源自间充质基质细胞的细胞外囊泡(EV)和用于获得所述EV的方法与流程

源自间充质基质细胞的细胞外囊泡(ev)和用于获得所述ev的方法
技术领域
1.本发明涉及源自间充质基质细胞(msc)的细胞外囊泡(ev)和包含所述囊泡的组合物，以及获得后者的方法。

背景技术：

2.ev是由细胞自然释放的脂双层分隔的颗粒，但是ev与细胞不同，不可复制。ev的直径范围从接近物理上可能的最小单层脂质体(大约20纳米至30纳米)至大到10微米以上，但是绝大多数的ev小于200nm。他们搬运大量蛋白质、核酸、脂质、代谢物、甚至是源自亲代细胞的细胞器。据认为迄今为止研究的大多数细胞能释放ev，包括一些细菌、真菌和被细胞壁包围的植物细胞。已经提出了多种ev亚型，根据大小、生物发生途径、转运物、细胞来源和功能进行了不同的定义，从而导致了历史上的不同命名，包括外泌体、微泡和核外颗粒体等术语。
3.ev可以用于目的，例如向病变组织和细胞输送核酸或其他转运物。与这种日益增长的兴趣并行的是公司的成立和资助计划(这些公司和资助计划聚焦于开发ev作为生物标志物或疾病疗法)、国际细胞外囊泡学会(isev)的成立，以及致力于该领域的科学期刊(the journal of extracellular vesicles)的成立。
4.随着将ev用于用途的兴趣日益增长，对临床级ev的需求也已经增加。为了应用于临床，需要以可复制和可控的方式生产ev。为了确保生产的各批次相同且质量一致，用于制造包含ev的组合物的良好操作规范(gmp)至关重要。当涉及细胞衍生疗法时，gmp尤其困难。
5.已知来源于间充质基质细胞(msc)的外泌体的生产方法，例如，reka agnes haraszti等人，2018。此外，diem huong huang等人，2020在外泌体对皮肤组织的再生潜力方面描述了源自msc的外泌体，即在特定条件下产生的外泌体。多种培养基可以用于生产msc，如lucas g.chase等人，2012中公开的无血清和无异源性培养基。antoine monsel等人，2016中进一步描述了msc分泌蛋白质组(secretome)和细胞外囊泡(ev)在肺部疾病方面的用途。提出的对于其在人类中的用途的数据大多是推测性的，并且突出了现有技术的几个问题，例如低再现性和低产量。此外，该文献警告，使用生物反应器大规模培养msc以生产ev存在潜在问题。最后，youngja park等人，2011提到了白蛋白在肺部疾病方面的用途。
6.然而可以广泛临床上应用ev之前，仍然需要克服多种问题。开发以可靠和可重复量化的方式生产、储存和处理临床级ev的平台仍然是一个挑战。将源自msc的ev类疗法引入临床之前，源自msc的ev类药物和后续的临床实验需要解决多种科学、监管、技术和机制问题。
7.因此，需要在gmp规范下，可以以稳定、可重复的方式低成本、大规模生产临床级的msc来源的ev的方案。而且还需要具有良好稳定性和具有商业吸引力的保质期的ev类产品。

技术实现要素：

8.本发明提供了一种可以在国际协调会(ich)2020gmp质量规范的gmp条件下，以稳定和可重复的方式从msc生产ev的方法。获得的ev组合物是临床级的cgmp产品，其易于在临床试验和患者中使用且具有良好的稳定性。
9.为此，本发明提供了一种根据权利要求1的制造方法和一种根据权利要求9的组合物。在权利要求2至8和权利要求10至13中描述了优选的实施方式。
10.所述产品可以具有多种临床应用和效果。在权利要求14至23中描述了所述产品的用途。由于所述组合物的长期稳定性，该产品可以应用于多种临床应用。
附图说明
11.图1示出了可以用于生产本发明的ev的msc扩增单元和ev加工单元的实施方式。
12.定义
13.除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步导引，包含了术语定义以更好地理解本发明的教导。
14.如本文中所使用的，以下术语具有以下含义：
15.除非上下文另有明确规定，否则本文使用的“一个”、“一种”和“所述”是指单数指代物和复数指代物。例如“一个隔室”是指一个或多于一个的隔室。
16.本文所用的“大约”是指诸如参数、量、持续时间等的测量值，旨在包括特定值+/-20％以下，优选+/-10％以下、更优选+/-5％以下、甚至更优选+/-1％以下、还更优选+/-0.1％以下的变化，目前为止这样的变化适用于所公开的发明。然而，应当理解的是，修饰语“大约”所指的值本身也被具体公开。
17.本文所用的“包括”与“包含”或“含有”同义，并且是开放式术语，其规定存在其之后的事项例如组分，并且不排除或不包括本领域已知或其中公开的额外的、未列举的成分、特征、元素、组分、步骤的存在。
18.通过端点列举的数值范围包括包含在该范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
19.除非另有定义，此处和贯穿说明书中的表述“重量％”、“重量百分比”、“％wt"”或“wt％”是指基于制剂总重量的各种组分的相对重量。
20.虽然术语“一种或多种”或“至少一种”，例如一组组分中的一种或多种或至少一种本身是清楚的，但是通过进一步举例，该术语特别指任何一种所述组分，或任何两种以上所述组分，例如≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等所述组分，至多全部所述组分。
21.除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步导引，包含了术语的定义以更好地理解本发明的教导。提供本文中所使用的术语或定义仅仅是帮助。
22.贯穿本说明书的“一个实施方式”是指结合该实施方式所描述的特定特征、结构或特性包含于本发明的至少一个实施方式中。因此，贯穿本说明书不同地方的短语“在一个实施方式中”不一定都指代相同的实施方式，但是可以指代相同的实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，特定特征、结构或特性可以以本公开领域的技术人员显而易见的任何合
适方式彼此结合。此外，虽然本文描述的一些实施方式包括其他实施方式中包含的一些特征但不包括其他特征，但是不同实施方式的特征的组合仍在本发明的范围内并形成不同的实施方式，并且是本领域技术人员所理解的。例如，在以下权利要求中，可以将任意要求保护的实施方式以任意组合使用。
23.出于本发明的目的，术语“细胞外囊泡”或“ev”应理解为由不同类型的细胞在体内和体外分泌的微米尺寸或纳米尺寸的颗粒，包括与所述ev结合的蛋白质。ev包含封装在脂质球中的蛋白质、生长因子、mirna和其他分子。ev可以根据尺寸和细胞内起源进行分类。外泌体是ev的亚型，其大小通常为0.1微米以下。外泌体来源于多泡体，这是一种次级内体隔室，其通过多泡体与质膜的融合分泌。另一种ev的亚型是脱落囊泡(也称为微囊泡)，其是通过破坏皮质细胞骨架直接从细胞膜释放的膜囊泡的异质，最大可达1微米。细胞分泌的所有类型的囊泡通常被称为ev。
24.与物质相关的术语“与ev结合”表示所述物质a)附着或结合到ev的表层(通过任意方式结合，例如共价结合或非共价结合)，优选以非共价键的形式；b)附着或结合到所述ev的表层内；c)被内化到所述ev中。
25.所述与ev结合的物质可以是任意类型的物质，例如但不限于包括下述的分子：氨基酸、蛋白质、肽、核酸如dna和rna(例如非编码rna、mirna、mrna)、糖、碳水化合物、脂肪、维生素、生长因子、促血管生成分子、心脏保护酶、抗体、抗炎分子、抗纤维化分子、抗氧化分子、促神经源性分子和抗病毒分子；和离子如金属离子或钙离子。
26.术语“细胞培养基”或“培养基”是指含有营养物和其他明确组成的成分的水溶液，可用于细胞维持或生长。
27.术语“无血清”细胞培养基是指不含动物或人血清、血浆或血淋巴的细胞培养基。所述无血清培养基可以包含从血液、血清或血浆加工的成分，或者源自血液、血清或血浆的成分，例如白蛋白、转铁蛋白、低密度脂质和激素。它还可以包含其他生物成分，优选已知且可以完全可复制的成分和浓度，但不是血清、血浆或血淋巴(例如，生长因子、激素和载体蛋白)。
28.术语“无异源性”细胞培养基应理解为不包含任何直接来源于非人类动物的成分或由非人类动物dna序列制造的重组成分的细胞培养基。
29.本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成显著刺激且不会消除所施用的组合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。例如，药学上可接受的载体可以作为稳定剂和/或辅料。载体的实例是丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物，但不限于此。
30.术语“足量”是指足以产生所需的可衡量效果的量，例如，足以改变蛋白表达特性的量。
31.术语“有效量”是可以有效改善疾病症状的量。有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是。
32.术语“”是指性和预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或疾病。需要的那些包括已经患有疾病的那些和易于患有疾病的那些或要预防疾病的那些。
33.术语“组合物”指制造过程中任意阶段的组合物，包括最终药学上可接受的产品及
任何过程中的中间体。
34.术语“”指逆转、预防、改善或抑制疾病、病症或病况的进程，或疾病、病症或病况的一个或多个的症状。如本文中所使用的，“”还可以指与未的对照体相比，或与前的相同哺乳动物相比，降低哺乳动物中疾病、病症或病况发生的可能性或发生率。例如，如本文所使用的，“”可以指预防疾病、病症或病况，并且可以包括推迟或预防疾病、病症或病况的发生，或推迟或预防疾病、病症或病况的症状。如本文中所使用的，“”还可以指在患有疾病、病症或病况之前降低疾病、病症或病况的严重性或减轻此类疾病、病症或病况的症状。这种在患病之前预防或减轻疾病、病症或病况的严重程度涉及本文所述的将本技术的组合物施用于在施用时未患有疾病、病症或病况的受试者。如本文所使用的，“”还可以指预防疾病、病症或病况或此类疾病、病症或病况的一种或多种的症状的复发。如本文所使用的，术语“疗法”、“”、“在上”指上文定义的行为。
35.如本文所使用的，术语“纤维化”是指在修复过程或反应过程中在器官或组织中形成过量的纤维结缔组织。
36.出于本发明的目的，术语“间充质基质细胞”或“msc”应理解为能够分化成各种细胞类型的基质贴壁细胞。msc的来源是骨髓、脐带细胞、脂肪组织、羊水、乳腺、血液。
具体实施方式
37.本发明涉及一种来自msc的ev的生产方法，通过所述方法获得的组合物和其用途。
38.在第一方面，本发明涉及一种源自msc的ev的组合物的制造方法。更具体地，所述方法包括以下步骤：
[0039]-在包含纯化的人血清白蛋白和人转铁蛋白的无血清且无异源性的培养基中培养和扩增msc。
[0040]-收集细胞上清液，所述细胞上清液中包含ev；
[0041]-过滤所述细胞上清液以获得ev；和
[0042]-浓缩所述ev，优选通过超滤。
[0043]
使msc在容器中培养和扩增，优选为生物反应器，更优选为搅拌罐生物反应器，以用于生产ev的用途。为此，msc可以在补充有人血清白蛋白和转铁蛋白的无血清且无异源性培养基中生长和扩增。通过使用无血清且无异源性的生长培养基来培养和扩增所述msc，可以避免ev中存在不想要的污染物。这类污染物可以干扰所得ev产品的进一步临床用途。血清和血小板裂解物通常包含白蛋白，并且细胞生长经常受到培养基中的白蛋白水平的影响。然而，与血清和血小板裂解物中任何其他成分一样，白蛋白的水平是可变的。为了获得临床级的ev，应避免使用血清和/或血小板裂解物。
[0044]
然而，白蛋白是终产品的关键成分，因为其有助于所述ev的稳定性和功能性。本发明上下文中，诸如ev等产品的“稳定性”是指特定配方或特定产品在特定环境下(例如容器或密闭系统)在给定的时间段内，保持在物理、化学、微生物、毒理学和功能规格或特征的参数的预定范围内。此类参数的非限制性实例是颗粒数目、粒径以及内部成分的泄漏和活性。
[0045]
因为外源白蛋白有助于ev的稳定性，外源白蛋白应该存在于所述培养基中。在一个实施方式中，因此所述培养基包含人白蛋白，其是重组或纯化的白蛋白，例如从人血浆中
