用于预测患有实体癌的患者在术前辅助和根治性手术后复发和/或死亡风险的方法

1.本发明属于医学领域，特别是肿瘤学和免疫学领域。

背景技术：

2.结肠直肠癌是世界上第三种最常见的癌症，其发病率增加，特别是在年轻成人中(1)。在局部晚期直肠癌(larc)中，国际指南建议新辅助放化疗(ncrt)后进行根治性手术(2，3)。肿瘤复发和患者生存受到对新辅助(nt)的应答质量的强烈影响(4-6)。larc患者的最新进展表明，在具有与对nt的完全应答相容的临床和成像特征的患者中可以预期避免切断直肠(保存性策略；例如：观察和等待)(7，8)。这些患者经历可接受的结果，然而，他们中约25％发展为早期肿瘤再生长(9)。目前没有分子标志物来预测对ncrt的应答，并指导决定(3)，例如在无应答患者中优化或修饰nt和更好地选择符合保存性策略的患者。
3.电离辐射具有引发/加强适应性t细胞介导的免疫应答的能力，所述免疫应答在局部肿瘤消退和远端肿瘤抑制和排斥(即，吸收效应)的机制中起作用(10-12)。这表明nt前肿瘤部位的天然免疫反应的质量和强度可影响对nt的应答程度并提供应答的预测标志物。肿瘤部位的天然免疫反应还与各种癌症的良好预后有关(13)，包括仅通过手术的结肠直肠癌(14，15)。数字病理学和图像分析的最新进展已经允许将免疫评估转化为临床相关应用(16)。使用这些技术，已经开发了称为“免疫评分”(is；即，肿瘤中cd3+和cd8+t细胞密度的组合及其侵袭性边缘)的第一个标准化的基于免疫的结肠癌测定。其在i-iii期结肠癌中的稳健性和预后性能已通过国际验证研究得以巩固(17)。因此，is提供了对肿瘤部位的天然免疫反应的可靠评估。
4.在直肠癌中的初步研究已经表明，肿瘤的天然免疫反应可以在活检(前可用的唯一样品材料)(18-20)上评价。在nt之前在初始活检(isb)中进行的免疫评分的衍生有益于评价肿瘤中初始免疫应答的质量及其对nt的应答程度和临床结果的潜在影响。
5.发明概述
6.本发明由权利要求限定。特别地，本发明涉及用于预测患有实体癌的患者在术前辅助和根治性手术后复发和/或死亡风险的方法。
7.发明详述
8.定义
9.如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌细胞和组织。
10.如本文所用，术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调控的细胞生长的生理病症。如本文所用的术语“癌症”包括癌(例如原位癌、侵袭性癌、转移性癌)和癌前病症、与其组织学来源无关的新形态变化。术语“癌症”不限于受影响组织或细胞聚集体的任何阶段、等级、组织形态学特征、侵袭性、侵占性或恶性。特别地，包括0期癌症、i期癌症、
ii期癌症、iii期癌症、iv期癌症、i级癌症、ii级癌症、iii级癌症、恶性癌症和原发性癌症。
11.如本文所用，术语“原发性癌症”是指机体中的原始或第一肿瘤。来自原发性肿瘤的癌细胞可扩散到机体的其它部分并形成新的或继发性肿瘤(即转移)。
12.如本文所用，术语“局部晚期癌症”是指已从其在器官组织中开始的位置扩散至附近组织或淋巴结但不扩散至机体的其它部分的癌症。
13.如本文所用，术语“转移性癌症”是指已从其最初开始的位置扩散到机体中的另一位置且尤其扩散至淋巴结的癌症。
14.如本文所用，术语“结肠直肠癌”包括公认的医学定义，其将结肠直肠癌定义为特征在于小肠以下的肠道(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)细胞的癌症的医学病症。另外，本文所用的术语“结肠直肠癌”还包括特征在于十二指肠和小肠(空肠和回肠)细胞的癌症的医学病症。本文所用的术语“微卫星不稳定性结肠直肠癌”是指特征在于微卫星不稳定性的结肠直肠癌。
15.如本文所用，术语“微卫星不稳定性”或“msi”具有其一般含义并且定义为在短重复dna序列(或“微卫星”)处插入-缺失突变的累积是具有dna错配修复(mmr)缺陷的癌细胞的特征性特征。几种mmr基因(包括mlh1、msh2、msh6和pms2)中的任一种的失活可导致msi。最初，msi显示与lynch综合征(ls)患者的mmr基因中的种系缺陷相关，其中》90％的结肠直肠癌(crc)患者表现出msi。后来认识到msi也发生在约12％的散发性crc中，发生在缺乏种系mmr突变的患者中，并且这些患者中的msi是由于启动子甲基化诱导的mlh1基因表达的沉默。crc中msi状态的测定涉及本领域公知的常规方法。
16.如本文所用，术语“复发”是指癌症局部(例如，之前其所在的位置)或远端(例如，转移)的复发。
17.如本文所用，本发明上下文中的术语“风险”涉及事件将在特定时间段内发生的概率，并且可意指受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以参考相关时间队列的实际观察后测量，或参考从相关时间段所遵循的统计有效的历史队列中得出的指数值来测量。相对风险是指受试者的绝对风险与低风险队列的绝对风险或平均体风险之比，其可根据如何评估临床风险因素而变化。也通常使用作为给定的测试结果的阳性时间与阴性事件之比的优势比(优势比根据公式p/(l-p)，其中p是事件的概率并且(l-p)是无事件的概率)来进行无转换(no-conversion)。在本发明的上下文中，“风险评估”或“风险的评估”涵盖预测事件或疾病状态可能发生的概率、几率或可能性，事件的发生率或从一种疾病状态到另一种疾病状态的转化。风险评估还可以包括预测未来的临床参数、传统的实验室风险因子值或其他复发指数，以相对于先前测量的体的绝对或相对术语表示。本发明的方法可用于进行转化风险的连续或分类测量，从而诊断和定义被定义为处于转化风险中的受试者类别的风险谱。
18.如本文所用，术语“复发时间”或“ttr”在本文中用于指将第二原发性癌症的第一次复发检查作为第一事件或无复发证据的死亡的以年为单位的时间。
19.本文所用的术语“生存时间”包括“无进展生存期”、“无死亡生存期”和“总生存期”。
20.如本文所用，本发明上下文中的术语“无进展生存期”或“pfs”是指期间和后的时间长度，在此期间，根据医师或研究者的评估，患者的疾病不会恶化，即不会
进展。如本领域技术人员将理解，如果患者经历较长的时间长度(在此期间疾病不进展)，则与类似处境的患者的对照组的平均或平均值无进展生存时间相比，患者的无进展生存期得到改进或增强。
21.如本文所用，术语“无疾病生存期”或“dfs”具有其在本领域中的一般含义并且被定义为从随机化到肿瘤复发或死亡的时间，并且其典型地用于辅助设置。该术语也称为“无复发生存期”。
22.如本文所用，本发明上下文中的术语“总生存期”或“os”是指患者组内患者的平均生存期。如本领域技术人员将理解，如果患者属于与另一患者亚组相比具有统计学上显著更长的平均生存时间的患者亚组，则患者的总生存期得到改进或增强。改进的总生存期在一个或多个患者亚组中可能是明显的，但当作为整体分析患者体时不明显。
23.如本文所用，表述“短生存时间”表示受试者将具有低于在一般受试者体中观察到的中值(或平均值)的生存时间。当受试者具有短生存时间时，意味着受试者将具有“不良预后”。相反，表述“长生存时间”表示受试者将具有高于在一般受试者体中观察到的中值(或平均值)的生存时间。当受试者具有长生存时间时，意味着受试者将具有“良好预后”。
24.如本文所用，术语“手术”适用于为切除癌组织而采取的外科手术方法，其包括乳房切除术、肿块切除术、淋巴结切除术、前哨淋巴结清扫术。特别地，术语“根治性手术”也称为“根治性剥离”，是比“保守性手术”更广泛的手术，并且旨在为目的切除肿瘤及其任何转移。
25.如本文所用，术语“疗法”是指用于癌症疗法的抗肿瘤剂，和/或抗血管剂，和/或抗基质剂，和/或免疫刺激剂或抑制剂，和/或血细胞增殖剂，和/或放疗，和/或高温，和/或低温的及时顺序或同时施用。这些的施用可以以佐剂和/或新佐剂模式进行。这种方案的组合可以在限定的窗内改变每种单一试剂的剂量、施用时间范围和施用频率。目前正在研究各种药物和/或物理方法的各种组合以及各种时间表。
26.如本文所用，“术前辅助疗法”或“新辅助疗法”是指由一组疗法组成的术前疗法方案(在根治性手术之前)，所述疗法可包括例如旨在缩小原发性肿瘤的化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法和/或免疫疗法，从而使局部疗法(例如手术)破坏性更小或更有效，或能够进行保存性手术或能够保存器官。
27.如本文所用，“术后辅助疗法”或“辅助疗法”是指由一组疗法组成的术后疗法方案(在根治性手术之后)，所述疗法可包括例如旨在降低转移和/或复发风险的化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法和/或免疫疗法。这种辅助的目的是改进预后。
28.如本文所用，术语“化疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指在于向患者施用化疗剂的。
29.如本文所用，术语“化疗剂”是指例如对恶性细胞和组织具有选择性破坏性或选择性毒性的化合物(即，药物)或变成对恶性细胞和组织具有选择性破坏性或选择性毒性的化合物(即，前药)。
30.如本文所用，术语“免疫疗法”具有其在本领域中的一般含义并且是指在于施用免疫原性剂(即能够诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的试剂)的。在一些实施方案中，免疫疗法在于向患者施用至少一种免疫检查点抑制剂。
31.如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”具有其在本领域中的一般含义并且是指抑
制免疫抑制性检查点蛋白的功能的任何化合物。如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”具有其在本领域中的一般含义并且是指由t细胞表达的分子，其或者上调信号(刺激性检查点分子)或者下调信号(抑制性检查点分子)。免疫检查点分子在本领域中被认为构成类似于ctla-4和pd-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如pardoll,2012.nature rev cancer 12:252-264；mellman et al.,2011.nature 480:480-489)。抑制性检查点分子的实例包括a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、ctla-4、cd277、ido、kir、pd-1、lag-3、tim-3和vista。抑制包括功能降低和完全阻断。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。许多免疫检查点抑制剂是已知的，并且类似于这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂，替代的免疫检查点抑制剂可以在(不久的)将来开发。免疫检查点抑制剂包括肽、抗体、核酸分子和小分子。免疫检查点抑制剂的实例包括pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、pd-l2拮抗剂、ctla-4拮抗剂、vista拮抗剂、tim-3拮抗剂、lag-3拮抗剂、ido拮抗剂、kir2d拮抗剂、a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂和btla拮抗剂。
