有将折叠保持在适当位置的内部交联。相比之下，具有一级结构(例如，连接在一起的特定核酸序列)和二级结构(例如，局部结构)但没有将折叠保持在适当位置的内部交联的寡核苷酸将不会被认为是具有作为如本文所用的术语的三级结构。当核酸配体与靶标耦合时，核酸配体的三级结构可改变。
63.如本文所用，元素“不同”旨在表示元素中的一个元素相对于另一个元素具有至少一个变化，这使得元素可彼此区分。例如，彼此不同的寡核苷酸可具有相对于彼此变化至少一个核酸的核酸序列。又如，彼此不同的蛋白质可具有相对于彼此变化至少一个肽的肽序列。又如，代谢物可相对于彼此改变至少一个化学基团。如本文所提供，可使用本发明的设备和方法针对不同的靶标选择不同的核酸配体。
64.如本文所用，术语“荧光团”旨在表示响应于在不同于第一波长的第二波长处的光的激发而发射第一波长处的光的分子。由荧光团发射的光可被称为“荧光”，并且可通过合适的光学检测电路检测。
65.可使用任何合适的光学检测电路检测荧光，该光学检测电路可包括基于从荧光团接收的光生成电信号的光学检测器，和使用电信号确定从荧光团接收到光的电子电路。作为一个示例，光学检测器可包括有源像素传感器(aps)，该有源像素传感器包括放大光电探测器阵列，该放大光电探测器阵列被配置成基于由光电探测器接收的光生成电信号。aps可基于本领域已知的互补金属氧化物半导体(cmos)技术。基于cmos的检测器可包括场效应晶体管(fet)，例如金属氧化物半导体场效应晶体管(mosfet)。在特定示例中，可使用具有单光子雪崩二极管(cmos-spad)的cmos成像仪以例如执行荧光寿命成像(flim)。在其它示例中，光学检测器可包括光电二极管，诸如雪崩光电二极管、电荷耦合器件(ccd)、低温光子检
测器、反向偏置发光二极管(led)、光敏电阻器、光电晶体管、光伏电池、光电倍增管(pmt)、量子点光电导体或光电二极管等。该光学检测电路还可包括硬件和软件的任何合适的组合，该组合与光学检测器可操作地通信以便从光学检测器接收电信号并且被配置成基于此种信号检测荧光，例如基于光学检测器检测到来自荧光团的光。例如，电子电路可包括存储器和耦合到存储器的处理器。存储器可存储用于使处理器从光学检测器接收信号并使用此种信号检测荧光团的指令。例如，指令可使处理器使用来自光学检测器的信号确定荧光在光学检测器的视野内发射，并使用此种确定来确定存在荧光团。衬底可包括光学检测电路，例如，可包括光学检测器，在其上可设置一个或多个孔，用于使用测序选择核酸配体。
66.使用测序选择核酸配体
67.如上所述并在下文更详细地描述，本设备和方法可用于使用测序选择核酸配体。可在多个孔中的每个孔内耦合靶标，在这些孔内进行核酸配体选择和核酸配体测序。可将多种核酸配体候选物(例如，selex核酸配体文库)引入孔中以使靶标与核酸配体候选物接触，并且对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与靶标耦合，而剩余的核酸配体候选物保持与靶标非耦合并且可被洗掉。与靶标耦合的核酸配体候选物可被扩增，并且可在孔中测序以鉴定对靶标具有选择性的核酸配体。
68.例如，图1a至图1i示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的工艺流程中使用的示例设备和操作的示例。图1a中所示的设备100可包括衬底110，该衬底包括多个贮存器。在图1a所示的非限制性示例中，贮存器可包括设置在彼此共同的一体形成的衬底110内的孔121、122、123、124。然而，应当理解，孔121、122、123、124中的一个或多个孔和实际上所有孔121、122、123、124可彼此物理分离，并且不必彼此形成于共同的衬底中。可提供任何适当尺寸和布置的任何适当数量的孔。例如，衬底110可包括几千个、几万个、几十万个或甚至几百万个孔。孔121、122、123、124中的每个孔可包括多个第一捕获引物和第二捕获引物111、112中的每一者，其可用于以诸如下文参照图1h至图1i进一步所述的方式来扩增候选核酸配体并对其测序。设备100进一步可包括检测电路190，以对孔内的任何核酸配体候选物进行测序，从而例如以诸如参照图1i所述的方式鉴定对靶标具有选择性的任何核酸配体。孔121、122、123、124可设置在检测电路190上或以其他方式与检测电路耦合。在一个非限制性示例中，检测电路190包括cmos光学检测器，孔121、122、123、124包括流体可平行流过的流通池，并且cmos在流通池内的寡核苷酸测序期间检测荧光。
69.例示性地，设备100可用于测序系统中以使用测序选择核酸配体。例示性地，测序系统可以是或包括可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购获得的iseq