纯化的白蛋白。在进一步的实施方式中，所述培养基中存在的所述白蛋白的浓度为1g/l至5g/l。已经证明后一种浓度对于获得有优良稳定的终产品尤其有用。
[0046]
所述细胞生长培养基进一步包含转铁蛋白，优选重组或纯化的转铁蛋白，例如，从血浆中纯化的转铁蛋白。转铁蛋白构成了广泛的单链糖蛋白同型的微异质，其分子量约为78kda至80kda。转铁蛋白是向培养的细胞提供铁的合适生理途径，因为其促进细胞外铁的储存和运输。据报道，转铁蛋白有助于体内ev的细胞摄取，例如参考wo2013084001。此外，与白蛋白类似，转铁蛋白有助于稳定最终ev产品。在一个实施方式中，所述转铁蛋白以50mg/l和100mg/l之间的浓度存在于生长培养基中、优选55mg/l和100mg/l之间、优选50mg/l和70mg/l之间，优选55mg/l和70mg/l之间。后一种浓度被认为是对ev产品的质量来说是最佳的。
[0047]
本发明能够使白蛋白和转铁蛋白都存在于终产品中，其中大部分白蛋白和转铁蛋白会结合所述ev。
[0048]
在进一步的实施方式中，所述培养基是无机金属盐、营养物如氨基酸和维生素的基础混合物，ph在7.0至7.4的范围内，例如从dulbecco’s改良eagle培养基(dmem)或dmem/f-12的组成中已知的。该培养基还可以包含谷氨酰胺和谷氨酸盐、或其前体例如l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、水平不超过4500mg/l的葡萄糖和一种或多种脂肪酸。
[0049]
在进一步的实施方式中，所述组合物包含人生长因子，例如但不限于表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子(igf)、人血小板衍生生长因子(pdgf，例如人pdgf-bb、人pdgf-ab和pdgf-aa)和/或人tgf-β1，优选重组pdgf-bb和/或tgf-β1。本发明人还发现该生长因子和其他生长因子协同以促进msc生长和增殖。在一个实施方式中，所述培养基还包含pdgf和tgf-β1。
[0050]
pdgf是细胞生长和分裂的调节剂，其与血小板来源的生长因子受体(pdgfr)结合。在化学术语中，pdgf是由两条a(-aa)链或两条b(-bb)链或两条(-ab)组合而组成的二聚体糖蛋白。已经表明pdgf-ab可以结合pdgf的α受体亚基和β受体亚基，从而形成pdgfα-β受体二聚体和pdgfα-α受体二聚体。在本公开的背景中，pdgf包括pdgf-bb、pdgf-ab和pdgf-aa。
[0051]
转化生长因子-β1(tgf-β1)是一种多效性的细胞因子，其刺激msc的增殖，此外还影响msc的免疫调节特性并修饰其分泌蛋白质组，使其具有促炎或抗炎特性。
[0052]
在一个实施方式中，pdgf是pdgf-bb。在一个实施方式中，pdgf-bb的水平在约1ng/ml和150ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平在约7.5ng/ml和120ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平在约15ng/ml和60ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少为约10ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为15ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为20ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为21ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为22ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为23ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为24ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为25ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为26ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为27ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为28ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为29ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为30ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为31ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至
少约为32ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为33ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为34ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为35ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为36ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为37ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为38ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为39ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-bb的水平至少约为40ng/ml。
[0053]
在另一个实施方式中，pdgf是pdgf-ab。在一个实施方式中，pdgf-ab的水平在约1ng/ml和150ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平在约7.5ng/ml和120ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平在约15ng/ml和60ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为10ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为15ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为20ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为21ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为22ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为23ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为24ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为25ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为26ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为27ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为28ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为29ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为30ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为31ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为32ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为33ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为34ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为35ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为36ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为37ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为38ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为39ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-ab的水平至少约为40ng/ml。
[0054]
在另一个实施方式中，pdgf是pdgf-aa。在一个实施方式中，pdgf-aa的水平在约1ng/ml和150ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平在约7.5ng/ml和120ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平在约15ng/ml和60ng/ml之间。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为10ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为15ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为20ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为21ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为22ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为23ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为24ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为25ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为26ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为27ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为28ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为29ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为30ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为31ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为32ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为33ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为34ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为35ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为36ng/ml。在另一个实施方式