32.如本文所用，术语“放疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指使用电离辐射的疗法。电离辐射沉积的能量通过破坏它们的遗传物质而损伤或破坏待区域(靶组织)中的细胞，使得这些细胞不能继续生长。通常使用的一种类型的放疗包括光子，例如x射线。根据其所具有的能量，射线可用于破坏机体表面或更深部位的癌细胞。x射线束的能量越高，x射线进入靶组织的深度就越深。线性加速器和电子感应加速器产生能量越来越大的x射线。使用机器将辐射(例如x射线)聚焦在结肠直肠癌部位被称为外部射束放疗。γ射线是放疗中使用的光子的另一种形式。当某些元素(例如镭、铀和钴60)在分解或衰变时释放辐射时，自发产生γ射线。在一些实施方案中，所述放疗是外部放疗。外部放疗的实例包括但不限于常规外部射束放疗；三维适形放疗(3d-crt)，其从不同方向递送成形光束以紧密地适配肿瘤的形状；强度调制放疗(imrt)，例如螺旋断层，其将放射束成形为与肿瘤的形状紧密适配，并且还根据肿瘤的形状改变辐射剂量；适形质子束放疗；图像引导放疗(igrt)，其结合扫描和辐射技术来提供肿瘤的实时图像以引导放疗；术中放疗(iort)，其在手术期间将辐射直接递送至肿瘤；立体定向放射外科，其在单个疗程中向小肿瘤区域递送大的精确的辐射剂量；超分割放疗，例如连续超分割加速放疗(chart)，其中每天向受试者给予超过一种放疗(次数)；以及低分割放疗，其中每次给予较大剂量，但给予较少的次数。
33.如本文所用，术语“低分割放疗”具有其在本领域中的一般含义，并且是指其中将辐射总剂量分成大剂量并且每天给予少于一次的的放疗。
34.在一些实施方案中，术语“接触放疗”具有其在本领域中的一般含义，并且是指用包括旨在与待的组织接触的施用器的装置进行照射(例如低能量x射线)的放疗。接触放疗。典型地，接触放疗涉及papillon技术(sun myint a,stewart a,mills j,et al.treatment:the role of contact x-ray brachytherapy(papillon)in the management of early rectal cancer.colorectal dis.2019；21suppl 1:45-52)。
35.如本文所用，术语“靶向疗法”是指靶向参与肿瘤发展或致癌信号传导的特定的蛋白质类别的疗法。例如，抗血管内皮生长因子的酪氨酸激酶抑制剂已经用于癌症。
36.如本文所用，术语“激素疗法”或“激素的疗法”是指包括减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用的疗法。如本文所用，术语“激素剂”是指抗雄激素(包括类固醇抗雄激素和非类固醇抗雄激素)、雌激素、促黄体激素释放激素(lhrh)激动剂和lhrh拮抗
剂，以及激素消融疗法。
37.如本文所用，术语“应答性”是指实现应答的患者，即其中癌症被根除、减少或改善的患者。患者因此被鉴定为“应答者”。根据本发明，应答者具有客观应答，因此该术语不包括患有稳定化癌症使得该疾病在术前辅助后不进展的患者。“无应答者”或“难治性”患者包括在术前辅助后癌症未表现出减轻或改善的患者。根据本发明，术语“无应答者”还包括患有稳定化癌症的患者。
38.如本文所用，术语“病理应答”是指对术前辅助的应答，其通过本领域熟知的任何病理方法评估，典型地包括抗肿瘤应答的解剖学和组织学评估。可以以定量方式或以定性方式如“无变化”(nc)、“部分应答”(pr)，“完全应答”(cr)或其它定性标准记录应答。
39.如本文所用，术语“肿瘤消退分级系统”或“trg系统”具有其在本领域中的一般含义，并且是指旨在估计原发性肿瘤在术前辅助后消退变化的程度的系统。trg典型地基于组织学。特别地，trg系统将术前辅助后的消退变化的量分类为与残余肿瘤相关的诱导纤维化的量和/或与先前肿瘤部位相关的残余肿瘤的估计百分比。
40.如本文所用，术语“tnm分类”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由国际癌症控制联盟(uicc)公布的分类。uicc tnm分类是国际公认的癌症分期标准。uicc tnm分类是基于记录肿瘤的原发和局部淋巴结范围以及转移的不存在或存在的解剖学的系统。tnm的每个单独方面被称为类别。t类描述原发性肿瘤的程度：ta、t0、tis、t1、t2、t3、t4、tx n类。n类描述局部淋巴结转移的不存在或存在和程度：n0、n1、n2、n3、nx m类。m类描述不存在或存在远处转移：m0、m1、mx。将原位癌分类为0期；通常将定位于起源器官的肿瘤根据程度分期为i或ii期，将局部广泛扩散至局部淋巴结的肿瘤分期为iii期，以及将具有远处转移的肿瘤分期为iv期。为了表明临床或病理分类已经在术前辅助后确定，tnm分类包括前缀“y”，其中yc表示临床分类和yp表示病理分类。在初始多峰性期间或之后进行分类的那些情况下，ctnm或ptnm类由“y”前缀标识。因此，yctnm或yptnm对在每次相应检查时实际存在的肿瘤的程度进行分类。下文说明“y”前缀的使用。患者出现直肠肿瘤。术前成像显示肿瘤延伸到直肠周围脂肪中。存在1个直肠周围淋巴结增大，并且无远处转移证据。患者接受术前放化疗。术前，临床和影像学检查均无肿瘤迹象，并且已实现临床完全缓解。进行手术，并且病理学报告显示残余肿瘤侵入粘膜下层。16个淋巴结中没有肿瘤迹象，但1个淋巴结含有粘蛋白淀。对于该患者，tnm分类是
[0041]-在任何之前：ct3n1m0
[0042]-新辅助疗法后：yct0n0m0
[0043]-术后：ypt1n0m0
[0044]
本文所用的术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血来源的并且包括淋巴细胞，如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0045]
如本文所用，术语“免疫应答”包括导致对人体肿瘤细胞的选择性损伤、破坏或从人体消除的先天和适应性免疫应答。示例性免疫应答包括t细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括由t细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的活化。
[0046]
如本文所用，术语“生物标志物”具有其在本领域中的一般含义并且是指在样品中
可检测的任何分子。这样的分子可以包括肽/蛋白质或核酸及其衍生物。
[0047]
如本文所用，术语“免疫标志物”由指示癌症患者针对肿瘤的免疫应答状态的任何可检测、可测量和可定量的参数组成。在本说明书中，各种目标免疫标志物中每一种的名称是指相应基因的国际公认名称，如在国际公认基因序列和蛋白质序列数据库中发现的，包括在来自hugo基因命名委员会的数据库中发现的。在本说明书中，各种目标免疫标志物中的每一种的名称也可以指相应基因的国际公认的名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库genbank中发现的。通过这些国际公认的序列数据库，本领域技术人员可以检索对应于本文所述目标免疫标志物中的每一种的核酸和氨基酸序列。免疫标志物包括肿瘤部位免疫系统细胞的存在或数量或密度。免疫标志物还包括肿瘤部位的免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或量。免疫标志物还包括任何指示肿瘤部位与宿主的特异性免疫应答的提高相关的基因的表达水平的生物材料的存在或量。因此，免疫标志物包括由编码肿瘤部位的免疫系统的细胞特异性产生的蛋白的基因组dna转录的信使rna(mrna)的存在或量。因此，免疫标志物包括由免疫系统细胞特异性表达的表面抗原，包括由肿瘤组织中募集的b淋巴细胞、t淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞树突细胞、nk细胞、nkt细胞和nk-dc细胞表达的表面抗原，或编码所述表面抗原的mrna。示例性地，用作免疫标志物的目标表面抗原包括由t细胞或t细胞亚表达的cd3、cd4、cd8和cd45ro。例如，如果cd3抗原的表达或其mrna的表达用作免疫标志物，则在根据本发明的方法的步骤a)中该免疫标志物的定量指示涉及所有t淋巴细胞和nkt细胞的患者的适应性免疫应答的水平。例如，如果cd8抗原的表达或其mrna的表达被用作免疫标志物，在根据本发明的方法的步骤a)中该免疫标志物的定量指示涉及细胞毒性t淋巴细胞的患者的适应性免疫应答的水平。例如，如果cd45ro抗原的表达或其mrna的表达用作免疫标志物，则在根据本发明的方法的步骤a)中该免疫标志物的定量指示涉及记忆t淋巴细胞或记忆效应t淋巴细胞的患者的适应性免疫应答的水平。还示例性地，用作免疫标志物的蛋白还包括由免疫系统的细胞特异性产生的溶细胞蛋白，如穿孔素、颗粒溶解素以及颗粒酶-b。
[0048]
本文所用的表述“代表适应性免疫应答的基因”是指由细胞表达的任何基因，所述细胞是肿瘤中适应性免疫应答的作用者或有助于肿瘤中适应性免疫应答的沉降。适应性免疫应答，也称为“获得性免疫应答”，包括t细胞亚型的抗原依赖性刺激、b细胞活化和抗体产生。例如，适应性免疫应答的细胞包括但不限于细胞毒性t细胞、t记忆t细胞、th1和th2细胞、活化的巨噬细胞和活化的树突细胞、nk细胞和nkt细胞。
[0049]
如本文所用，表述“代表免疫抑制应答的基因”是指由细胞表达的任何基因，所述细胞是肿瘤中免疫抑制应答的作用者或有助于肿瘤中免疫抑制应答的沉降。例如，免疫抑制应答包括
[0050]
－t细胞亚型的抗原依赖性刺激的共抑制：基因cd276、ctla4、pdcd1、cd274、tim-3或vtcn1(b7h4)，
[0051]
－巨噬细胞和树突细胞的灭活和nk细胞的灭活：基因tslp、cd1a或vegfa
[0052]
－癌症干细胞标志物的表达、分化和/或瘤形成：prom1、ihh。
[0053]
－在肿瘤环境中产生的免疫抑制蛋白的表达：基因pf4、ren、vegfa。
[0054]
例如，免疫抑制应答的细胞包括未成熟树突细胞(cd1a)、调节性t细胞(treg细胞)和表达il17a基因的th17细胞。
[0055]
如本文所用，术语“样品”是指出于进行本发明的方法的目的从受试者获得的任何样品。在一些实施方案中，样品是体液(例如血液样品)、细胞或组织。此类体液的实例包括血液、唾液、泪液、精液、阴道排出物、脓液、粘液、尿液和粪便。
[0056]
如本文所用，术语“血液样品”是指全血样品、血清样品和血浆样品。血液样品可以通过本领域已知的方法获得，包括静脉穿刺或手指穿刺。血清和血浆样品可以通过本领域已知的离心方法获得。在进行测定之前，可以用合适的缓冲液稀释样品。
[0057]
如本文所用，术语“肿瘤活检样品”是指由在患者的原发性肿瘤中进行的活检或在远离患者的原发性肿瘤的转移性样品中进行的活检产生的肿瘤样品。例如，在患有结肠直肠癌的患者的肠中进行内窥镜活检。
[0058]
本文所用的术语“肿瘤组织样品”是指在根治性手术后从患者切除的肿瘤获得的任何组织肿瘤样品。在一些实施方案中，切除的肿瘤样品可以是患者的原发性肿瘤或转移瘤。当然，肿瘤组织样品可以经受多种众所周知的收集后制备和储存技术(例如，固定、储存、冷冻等)。样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。
[0059]
如本文所用，术语“解剖学病理学”是涉及基于器官和组织的宏观、微观、生化、免疫学和分子检查来诊断疾病的医学专业。
[0060]