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100测序系统。iseq
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100测序系统是台式系统，该台式系统使用包括以与图1a至图1b中所示的设备100类似的方式储存不同测序试剂的贮存器的预填充筒执行边合成边测序。然而，应当理解，设备100可适当地适用于任何其他测序系统，诸如可从illumina公司商购获得的cbot 2、novaseq 6000或miniseq系统，或来自另一来源的测序系统。
70.可在孔121、122、123、124中的每个孔内耦合可能期望到核酸配体的靶标。本文其他地方提供了靶标的非限制性示例。靶标可经由任何合适的连接直接耦合，例如经由捕获引物以诸如下文参照图2a至图2f进一步所述的方式耦合。另选地，靶标可经由彼此相互作用的部分间接耦合。例如，以诸如图1a所示的方式，第一部分130可例如经由任何合适的连接在孔121、122、123、124中的每个孔内耦合。孔121、122、123、124可以与包括多个分子
140的流体接触，每个分子可以包括经由任何合适的连接彼此耦合的第二部分150和目标160，该连接任选地是可裂解的。第一部分130和孔121、122、123、124之间以及第二部分150和靶标160之间的相应连接可通过任何合适的相互作用(诸如nta-his-tag、spytag-spycatcher、寡核苷酸与互补寡核苷酸的杂交、cu(i)催化的点击反应或应变促进的叠氮-炔环加成)形成。任何合适数目的此类连接可包括可裂解部分，诸如8-氧代-g或可使用蛋白酶裂解的蛋白质，其可用于以诸如下文更详细所述的方式从衬底解耦一个或多个元素。
71.以诸如图1b所示的方式，第二部分150可与第一部分130耦合，以便在孔121、122、123、124中的每个孔内耦合靶标160。可以为第一部分和第二部分130、150提供彼此共价或非共价相互作用的任何合适的部分。在一个非限制性示例中，第一部分130包括链霉亲和素，并且第二部分150包括生物素。在另一个非限制性示例中，第一部分130包括生物素，并且第二部分150包括链霉亲和素。另选地，靶标160可通过任何合适的相互作用诸如nta-his-tag、spytag-spycatcher、寡核苷酸与互补寡核苷酸的杂交、cu(i)催化的点击反应或应变促进的叠氮-炔环加成(任选地包括可裂解部分诸如8-氧代-g或可使用蛋白酶裂解的蛋白质)在孔121、122、123、124中的每个孔内耦合。尽管为了简单起见，单个第一部分130、单个第二部分150和单个靶标160被图示为在这些孔中的每个孔内，但是应当理解，任何合适数量的第一部分和第二部分以及靶标可在这些孔中的每个孔内耦合，并且每个孔可具有在其中耦合的相同数量或不同数量的部分或靶标。在诸如图1b所示的示例中，捕获引物111、112可与靶标160分开地与孔121、122、123、124耦合。
72.以诸如图1c所示的方式，系统100可包括流体，该流体包括多种核酸配体候选物171、172、173、174并且接触孔121、122、123、124中的每个孔。核酸配体候选物171、172、173、174中的每种核酸配体候选物可包括衔接子181、182，该核酸配体候选物可经由这些衔接子分别与捕获引物111或112耦合以诸如下文参照图1h所述的方式进行扩增。对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与靶标160耦合。例如，如图1d所示，核酸配体候选物174在孔124内与靶标160耦合，而核酸配体候选物171、172、173在孔121、122、123内保持与靶标160解耦，并且可以诸如图1e所示的方式除去，例如通过使缓冲液流过孔121、122、123、124。在一些示例中，对靶标160具有选择性的任何核酸配体候选物可具有当与靶标耦合时改变的三级结构。如图1d所示，核酸配体候选物171、172、173、174中的至少一些核酸配体候选物可包括发夹结构，该发夹结构包括单链环和单链茎，当核酸配体候选物对靶标160具有选择性时，这些单链环和单链茎可与该靶标耦合。