中，pdgf-aa的水平至少约为37ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为38ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为39ng/ml。在另一个实施方式中，pdgf-aa的水平至少约为40ng/ml。
[0055]
无异源性且无血清培养基可以通过组合单独的成分而制备，或者可以选自(任意调整)基于本文指导的商用产品。例如，可以使用可以潜在使用的商用无血清且无异源性培养基，可选在根据本文所公开的任选特征和/或偏好任选地进行修改之后使用。
[0056]
在一个实施方式中，所述培养基可以配备有缓冲系统。调节ph对于最佳培养条件至关重要，通常由两种缓冲系统之一(天然缓冲系统或化学缓冲系统)实现。
[0057]
天然缓冲系统中，气态co2与培养基中的co3
‑‑
/hco3-的含量保持平衡。具有天然缓冲系统的培养基需要在5-10％co2的气体环境中保持，通常使用co2培养箱保持。天然缓冲系统成本低且无毒。使用两性离子hepes的化学缓冲在ph 7.2至7.4的范围内具有出的缓冲能力，并且不需要受控的气体环境。hepes相对昂贵，并且在较高浓度下对于某些细胞类型有毒。已经显示hepes可以极大地提高培养基对暴露在荧光灯下所引起的光毒性效应的敏感性。
[0058]
在一个实施方式中，所述培养基可以包括酚红作为ph指示剂，其可以持续监测ph。细胞生长期间，由于细胞释放的代谢物使ph值发生变化，培养基会改变颜。在低ph值时，酚红使培养基变黄，而在较高的ph值时，酚红使培养基变紫。ph7.4时培养基呈亮红，这是培养细胞的最佳ph值。
[0059]
在另一个实施方式中，所述培养基中可以包含无机盐。所述无机盐有助于保持渗透压平衡并通过提供钠、钾和钙离子以助于调节膜电位。
[0060]
所述培养基可以包含氨基酸，优选必需氨基酸。l-谷氨酰胺是一种必需氨基酸，尤为重要。l-谷氨酰胺向nad、nadph和核苷酸提供氮，并作为新陈代谢的次级能量来源。l-谷氨酰胺是一种不稳定的氨基酸，随着时间的推移，它会转化为细胞无法使用的形式，因此应该在即将使用前添加到培养基中。添加高于原始培养基配方所要求的l-谷氨酰胺时应注意，因为l-谷氨酰胺的降解会导致氨的累积，而氨会对某些细胞系造成有害影响。哺乳动物细胞培养基的l-谷氨酰胺浓度可以为培养基199中的0.68mm至dulbecco’s改良eagle培养基中的4mm不等。无脊椎动物细胞培养基可以包含多达12.3mm的l-谷氨酰胺。glutamax等的补充剂更加稳定，可以代替谷氨酰胺用于长期培养而无需更换或补充培养基，并在此期间获得更稳定的谷氨酰胺浓度。
[0061]
也可以在培养基中添加非必需氨基酸以替换那些在生长期间中被耗尽的氨基酸。用非必需氨基酸补充培养基可刺激细胞生长以及延长细胞活性。
[0062]
糖类形式的碳水化合物是主要的能量来源。大多数培养基含有葡萄糖和半乳糖，然而，有些培养基含有麦芽糖和果糖。
[0063]
所述培养基还可以进一步包含脂肪酸、脂质、维生素、微量元素。
[0064]
微量元素通常被补充至无血清培养基中以取代那些在血清中通常存在的微量元素。微量元素如铜、锌、硒和三羧酸中间体，是细胞正常生长所需的微量化学元素。
[0065]
在一个实施方式中，抗生素可用于控制细菌和/或真菌污染物的生长，例如，其通常是青霉素和链霉素的混合物，和/或其他化合物，例如但不限于两性霉素、氨苄霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌
素、巴龙霉素、青霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大观霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素和吉欧霉素。
[0066]
在一个实施方式中，所述msc可以在所述生物反应器中存在的微载体或微珠上生长和扩增。这种微载体或微珠是本领域已知的并且是商业上可购得的。在一个实施方式中，所述微载体或微珠可以涂覆有细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、它们的模拟物或其组合。在优选的实施方式中，所述微载体或微珠带负电。
[0067]
一旦msc达到所需浓度和/或融合度，就收集包含所述ev的细胞上清液以进一步加工。本发明的背景中，所述细胞上清液是msc可以在其中生长和扩增的细胞培养基。在一个实施方式中，在msc达到至少40x106细胞/l的最低浓度时收集上清液。可以通过细胞计数确定细胞浓度和细胞活性，例如通过血细胞计数仪如b
ü
rker计数室和台盼蓝染。在上述的培养条件下，在培养所述msc 18小时至24小时的时间段内，所述msc会至少产生每ml细胞培养基0.25x109个ev。
[0068]
上述使用的“颗粒”可以是粒径优选在0.05微米和0.22微米之间的任意颗粒，其中是ev。颗粒的其他实例可以是蛋白质或肽聚集体。所述颗粒的来源为msc或用于培养和扩增msc的细胞培养基。因此，所述颗粒可以是通常存在于所述细胞培养基或msc的任意颗粒，或是所述细胞培养基或msc一部分的任意颗粒。
[0069]
优选地，当使用本文所描述的方法时，至少90％的粒径在0.05微米和0.22微米之间的所述颗粒是ev。
[0070]
在后续的步骤中，将过滤所述细胞上清液以去除存在于所述细胞培养基的污染物。后者将有助于终产品的纯度和稳定性。在一个优选实施方式中，所述过滤包括至少两个过滤步骤。在一个实施方式中，至少一个所述过滤步骤是死端过滤。在进一步的实施方式中，所述两个过滤步骤均通过死端过滤进行。优选地，至少一个过滤步骤用作产物灭菌，以符合上述定义的gmp规范。在某些情况下，发现连续死端过滤对于从上清液中充分去除杂质是必要的。在某些情况下，据发现单次过滤通常会导致使用的过滤器堵塞，并降低最终产品的纯度和量。
[0071]
第一个过滤步骤中，通过死端过滤来过滤细胞上清液。在进一步优选的实施方式中，所述过滤通过将所述上清液置于筛孔尺寸为1微米至5微米的过滤器上进行，更优选筛孔尺寸为1微米至3微米的过滤器。在一个实施方式中，所述过滤通过死端过滤进行，优选在具有提供通过过滤器的恒定流速的蠕动泵的密闭系统中进行的，优选是100ml/min。
[0072]
在一个实施方式中，将第一次过滤的滤液通过第二过滤器，此时该第二过滤器的孔径小于第一个过滤步骤中所使用过滤器的孔径。优选地，该第二过滤步骤是灭菌步骤，以使最终产品符合上述定义的gmp规范。在一个更优选的实施方式中，所述过滤器的筛孔尺寸低于1微米，更优选在0.05微米和1微米之间，甚至更优选在0.1微米和0.5微米之间，最优选在0.1微米和0.22微米之间。在一个实施方式中，所述第二过滤步骤通过死端过滤进行，优选在与第一个过滤步骤相互连接的密闭系统中进行，由蠕动泵提供通过过滤器的恒定流量，优选是100ml/min。
[0073]
所述过滤步骤中的滤液将会包含本发明的ev。最终步骤中，所述ev将会被洗涤和浓缩。洗涤和浓缩可以通过本领域常规方式进行如膜过滤、微滤或超滤进行。浓缩是去除溶液中的液体同时保留溶质分子的过程。
[0074]
膜过滤是生命科学实验室常用的分离技术。根据膜的孔隙度，膜过滤可以分类为微滤或超滤。微滤膜的孔径通常在0.1μm和10μm之间，通常用于澄清、灭菌和去除微粒或用于细胞收集。超滤膜具有0.001μm至0.1μm的小的多的孔径，用于浓缩并脱盐溶解的分子(蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和其他生物分子)、交换缓冲液和粗馏分。超滤膜通常根据截留分子量(mwco)进行分类，而非根据孔径进行分类。有两种主要的膜过滤方式，其可以用微滤膜或超滤膜：1)直流过滤(dff)，也称为“死端”过滤，将进料流垂直施加于膜面并试图使100％的流体穿过该膜，和2)切向流过滤(tff)，也称为错流过滤，其中进料流平行于膜面通过，一部分穿过该膜(渗透物)，而其余部分(渗余物)再循环回进料容器中。
[0075]
优选地，所述洗涤和浓缩将通过tff进行。tff或错流过滤是其中进料流平行于膜面流过的方法。施加的压力使一部分进料流穿过膜(滤液或渗透物)，而其余部分(渗余物)再循环回进料容器中。
[0076]
在一个实施方式中，将一个或多个死端过滤步骤的滤液用于tff浓缩步骤。在进一步优选的实施方式中，tff的截流分子量为100kda并且会将大部分(而非全部)的分子量低于100kda的颗粒和成分移除到tff渗透物中。因此，在渗余物中的所述最终组合物，将会去除分子量低于100kda的游离(即不与ev结合)的组分、成分或物质。所述组分、成分或物质可以是任意颗粒，例如通常存在于所述培养基或是所述培养基的一部分的蛋白质或肽段。将渗余物在tff装置中再循环，直至达到所需的渗余物浓度。再循环期间，渗余物可以使用洗涤介质或洗涤缓冲液进行洗涤，优选为盐缓冲液，以去除不需要的成分。随后可以将浓缩的渗余物收集在收集容器中，例如但不限于收集袋或冻存管，可以储存在低于10℃，优选在4℃，或冷冻在-20℃至-196℃、优选在-40
°
至-196℃、更优选在-80℃至-196℃。
[0077]
本发明的ev来源于msc。所述msc是人类来源的，并且可以来自于骨髓、脐带、华通氏胶(wharton’s jelly)、脐带血、羊膜、骨髓、脂肪组织、牙髓、外周血、输卵管、乳腺、肝和肺组织。在优选的实施方式中，所述msc来源于脐带(uc-msc)。
[0078]
在一个实施方式中，msc将从上述组织之一新鲜分离，并在生物反应器中进一步扩增。在另一个实施方式中，使用冻存的msc。从各种来源获得mscs的方法通常是本领域已知的，并且易于适用于本发明。简而言之，诸如脐带等组织可以被酶促消化，例如通过胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶等酶的方式，洗涤并离心。随后将所得沉淀接种于培养瓶中的合适细胞培养基中，同时在合适的条件下温育。所述培养瓶可以涂覆细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、它们的模拟物或其组合。后者可以增强附着和细胞生长。在另一个实施方式中，所述培养瓶可以包含微载体或微珠，例如涂覆有细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、它们的模拟物或其组合。将更新培养基，直至细胞达到预定最低百分比的融合度，优选融合度为80％以上，之后收集细胞。
[0079]
传代时，培养的细胞从培养基质和彼此脱离和解离。细胞的脱离和解离可以如本领域通常已知的方式进行，例如通过用蛋白水解酶进行酶处理(例如选自胰蛋白酶、胶原酶，例如i、ii、iii或iv型、分散酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、用二价离子螯合剂处理(例如edta或egta)或机械处理(例如，通过小口径移液器或移液器吸头重复移液)，或这些处理方式的任意组合。
[0080]
合适的细胞脱离和分散方法应确保所需程度的细胞脱离和分散，同时保留培养基中的大部分活细胞。优选地，对培养的细胞进行脱离和解离将产生相当大比例的细胞作为
单个活细胞(例如，至少50％、70％、80％、90％以上的细胞)。残留的细胞可以存在于细胞团中，每个细胞团包含相对少量的细胞(例如，平均在1个和100个细胞之间)。
[0081]
接下来，可以将这样脱离和解离的细胞(通常作为等渗缓冲液或培养基中的细胞悬浮液)重新铺板到基质上(细胞可以粘附其上)，随后在上述的培养基中培养以保持进一步增殖。然后可以将这些细胞以10个至105个细胞/cm2的密度和在约1/16和1/2之间的分裂比、优选在约1/8和1/2之间、更优选在约1/4和1/2之间重新铺版进行培养。分裂比表示接种到空的(通常是新的)培养容器的传代细胞的分数，该培养容器与获得传代细胞的容器的表面积相同。培养容器，以及允许细胞粘附到培养容器的表面和细胞培养基的类型，可以与最初使用的以及上述描述的相同，也可以不同。