如本文所用，术语“组织学”是指微观解剖学。组织学典型地是指将组织切成薄片的研究，其中组织用蜡或塑料浸润或在冷冻保存介质中冷冻。
[0061]
如本文所用，术语“组织病理学”是指患病组织的显微镜研究。
[0062]
如本文所用，术语“组织化学”是指使用实验室化学品与组织内组分之间的化学反应的科学。
[0063]
如本文所用，术语“参数”是指当进行根据本发明的方法时评估的任何特征。如本文所使用，术语“参数值”是指与参数相关联的值(例如数字)。
[0064]
如本文所用，术语“得分”是指通过在数学算法或公式中组合一个或多个参数而得到的数值。例如，可以通过将每个表达水平与定义和规定的系数相乘，并将这些乘积相加得到得分来完成参数的组合。得分可以通过可以是连续评分系统或非连续评分系统的评分系统来测定。
[0065]
如本文所用，术语“评分系统”是指其中使用商定数值标度作为估计应答程度(即免疫应答或临床应答)的手段的任何方法。
[0066]
如本文所用，术语“自动评分系统”是指评分系统部分或完全由机器(例如计算机)控制和进行，从而限制人输入。
[0067]
如本文所用，术语“连续评分系统”是指其中输入的一个或多个变量是连续的评分系统。术语“连续”表示变量可以取其最小值和最大值之间的任何值。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的实际量值。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的绝对值。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的归一化值。相反，术语“非连续评分系统”或“二元评分系统”将每个变量指定为预定的“仓”(例如，“高”、“中”或“低”)。例如，如果所评估的变量是cd3+t细胞的密度，则在连续评分系统中，输入到函数中的值是cd3+t细胞的密度，而在非连续评分系统中，首先分析密度值以确定其是否落入“高密度”、“中密度”或“低密度”。因此，考虑两个样品，第一个具有1000个cd3+细胞/
mm2的密度，第二个具有500个cd3+细胞/mm2的密度，输入到连续评分系统中的值分别是500和700，而输入到非连续评分系统中的值取决于它们落在其中的仓。如果“高仓”涵盖500和1000个细胞/mm2，则对于每个样品将值1输入到非连续评分系统中。如果“高”和“低”仓之间的截止值落在500-1000个细胞/mm2之间的某处，则将“高”的值输入第一样品的非连续评分系统，并将“低”的值输入第二样品的非连续评分系统。确定这样的截止值的有用方式是基于所有可预期的截止值来构造接收器-操作者曲线(roc曲线)，确定roc曲线上最接近roc曲线中左上角(0/1)的单个点。显然，大多数时间截止值将通过选择由这样的截止值确定的灵敏度和特异性的组合而由不太形式化的程序来确定，该截止值为所研究的问题提供最有益的医疗信息。请注意，这些值旨在说明连续评分系统和非连续评分系统之间的差异，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围，除非在权利要求中记载。
[0068]
如本文所用，术语“免疫评分(immunoscore)”是指如实施例中所述在获自患者的肿瘤活检样品中测定的cd3+和cd8+t细胞密度的组合。是inserm(institut national de la sante et dela recherche medicale)
–
france)的注册商标。特别地，inserm是在美国通过01、05、09、10、42和44类的国际注册号1146519正式保护的商标“immunoscore”的所有者。
[0069]
如本文所用，术语“百分位数”具有其在本领域中的一般含义，并且是指在统计中使用的量度，其指示一组观测值中的给定观测值百分比低于其的值。例如，第20百分位数是低于其可以发现20％的观测值的值(或分数)。同样，发现80％的观测值高于第20百分位数。术语百分位数和相关术语百分位数等级通常用于报告标准参考测试的评分。例如，如果得分在第86百分位数，其中86是百分位数等级，则它等于低于可以发现86％的观测值的值(与第86百分位数仔细对比，这意味着得分等于或低于低于可以发现86％的观测值的值－每个得分在第100百分位数)。第25百分位数也称为第一四分位数(q1)，第50百分位数称为中位数或第二四分位数(q2)，第75百分位数称为第三四分位数(q3)。通常，百分位数和四分位数是分位数的具体类型。
[0070]
如本文所用，术语“算术平均值”具有其在本领域中的一般含义，并且是指通过将两个或更多个数字或变量求和然后除以数字或变量的数目而获得的量。
[0071]
如本文所用，术语“中值”具有其在本领域中的一般含义，并且是指将数据样本、体或概率分布的上半部分与下半部分分开的值。对于数据集，它可以被认为是“中间”值。
[0072]
如这里所使用的，术语“组合”或“合并”被定义为使用数学公式或算法对一定数量的参数的可能选择以及将这些参数设置成指定的组。
[0073]
如本文所用，术语“算法”是采用一个或多个连续参数并计算输出值(有时称为“指数”或“指数值”)的任何数学方程式、算法、分析或编程过程或统计技术。
[0074]
如这里所使用的，术语“数字病理学”是集中于基于从数字化标本载片产生的信息的数据管理的病理学子字段。应当理解，这种图像将具有表示组织特征的图像中的特征，诸如形状和颜以及纹理。这些特征可以通过使用基于计算机的技术以定量形式提取。
[0075]
本发明的方法：
[0076]
本发明涉及预测实体癌患者在术前辅助和根治性手术后复发和/或死亡的风险的方法，其包括评估至少两个参数的步骤，其中第一参数是在术前辅助前测定的免疫应答，并且第二参数是在根治性手术后测定的病理应答，并且其中所述参数的组合指示
复发和/或死亡的风险。
[0077]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适合于预测到复发的时间。
[0078]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测患者的生存时间。特别地，本发明的方法特别适用于预测癌症患者的总生存期(os)、无进展生存期(pfs)和/或无疾病生存期(dfs)。更特别地，本发明的方法特别适用于预测无疾病生存期。
[0079]
癌症：
[0080]
典型地，进行上述方法的患者可患有选自下组的实体癌：肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如，肝周癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、骨癌(例如，成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、多发性骨髓瘤)、脑和中枢神经系统癌(例如，脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(例如，原位导管癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位小叶癌、男子女性型乳房)、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌、腺棘皮瘤、乳头状浆液性腺癌、透明细胞)、食道癌、胆囊癌(粘液腺癌、小细胞癌)、消化道类瘤(如绒毛膜癌、恶性葡萄胎)、卡波氏肉瘤、肾癌(如肾细胞癌)、喉癌和下咽癌、肝癌(如血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节性增生、肝细胞癌)、肺癌(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔和鼻窦癌(如感觉神经母细胞瘤、中线肉芽肿)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(如胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、皮肤癌(例如黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌)、胃癌、睾丸癌(例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤生殖细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如滤泡癌、间变性癌、低分化癌、甲状腺髓样癌)、阴道癌、外阴癌、子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。
[0081]
在一些实施方案中，患者患有原发性癌症。在一些实施方案中，患者患有局部晚期癌症。在一些实施方案中，患者患有ii期tnm癌症。在一些实施方案中，患者患有iii期tnm癌症。
[0082]
在一些实施方案中，患者患有转移性癌症。在一些实施方案中，患者患有iv期tnm癌症。
[0083]
在一些实施方案中，患者患有食道癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌或肝癌。
[0084]
在一些实施方案中，患者患有结肠直肠癌，并且更特别地患有直肠癌。在一些实施方案中，患者患有局部晚期直肠癌。
[0085]
术前辅助：
[0086]
在一些实施方案中，在根治性手术之前对患者施用术前辅助疗法。
[0087]
在一些实施方案中，术前辅助疗法由放疗、化疗、靶向疗法、激素疗法、免疫疗法或其组合组成。在一些实施方案中，术前辅助疗法由放疗和化疗的组合组成。
[0088]
可用于术前辅助靶向的靶向的非限制性实例选自her1/egfr(egfrviii、磷酸化(p-)egfr、egfr:shc、泛素化(u-)egfr、p-egfrviii)；erbb2(p-erbb2、p95her2(截短的erbb2)、p-p95her2、erbb2:shc、erbb2:pi3k、erbb2:egfr、erbb2:erbb3、erbb2:erbb4)；erbb3(p-erbb3、截短的erbb3、erbb3:pi3k、p-erbb3:pi3k、erbb3:shc)；erbb4(p-erbb4、
erbb4:shc)；c-met(p-c-met、截短的c-met、c-met:hgf复合物)；akt1(p-akt1)；akt2(p-akt2)；akt3(p-akt3)；pten(p-pten)；p70s6k(p-p70s6k)；mek(p-mek)；erk1(p-erk1)；erk2(p-erk2)；pdk1(p-pdk1)；pdk2(p-pdk2)；sgk3(p-sgk3)；4e-bp1(p-4e-bp1)；pik3r1(p-pik3r1)；c-kit(p-c-kit)；er(p-er)；igf-1r(p-igf-1r、igf-1r:irs、irs:pi3k、p-irs、igf-1r:pi3k)；insr(p-insr)；flt3(p-flt3)；hgfr1(p-hgfr1)；hgfr2(p-hgfr2)；ret(p-ret)；pdgfra(p-pdgfra)；pdgfrb(p-pdgfrb)；vegfr1(p-vegfr1、vegfr1:plcγ、vegfr1:src)；vegfr2(p-vegfr2、vegfr2:plcγ、vegfr2:src、vegfr2:硫酸肝素、vegfr2:ve-钙粘着蛋白)；vegfr3(p-vegfr3)；fgfr1(p-fgfr1)；fgfr2(p-fgfr2)；fgfr3(p-fgfr3)；fgfr4(p-fgfr4)；tie1(p-tie1)；tie2(p-tie2)；epha(p-epha)；ephb(p-ephb)；gsk-3β(p-gsk-3β)；nfkb(p-nfkb)、ikb(p-ikb、p-p65:ikb)；bad(p-bad、bad:14-3-3)；mtor(p-mtor)；rsk-1(p-rsk-1)；jnk(p-jnk)；p38(p-p38)；stat1(p-stat1)；stat3(p-stat3)；fak(p-fak)；rb(p-rb)；ki67；p53(p-p53)；creb(p-creb)；c-jun(p-c-jun)；c-src(p-c-src)；桩蛋白(p-桩蛋白)；grb2(p-grb2)、shc(p-shc)、ras(p-ras)、gab1(p-gab1)、shp2(p-shp2)、grb2(p-grb2)、crkl(p-crkl)、plcγ(p-plcγ)、pkc(例如p-pkcα、p-pkcβ、p-pkcδ)、内收蛋白(p-内收蛋白)、rb1(p-rb 1)和pyk2(p-pyk2)。