73.扩增子可由对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物产生。例如，产生对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子可包括从靶标解耦该核酸配体候选物并使用pcr以使用该核酸配体候选物产生扩增子。例如，可从靶标160解耦图1e所示的核酸配体候选物174，并且进行pcr以产生该核酸配体候选物的扩增子。核酸配体候选物174和靶标160之间的这种解耦可使用破坏靶标和核酸配体之间的相互作用的任何合适的反应条件来进行，诸如热或缓冲液交换，其中使盐浓度或ph对核酸配体的三级结构不利或对稳定核酸配体-靶标界面的力不利。在一些示例中，设备100可包括与孔121、122、123、124不同的扩增室以进行pcr。然后，以诸如图1f所示的方式，使孔121、122、123、124中的每个孔中的靶标160与包括核酸配体候选物174的扩增子174的流体接触。注意，扩增子174和核酸配体候选物174在本文中使用相同的附图标记表示，因为它们是等同的结构；例如，扩增子174也是靶标160的
核酸配体候选物，并且预期类似于核酸配体候选物174与其耦合。以类似于参照图1d所述的方式，对靶标具有选择性的任何扩增子174与靶标耦合，例如，诸如图1g所示，其中多个扩增子174与相应靶标160耦合。然而，注意，可省略用于从靶标解耦核酸配体候选物并使用pcr以使用该核酸配体候选物产生扩增子的另外的操作。
74.然后设备100可用于对核酸配体候选物174(包括其任何扩增子)进行测序。例如，可对在除去未与靶标150耦合的核酸配体候选物之后保留与靶标160耦合的任何核酸配体候选物进行测序。图1g中所示的核酸配体候选物174(包括其任何扩增子)可以诸如参照图1e所述的方式从靶标160解耦，并且簇扩增可用于产生核酸配体候选物174的扩增子，包括产生对靶标具有选择性的任何扩增子的另外的扩增子。例如，如上文参照图1a所述，捕获引物111、112可设置在孔121、122、123、124内。捕获引物111和捕获引物112可彼此正交，例如捕获引物111可包括p5引物，并且捕获引物112可包括p7引物。捕获引物111、112可与在除去未与靶标160耦合的任何核酸配体候选物(和扩增子)之后剩余的任何核酸配体候选物(包括其任何扩增子)174耦合。例如，如上文参照图1a所述，核酸配体候选物171、172、173、174可包括衔接子181、182，该核酸配体候选物可经由这些衔接子分别与捕获引物111或112耦合以进行扩增。
75.以诸如图1i所示的方式，核酸配体候选物174(或其扩增子)的衔接子181可与捕获引物111耦合，并且核酸配体候选物的衔接子182可与捕获引物112耦合。桥式扩增或其他合适的基于表面的扩增过程可用于以诸如图1i所示的方式产生核酸配体候选物(或扩增子)174的扩增子174、174'的簇。注意为了简单起见，图1i省略了第二部分150和靶标160，它们可保持在孔中，也可被除去，例如，通过将圈合目标160的连接子切割到部分130，或将连接子切割部分130切割到表面。检测电路190可对与捕获引物耦合的扩增子174、174'进行测序，例如，以诸如本领域已知的方式使用边合成边测序。类似性地，聚合酶可用于基于相应扩增子174、174'的序列使用标记的(例如，荧光标记的)核苷酸延伸引物111或112，并且检测电路190可使用由那些核苷酸的标记产生的信号来鉴定添加此类核苷酸的序列。被测序的核酸配体候选物(或其扩增子174)可被认为是靶标160的核酸配体，例如，因为此类核酸配体候选物已经通过多个操作与靶标160耦合，表明对靶标具有选择性。
76.如上文参照图1a所述，用于核酸配体选择过程的靶标可以任何合适的方式在孔内耦合，诸如使用捕获引物。例如，图2a至图2f示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的另选工艺流程中使用的示例设备和操作。在图2a所示的示例中，第一部分在这些孔中的每个孔内通过捕获引物耦合，例如，第一部分230经由捕获引物211与衬底210耦合，而第一部分230'经由捕获引物212与衬底210耦合。捕获引物211和捕获引物212可彼此正交，例如捕获引物211可包括p5引物，并且捕获引物212可包括p7引物。第一部分230、230'可以诸如参照图1a所述的方式与包括分子140的流体接触，这些分子包括第二部分150和靶标160。如图2b所示，第二部分150可与第一部分230耦合，以便经由捕获引物212使靶分子160与衬底210耦合(例如，在孔内，未具体示出)，而另一个第二部分150可与第一部分230耦合，以便经由捕获引物211使靶分子160与衬底210耦合(例如，在同一孔或另一个孔内，未具体示出)。如图2c所示，对靶标160具有选择性的核酸配体候选物(或其扩增子)174可以诸如参照图1d和图1g所述的方式与其耦合。如图2d所示，核酸配体候选物174可以诸如参照图1e所述的方式从靶160解耦以用于扩增。