[0082]
在优选的步骤中，随后细胞将在更大的容器中接种和扩增。一旦细胞达到所需数量，就可以将细胞直接转移至生物反应器以进行进一步扩增和收获ev，或者可以冻存合适数量的细胞以备后续使用。所述msc的冻存通常在一种或多种冷冻保护剂的存在下进行。这种试剂可以避免冻融期间的细胞损伤，并且通常是技术人员已知的。冷冻保护剂的实例是，例如将dmso与细胞培养基混合。可以将细胞冻存在合适的容器或低温袋中。
[0083]
在进一步的步骤中，所述msc(可以是新鲜分离的或冻存的msc)可以在生物反应器中进一步扩增，优选密闭的搅拌罐生物反应器。细胞可以在上述合适的扩增条件(无血清且无异源性培养基)下在生物反应器中扩增。在一个实施方式中，如上述所述的用于冷冻保存的容器或低温袋设计为以无菌的方式连接于生物反应器，从而无需(层流)超净工作台。这使得ev的生产过程不需要(高度灭菌)的净室。
[0084]
上述的方法可以在用于ev的纯化系统中进行，包括msc细胞扩增单元和用于ev的加工单元。两个单元及其各自的隔室和/或组件彼此流体连接，允许细胞培养基和材料从一个单元流动至另一个单元。流体连接将通过本领域中的常规方式实现，例如管子、管道、阀门和泵。在一个实施方式中，所述msc细胞扩增单元将包括生物反应器(优选搅拌式生物反应器)和冷却室。所述冷却室将配备有用于将所述冷却室中的环境温度和物体冷却至低于10度(如4度)的装置。在优选的实施方式中，所述冷却室是冰箱。所述冷却室可以配备有罐和容器，用于分别储存要转移至生物反应器的新鲜细胞培养基，和来自所述生物反应器的细胞上清液。为此，细胞培养基容器或罐的出口将与生物反应器的入口流体连接。将存在泵，最好是蠕动泵，以确保正确的介质流动。生物反应器的出口将与冷却室中的细胞上清液容器的入口流体连接。同样，可以存在(蠕动)泵以确保产物流动。通过目前的设置，来自生物反应器的上清液可以流向细胞上清液收集容器或罐，同时可以向生物反应器供应新鲜培养基。生物反应器优选是搅拌式生物反应器。优选所述新鲜培养基至少是室温或更优选由本领域已知的任何加热装置预热，例如培养箱，优选预热至约37℃。可以通过本领域的常规方式实现搅拌，例如通过磁力搅拌器或安装在所述生物反应器中的搅拌器。所述生物反应器可以供应有co2或者可以位于co2培养箱中。在后一种实施方式中，该生物反应器将配备有允许气体交换的装置。传感器可以存在于细胞扩增单元中以监测各种过程。在一个实施方式中，可以存在传感器以测量所述生物反应器和/或co2培养箱中的温度、湿度和co2水平。还可以存在传感器以监测冷却室的条件，例如监测其温度。
[0085]
一旦msc达到所需数量，将从生物反应器中获得包含ev的细胞上清液，并将其储存于低于10℃的温度，例如4℃。一旦获得了适当体积的细胞上清液，所述上清液将被转移到
ev加工单元。在一个实施方式中，将该适当体积分批次转移至ev加工单元。在替代性实施方式中，将该体积连续转移至ev加工单元。ev加工单元优选配备一个或多个过滤装置，膜过滤装置，如tff浓缩器和用于最终产品的储存隔室(按本文所述顺序)。这些装置和隔室是流体连接的，并且液体可以从一个装置流至另一个装置，优选是闭环系统。在进一步优选的实施方式中，所述ev加工单元包含筛孔尺寸在1微米和5微米之间的第一过滤装置，更优选在1微米和3微米之间。随后将第一次过滤的滤液转移至第二过滤装置，此时筛孔尺寸小于第一过滤步骤中所使用的过滤装置的筛孔尺寸。在优选的实施方式中，所述过滤装置的筛孔尺寸低于1微米，更优选在0.05微米和1微米之间，甚至更优选在0.1微米和0.5微米之间，最优选在0.1微米和0.22微米之间。在一个实施方式中，所述过滤装置允许死端过滤，优选在与第一个过滤步骤相互连接的密闭系统中进行，蠕动泵提供通过过滤器的恒定流速，优选在100ml/min。
[0086]
过滤后，将滤液转移至tff装置。为此，将最终过滤装置再一次流体连接至所述tff。这些装置通常根据截留分子量(mwco)进行分类。截留分子量(mwco)或标称截留分子量(nmwco)定义为90％被膜保留的溶质的最小分子量。在优选的实施方式中，所述tff的截留分子量为100kda。所述tff将用于洗涤、浓缩并进一步纯化样品。从tff中，浓缩和纯化的样品将被转移到灌装和最终单元以获得最终产品。在一个实施方式中，最终产品将收集在袋中，该袋可以连接到将样品等分到最终容器的填充装置。或者，可以手动分装到最终容器中。
[0087]
例如，当使用上述的生产方法时，从生物反应器中最低浓度为至少40x106个细胞/升的msc的100倍浓缩上清液中，可以获得每毫升最终产品组合物至少1x10
11
个颗粒。msc的融合度为最高80％。优选每0.5l生物反应器接种约8x106个msc，进行培养并使其完全扩增。随后，所述msc开始向上清液释放ev，每24小时将该ev收集在，例如，培养袋中。在该实例中，合并四个所述培养袋中的内容物，进行过滤(在该实例中使用0.22微米的筛孔尺寸)和100x浓缩，获得每毫升至少1x10
11
个颗粒。
[0088]
上述实例中使用的“颗粒”可以是粒径在0.05微米和0.22微米之间的任意颗粒，其中是ev。颗粒的其他实例可以是蛋白质或肽聚集体。所述颗粒的来源为msc或用于培养和扩增msc的细胞培养基。因此，所述颗粒可以是通常存在于所述细胞培养基或msc的任意颗粒，或是所述细胞培养基或msc一部分的任意颗粒。
[0089]
优选地，当使用本文所描述的方法时，至少90％的粒径在0.05微米和0.22微米之间的所述颗粒是ev。
[0090]
在另一方面，本发明还涉及一种包含来源于msc的ev的组合物。在优选的实施方式中，所述组合物的尺寸低于1μm，并且所述组合物的人白蛋白浓度在10g/l和30g/l之间。
[0091]
在另一个或进一步的实施方式中，根据本发明的包含来源于msc的ev的组合物尺寸低于1μm并且包含比例为每克白蛋白约2mg至60mg转铁蛋白的转铁蛋白和白蛋白，优选每克白蛋白约5mg至55mg的转铁蛋白，更优选每克白蛋白约10mg至45mg的转铁蛋白，最优选每克白蛋白约10mg至40mg的转铁蛋白。
[0092]
在一个实施方式中，组合物中的ev尺寸低于1μm。在优选的实施方式中，组合物中的ev尺寸为约低于750nm、优选低于500nm、优选低于400nm、优选低于300nm。在另一个或进一步优选的实施方式中，组合物中的ev尺寸为至少5nm、更优选为至少10nm、更优选为至少
25nm、更优选为至少50nm。在另一个或进一步优选的实施方式中，组合物中的ev尺寸在25nm和500nm之间、优选在25nm和400nm之间、最优选在约50nm和约300nm之间。
[0093]
通常将光学技术应用于确定ev的大小和数目。在本发明的一个实施方式中，通过纳米颗粒追踪分析仪(nta)测量所述ev的粒径，这是对悬浮在液体缓冲液中的纳米颗粒进行定量和测定大小的优选方法。在另一个进一步优选的实施方式中，使用可调电阻式脉冲传感器(trps)测量粒径，将其用作为nta的参考方式。在另一个或进一步优选的实施方式中，使用高分辨率流式细胞仪测量粒径。
[0094]
由上述方法获得的本发明的组合物将包含浓度在10g/l和30g/l之间的人白蛋白，浓度更优选在10g/l和20g/l之间、更优选在15g/l和20g/l之间，优选在12g/l和16g/l之间。所述白蛋白浓度可以通过比法或通过抗白蛋白抗体的elisa进行测量。在一个实施方式中，所述比法是溴甲酚绿测定法。
[0095]
所述白蛋白的来源是msc的细胞培养基。虽然白蛋白理论上可以视为生产过程的污染物，因为其不是由msc产生的，但是惊讶地发现，事实上需要白蛋白以确保终产品的稳定性和功能性，从而确保本发明的组合物的稳定性和功能性。所需浓度的白蛋白在一定程度上作为药物稳定剂和活性增强剂。已经发现强制去除白蛋白会降低产品活性(hyungtaekjeon等人，2020)。
[0096]
优选地，所述白蛋白是临床级产品以便可以用于动物和/或人类。
[0097]
在一个实施方式中，所述组合物中存在的所述白蛋白中的至少90％与所述组合物中的ev相结合。
[0098]
人白蛋白的分子量约为66kda。因此不与ev结合的白蛋白将通过tff处理去除，组合物中剩余的白蛋白是与ev结合的。在进一步优选的实施方式中，所述组合物中至少93％、更优选94％、更优选95％、更优选96％、更优选97％、更优选98％、更优选99％的白蛋白与ev结合。
[0099]
在一个实施方式中，所述组合物进一步包含转铁蛋白。所述组合物中的转铁蛋白水平优选在25mg/l和95mg/l之间，更优选在55mg/l和75mg/l之间。在一个实施方式中，所述组合物中的转铁蛋白水平优选在60mg/l和600mg/l之间，优选在100mg/l和500mg/l之间，更优选在150mg/l和450mg/l之间。据描述，转铁蛋白在细胞膜的颗粒转运中发挥作用，并且据说转铁蛋白在ev的稳定性和体内细胞对于ev的摄取中发挥作用。因此，已知转铁蛋白的存在对于所述ev组合物的进一步用途具有积极影响。
[0100]
在一个实施方式中，至少90％的存在于所述组合物中的所述转铁蛋白与所述组合物中的所述ev相结合。
[0101]
人转铁蛋白的分子量为约80kda。因此，通过tff处理一定程度上去除不与所述ev结合的转铁蛋白，组合物中剩余的转铁蛋白与ev结合。在进一步优选的实施方式中，所述组合物中所述至少93％、更优选94％、更优选95％、更优选96％、更优选97％、更优选98％、更优选99％的转铁蛋白与所述ev结合。
[0102]
白蛋白和转铁蛋白以及其他蛋白质的浓度可以通过本领域常规方式进行测量，例如elisa。
[0103]
在一个实施方式中，所属组合物包含低于5％的分子量低于100kda的游离组分。
[0104]
术语“游离组分”是指终产品中不与ev结合的成分或组分，因此在终产品中是游离
的。
[0105]
通过确保组合物包含低于5％的分子量低于100kda的游离组分(例如可以通过截流分子量为100kdda的tff过滤获得)，可以确保该组合物被充分的确定，并符合gmp。msc的细胞生长培养基的大多数组分的分子量低于100kda。当这种小组分残留在终产品时，这种小组分可以被视为污染物，因此优选保持在最低值。在进一步优选的实施方式中，所述组合物包含低于4％、低于3％、低于2％、低于1％的游离组分。
[0106]
在进一步的实施方式中，至少60％的所述ev将会包含膜联蛋白v。
[0107]
膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白，与ev结合增加ev的抗炎特性。一些膜联蛋白，如膜联蛋白v，与促炎活性相关。研究表明膜联蛋白v与ev的结合增加了ev的抗炎活性。膜联蛋白v的分子量为约37kda。
[0108]
根据本发明的一个实施方式，与ev结合的白蛋白和与ev结合的膜联蛋白v的比例在1:4.500和1:350.000之间。
[0109]
在本发明的一个实施方式中，所述组合物可以进一步包含一种或多种第二剂。如本文所使用的，剂指可以用于预防、和/或控制本文所讨论的疾病的任意试剂。这类试剂可以是囊泡内的(即包含在ev体内)或与ev相结合的。合适的剂是技术人员已知的并且可以包括非编码rna、mirna、mrna、生长因子、促血管生成分子、心脏保护酶、抗体、抗炎分子、抗纤维化分子、抗氧化分子、促神经源性分子、抗病毒分子等。在一些实施方式中，将分离的ev与第二试剂一起使用。在一些实施方式中，第二试剂是类固醇、抗氧化剂或吸入一氧化氮。在一些实施方式中，类固醇是皮质类固醇。在一些实施方式中，皮质类固醇是甲泼尼龙或地塞米松。在一些实施方式中，抗氧化剂是超氧化物歧化酶。
[0110]
用于或控制某些肺部疾病(包括但不限于肺动脉高压)的某些第二剂包括氧气、抗凝剂如华法林(coumadin)；利尿剂，例如速尿(furosemide)或螺内酯钙通道阻滞剂；钾，例如强心剂，如；血管扩张药，例如硝苯地平或地尔硫卓内皮素受体拮抗剂，例如波生坦和安贝生坦前列环素类似物，例如依前列醇曲前列尼尔钠和伊洛前列素和pde-5抑制剂，例如西地那非和他达拉非
[0111]
优选将所述组合物配制成液体。可以通过小瓶、iv袋、安瓿瓶、卡式瓶(cartridges)、吸入器例如液体吸入器、雾化器或粉末吸入器以及预灌封注射器来进行储存。除了作为活性成分或药物产品的ev之外，所述液体制剂还可以包含多种化合物从而确保后续储存中稳定的活物。这些包括增溶剂、稳定剂、缓冲剂、张力调节剂、填充剂、粘度增强剂/粘度降低剂、表面活性剂、螯合剂和佐剂。