[0089]
此类抑制剂的实例包括小有机分子her2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可获自takeda的tak165；cp-724,714，erbb2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(pfizer和osi)；双重her抑制剂，例如ekb-569(可获自wyeth)，其优先结合egfr但抑制her2和egfr过表达细胞两者；gw 72016(可获自glaxo)，口服her2和egfr酪氨酸激酶抑制剂；pki-166(可获自novartis)；泛her抑制剂，例如卡奈替尼(ci-1033；pharmacia)；非选择性her抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(gleevec
tm
)；mapk细胞外调节激酶i抑制剂ci-1040(可获自pharmacia)；喹唑啉类，例如pd 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，例如cgp 59326、cgp 60261和cgp 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰基甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制剂；pd-0183805(warner-lamber)；喹喔啉(美国专利no.5,804,396)；酪氨酸磷酸化抑制剂(美国专利no.5,804,396)；zd6474(astra zeneca)；ptk-787(novartis/schering ag)；泛her抑制剂，如ci-1033(pfizer)；pki 166(novartis)；gw2016(glaxo smithkline)；ci-1033(pfizer)；ekb-569(wyeth)；司马替尼(sugen)；zd6474(astrazeneca)；ptk-787(novartis/schering ag)；inc-1ci 1(imclone)；或如以下任何专利公开中所述：美国专利no.5,804,396；wo99/09016(american cyanimid)；wo98/43960(american cyanamid)；w097/38983(warner lambert)；wo99/06378(warner lambert)；wo99/06396(warner lambert)；wo96/30347(pfizer，inc)；w096/33978(zeneca)；w096/3397(zeneca)；和wo96/33980(zeneca)。在一些实施方案中，her抑制剂是egfr抑制剂。egfr抑制剂是本领域熟知的(inhibitors of erbb-1kinase；expert opinion on therapeutic patents dec 2002,vol.12,no.12,pages 1903-1907,susan e kane.cancer therapies targeted to the epidermal growth factor receptor and its family members.expert opinion on therapeutic patents feb 2006,vol.16,no.2,pages 147-164.peter traxler tyrosine kinase抑制剂s in cancer treatment(part ii).expert opinion on therapeutic patents dec 1998,vol.8,no.12,1599-1625页)。此类试剂的实
例包括结合egfr的抗体和小有机分子。结合egfr的抗体的实例包括mab 579(atcc crl hb 8506)、mab 455(atcc crl hb8507)、mab 225(atcc crl 8508)、mab 528(atcc crl 8509)(参见美国专利no.4,943,533,mendelsohn et al.)及其变体，如嵌合的225(c225或西妥昔单抗；)和再成形的人225(h225)(参见wo 96/40210,imclone systems inc.)；imc-11f8、完全人egfr靶向抗体(imclone)；结合ii型突变egfr的抗体(美国专利no.5,212,290)；美国专利no.5,891,996所述的结合egfr的人源化和嵌合抗体；和结合egfr的人抗体，如abx-egf(参见wo98/50433,abgenix)；emd 55900(stragliotto et al.eur.j.cancer32a:636-640(1996))；emd7200(matuzumab)，抗egfr的人源化egfr抗体，其与egf和tgf-α竞争egfr结合；和mab 806或人源化mab 806(johns et al.,j.biol.chem.279(29):30375-30384(2004))。抗egfr抗体可以与细胞毒性剂缀合，从而产生免疫缀合物(参见例如ep659,439a2,merck patent gmbh)。结合egfr的有机小分子的实例包括zd1839或吉非替尼(iressa
tm
；astra zeneca)；cp-358774或埃罗替尼(tarceva
tm
；genentech/osi)；和ag1478、ag1571(su 5271；sugen)；emd-7200。在一些实施方案中，her抑制剂是小有机分子泛her抑制剂，如达克替尼(pf-00299804)。在一些实施方案中，her抑制剂选自下组：西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、埃罗替尼、吉非替尼、拉帕替尼、奈拉替尼、卡奈替尼、凡德他尼、阿法替尼、tak-285(双重her2和egfr抑制剂)、arry334543(双重her2和egfr抑制剂)、达可替尼(泛erbb抑制剂)、osi-420(去甲基埃罗替尼)(egfr抑制剂)、azd8931(egfr、her2和her3抑制剂)、aee788(nvp-aee788)(egfr、her2和vegfr 1 12抑制剂)、培利替尼(ekb-569)(泛erbb抑制剂)、cudc-101(egfr、her2和hdac抑制剂)、xl647(双重her2和egfr抑制剂)、bms-599626(ac480)(双重her2和egfr抑制剂)、pkc412(egfr、pkc、环状amp依赖性蛋白激酶和s6激酶抑制剂)、bibx1382(egfr抑制剂)和ap261 13(alk和egfr抑制剂)。抑制剂西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗是单克隆抗体，厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、来那替尼、卡纳替尼、凡德他尼和阿法替尼是酪氨酸激酶抑制剂。
[0090]
示例性的激素剂包括但不限于醋酸环丙孕酮、阿比特龙、非那雄胺、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、己烯雌酚(des)、醋酸甲地孕酮、磷雌酚、雌莫司汀磷酸盐、亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、布舍瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克。
[0091]
在一些实施方案中，术前辅助放疗是接触放疗。
[0092]
可用于术前辅助化疗的化疗剂的实例包括但不限于烷化剂，诸如噻替帕和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，诸如苯唑多巴、卡巴醌、米特多巴和尤利多巴；伸乙基亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基密胺、三伸乙基磷酰胺、三伸乙基硫代磷酰胺和三羟甲密胺；多聚乙酰(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)、苔藓虫素；卡利斯塔叮；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素；多卡米辛(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴素；盘克斯塔叮；沙考地汀；海绵素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、盐酸二氯甲二乙胺氧化物、美法仑、新氮芥、胆固醇氮芥、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和拉宁司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1；达米辛，包括达米辛a；二膦