77.在一些示例中，第一部分230、230'可从捕获引物211、212分离。因此，以诸如图2e所示的方式，第一部分230、230'、第二部分150和靶标160可通过将第一部分230、230'从其相应捕获引物211、212分离而从衬底210解耦。例示性地，捕获引物211、212可包括可切割部分，诸如8-氧代-g，其可在进行测序之前被切割以分离第一部分230、230'和与其耦合的任何元素。例如，如图2f所示，核酸配体候选物174的衔接子181、181'和其扩增子174'可与相应捕获引物211杂交，并且核酸配体候选物的衔接子182、182'和其扩增子可与相应捕获引物212杂交以用于扩增和测序，诸如参考图1h至图1i所述。另选地，在诸如贯穿本公开提供的示例中，靶标160、连接子、第一部分和第二部分中的任何合适的部分可包括可使用蛋白酶消化并因此从衬底和/或捕获引物解耦的蛋白质。
78.应当理解，与靶标接触的核酸配体候选物可包括任何合适的序列和组分。例如，图3示意性地示出了用于设备或工艺流程的示例核酸配体候选物，如参考图1a至图1i或图2a至图2f所述。在图3所示的非限制性示例中，核酸配体候选物171、172、173、174各自包括可能对靶标具有选择性的寡核苷酸亚序列(区域)171"、172"、173"、174"，以及与寡核苷酸亚序列耦合的衔接子181和182。寡核苷酸子序列171"、172"、173"、174"可能彼此不同。每个衔接子181可包括任选的间隔区300、与捕获引物111互补的捕获引物衔接子311和可用于进行核酸配体候选物的pcr扩增(如果合适的话并且如果此类操作包括在工艺流程中的话)的任选的pcr衔接子320。类似地，每个衔接子182可包括任选的间隔区300、与捕获引物112互补的捕获引物衔接子312和可用于进行核酸配体候选物的pcr扩增(如果合适的话并且如果此类操作包括在工艺流程中的话)的任选的pcr衔接子320。间隔区300可在寡核苷酸亚序列171"、172"、173"、174"和捕获引物衔接子311或312之间提供合适的距离，使得捕获引物衔接子311可不抑制寡核苷酸亚序列与靶标160适当地耦合。例示性地，间隔区300可包括5个或更多个核苷酸、10个或更多个核苷酸、或15个或更多个核苷酸。
79.应当理解，任何合适的系统、方法和组合物可用于基于本教导来选择核酸配体。例如，图4示意性地示出了在用于使用测序选择核酸配体的工艺流程中的示例操作。图4中所示的方法400包括在设置于衬底内的多个孔中的每个孔内耦合靶标(操作410)。例如，参照图1a所述的靶标160可与每个孔内的衬底直接耦合，例如，以诸如参照图2a所述的方式，经由合适的连接子诸如捕获引物。或者，例如，靶标160可经由与衬底耦合的第一部分和与靶标耦合并与第一部分耦合的第二部分，以诸如参照图1a至图1b所述的方式，在每个孔内与衬底间接耦合。图4中所示的方法400还包括使这些孔中的每个孔与包含多种核酸配体候选物的流体接触(操作420)。例如，孔可以诸如参照图1c所述的方式与核酸配体文库171、172、173、174接触，或者可以诸如参照图1f所述的方式与核酸配体174的扩增子接触。图4所示的方法400包括，在这些孔中的至少一个孔内，使对靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与靶标耦合(操作430)。例如，核酸配体候选物174(或其任何扩增子)可以诸如参照图1d、图1g或图2c所述的方式与靶标160耦合。图4中所示的方法400包括除去未与靶标耦合的任何核酸配体候选物(操作440)。例如，以诸如参考图1e所述的方式，核酸配体候选物171、172、173可通过使缓冲液流过孔而被除去，而核酸配体候选物174尽管有这样的流动仍保持与靶标160耦合。图4所示的方法400包括在孔内对除去之后剩余的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对靶标具有选择性的任何核酸配体(操作450)。例如，可产生核酸配体候选物174的扩增子(或其扩增子)，并对此类扩增子进行测序。
80.另外的注释
81.应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
82.虽然上文描述了各种说明性示例，但本领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本发明的情况下在其中作出各种改变和修改。所附权利要求书打算涵盖落入本发明的真正精神和范围内所有此类改变和修改。

技术特征：