[0112]
在另一个实施方式中，所述组合物可以冻干或冷冻干燥。所述冻干制剂可以通过储存在小瓶、卡式瓶、吸入器例如液体吸入器、雾化器或粉末吸入器、双室注射器以及预灌封混合系统。在施用前，将冻干组合物在施用前重构为液体。可以通过将液体稀释剂与冻干粉末合并、混合、然后注射来进行。重构通常需要重构和递送系统以确保药物被正确地混合和施用。
[0113]
在优选的实施方式中，所述组合物为水性。在本发明的一个实施方式中，可以将ev
配制成进一步包含药学上可接受的载体的组合物。选择其中使本发明的ev保持活性并保留其特性的药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体是参与运送或输送预防或活性剂的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂的其他成分相容，且不对受试者造成伤害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁、硬脂酸镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
[0114]
可以将所述组合物存储于4℃，更优选通过冷冻保存，其中将所述组合物冷冻在-20℃和-196℃之间、更优选在-40℃和-196℃之间、更优选在-80℃和-196℃之间。所述冷冻程序优选是快速冷冻程序或玻璃化程序，确保产品在冷冻过程中和解冻后保持活性。另一种冷冻程序可以是受控速率冷冻，优选在结晶点补偿放热反应以获得更佳的产品稳定性。对于后一种程序，可以使用受控速率冷冻器。
[0115]
在一个实施方式中，所述组合物将适于通过注射、静脉施用、吸入、气管内输注、全身输注、鼻内输注施用。所述组合物还可以配制成外用，单独使用或与水凝胶、聚合物或聚合物医疗设备联合使用以缓慢释放ev。
[0116]
在一些实施方式中，组合物适用于静脉施用。在一些实施方式中，组合物适用于施用于受试者的肺或气管。在一些实施方式中，组合物被配制为通过吸入施用。在一些实施方式中，将组合物配制成作为气溶胶施用。在一些实施方式中，使用雾化器施用分离的ev。在一些实施方式中，使用气管内插管施用分离的ev。
[0117]
在一些实施方式中，分离的ev与表面活性剂一起施用或配制，优选是肺表面活性剂。优选以不影响组合物稳定性的方式选择表面活性剂。在一些实施方式中，肺表面活性剂是分离的天然存在的表面活性剂。在一些实施方式中，肺表面活性剂源自牛肺或猪肺。在一些实施方式中，肺表面活性剂是合成的表面活性剂。肺表面活性剂是脂蛋白混合物，其用于保持肺气道畅通(例如，通过预防肺泡壁相互粘连)。肺表面活性剂可由以下物质组成：磷脂，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰甘油(pg)；胆固醇；和蛋白质，如sp-a、b、c和d。肺表面活性剂可以源自天然存在的来源，如牛肺组织或猪肺组织。例如，alveofact
tm
(来自牛肺灌洗液)、curosurf
tm
(来自切碎的猪肺)、infasurf
tm
(来自小牛肺灌洗液)和survanta
tm
(来自切碎的牛肺，含有括dppc、棕榈酸和三棕榈酸甘油酯在内的其他成分)。肺表面活性剂也可以是合成的。实例包括exosurf
tm
(由dppc与十六醇和泰洛沙泊(tyloxapol)组成)、pumactant
tm
或人工肺扩张化合物(alec)(由dppc和pg组成)、kl-4(由dppc、棕榈酰油酰磷脂酰甘油、棕榈酸和模拟sp-b的合成肽)、venticute
tm
(由dppc、pg、棕榈酸和重组sp-c组成)。可以从商业供应商处购得肺表面活性剂。
[0118]
本发明还包括包装和贴标的药品。该制品或试剂盒包括合适的器皿或容器中的合适单位剂型，例如玻璃小瓶或塑料安瓿瓶或其他密封的容器。该单位剂型应适用于肺部输送，例如气溶胶。优选地，所述制品或试剂盒还包括关于如何使用的说明，包括如何施用所述药品。说明书还可以包含信息材料，其向医生、技术人员或受试者建议如何适当地预防或所述疾病或病症。换句话说，制品包括指示或建议使用的给药方案的说明书，包括但不限于实际剂量、监测程序和其他监测信息。
[0119]
与任何药品一样，包装材料和容器经设计用于在储存和运输期间保持产品的稳定性，并且可以含有干燥剂以确保稳定性。
[0120]
该试剂盒可以在无菌水性悬浮液中包含ev，其可以直接使用或通过生理盐水稀释以用于静脉注射或雾化器，或通过与表面活性剂稀释或联用以用于气管内施用。因此该试剂盒还可以包含稀释液或稀释剂，例如盐水或表面活性剂。该试剂盒还可以包括肺部递送装置，例如雾化器或一次性组件，例如衔口(mouthpiece)、鼻托(nosepiece)或面罩。
[0121]
在最后方面，本发明同样涉及上述组合物的用途。更具体而言，所述组合物适用于和预防用途。本发明考虑预防和特定疾病。预防疾病意味着降低疾病表现出自身的可能性和/或延迟疾病的发作。疾病意味着降低或消除疾病的症状。因此本发明还考虑了提供一种和/或预防受试者疾病的方法。
[0122]
受试者优选是人类受试者，但是本发明的某些方面可以在可以对可能从中受益的任意受试者进行，包括人类受试者、农业牲畜(例如牛、猪等)、珍贵动物(例如马)、伴侣动物(例如狗、猫等)等。在优选的实施方式中，所述受试者是人，优选是人类患者，所述患者可以是成人、婴儿或新生儿。
[0123]
在一个实施方式中，将以上任意实施方式的组合物用于预防或肺部疾病。在一个实施方式中，所述肺部疾病可以是炎性肺病、肺血管病或急性肺损伤。更优选地，所述炎性肺病是肺高压，也称为肺动脉高压(pah)、哮喘、支气管肺发育不良(bpd)、过敏、特发性肺纤维化或肺炎。所述炎性肺病可能由感染引起，例如病毒感染。在优选的实施方式中，所述病毒感染是流感、sars-cov-1、mers或sars-cov-2。在另一个实施方式中，所述急性肺损伤与败血症有关或是急性呼吸窘迫综合征(ards)。
[0124]
这些疾病也包括可能没有炎症成分的肺血管病。可以根据本发明的其他肺部疾病包括急性肺损伤，其可能与败血症或通气相关。后一种疾病的实例是急性呼吸窘迫综合征。
[0125]
肺动脉高压是一种以远高于正常水平的肺动脉血压为特征的肺部疾病。症状包括呼吸短促、胸痛(尤其在体育活动期间)、虚弱、疲劳、昏厥、轻度头痛(尤其是在运动期间)、头晕、异常心音和杂音、颈静脉怒张、腹部、腿部和脚踝的液体潴留、以及甲床发青。
[0126]
支气管肺发育不良是一种折磨吸氧或使用呼吸机的新生儿或早产新生儿，尤其是特别早产的新生儿(例如，孕龄32周前出生的新生儿)的病症。它也被称为新生儿慢性肺病。bpd的成因包括机械损伤(例如通气引起的)、氧中毒(例如氧疗引起的)和感染。随着时间的推移，疾病可能从非炎症性发展为炎症性。症状包括皮肤发青、慢性咳嗽、呼吸急促和呼吸短促。患有bpd的受试者更容易受到感染，例如呼吸道合胞病毒感染。患有bpd的受试者可能会发展为肺动脉高压。
[0127]
急性呼吸窘迫综合征(ards)，也称为呼吸窘迫综合征(rds)或成人呼吸窘迫综合征，是由于肺损伤或急性疾病而引起的病症。肺损伤可以由通气、外伤、烧伤和/或吸气(aspiration)造成。急性疾病可以是传染性肺炎或败血症。它被认为是一种严重的急性肺损伤，并且其通常是致命的。它的特征为肺部炎症、气体交换受损、炎症介质释放、低氧血症和多器官衰竭。ards也可以定义为在x线胸片存在双侧浸润的情况下，动脉血氧分压(pao2)与吸入氧(fio2)的比值低于200mmhg。pao2/fio2比值低于300mmhg且双侧浸润表明急性肺损伤，这通常是ards的前兆。ards的症状包括呼吸短促、呼吸急促和由于低氧水平导致的精神
错乱。
[0128]
特发性肺纤维化的特征为未知原因的肺部瘢痕或增厚。特发性肺纤维化最常发生在50岁至70岁的人中。它的主要症状包括呼吸短促、经常咳嗽(通常是干咳)、胸痛和活动水平降低。
[0129]
在某些情况下，预防和/或可以包括单独使用ev或将其与一种或多种的第二试剂或活性成分一起使用。也可以对受试者进行机械干预例如有外源供氧的通气或无外源供氧的通气。
[0130]
受试者可以是患有适用于使用本发明的ev的肺疾病(或病症)的那些，或者他们可以是有风险患有这类疾病(或病症)的那些。所述受试者包括新生儿，尤其是低孕龄出生的新生儿。如本文所使用的，人类新生儿指从出生至约4周的人。如本文所使用的，人类婴儿指约4周至约3岁的人。如本文所使用的，低孕龄指出生(或分娩)早于给定物种的正常孕龄。人类的完整孕期约为40周，并且其范围可以为37周到超过40周。人类的低孕龄(类似于早产)的定义为在37周孕龄前出生，包括在更短的孕龄出生(例如，孕龄36周之前、35周之前、34周之前、33周之前、32周之前、31周之前、30周之前、29周之前、28周之前、27周之前、26周之前或25周之前)。通常将这类早产儿作为新生儿，然而本发明考虑将他们超过新生儿阶段，达到儿童和/或成人阶段。某些受试者可能具有对某些形式的肺疾病(例如肺动脉高压)的遗传易感性，这些受试者也可以根据本发明进行。
[0131]
对于新生儿，特别是低孕龄新生儿，本发明考虑在出生4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内施用ev。在一些重要情况下，在出生1小时内施用msc外泌体。
[0132]
本公开进一步考虑即使在没有显示肺部疾病(例如但不限于bpd)症状的情况下，施用ev。
[0133]
在一个实施方式中，本发明的包含ev的所述组合物可以用于covid-19，更具体地，covid-19诱发的肺炎或急性肺炎。covid-19是一种由严重急性呼吸系统综合症引起的新型传染病，攻击人体呼吸系统和肺上皮组织。据报道，一部分患者患有covid-19疾病的更严重症状的风险更高。主要并发症包括肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ards)、多器官衰竭、感染性休克和死亡。
[0134]
已经表明covid-19(也称为sars-cov-2，或由sars-cov-2引起)涉及不同的肺部感染机制，肺部感染可以发展为可能由细胞因子风暴、多器官衰竭、感染性休克和血栓引发的急性呼吸窘迫综合征(ards)。对比细菌性肺炎，细菌性肺炎是一种常见的肺部感染，其中整个肺部或部分肺部的气囊发炎并充满液体、脓液和细胞碎片，主要由于病毒、真菌或细菌引起，通常通过抗生素进行。在其他情况下，会出现心血管并发症、反映肝损伤的肝酶升高、神经系统表现。在儿童中，如果感染进展，其发展为儿童多系统炎症综合征，其症状类似于川崎病，这可能导致死亡。根据目前的数据，报告的病例中儿童的占比很小，约1％的病例在10岁以下，4％在10岁至19岁之间。
[0135]
所述包含ev的组合物提供了多靶点效果，其主要作用模式是抑制炎症过程。
[0136]
ev靶向多种肺部损伤机制，包括高炎症反应和细胞因子风暴、纤维化、(机械)通气引起的氧化应激以及由于病毒活性和炎症反应引起的上皮细胞凋亡。
[0137]
在另一个实施方式中，将所述包含ev的组合物用作covid-19的辅助，更具体
地，covid-19诱发的肺炎或急性肺炎。
[0138]
在另一个实施方式中，上述任一实施方式的所述组合物用于预防或炎症性肠病(ibd)，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。ibd是一组引起胃肠道(gi)炎症的疾病，两种最常见的ibd是溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)。uc是在结肠和直肠的最深处的内壁处造成长期炎症和溃疡的疾病。cd可以在消化道的任意位置发展，并且可以深入受累组织的深层。cd的症状是肛瘘的发展。而这两种疾病的相似之处在于，两者都会导致腹痛、严重腹泻、疲劳和体重减轻。
[0139]
如果在肺疾病的情况下施用ev，优选的施用方式将会是气管内输注或吸入。在神经疾病的情况下，其优选是全身输注、鼻内输注或吸入。在克罗恩病瘘管病、溃疡或软骨修复的情况下，优选通过局部注射。在伤口愈合、烧伤和/或溃疡的情况下，优选将ev在身体的外侧施用，优选与水凝胶或聚合物医疗设备联合以缓慢释放ev。