酸盐，诸如氯膦酸盐；艾斯帕米辛；以及新制癌菌素发团及相关蛋白烯二炔抗生素发团、克拉斯米辛、放线菌素、奥斯拉米辛、重氮丝胺酸、博莱霉素、放线菌素c、卡拉比辛、洋红霉素、嗜癌霉素、克罗米辛、放线菌素d、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-侧氧-l-正白胺酸、阿霉素(包括吗啉并-阿霉素、氰基吗啉并-阿霉素、2-吡咯并-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、埃达霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲胺蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如傣诺特呤、甲胺蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿核苷；雄激素，诸如二甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺剂，诸如胺基苯乙酮、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如夫罗林酸；醋葡内酯；醛磷酰胺葡糖苷；胺基乙酰丙酸；伊利卢拉；胺苯吖啶；倍思塔布；比生；埃达曲克；得弗伐胺；秋水仙胺；地吖醌；艾弗利散；依利醋铵；埃坡霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇糖；罗尼达宁；美登素，诸如美登素和胺沙托辛；丙脒腙；米托蒽醌；莫比达摩；硝拉维林；喷司他丁；凡那明；比柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；普鲁苄肼；psk多醣复合物；丙亚胺；根霉菌素；西佐糖；螺锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；单端孢霉烯族毒素(尤其是t-2毒素、弗纳库林a、杆孢菌素a和胺癸叮)；乌拉坦；去乙酰长春酰胺；氮烯唑胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；双溴丙基哌嗪；甲托辛；阿糖胞苷("ara-c")；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲胺蝶呤；铂配合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特龙；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸；伊立替康(例如cpt-1 1)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟胺酸(dmfo)；类视素，诸如视黄酸；卡培他滨以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0093]
可用于术前佐剂免疫疗法的免疫检查点抑制剂的实例包括抗ctla4抗体、抗pd1抗体、抗pdl1抗体、抗pdl2抗体、抗tim-3抗体、抗lag3抗体、抗ido1抗体、抗tigit抗体、抗b7h3抗体、抗b7h4抗体、抗btla抗体和抗b7h6抗体。
[0094]
抗ctla-4抗体的实例描述于美国专利号5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720和7,605,238中。一种抗cdla-4抗体是曲美木单抗(替西木，cp-675,206)。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是结合ctla-4的完全人单克隆igg抗体伊匹木单抗(也称为10d1、mdx-d010)。
[0095]
pd-1和pd-l1抗体的实例描述于美国专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149，和pct公布专利申请号：wo03042402、wo2008156712、wo2010089411、wo2010036959、wo2011066342、wo2011159877、wo2011082400和wo2011161699中。在一些实施方案中，pd-1阻断剂包括抗pd-l1抗体。在某些其他实施方案中，pd-1阻断剂包括抗pd-1抗体和类似的结合蛋白，诸如纳武单抗(mdx1106、bms 936558、ono4538)，结合pd-1并通过其配体pd-l1和pd-l2阻断pd-1的活化的完全人igg4抗体；派姆单抗(mk-3475或sch 900475)，抗pd-1的人源化单克隆igg4抗体；ct-011，结合pd-1的人源化抗体；amp-224是b7-dc的融合蛋白；抗体fc部分；用于pd-l1(b7-h1)阻断的bms-936559(mdx-1105-01)。
2005,elsevier；kononen et al 1198；nature medicine。
[0105]
在所述实施方案中，免疫标志物的定量典型地通过下文所述的免疫组化(ihc)进行。在所述实施方案中，免疫适应性应答的标志物的定量典型地通过测定至少一种基因的表达水平来进行。
[0106]
在一些实施方案中，标志物包括来自免疫系统的细胞的存在或数量或密度。在一些实施方案中，标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或量。在一些实施方案中，标志物包括指示与宿主的特异性免疫应答的提高相关的基因水平的任何生物材料的存在或量。因此，在一些实施方案中，标志物包括从编码由免疫系统的细胞特异性产生的蛋白的基因组dna转录而来的信使rna(mrna)的存在或量。在一些实施方案中，标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原，包括由b淋巴细胞、t淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞树突细胞、nk细胞、nkt细胞和nk-dc细胞表达的表面抗原，或者编码所述表面抗原的mrna。
[0107]
当用一种以上的免疫标志物进行本发明的方法时，在步骤a)中定量的不同免疫标志物的数量通常少于100个不同的标志物，并且在大多数实施方案中少于50个不同的标志物。使用本发明的方法获得准确和可靠的预后所需的不同免疫标志物的数量可根据定量技术的类型而显著变化。示例性地，当本发明的方法通过目标蛋白质标志物的原位免疫组化检测进行时，用少量免疫标志物的组合可以发现高统计显著性。示例性地，如实施例中所公开的，仅用一种标志物或两种标志物的组合获得高统计显著性。进一步示例性地，当通过目标基因标志物的基因表达分析进行本发明的方法时，也发现用少量免疫标志物获得高统计显著性。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信，当通过使用用于免疫标志物定量的基因表达分析和通过使用10种不同的免疫标志物的组合，更优选15种不同的免疫标志物的组合，最优选20种不同的免疫标志物或更多进行本发明的方法时，达到了高度统计相关性(p值低于10-3
)。
[0108]
典型地，可以定量2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49和50种不同免疫标志物的组合，优选2，3，4，5，6，7，8，9或10种免疫标志物的组合，更优选2，3，4，5或6种免疫标志物的组合。
[0109]
许多专利申请已经描述了大量可用于本发明方法的指示免疫应答状态的免疫标志物。典型地，可以使用描述于wo2015007625、wo2014023706、wo2014009535、wo2013186374、wo2013107907、wo2013107900、wo2012095448、wo2012072750和wo2007045996(通过引用全部合并)的指示免疫应答状态的免疫标志物。
[0110]
在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是wo2007045996中描述的那些。
[0111]
在一些实施方案中，可以使用的免疫标志物是来自免疫系统的细胞的细胞密度。在一些实施方案中，免疫标志物包括cd3+细胞的密度，cd8+细胞的密度，cd45ro+细胞的密度，gzm-b+细胞的密度，cd103+细胞的密度和/或b细胞的密度。更优选地，免疫标志物包括cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度，cd3+细胞的密度和cd45ro+细胞的密度，cd3+细胞的密度，gzm-b+细胞的密度，cd8+细胞的密度和cd45ro+细胞的密度，cd8+细胞的密度和gzm-b+细胞的密度；cd45ro+细胞的密度和gzm-b+细胞的密度或cd3+细胞的密度和cd103+细胞的
密度。
[0112]
在一些实施方案中，在肿瘤活检样品中测定cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度。
[0113]
在一些实施方案中，还可以测量b细胞的密度(参见wo2013107900和wo2013107907)。在一些实施方案中，还可以测量dc细胞的密度(参见wo2013107907)。
[0114]
典型地，wo2013186374中公开的方法可用于定量肿瘤样品中的免疫细胞。
[0115]
在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物可包括wo2007045996的表9中所列的一种或多种基因或相应蛋白的表达水平，其为：18s、ace、actb、agtr1、agtr2、apc、apoa1、arf1、axin1、bax、bcl2、bcl2l1、cxcr5、bmp2、brca1、btla、c3、casp3、casp9、ccl1、ccl11、ccl13、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl5、ccl7、ccl8、ccnb1、ccnd1、ccne1、ccr1、ccr10、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccrl2、cd154、cd19、cd1a、cd2、cd226、cd244、pdcd1lg1、cd28、cd34、cd36、cd38、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd40lg、cd5、cd54、cd6、cd68、cd69、clip、cd80、cd83、slamf5、cd86、cd8a、cdh1、cdh7、cdk2、cdk4、cdkn1a、cdkn1b、cdkn2a、cdkn2b、ceacam1、col4a5、crebbp、crlf2、csf1、csf2、csf3、ctla4、ctnnb1、ctsc、cx3cl1、cx3cr1、cxcl1、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl6、cxcl9、cxcr3、cxcr4、cxcr6、cyp1a2、cyp7a1、dcc、dcn、defa6、dicer1、dkk1、dok-1、dok-2、dok6、dvl1、e2f4、ebi3、ece1、ecgf1、edn1、egf、egfr、eif4e、cd105、enpep、erbb2、ereg、fcgr3a,、cgr3b、fn1、foxp3、fyn、fzd1、gapd、gli2、gnly、golph4、grb2、gsk3b、gstp1、gusb、gzma、gzmb、gzmh、gzmk、hla-b、hla-c、hla-、ma、hla-dmb、hla-doa、hla-dob、hla-dpa1、hla-dqa2、hla-dra、hlx1、hmox1、hras、hspb3、huwe1、icam1、icam-2、icos、id1、ifna1、ifna17、ifna2、ifna5、ifna6、ifna8、ifnar1、ifnar2、ifng、ifngr1、ifngr2、igf1、ihh、ikbkb、il10、il12a、il12b、il12rb1、il12rb2、il13、il13ra2、il15、il15ra、il17、il17r、il17rb、il18、il1a、il1b、il1r1、il2、il21、il21r、il23a、il23r、il24、il27、il2ra、il2rb、il2rg、il3、il31ra、il4、il4ra、il5、il6、il7、il7ra、il8、cxcr1、cxcr2、il9、il9r、irf1、isgf3g、itga4、itga7、整合素αe(抗原cd103、人粘膜淋巴细胞、抗原1；α多肽)、基因hcg33203、itgb3、jak2、jak3、klrb1、klrc4、klrf1、klrg1、kras、lag3、lair2、lef1、lgals9、lilrb3、lrp2、lta、slamf3、madcam1、madh3、madh7,maf、map2k1、mdm2、mica、micb、mki67、mmp12、mmp9、mta1、mtss1、myc、myd88、myh6、ncam1、nfatc1、nkg7、nlk、nos2a、p2x7、pdcd1、pecam-,、cxcl4、pgk1、pias1、pias2、pias3、pias4、plat、pml、pp1a、cxcl7、ppp2ca、prf1、prom1、psmb5、ptch、ptgs2、ptp4a3、ptpn6、ptprc、rab23、rac/rho、rac2、raf、rb1、rbl1、ren、drosha、sele、sell、selp、serpine1、sfrp1、sirp