1.一种从多种核酸配体候选物中选择核酸配体的方法，所述方法包括：在设置在衬底内的多个孔中的每个孔内耦合靶标；使所述孔中的每个孔与包含多种核酸配体候选物的流体接触；在所述孔中的至少一个孔内，使对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与所述靶标耦合；除去未与所述靶标耦合的任何核酸配体候选物；以及在所述孔内对所述除去之后剩余的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对所述靶标具有选择性的任何核酸配体。2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述多个孔中的每个孔内耦合所述靶标包括：在所述孔中的每个孔内耦合第一部分；使多个第二部分与所述靶标中的相应靶标耦合；以及在所述孔中的每个孔内使所述第二部分与所述第一部分耦合。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一部分包括链霉亲和素，并且所述第二部分包括生物素。4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述第一部分通过捕获引物在所述孔中的每个孔内耦合。5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括在进行所述测序之前从所述捕获引物分离所述第一部分。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述衬底包括检测电路，所述检测电路用于对所述除去之后剩余的所述核酸配体候选物进行测序。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述多个孔包括所述流体平行流过的流通池。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物具有当与所述靶标耦合时改变的三级结构。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括产生对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子。10.根据权利要求9所述的方法，其中产生对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的扩增子包括：从所述靶标解耦所述核酸配体候选物；以及使用聚合酶链式反应(pcr)以使用所述核酸配体候选物产生所述扩增子。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述pcr在与所述孔不同的扩增室中进行。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：使所述孔中的每个孔与包含所述扩增子的流体接触；在所述孔中的每个孔内，使对所述靶标具有选择性的任何扩增子与所述靶标耦合；以及除去未与所述靶标耦合的任何扩增子。13.根据权利要求12所述的方法，其中被测序的任何核酸配体候选物包括在去除未与所述靶标耦合的任何扩增子之后剩余的任何扩增子。14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括产生对所述靶标
具有选择性的任何扩增子的另外的扩增子。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中对任何核酸配体候选物进行测序包括：使所述除去之后剩余的任何核酸配体候选物与设置在所述孔内的捕获引物耦合；在所述孔内进行扩增以产生与所述捕获引物耦合的扩增子；以及对与所述捕获引物耦合的所述扩增子进行测序。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶标经由所述捕获引物中的相应捕获引物在所述孔内耦合。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述捕获引物在所述孔内耦合第一部分，并且第二部分在所述孔内与所述第一部分耦合并与所述靶标耦合。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述捕获引物与所述靶标分开地与所述孔耦合。19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包含与相应捕获引物互补的第一衔接子和第二衔接子。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物进一步包括设置在所述第一衔接子和对所述靶标具有选择性的候选物的区域之间的第一间隔区，以及设置在所述第二衔接子和对所述靶标具有选择性的候选物的所述区域之间的第二间隔区。