[0140]
以有效量施用本发明的ev。有效量是指制剂的量单独刺激所需结果。该绝对量取决于许多因素，包括施用所选材料、以单剂量或多剂量施用、包括年龄、身体状况、体型、体重和疾病阶段在内的个体患者参数。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且仅需常规实验就可以解决。剂量也可以根据施用所述组合物的受试者而不同。
[0141]
在本发明的一个实施方式中，所述ev以109evs/kg至10
12
evs/kg所述患者的剂量施用，优选为10
10
evs/kg至10
12
evs/kg所述患者的剂量。在进一步的实施方式中，儿童(年龄为0个月至12岁)的剂量的范围为109evs/kg至10
11
evs/kg。青少年和成年人的所述剂量的范围为在成年人中为109evs/kg至10
12
evs/kg。
[0142]
在本发明的一个实施方式中，所述ev以每个患者约10
10
至约10
12
ev的剂量施用，以cd肛瘘。
[0143]
本公开还考虑了ev的重复施用，包括2次、3次、4次、5次以上施用。一些情况下，可以连续施用所述ev。根据所的疾病的严重程度，重复或连续施用可以发生在数小时(例如，1小时至2小时、1小时至3小时、1小时至6小时、1小时至12小时、1小时至18小时或1小时至24小时)、数天(例如，1天至2天、1天至3天、1天至4天、1天至5天、1天至6天或1天至7天)或数周(例如，1周至2周、1周至3周或1周至4周)。如果重复施用但不连续，两次施用的时间可以是数小时(例如，4小时、6小时或1小时)、数天(例如，1天、2天、3天、4天、5天或6天)或数周(例如，1周、2周、3周或4周)。两次施用之间的时间可以相同，也可以不同。例如，如果疾病的症状似乎正在恶化，则可以更频繁地施用ev，一旦症状稳定或减轻，就可以降低施用ev的频率。
[0144]
在一些情况下，可以重复静脉施用低剂量的ev。因此，本公开考虑重复施用低剂量形式的ev以及单次施用高剂量形式的ev。低剂量的范围可以为10
10
至10
11
ev每千克或每次局部输注，但不限于此，而高剂量的范围可以为10
11
至10
12
ev每千克或每次局部输注。应当理解，根据疾病的严重程度、受试者的健康状况和施用途径，考虑单次或重复施用低剂量或高剂量的ev。
[0145]
ev可以通过任意实现递送到肺或胃肠道的途径进行施用。全身施用途径例如静脉推注和连续输注的是合适的。更直接的途径例如鼻内施用、气管内施用(例如通过插管)和吸入(例如，经鼻或嘴的气溶胶)也在本发明的考虑，并且在需要快速作用的某些情况下可能是更合适的。如本文中所使用的，气溶胶是以小颗粒形式分散在气体中的液体悬浮液，并
且其包括含有此类颗粒的细雾或喷雾。如本文中所使用的，气溶胶化是通过将液体悬浮液转变为小颗粒或液滴以产生气溶胶的过程。可以使用气溶胶递送系统进行，如加压包或雾化器。雾化器包括空气喷射雾化器(即气动)、超声雾化器和振动网式雾化器，例如使用合适的推进剂，例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。除雾化器外，其他肺部递送装置包括但不限于定量吸入器(mdi)和干粉吸入器(dpi)。用于吸入器或吹药器的例如明胶的胶囊和卡式瓶可以配制为含有冻干的外泌体和合适的粉末基质，例如乳糖或淀粉。
[0146]
当需要全身递送ev时，可以将ev配制成通过注射用于非肠道施用，例如通过推注或连续输注。注射用制剂可以是单位剂量形式，例如安瓿瓶或多剂量容器，添加或不添加防腐剂。
[0147]
组合物可以采取油性载体或水性载体的水溶性悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有调配剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性试剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油、或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖苷。可选地，悬浮液还可以包含增加溶解度的合适稳定剂或试剂。另外，外泌体可以是冻干或其他粉末或固体的形式，以用于在使用前用合适载体(例如无菌无热原水)。
[0148]
本文所述的ev和组合物优选通过上述方法获得。
[0149]
现在将参照非限制性实施例更详细地描述本发明。
[0150]
实施例和/或附图描述
[0151]
实施例1-从msc中分离ev
[0152]
从脐带组织或华通氏胶中获得的脐带(uc)来源的msc在扩增单元中进行扩增，扩增单元包括与细胞培养基供应容器(1)流体连接的搅拌式生物反应器(2)。参照图1，其中以下数字表示：
[0153]
1.细胞培养基容器
[0154]
2.搅拌式生物反应器
[0155]
3.细胞上清液容器
[0156]
4.冰箱
[0157]
5a,5b,5c.蠕动泵
[0158]
6.第一过滤单元
[0159]
7.第二过滤单元
[0160]
8.tff盒
[0161]
9.最终产品
[0162]
细胞在所述生物反应器(2)的三维微载体存在的情况下，以及在包含浓度为3g/l的纯化人白蛋白的无异源性且无血清的培养基的存在下增殖。培养基还包含浓度为60mg/l的重组纯化转铁蛋白。
[0163]
msc在生物反应器(2)中扩增和生长，直至在生物反应器(2)中达到至少40x106细胞/l的最小浓度且msc的融合度为最高80％。细胞浓度是通过细胞计数和附着在微珠上的msc的荧光标记来测量的。在此阶段，细胞已经准备好开始分泌ev。为此，将新鲜无血清且无异源性的培养基由基础培养基(dmem/高葡萄糖/无酚红/glutamaxx,thermoscientific)稀
释至1:10，并补充到细胞培养基。24小时后，该体系已经准备好开始收集ev。为此，将源自生物反应器(2)的条件细胞培养基或细胞上清液泵送至细胞上清液容器(3)中，该容器存在于设置成4℃的冰箱(4)。该上清液含有由msc产生的ev。随后将收集在容器(3)中的上清液通过蠕动泵(5c)泵送至具有2微米过滤器的第一过滤单元(6)。上清液通过具有蠕动泵(5c)的密闭系统中的死端过滤方式进行过滤，该蠕动泵(5c)提供通过过滤器(6)的100ml/min的恒定流速。第一次过滤步骤的流穿液随后在第二过滤单元(7)进行过滤，第二过滤单元流体连接于第一过滤单元(6)且具有0.2微米的过滤器。过滤是在具有蠕动泵(5c)的密闭系统中通过死端过滤的方式进行的，该蠕动泵(5c)提供通过过滤器(7)的100ml/min的恒定流速。将包含ev的流穿液收集到1升袋中，随后储存于4℃。
[0164]
最后步骤中，将所述流穿液引入到截留分子量(cut-off)为100kda的tff盒中，该tff盒流体连接于死端过滤单元(6、7)。tff盒(8)的包含ev的渗余物由盐缓冲液进行洗涤，并使用蠕动泵(5c)通过tff盒(8)循环浓缩至最终体积为10ml，蠕动泵的转速为300rpm。从tff(8)中收集最终产品(9)，并将其冷冻于-80℃以下，或保存在4℃的冻存管、袋子或其他适合的容器。
[0165]
分析最终产品以确保所述产品的品质。品质控制包括测量与ev结合的白蛋白的浓度，通过比分析和elisa、通过纳米颗粒追踪分析仪(nta)、可调电阻式脉冲传感器(trps)、电子显微镜和/或raman显微镜等技术进行颗粒分析以确保所述产品的纯度和稳定性。测试产品样品是否存在内毒素和/或支原体。其他品质控制包括定性谱、质谱、elisa、测序、qrt-pcr和活性测试，例如体外t细胞、b细胞和巨噬细胞极化。
[0166]
在上述培养条件下，在培养18小时至24小时所述msc的时间段内，所述msc就会至少产生每ml培养基0.25x109个颗粒。
[0167]
该实验由源自uc的msc进行，但是也可以通过源自其他组织或来源的msc重复，所述其他组织或来源包括但不限于乳腺、骨髓、华通氏胶、(脐带)血、外周血、羊膜、脂肪组织、牙髓、输卵管、肝组织和肺组织。
[0168]
实施例2:测量ev产品的白蛋白浓度
[0169]
分析通过实施例1所描述的方法获得的ev产品的白蛋白浓度。使用两种不同方法测量白蛋白浓度：
[0170]-比法测量
[0171]-elisa
[0172]
简而言之，使用溴甲酚绿来通过比反应评估样品中的白蛋白浓度。通过抗人白蛋白抗体使用elisa浓度测量。
[0173]
通过比反应的方式测量的最终产品中的白蛋白浓度为16g/l。通过elisa测量的浓度为约17g/l。
[0174]
白蛋白的分子量为约66kda，并且预期不与ev结合的任意蛋白质都被100kda截留分子量的tff去除。因此剩余的白蛋白被认为与ev结合。
[0175]
实施例3:测量ev产品的转铁蛋白浓度
[0176]
分析通过实施例1所描述的方法获得的ev产品的转铁蛋白浓度。使用elisa(abcam)按照制造商方案对转铁蛋白浓度进行量化。
[0177]
通过elisa的方式测量的最终产品中的转铁蛋白浓度为70mg/l。
[0178]
实施例4：对用于ev生产的临床级培养基的纯化
[0179]
进行了实验以评价用于ev生产的不同培养基的污染物颗粒浓度。测试以下培养基：
[0180]
1.含有0.3g/l纯化人白蛋白和7mg/l重组纯化转铁蛋白的无异源性且无血清培养基(与实施例1中使用的培养基相比，使用dmem培养基稀释约1:10)
[0181]
2.不具有补充剂剂的基础dmem培养基(thermo scientific/lonza)
[0182]
3.补充有未定义产品的培养基(thermo scientific/lonza)
[0183]
使用nta、trps和facs装置分析新鲜培养基的样品。对粒径和数量进行定量。使用纯净水作为对照。
[0184]
通过实施例1中所描述的方法，用上述的培养基之一来生产ev。品质控制结果表明，对于在不同培养基中产生的ev，污染颗粒数目最少的是培养基2，然而这种培养基不支持长期的细胞培养。污染颗粒数目最高的是培养基3。培养基1的污染颗粒数目在其他培养基之间，但是支持长期细胞培养。
[0185]
实施例5：用于ev生产的临床级培养基中的细胞培养
[0186]
该实验示出了以下培养基中的细胞数目、细胞生长曲线和细胞活性：
[0187]
1.含有3g/l纯化人白蛋白和60mg/l重组纯化转铁蛋白的无异源性且无血清培养基(与实施例1中使用的培养基相似)
[0188]
2.不具有补充剂的基础dmem培养基(thermo scientific/lonza)
[0189]
3.补充有未定义产品的培养基(thermo scientific/lonza)
[0190]
方法
[0191]
在第一个实验中，msc在第1个实施例所描述的培养体系中扩增，在培养基1、2或3的存在下，直到细胞达到70％至80％的融合度。
[0192]
随后，在第二个实验中，使用相同的培养基对在第一个实验中在培养基1、2和3中扩增的细胞进行更新。
[0193]
在第三个实验中，对在第一个实验中在培养基1中扩增的细胞用以2:8的比例混合的培养基1和培养基2进行更新。在同一个实验中，对第一个实验中在培养基3中扩增的细胞用以2:8的比例混合的培养基3和培养基2进行更新。
[0194]
在第四个实验中，将对第一个实验中在培养基1、2和3中扩增的细胞用培养基2进行更新。
[0195]
在实验2、3和4中，细胞培养持续至少5天，每24小时更新一次培养基。通过去除100％的旧培养基并添加相同体积相应的新鲜培养基从而进行培养基的更新。
[0196]
结果
[0197]
第一个实验证明，培养基1和培养基3中的msc附着在微载体上，然而培养基2则情况不同。msc能够在培养基1和培养基3中生长/扩增，但在培养基2中不能保持活性。只有在培养基1和培养基3中培养的细胞被用于后续实验。
[0198]
在实验2中，在未稀释培养基1和未稀释培养基3中培养的细胞在24小时至48小时内快速地过度生长，随后细胞死亡。在实验3中，使用稀释培养基1和稀释培养基3的细胞培养物保持非常缓慢地生长，细胞至少可以存活5天。在实验4中，其中用培养基2替换培养基1和培养基3的细胞培养物仅存活2天，随后细胞死亡。
[0199]
实施例6：临床级培养基中的ev浓度和效率
[0200]
该实验示出了以下培养基中的ev浓度：
[0201]