beta 1、ski、slamf1、slamf6、slamf7、slamf8、smad2、smad4、smo、smoh、smurf1、socs1、socs2、socs3、socs4、socs5、socs6、socs7、sod1、sod2、sod3、sos1、sox17、cd43、st14、stam、stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b、stat6、stk36、tap1、tap2、tbx21、tcf7、tert、tfrc、tgfa、tgfb1、tgfbr1、tgfbr2、tim-3、tlr1、tlr10、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tnf、tnfrsf10a、tnfrsf11a、tnfrsf18、tnfrsf1a、tnfrsf1b、ox-40、tnfrsf5、tnfrsf6、tnfrsf7、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfsf10、tnfsf6、tob1、tp53、tslp、vcam1、vegf、wif1、wnt1、wnt4、xcl1、xcr1、zap70和zic2。
[0116]
在一些实施方案中，免疫标志物是wo2014023706(通过引用并入)中描述的那些。
在该实施方案中，用本发明的方法评估代表人适应性免疫应答的单个基因和代表人免疫抑制应答的单个基因(一对基因)的表达水平el1。
[0117]
在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自用于th1适应性免疫、用于细胞毒性应答或用于记忆应答的共调节基因簇，并且可以编码th1细胞表面标志物、白介素(或白介素受体)或趋化因子(趋化因子受体)。在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自下组：
[0118]
－趋化因子和趋化因子受体家族，其由以下组成：cxcl13、cxcl9、ccl5、ccr2、cxcl10、cxcl11、cxcr3、ccl2和cx3cl1,$
[0119]
－细胞因子家族，其由以下组成：il15，
[0120]
－th1家族，其由以下组成：ifng、irf1、stat1、stat4和tbx21
[0121]
－淋巴细胞膜受体家族，其由以下组成：itgae、cd3d、cd3e、cd3g、cd8a、cd247、cd69和icos，
[0122]
－细胞毒性分子家族，其由以下组成：gnly、gzmh、gzma、gzmb、gzmk、gzmm和prf1，
[0123]
和激酶ltk。
[0124]
在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自下组：ccl5、ccr2、cd247、cd3e、cd3g、cd8a、cx3cl1、cxcl11、gzma、gzmb、gzmh、gzmk、ifng、il15、irf1、itgae、prf1、stat1和tbx21。
[0125]
在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因典型地可以地选自下组：共调控的适应性免疫基因，而免疫抑制基因可以代表免疫细胞(例如树突细胞)的失活并且可以有助于免疫抑制应答的诱导。
[0126]
在一些实施方案中，代表免疫抑制反应的基因或相应蛋白选自下组：cd274、ctla4、ihh、il17a、pdcd1、pf4、prom1、ren、tim-3、tslp和vegfa。
[0127]
在实施本发明的优选条件下，代表适应性免疫应答的基因选自下组：gnly、cxcl13、cx3cl1、cxcl9、itgae、ccl5、gzmh、ifng、ccr2、cd3d、cd3e、cd3g、cd8a、cxcl10、cxcl11、gzma、gzmb、gzmk、gzmm、il15、irf1、ltk、prf1、stat1、cd69、cd247、icos、cxcr3、stat4、ccl2和tbx21，并且代表免疫抑制应答的基因选自下组：pf4、ren、vegfa、tslp、il17a、prom1、ihh、cd1a、ctla4、pdcd1、cd276、cd274、tim-3和vtcn1(b7h4)。
[0128]
因为当组合一个适应性基因和一个免疫抑制基因时，更经常发现一些基因是显著的，因此最优选的基因是：
[0129]
－代表适应性免疫应答的基因：cd3g，cd8a，ccr2和gzma
[0130]
－代表免疫抑制应答的基因：ren，il17a，ctla4和pdcd1。
[0131]
在实施本发明的进一步优选的条件下，代表适应性免疫应答的基因和代表免疫抑制应答的基因分别选自下组：上表1和2的基因。
[0132]
两对基因(总共4个基因)的优选组合是
[0133]
－ccr2，cd3g，il17a和ren以及
[0134]
－cd8a，ccr2，ren和pdcd1。
[0135]
在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是wo2014009535(通过引用并入)中描述的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包括来自下组的一种或多种基因的表达水平：ccr2、cd3d、cd3e、cd3g、cd8a、cxcl10、cxcl11、gzma、gzmb、gzmk、gzmm、il15、
irf1、prf1、stat1、cd69、icos、cxcr3、stat4、ccl2和tbx21。
[0136]
在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是wo2012095448(通过引用并入)中描述的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包括来自下组的一种或多种基因的表达水平：gzmh、ifng、cxcl13、gnly、lag3、itgae、ccl5、cxcl9、pf4、il17a、tslp、ren、ihh、prom1和vegfa。
[0137]
在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是wo2012072750(通过引用并入)中描述的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包含mirna簇的表达水平，所述mirna簇包含：mir.609、mir.518c、mir.520f、mir.220a、mir.362、mir.29a、mir.660、mir.603、mir.558、mir519b、mir.494、mir.130a或mir.639。
[0138]
在一些实施方案中，通过输入如上所述的一种或多种免疫标志物的定量值的评分系统评估免疫应答。
[0139]
在一些实施方案中，评分系统是连续评分系统。在一些实施方案中，连续评分系统输入一种或多种免疫标志物的绝对定量值。在一些实施方案中，连续评分系统输入从患者获得的肿瘤活检样品中测定的细胞密度的绝对定量值。在一些实施方案中，连续评分系统输入cd3+细胞密度的绝对定量值和cd8+细胞密度的绝对定量值。根据这些实施方案，评分系统输出连续变量(即得分)。
[0140]
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的连续评分系统评估免疫应答：
[0141]
a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中的一种或多种免疫标志物；
[0142]
b)将在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值的分布进行比较；
[0143]
c)对于在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；
[0144]
d)计算百分位数的算术平均值或中值。
[0145]
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的连续评分系统评估免疫应答：
[0146]
a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；
[0147]
b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；
[0148]
c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；
[0149]
d)计算百分位数的算术平均值。
[0150]
在一些实施方案中，评分系统是非连续系统。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中将一种或多种免疫标志物的绝对定量值指定为预定的库。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中将从患者获得的肿瘤活检样品中测定的细胞密度的绝对定量值指定为“高”或“低”仓。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中将从患者获得的肿瘤活检样品中测定的cd3+和cd8+细胞密度的绝对定量值指定为“高”或“低”仓。根据这些特定的实施方案，由此将细胞密度值与预定参考值进行比较，并且由此根据细胞密度是低于还是高于预定参考值而将细胞密度值指定为“低”或“高”仓。根据这些实施方案，评分系统输出非连续变量，如“低”、“中”和“高”。
[0151]
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的非连续评分系统评估免疫应答：
[0152]
a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中的一种或多种免疫标志物；
[0153]
b)将在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值的分布进行比较；
[0154]
c)对于在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；
[0155]
d)计算百分位数的算术平均值或中值；和