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括寡核苷酸。22.一种用于从多种核酸配体候选物中选择核酸配体的系统，所述系统包括：衬底，所述衬底包括多个孔；靶标，所述靶标在所述孔中的每个孔内耦合；流体，所述流体包含多种核酸配体候选物并接触所述孔中的每个孔，其中对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与所述靶标耦合；和检测电路，所述检测电路对所述孔内的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对所述靶标具有选择性的任何核酸配体。23.根据权利要求22所述的系统，其中：第一部分在所述孔中的每个孔内耦合；多个第二部分与所述靶标中的相应靶标耦合；并且所述第二部分在所述孔中的每个孔内与所述第一部分耦合，以在所述孔中的每个孔内与所述靶标耦合。24.根据权利要求23所述的系统，其中所述第一部分包括链霉亲和素，并且所述第二部分包括生物素。25.根据权利要求23或权利要求24所述的系统，其中所述第一部分通过捕获引物在所述孔中的每个孔内耦合。26.根据权利要求25所述的系统，其中所述第一部分可从所述捕获引物分离。27.根据权利要求22至26中任一项所述的系统，其中所述多个孔设置在所述检测电路上。28.根据权利要求22至27中任一项所述的系统，其中所述多个孔包括所述流体平行流
过的流通池。29.根据权利要求22至28中任一项所述的系统，其中对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物具有当与所述靶标耦合时改变的三级结构。30.根据权利要求22至29中任一项所述的系统，其中扩增子由对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物产生。31.根据权利要求30所述的系统，其中使用包括以下的步骤产生对所述靶标具有选择性的任何核酸配体候选物的所述扩增子：从所述靶标解耦所述核酸配体候选物；以及使用聚合酶链式反应(pcr)以使用所述核酸配体候选物产生所述扩增子。32.根据权利要求31所述的系统，所述系统包括与所述孔不同的扩增室以进行所述pcr。33.根据权利要求30至32中任一项所述的系统，所述系统进一步包括：流体，所述流体包含所述扩增子并接触所述孔中的每个孔，其中对所述靶标具有选择性的任何扩增子与所述靶标耦合。34.根据权利要求33所述的系统，其中被测序的任何核酸配体候选物包括在去除未与所述靶标耦合的任何扩增子之后剩余的任何扩增子。35.根据权利要求34所述的系统，所述系统进一步包括对所述靶标具有选择性的任何扩增子的另外的扩增子。36.根据权利要求22至35中任一项所述的系统，所述系统进一步包括：设置在所述孔内并与所述除去之后剩余的任何核酸配体候选物耦合的捕获引物；和与所述捕获引物耦合的所述核酸配体候选物的扩增子，其中所述检测电路对与所述捕获引物耦合的所述扩增子进行测序。37.根据权利要求36所述的系统，其中所述靶标经由所述捕获引物中的相应捕获引物在所述孔内耦合。38.根据权利要求37所述的系统，其中所述捕获引物在所述孔内耦合第一部分，并且第二部分在所述孔内与所述第一部分耦合并与所述靶标耦合。39.根据权利要求36所述的系统，其中所述捕获引物与所述靶标分开地与所述孔耦合。40.根据权利要求36所述的系统，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包含与相应捕获引物互补的第一衔接子和第二衔接子。41.根据权利要求40所述的系统，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物进一步包括设置在所述第一衔接子和对所述靶标具有选择性的候选物的区域之间的第一间隔区，以及设置在所述第二衔接子和对所述靶标具有选择性的候选物的所述区域之间的第二间隔区。42.根据权利要求22至41中任一项所述的系统，其中所述核酸配体候选物中的每种核酸配体候选物包括寡核苷酸。

技术总结

本发明提供了用于从多种核酸配体候选物中选择核酸配体的方法和系统。在设置在衬底内的多个孔中的每个孔内耦合靶标。使这些孔中的每个孔与包含多种核酸配体候选物的流体接触。在这些孔中的至少一个孔内，使对该靶标具有选择性的任何核酸配体候选物与该靶标耦合。除去未与该靶标耦合的任何核酸配体候选物。在这些孔内对该除去之后剩余的任何核酸配体候选物进行测序，以鉴定对该靶标具有选择性的任何核酸配体。酸配体。酸配体。