1.含有0.3g/l纯化人白蛋白和7mg/l重组纯化转铁蛋白的无异源性且无血清培养基(与实施例1中使用的培养基相比，使用dmem培养基稀释约1:10)
[0202]
2.不具有补充剂的基础dmem培养基(thermo scientific/lonza)
[0203]
3.补充有未定义产品的培养基(thermo scientific/lonza)
[0204]
如上述所述扩增msc，并且如上述所述在培养基之一扩增msc。培养持续至少5天，并且每24小时更新全部培养基。
[0205]
使用实施例1和实施例5的ev生产方案。培养基1给出了最高浓度的细胞分泌颗粒(正是ev)，计算为总颗粒减去新鲜培养基中存在的颗粒。特别是在该实施例中，至少95％和高达99％的颗粒由msc(ev)分泌。
[0206]
实施例7：3d生物反应器系统的ev生产效率
[0207]
该实验示出了以下系统的ev生产效率：
[0208]
i)3d培养系统，如图1所示，并在实施例1中描述
[0209]
ii)2d培养系统
[0210]
msc在3d培养系统中(0.5l和1l的搅拌式生物反应器)和2d多层培养瓶中使用培养基(i)进行扩增，然后使用稀释培养基(i)进行ev生产。计算细胞数目、培养基体积、占地面积(footprint,)和ev产量，并且外推至更大体积的生物反应器。当与2d培养系统相比时，3d生物反应器的方法提供了更低的占地面积、更低的培养基消耗和更高的每批次ev产量。
[0211]
实施例8：使用tff系统的ev分离效率
[0212]
该实验示出了使用以下方式的ev纯化效率：
[0213]
i)如最终浓缩步骤的tff系统，截留分子量为100kda
[0214]
ii)尺寸排阻谱法
[0215]
iii)超速离心
[0216]
当与sec相比时，使用tff浓缩可以提供显著更高的ev回收率。tff的产量与ev的产量相当，但是后者中的ev受损，因此质量较差。此外，uc不适合gmp/大规模生产。
[0217]
实施例9：旨在用于bpd的ev在体外试验中的活性
[0218]
根据实施例1生产ev，并且用于bpd的主要症状：
[0219]
a)炎症
[0220]
ev内化测试。将荧光标记的ev与人外周血单核细胞(pbmc)共同培养。进行流式细胞术以量化具有内化标记ev的免疫细胞。研究了以下标记：抗cd4、抗cd8、抗cd11c、抗cd14、抗cd19、抗cd56和抗cd15。在0-1-6-12-24后和6小时后对中性粒细胞进行分析。将成纤维细胞产生的ev作为阴性对照。
[0221]
淋巴细胞迁移测试。将ev与pbmc在trans-well系统中共同培养。针对sdf-1趋化因子研究细胞迁移。使用流式细胞术进行细胞表型分析和量化。
[0222]
b细胞测试。将ev与cpg刺激的人外周血单核细胞共同培养。研究细胞增殖和细胞向浆细胞的分化，使用流式细胞术进行表型分析和定量。通过elisa进行对细胞因子和抗体的定量。
[0223]
t细胞测试。ev与人外周血单核细胞和t细胞激活剂cd3/cd28珠共同培养。使用流
式细胞术对cd4+t细胞增殖和cd4+t细胞凋亡进行定量。计算treg/teff比率。使用流式细胞术对treg的增殖进行量化。使用elisa对以下细胞因子进行定量：il10、tgf-β、半乳凝素-1、hgf、pge2、gm-csf、il2、tnf-α、ifn-γ。
[0224]
cd细胞测试：使用流式细胞术研究与ev的共同培养的cd细胞活化。使用流式细胞术对共刺激分子cd80和cd86以及成熟标志物cd83的上调进行定量。使用elisa对以下细胞因子进行定量：il6、il8、il12、ccl3、ccl4、il10、tgf-β。使用流式细胞术进行吞噬功能测试(与fitc-葡聚糖温育)。使用trans-well测试和流式细胞术进行迁移测试。
[0225]
巨噬细胞测试：将ev与m1刺激(lps)和m2刺激(il4/il13)的巨噬细胞共同培养。使用流式细胞术计算m1与m2的比例。使用elisa对以下细胞因子进行定量：il6、tnfα、ifnγ、il1β、il12、il10、vegf、mcp1、tgf-β、fgf，并通过qpcr基因表达分析进行确认。进行trans-well测试(朝向fmlp)并通过流式细胞术进行定量。
[0226]
nk细胞测试。将ev与源自pbmc的nk细胞共同培养。使用elisa对以下细胞因子进行定量：tnfα、ifnγ。使用流式细胞术对成熟标志物cd27、cd11b、cd107a、ifn-γ和细胞增殖进行量化。
[0227]
b)纤维化
[0228]
使用商业纤维化测定法对正常人肺成纤维细胞和人上皮细胞进行实验。将人肺成纤维细胞与在不同时间点以多种剂量和不同浓度递送的ev共同培养。随后，对alpha-sma和i型胶原蛋白/纤连蛋白进行分析。
[0229]
另一项实验中，测定了ev对原代人支气管上皮细胞中上皮间质转化(emt)的影响。根据制造商方案使用商用测定方案研究emt。在一项实验中，用tgf-β刺激源自健康组织或特发性肺纤维化患者的实验原代细胞以诱导emt，将未受刺激的细胞作为对照。随后，将人上皮细胞与在不同时间点以多种剂量和不同浓度递送的的ev共同培养。使用facs和e-钙粘蛋白和纤连蛋白的表达检测并量化emt。
[0230]
另一项实验中，测定了ev对原代人支气管成纤维细胞中成纤维细胞向成肌纤维细胞转化(fmt)的影响。根据制造商方案使用商用测定方案研究fmt。在一项实验中，用tgf-β刺激源自健康组织或特发性肺纤维化患者的实验原代细胞以诱导fmt，将未受刺激的细胞作为对照。随后，将人成纤维细胞与在不同时间点以多种剂量和不同浓度递送的ev共同培养。使用α-平滑肌肌动蛋白标志物检测和量化fmt。
[0231]
c)氧化应激和细胞凋亡
[0232]
将用于研究纤维化描述的测试和细胞系用于量化细胞凋亡和氧化应激(elisa，流式细胞术)。
[0233]
使用h2o2或其他试剂诱导氧化应激。在不同的时间段期间将细胞暴露于氧化应激，也使用了不同剂量的氧化应激诱导剂。随后，将细胞与在不同时间点以多种剂量和不同浓度递送的ev共同培养。氧化应激的直接影响是通过活性氧物质(ros)的检测和量化来测量的，间接影响是通过测量核酸损伤、脂质过氧化和蛋白质氧化来测量的。使用elisa和facs对氧化应激的直接和间接标志物进行检测和量化。
[0234]
会根据制造商方案使用商用测定方案对响应于氧化应激的细胞凋亡进行检测和量化。在一个实验中，live/dead
tm
(thermofisher)将用于使用facs检测细胞活性。
[0235]
在其他实验中，膜联蛋白v免疫荧光染将检测早期细胞凋亡并使用facs进行量
化。
[0236]
在其他实验中，将通过使用facs对活化的半胱天冬酶(caspase)-3和半胱天冬酶-7进行定量来检测早期细胞凋亡。
[0237]
实施例10：旨在用于克罗恩病的ev在体外试验中的活性
[0238]
该实验显示了根据实施例1生产的ev在克罗恩病的主要症状中的活性。除了实施例9(a)至(c)中描述的实验之外，还使用ev进行了血管生成测定。
[0239]
在一个实验中，将ev与huvec细胞在matrigel上共同培养，并对管形成进行分析。使用人huvec细胞利用商用血管生成管形成测定进行实验。将在3d环境中培养细胞，即水凝胶，以模拟血管形成所需的天然细胞外基质特性。将ev在不同时间点以多种剂量和不同浓度递送。使用huvec细胞的免疫标记和荧光标记，以及响应于ev的管长和分支测量进行分析。
[0240]
实施例11：bpd体内模型的ev的生物分布研究
[0241]
该实验评估了bpd体内模型中实施例1中产生的ev的生物分布。
[0242]
使用了成熟、广泛使用的bpd动物模型(即暴露在高氧环境的新生大鼠)(o'reilly m等人，2014；th
é
baud b，2018)进行体内非临床研究。该模型模拟人工通气早产儿的情况，因为新生大鼠出生时肺部不成熟(晚期管状/早期囊状阶段)，只有在出生后第5天才达到肺泡阶段。大鼠在出生后第30天左右达到完全的肺泡化，并且已知将足月出生的大鼠在出生后早期暴露在高氧环境中会破坏其肺泡发育，增加肺泡巨噬细胞，并对肺血管的形成造成负面影响。因此，就结构的角度而言，新生儿足月啮齿动物的肺部与24周至28周的早产人类新生儿的肺部大致相当(porzionato a等人，2019；porzionato a等人，2021)。
[0243]
在高氧诱导的bpd新生大鼠模型中，对气管内(it)施用的ev产品的生物分布进行如下测定。
[0244]
将该产品的ev用亲脂性荧光标志物(dir碘化物[1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚三碳菁碘化物])染，以评估体内施用后产品的生物分布。
[0245]
总共使用了40只野生型sprague-dawley大鼠幼鼠，将其中20只暴露于常氧环境中，而将其余20只幼鼠暴露于如上讨论的高氧条件下。在出生后第7天，20只幼鼠(10只高氧和10只常氧)接受ev产品的it施用，剂量为1x109个颗粒，相当于1x10
11
/kg bw。20只对照幼鼠(10只高氧和10只常氧)接受pbs对照注射。选择it注射是以在肺损伤部位直接局部施用ev产品，最终目的是将该过程转变为临床实践。
[0246]
通过荧光分析评估全身分布，从而评估注射后不同时间点(3小时和24小时)每组10只幼鼠的各个器官中的染料浓度。
[0247]
该测试结果表明，暴露于常氧条件下的幼鼠在注射后3小时的时候，ev产品均匀分布在不同器官中，主要的信号在腹股沟淋巴结。常氧条件下注射后24小时的时候，可以在淋巴结(腹股沟和腋窝)中发现信号。在这些幼鼠中，标记的ev产品迅速从肺部清除并分布到全身。信号特别集中于淋巴结(腹股沟和腋窝)，这是24小时内唯一停留的区域。
[0248]
在暴露于高氧环境的幼鼠中，在注射后3小时的时候，肺部信号以及其他器官中的大部分信号完全不存在。可以在腋窝和腹股沟淋巴结中发现几乎所有的信号。这可以表明在高氧条件下，从施用部位摄取ev产品的速度更快。在高氧处理的幼鼠中，注射后24小时，在腋窝淋巴结中发现大部分信号(腹股沟淋巴结没有信号)。
[0249]
应当提及的是，这些结果是新颖的，因为在ev生物分布研究中，从未将淋巴结评估为可能的靶组织。这些结果清楚地说明，淋巴结是ev产品积累的主要部位，因此代表驱动对ev产品施用的免疫响应的基本效应部位。
[0250]
实施例12：bpd体内模型的ev活性
[0251]
该实验显示了根据实施例1产生的ev在bpd体内模型中的活性。使用porzionato等人，2018所述的模型。
[0252]
简言之，经伦理委员会批准，将30只野生型sprague-dawley大鼠用于研究。高氧暴露方法由不同的研究团队建立，并发表在多项工作中(grisafi等人，2012、2013；marconi等人，2014；porzionato等人，2012、2018)。在连续监测氧气的情况下，对保持在箱子中的大鼠幼鼠进行实验。将实验动物暴露于60％的氧气2周，并通过本发明的ev产品进行气管内。将对照动物暴露于60％的氧气中2周，并通过气管内施用生理溶液(安慰剂)进行。将常氧对照动物暴露于21％的氧气2周，并通过本发明的ev产品或生理溶液进行气管内。在产后第3天、第7天和第10天进行ev输注。
[0253]
测试ev产品的单次或多次it注射功效。在三个不同的时间点，该产品的剂量为6.4x109个颗粒/施用，相当于3.19x10
11
至5.71x10
11
颗粒/kg bw。
[0254]
然后，根据porzionato等人，2018所描述的方案固定动物的肺，并按照scherle的方法(scherle，1970)测量肺容积。对肺部切片进行组织学分析和免疫组织学分析。按照porzionato等人，2018所描述的方案计算组织收缩因子。按照porzionato等人，2018的描述进行体视学分析，量化了以下几个参数，即：i)肺泡气体空间和肺泡间隔的体积分数，ii)肺泡气体空间和肺泡间隔的总容积，iii)气体空间的表面积密度，iv)肺泡气体空间的总面积，v)总肺容积，vi)肺泡数目和平均肺泡容积等参数。
[0255]
特别是，通过形态学、细胞荧光和qrt-pcr分析评估ev产品的it施用功效，以确定高氧诱导的肺损伤的恢复和后的炎症响应。形态分析包括肺容积估计、组织学评估、免疫组化分析、肌成纤维细胞的免疫荧光分析、肺泡2型上皮细胞的免疫荧光分析、用免疫荧光技术染的样品的定量、阿尔新蓝染和定量、蛋白质羰基化检测、肺泡形成的体视学分析、动脉肌肉层的形态测定、微血管密度和巨噬细胞的形态分析。