[0156]
e)将在步骤d)获得的百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定参考算术平均值或预定中值进行比较，和
[0157]
f)根据百分位数的算术平均值或中值是分别低于还是高于百分位数的预定参考算术平均值或预定中值指定“低”或“高”得分。
[0158]
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的评分系统评估免疫应答：
[0159]
a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；
[0160]
b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；
[0161]
c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值所对应的分布的百分位数；
[0162]
d)计算百分位数的算术平均值；和
[0163]
e)将在步骤d)获得的算术平均值与百分位数的预定参考算术平均值进行比较，和
[0164]
f)根据百分位数的算术平均值是否分别低于或高于百分位数的预定参考算术平均值来指定“低”或“高”得分。
[0165]
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的评分系统评估免疫应答：
[0166]
a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；
[0167]
b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；
[0168]
c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值所对应的分布的百分位数；
[0169]
d)计算百分位数的算术平均值；和
[0170]
e)将在步骤d)获得的百分位数的算术平均值与2个百分位数的预定参考算术平均值进行比较，和
[0171]
f)根据算术平均值指定“低”、“中”或“高”得分：
[0172]
－低于最低预定参考百分位数的算术平均值(“低”)
[0173]
－在2个百分位数的预定参考算术平均值之间(“中”)
[0174]
－高于最高预定参考百分位数的算术平均值(“高”)。
[0175]
在一些实施方案中，非连续评分系统是如实施例中所述的免疫评分。
[0176]
在一些实施方案中，用于评估免疫应答的评分系统涉及如本文下文和实施例中所述的数字病理学。
[0177]
在一些实施方案中，评分系统是自动评分系统。
[0178]
用于定量免疫标志物的方法：
[0179]
本领域技术人员已知的用于定量本文涵盖的细胞类型、蛋白质类型或核酸类型免
疫标志物的任何一种方法可用于进行本发明的癌症预后方法。因此，可以容易地应用本领域公知的用于检测和定量样品中的蛋白质或核酸的标准和非标准(新兴)技术中的任何一种。
[0180]
本发明的免疫标志物的表达可以通过用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的多种公知方法中的任一种来评估。这些方法的非限制性实例包括用于检测分泌的、细胞表面的、细胞质的或细胞核的蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
[0181]
在一些实施方案中，使用抗体(例如放射性标记的、发团标记的、荧光团标记的、聚合物骨架抗体或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白质-配体对的蛋白质或配体(例如生物素-链霉抗生物素蛋白)缀合的抗体)或抗体片段(例如单链抗体、分离的抗体高变域等)评估标记物的表达，所述抗体片段特异性结合标志物蛋白质或其片段，所述标志物蛋白质或其片段包括已经经历其正常翻译后修饰的全部或部分的标志物蛋白质。
[0182]
在一些实施方案中，免疫标志物或一组免疫标志物可以用本领域已知的任何一种免疫组化方法定量。
[0183]
典型地，为了进一步分析，首先将肿瘤的一个薄切片与抗一种目标免疫标志物的标记抗体一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标记种类，例如放射性、荧光或酶标记，通过适当的技术显示与所述目标免疫标志物结合的标记抗体。可以同时进行多个标记。
[0184]
免疫组化典型地包括以下步骤：i)用福尔马林固定活检样品，ii)将所述活检样品包埋在石蜡中，iii)将所述活检样品切成切片用于染，iv)将所述切片与对免疫标志物特异性的结合配偶体一起孵育，v)冲洗所述切片，vi)将所述切片与典型地生物素化的二抗一起孵育，和vii)典型地用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物显示抗原-抗体复合物。因此，首先将肿瘤活检样品与具有免疫标志物的结合配偶体一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标记的种类，例如放射性、荧光或酶标记，通过适当的技术显示与免疫标志物结合的标记抗体。可以同时进行多个标记。或者，本发明的方法可使用偶联于扩增系统(以增强染信号)和酶分子的二抗。这种偶联的二抗可从例如dako,envision system商购获得。可以使用复染，例如苏木精&伊红、dapi、hoechst。其它染方法可以使用本领域技术人员显而易见的任何合适的方法或系统来完成，包括自动、半自动或手动系统。
[0185]
例如，可以将一种或多种标记附着于抗体，从而允许检测靶蛋白(即免疫标志物)。示例性的标记包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、酶及其组合。可与一级和/或二级亲和配体缀合的标记的非限制性实例包括荧光染料或金属(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(例如荧光素、荧光素酶)、半抗原(例如生物素)。在stryer l(1968)science 162:526-533and brand l and gohlke j r(1972)annu.rev.biochem.41:843-868中描述了多种其它有用的荧光剂和发团。亲和配体也可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如3h、
14
c、
32
p、
35
s或
125
i)和颗粒(例如金)标记。不同类型的标记可以使用各种化学方法缀合到亲和配体上，例如胺反应或硫醇反应。然而，可以使用除胺和硫醇之外的其它反应性基团，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。本领域已知多种酶染方法用于检测目标蛋白。例如，可以使用不同的酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶)或不同的原(如dab、aec)或固红显现酶相互作用。在一些实施方案中，标记是量子点。例如，量子点(qdot)在包
括免疫组化、流式细胞计量术和基于板的测定的不断增长的应用列表中变得越来越有用，并且因此可以与本发明结合使用。qdot纳米晶体具有独特的光学性质，包括用于灵敏度和定量的极亮信号；用于成像和分析的高光稳定性。需要单一的激发源，并且缀合物的增长范围使得它们可用于广泛的基于细胞的应用。qdot生物缀合物的特征在于与可获得的最亮的传统染料相当的量子产率。另外，这些基于量子点的荧光团比传统染料吸收多10-1000倍的光。来自基础qdot量子点的发射是窄的和对称的，这意味着与其它颜的重叠被最小化，导致进入相邻检测通道的最小渗和衰减的串扰，尽管可以同时使用更多的颜。在其它实例中，抗体可缀合至可经由标记的结合配偶体或抗体检测的肽或蛋白质。在间接ihc测定中，二抗或第二结合配偶体是检测第一结合配偶体的结合所必需的，因为其未被标记。
[0186]
在一些实施方案中，使用用于观察可检测信号并获取图像(例如染的数字图像)的系统来对所得染样本中的每一个成像。用于图像获取的方法是本领域技术人员公知的。例如，一旦样品被染，任何光学或非光学成像装置可用于检测染剂或生物标记，例如，直立或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、照相机、扫描或隧道电子显微镜、套管探针显微镜和成像红外检测器。在一些实例中，可以数字地捕获图像。所获得的图像然后可以用于定量或半定量地测定样品中免疫检查点蛋白质的量，或对目标标记呈阳性的细胞的绝对数，或对目标标记呈阳性的细胞的表面。适用于ihc的各种自动化样品处理、扫描和分析系统在本领域中是可获得的。这样的系统可以包括自动染和显微扫描、计算机化的图像分析、连续切片比较(以控制样品的取向和尺寸的变化)、数字报告生成以及样品的存档和跟踪(例如放置组织切片的载玻片)。细胞成像系统是可商购的，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统组合以对细胞和组织(包括免疫染样品)进行定量分析。参见例如cas-200系统(becton,dickinson&co.)。特别地，检测可以手动进行或通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术进行。使用这样的软件，例如，可以使用本领域技术人员已知的程序，基于包括例如染质量或染强度的因素来配置、校准、标准化和/或验证图像(参见例如公开的美国专利公开号us 20100136549)。可以基于样品的染强度定量或半定量地分析和评分图像。定量或半定量组化是指对经历组化的样品进行扫描和评分以鉴定和定量指定生物标志物(即免疫检查点蛋白)的存在的方法。定量或半定量方法可以使用成像软件来检测染密度或染量，或通过人眼检测染的方法，其中受过训练的操作者对结果进行数值分级。例如，可以使用像素计数算法和组织识别模式(例如，aperio spectrum software,automated quantitatative analysis platform(平台)，或具有ilastic和calopix软件的tribvn)，以及测量或定量或半定量染程度的其他标准方法来定量分析图像；参见例如美国专利no.8,023,714；美国专利no.7,257,268；美国专利no.7,219,016；美国专利no.7,646,905；公开的美国专利no.us20100136549和20110111435；camp et al.(2002)nature medicine,8:1323-1327；bacus et al.(1997)analyt quant cytol histol,19:316-328)。可以计算强阳性染(例如褐变)与总染面积之和的比率并评分。将检测到的生物标志物(即免疫检查点蛋白质)的量定量并作为阳性像素的百分比和/或分数给出。例如，可以将该量量化为阳性像素的百分比。在一些实例中，将该量量化为染面积的百分比，例如，阳性像素的百分比。例如，与总染面积相比，样品可以具有至少或约至少或约0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、
faststain、ponceau red、亮蓝染料等来显示结合的生物素，从而测定每个膜的总蛋白质，如本领域已知。
[0190]