[0256]
所有组织病理学和形态学评估均参照实验组单盲进行。所有动物都完成了周期，包括分别在出生后第3天、第7天和第10天进行三次it对照注射(仅载体)或ev产品溶液注射。
[0257]
由于肺泡的破坏，出生后暴露于高氧会导致所有列出的组织形态学参数的劣化。这些参数中，高氧组中肺泡表面减少具有统计学意义。隔膜的厚度也显著增加，可能是由于炎症过程造成的(表1)。
[0258]
表1：肺泡的形态学参数
[0259][0260]
多重比较(bonferroni检验)表明，对于肺泡面积，高氧组相对于常氧组和高氧+ev产品组都具有统计学差异，因此ev产品显示出效果。对于隔膜的厚度，高氧组和高氧+ev产品组之间没有统计学差异。
[0261]
通过免疫荧光法对肺表面活性剂相关蛋白c(sftpc)阳性的细胞进行定量，该蛋白是肺ii型上皮细胞(atii)的特异性标志物，表明在缺氧诱导的损伤后，atii显著降低。通过ev产品可以增加肺部组织中的sfptc的数目。阿尔新蓝染也得到了类似的结果，它是糖胺聚糖产生的标志物。此外，还测试了ev产品对蛋白质羰基化的影响，这是由ros(活性氧物质)诱导的蛋白质氧化损伤的成熟标志物，由于高氧处理和所导致的炎症过程而产生。结果表明，高氧条件下损伤增加，并且其通过施用ev产品而得以逆转。在ev产品组没有观察到死亡率的提升，证明了气管内施用的安全性。
[0262]
这些结果表明了ev产品在成熟的新生大鼠模型中支气管肺发育不良的功效。初步数据表明，ev产品保护肺实质免受氧化应激的影响，并增加at2细胞产生的表面活性剂，这是bpd发展的关键因素。
[0263]
实施例13：克罗恩病体内模型的ev活性
[0264]
该实验旨显示测定根据实施例1生产的ev在克罗恩病的体内模型的活性。简而言之，对雌性8周龄b57bl/6j小鼠进行该实验。通过在饮用水中添加3％的十二烷基硫酸钠(sds)，随意施用5天，诱导结肠炎。这是一种成熟且广泛应用的动物模型，被pubmed引用了数百次(综述参考kawada等人，2007)。按照合适的道德规范对待所有动物。将动物细分为三个实验组。
[0265]-组1(n＝4，正常对照)：每日腹腔(ip)注射pbs(仅载体)0.2ml，第1天至第5天；
[0266]-组2(n＝5，诱导结肠炎)：同组1，在饮用水中添加3％sds。
[0267]-组3(n＝4，诱导结肠炎和用ev)：同组2，通过ip途径添加悬浮于0.2ml pbs的msc-ev。
[0268]
在第6天，使用co2处死动物。切除结肠，将一部分组织固定在福尔马林中以用于后续的组织学分析，将另一部分立即冷冻于液氮中，然后储存于-80℃以用于后续的rna提取。
[0269]
ev的剂量和施用途径
[0270]
根据上述程序分离和施用ev。
[0271]
施用途径：从第0天至第5天，每日通过腹腔(ip)途径施用悬浮在0.2ml pbs的ev。
[0272]
肠道损伤评估
[0273]
动物重量
[0274]
疾病活动指数(粪便评估；参照tanaka f，2008)
[0275]-炎症(flogosis)组织病理学标志
[0276]-结肠组织提取物中炎症介质表达的滴定：通过rt-pcr检测tnfα、il6、il-1β和cox2。
[0277]
结果的统计学分析
[0278]
数据表示为平均值
±
sd。通过t检验分析组间差异，p《0.05具有显著性。
[0279]
结果
[0280]
总而言之，结果表明所述ev适合降低实验性结肠炎的炎症反应，导致降低疾病活动指数，改善常见症状。ev改善了肠道炎症疾病动物模型的临床表现和炎症响应。
[0281]
实施例14：用于人类bpd的ev产品的施用方案以及安全性和功效的评估
[0282]
在人类临床试验中测试通过实施例1所述的方法获得的用于bpd的ev产品的安全性和功效。简言之，该研究是在具有高风险bpd、23周至28周孕龄且出生体重≤1500g、气管插管接受机械通气且吸入氧分数(fio2)》25％的早产新生儿中进行的。该ev产品通过气管内施用。气管内施用ev产品或生理盐水对照溶液不会造成额外的风险，因为只有通过气管插管接受有创通气的新生儿才符合资格。
[0283]
将该研究分为两个阶段。
[0284]
阶段i：ev产品的安全性和耐受性
[0285]
阶段i包括18名受试者，分为6组，每组3名受试者，每名受试者接受ev产品的三种剂量水平之一(低剂量(ld)：1x10
10
evs/kg体重(bw)、中剂量(md)：3x10
10
evs/kg bw、或高剂量(hd)：9x10
10
evs/kg bw)，以及两种方案之一(1次或3次it施用，多次施用之间间隔24h)。
[0286]
主要目的是确定3种不同剂量水平的ev产品单次或多次it施用的剂量限性(dlt)或最大耐受剂量(mtd)。
[0287]
在该阶段评估以下数个方面：
[0288]-在36周孕龄(pma)或出院时，ev产品(单剂或多剂，以不同的剂量水平)的it施用的急性短期毒性。
[0289]-施用ev产品后，6小时和24小时的dlt。
[0290]-在不同时间点报告的ae(不良事件)和sae(严重不良事件)(包括病死率)直至36pma或出院(相关和非相关)。
[0291]-通过在数个时间点进行的临床检查和血液检查(例如肝肾功能检查、造血指标、血压、体温)、肺部超声和超声心动图，直至出院，以检测ev产品的中期毒性。
[0292]-出生后28天在氧气和通气支持下的受试者人数(根据jobe ah等人，2001定义的bpd)。
[0293]-根据修改后的nichd严重程度分级(i级至iiia级)病例定义的(根据higgins rd等人，2018年)，在pma 36周时施用ev产品后bpd的发生率和严重程度。将其与历史匹配病例进行比较。
[0294]-施用ev产品后在研究结束时(eos)(1岁调整年龄)的总体健康状况。
[0295]-36周pma和eos(1岁调整年龄)时的死亡率。
[0296]
阶段iia：ev产品bpd的功效
[0297]
阶段iia包括70名受试者，分为每组35名受试者的2组。一组根据阶段i的结果选择的剂量水平和方案用ev产品进行，一组用生理盐水对照溶液进行(安慰剂组)。
[0298]
主要目的是评估随机、双盲、安慰剂对照研究中ev产品bpd的功效。
[0299]
在该阶段评估以下数个方面：
[0300]-与安慰剂组(生理盐水)相比，ev产品对于36周pma的bpd发生率和严重程度的功效。bpd的情况和严重程度是根据修改后的nichd严重程度分级(i级到iiia级)定义来评估的。
[0301]-出生后28天在氧气和通气支持下的受试者人数。
[0302]-施用ev产品后以及安慰剂组在eos(1岁调整年龄)时的总体健康状况。
[0303]-两组中在36周pma和eos(1岁调整年龄)时的死亡率。
[0304]-两组中在不同时间点报告的ae和sae，直至36周pma或出院(相关和非相关)。
[0305]-两组中在被动监测期间报告的sae，直至eos(相关和非相关)。
[0306]-两组中mv/呼吸支持的持续时间，rop、nec、ivh、败血症的评估，直至36周pma或出院。
[0307]-在数个时间点测试气管抽取液中的免疫标志物(il-6、il-8、tnfa、tgfb1、
[0308]
il1b、il1ra)，直至该婴儿插管。
[0309]-评估两组中在1岁调整年龄或eos时婴儿的神经发育状况。
[0310]
本发明绝不仅限于实施例所描述的和/或附图中所示的实施方式。相反，在不偏离本发明的范围的情况下，可以以许多不同的方式实现本发明的方法。

技术特征：

1.一种制造源自间充质基质细胞(msc)的细胞外囊泡(ev)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：-在包含纯化的人血清白蛋白和人转铁蛋白的无血清且无异源性的培养基中培养和扩增msc；-收集细胞上清液，所述细胞上清液中包含ev；-过滤所述细胞上清液以获得ev；和-浓缩所述ev。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述白蛋白和转铁蛋白是从人血浆中纯化的或是重组白蛋白和重组转铁蛋白。3.如前述权利要求所述的方法，其中，所述培养基中所述白蛋白的浓度为1g/l至5g/l。4.如前述权利要求所述的方法，其中，所述培养基中所述转铁蛋白的浓度为55mg/l至100mg/l、优选55mg/l至70mg/l。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述过滤细胞上清液的步骤是至少两步过滤法。6.如权利要求5所述的方法，其中，两步过滤法中的所述过滤是通过筛孔尺寸为1微米至5微米的第一过滤器，随后通过筛孔尺寸低于1微米的第二过滤器进行的。7.如权利要求5至6中任一项所述的方法，其中，所述浓缩步骤是切向流过滤步骤，由此浓缩所述过滤步骤中的滤液。8.如权利要求7所述的方法，其中，在培养所述msc 18小时至24小时的时间段内，产生至少每ml细胞培养基0.25x 109个颗粒，其中至少90％的粒径为0.05微米至0.22微米的所述颗粒是ev。9.一种包含源自间充质基质细胞(msc)的细胞外囊泡(ev)的组合物，其中，所述ev的尺寸低于1μm，其中所述组合物的人白蛋白浓度为10g/l至30g/l，并且其中至少90％的在所述组合物中存在的所述白蛋白与所述ev相结合。10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物包含人转铁蛋白，优选浓度为60mg/l至600mg/l。11.如权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物包含人转铁蛋白和人白蛋白，比例为每克白蛋白约2mg至60mg转铁蛋白。12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述ev尺寸为50nm至300nm。13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物被进一步配制和/或加工。14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于或预防用途。15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其应用于预防或肺部疾病。16.如权利要求15所述应用的组合物，其中，所述肺部疾病是炎性肺病、肺血管病或急性肺损伤。17.如权利要求16所述应用的组合物，其中，所述炎性肺病是肺动脉高压、哮喘、支气管肺发育不良(bpd)、过敏、肺炎或特发性肺纤维化。18.如权利要求16所述应用的组合物，其中，所述急性肺损伤与败血症有关或是急性呼吸窘迫综合征(ards)。
19.如权利要求16所述应用的组合物，其中，所述炎性肺病与病毒感染有关，优选与流感、sars-cov-1、mers或sars-cov-2有关。20.如权利要求13至19所述应用的组合物，其应用于covid-19，优选应用于covid-19诱发的肺炎或急性肺炎。21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其应用于预防或炎症性肠病如克罗恩病。22.如前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，对患者施所述有效量的所述组合物，所述患者可以是成人、婴儿或新生儿。23.如前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，所述组合物以109ev/kg至10
12
ev/kg所述患者的剂量施用或用于每次施用。

技术总结

本发明涉及一种制造源自间充质基质细胞(MSC)的细胞外囊泡(EV)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：在包含纯化的人血清白蛋白和人转铁蛋白的无血清且无异源性的培养基中培养和扩增MSC；收集细胞上清液，所述细胞上清液中包含EV；过滤所述细胞上清液以获得EV；和浓缩所述EV，优选通过超滤。在第二方面和进一步的方面，所述发明涉及一种包含EV的组合物和其临床应用。其临床应用。其临床应用。