在一些实施方案中，本发明的方法利用多重组织印记(mti)技术来测量生物标志物，其中该方法通过允许多种生物标志物，在一些情况下至少六种生物标志物来保存珍贵的活检组织。
[0191]
在一些实施方案中，存在可选的多重组织分析系统，其也可用作本发明的一部分。一种这样的技术是基于质谱的选择性反应监测(srm)测定系统("liquid tissue"，可获自oncoplexdx(rockville,md))。该技术描述于美国专利no.7,473,532中。
[0192]
在一些实施方案中，本发明的方法使用由ge global research(niskayuna,ny)开发的多重ihc技术。该技术描述于美国公开号2008/0118916和2008/0118934中。在此，对含有多个靶标的生物样品进行序列分析，包括以下步骤：将荧光探针结合到样品上，随后进行信号检测，然后使探针失活，随后将探针结合到另一个靶标上，检测和失活，并继续该过程直到检测到所有靶标。
[0193]
在一些实施方案中，当使用荧光(例如荧光团或量子点)时可以进行多重组织成像，其中可以用多光谱成像系统测量信号。多光谱成像是其中收集图像的每个像素处的光谱信息，并且用光谱图像处理软件分析所得数据的技术。例如，系统可以拍摄一系列电子地和连续地可选择的不同波长的图像，然后与为处理这些数据而设计的分析程序一起使用。因此，即使当染料的光谱高度重叠或当它们共定位或出现在样品中的同一点时，该系统也能够同时从多种染料获得定量信息，只要光谱曲线不同。许多生物材料在被高能光激发时自动发荧光或发射低能光。该信号可导致较低对比度的图像和数据。没有多光谱成像能力的高灵敏度照相机仅增加自发荧光信号以及荧光信号。多光谱成像可以不混合或分离来自组织的自发荧光，从而增加可获得的信噪比。简言之，可以通过以下步骤来进行量化：i)提供从患者获得的肿瘤组织微阵列(tma)，ii)然后，用具有目标免疫检查点蛋白质的特异性的抗-抗体染tma样品，iii)进一步用上皮细胞标志物染tma载玻片以帮助肿瘤和基质的自动分割，iv)然后，使用多光谱成像系统扫描tma载玻片，v)使用自动图像分析软件(例如perkin elmer技术)处理扫描的图像，其允许通过强大的模式识别算法检测、定量和分割特定组织。机器学习算法典型地预先训练以从基质中分割肿瘤并鉴定标记的细胞。
[0194]
测定获自患者的肿瘤样品中基因的表达水平可通过本领域熟知的一组技术实现。
[0195]
在一些实施方案中，通过测定由该基因产生的mrna的量来评估基因的表达水平。
[0196]
用于测定mrna量的方法是本领域熟知的。例如，将包含在样品(例如，从患者制备的细胞或组织)中的核酸首先根据标准方法提取，例如使用裂解酶或化学溶液，或根据制造商的说明书通过核酸结合树脂提取。然后，通过杂交(例如：northern印迹分析)和/或扩增(例如，rt-pcr)检测由此提取的mrna。优选地，定量或半定量rt-pcr是优选的。实时定量或半定量rt-pcr是特别有利的。
[0197]
扩增的其它方法包括连接酶链反应(lcr)、转录介导的扩增(tma)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)、定量性新一代rna测序(ngs)。
[0198]
包含至少10个核苷酸并表现出与本文的目标mrna的序列互补性或同源性的核酸(多核苷酸)可用作杂交探针或扩增引物。应当理解，这样的核酸不需要完全相同，但典型地与可比大小的同源区至少约80％相同，更优选85％相同，甚至更优选90-95％相同。在一些
实施方案中，将核酸与合适的手段(例如可检测标记)组合用于检测杂交是有利的。各种合适的指示剂是本领域已知的，包括荧光的、放射性的、酶促的或其它配体(例如：抗生物素蛋白/生物素)。
[0199]
探针典型地包含长度为10-1000个核苷酸，例如10-800个，更优选15-700个，典型地20-500个核苷酸的单链核酸。引物典型地是长度为10-25个核苷酸的较短的单链核酸，设计成与待扩增的目标核酸完全或几乎完全匹配。探针和引物对它们杂交的核酸是“特异性的”，即它们优选在高严格性杂交条件(对应于最高解链温度tm，例如50％甲酰胺，5x或6x scc。scc是0.15m nacl、0.015m柠檬酸钠)下杂交。
[0200]
在上述扩增和检测方法中可用作引物或探针的核酸可装配成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括测定是否发生扩增所必需的组分。试剂盒还可以包括例如pcr缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及用于扩增和检测特定序列的说明书。
[0201]
在一些实施方案中，本发明的免疫标志物的表达可以通过用数字寡核苷酸条形码标记生物标记物(在其dna、rna或蛋白质中)并测量或计数条形码的数目来评估。
[0202]
在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞提取的总rna，并使rna进行扩增并与特异性探针杂交，更特别地通过定量或半定量rt-pcr。
[0203]
使用所公开的方法制备的探针可用于核酸检测，如原位杂交(ish)程序(例如，荧光原位杂交(fish)、显原位杂交(cish)和银原位杂交(sish))或比较基因组杂交(cgh))。
[0204]
原位杂交(ish)涉及在中期或间期染体制备物(例如固定在载玻片上的细胞或组织样品)的背景下使含有靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)的样品与对靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)可特异性杂交或特异性的标记探针接触。任选地预处理载玻片，例如，以除去石蜡或其它可能干扰均匀杂交的物质。样品和探针都进行处理，例如通过加热使双链核酸变性。将探针(配制在合适的杂交缓冲液中)和样品在允许杂交发生(典型地达到平衡)的条件和足够的时间下组合。洗涤染体制备物以除去过量的探针，并使用标准技术进行染体靶标的特异性标记的检测。
[0205]
例如，可以使用荧光素标记的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-碱性磷酸酶检测生物素化的探针。对于荧光染料检测，可以直接检测荧光染料，或者可以将样品与例如异硫氰酸荧光素(fitc)-缀合的抗生物素蛋白一起孵育。如果需要，fitc信号的扩增可以通过与生物素缀合的山羊抗亲和素抗体孵育、洗涤和与fitc偶联的抗亲和素第二次孵育来实现。为了通过酶活性进行检测，可以将样品例如与链霉抗生物素孵育、洗涤、与生物素缀合的碱性磷酸酶孵育，再次洗涤并预平衡(例如，在碱性磷酸酶(ap)缓冲液中)。对于原位杂交方法的一般描述，参见例如美国专利号4,888,278。
[0206]
用于fish、cish和sish的许多程序是本领域已知的。例如，用于进行fish的程序描述于美国专利号5,447,841；5,472,842；和5,427,932；和例如pinkel et al.,proc.natl.acad.sci.83:2934-2938,1986；pinkel et al.,proc.natl.acad.sci.85:9138-9142,1988；和lichter et al.,proc.natl.acad.sci.85:9664-9668,1988中。cish例如描述于tanner et al.,am.j.pathol.157:1467-1472,2000和美国专利号6,942,970中。在美国专利no.6,280,929中提供了另外的检测方法。
[0207]
许多试剂和检测方案可与fish、cish和sish程序结合使用，以改进灵敏度、分辨率
或其它所需性质。如上所述，当进行fish时，可以直接光学检测用荧光团(包括荧光染料和quantum)标记的探针。或者，探针可用非荧光分子，如半抗原(如以下非限制性实例：生物素，洋地黄毒苷，dnp和各种唑类、吡唑类、噻唑类、硝基芳基、苯并呋喃类、三萜类、脲类、硫脲类、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其它可间接检测的部分标记。然后，可以通过使样品(例如，与探针结合的细胞或组织样品)与标记的检测试剂接触来检测用这种非荧光分子(和它们结合的靶核酸序列)标记的探针，所述标记的检测试剂诸如对所选半抗原或配体具有特异性的抗体(或受体，或其它特异性结合配偶体)。检测试剂可用荧光团(例如quantum)或另一可间接检测的部分标记，或可与一种或多种可用荧光团标记的其它特异性结合剂(例如二抗或特异性抗体)接触。
[0208]
在其它实例中，将探针或特异性结合剂(例如抗体，诸如一抗、受体或其它结合剂)用酶标记，所述酶能够将荧光或显组合物转化成可检测的荧光、有或其它可检测信号(例如，如在sish中可检测金属颗粒的沉积中)。如上所述，酶可以通过接头直接或间接连接到相关的探针或检测试剂上。合适的试剂(例如结合试剂)和化学物质(例如接头和连接化学物质)的实例描述于美国专利申请公开号2006/0246524；2006/0246523和2007/0117153中。
[0209]
本领域技术人员将理解，通过适当地选择标记的探针特异性结合剂对，可以产生多重检测方案以促进在单个测定中(例如，在单个细胞或组织样品上或在多于一个细胞或组织样品上)检测多个靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)。例如，对应于第一靶序列的第一探针可以用第一半抗原(如生物素)标记，而对应于第二靶序列的第二探针可以用第二半抗原(如dnp)标记。在将样品暴露于探针之后，可以通过将样品与第一特异性结合剂(在这种情况下，用第一荧光团标记的抗生物素蛋白，例如，在585nm处发射的第一光谱上不同的quantum)和第二特异性结合剂(在这种情况下，用第二荧光团标记的抗dnp抗体或抗体片段，例如，在705nm处发射的第二光谱上不同的quantum)接触来检测结合的探针。可以将另外的探针/结合剂对添加到使用其它光谱上不同的荧光团的多重检测方案中。可以预期直接和间接(一步、两步或更多)的许多变化，所有这些都适用于所公开的探针和测定的上下文中。
[0210]
探针典型地包含长度为10-1000个核苷酸，例如10-800个，更优选15-700个，典型地20-500个核苷酸的单链核酸。引物典型地常是长度为10-25个核苷酸的较短的单链核酸，其被设计成与待扩增的目标核酸完全或几乎完全匹配。探针和引物对它们杂交的核酸是“特异性的”，即它们优选在高严格性杂交条件(对应于最高解链温度tm，例如50％甲酰胺，5x或6x scc。scc是0.15m nacl、0.015m柠檬酸钠)下杂交。
[0211]
在上述扩增和检测方法中可用作引物或探针的核酸可装配成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括测定是否发生扩增所必需的组分。试剂盒还可以包括例如pcr缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及用于扩增和检测特定序列的说明书。
[0212]
在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞提取的总rna，并使rna进行扩增并与特异性探针杂交，更特别地通过定量或半定量rt-pcr。
[0213]
在另一个优选的实施方案中，表达水平通过dna芯片分析测定。这样的dna芯片或核酸微阵列由化学连接到基质上的不同的核酸探针组成，所述基质可以是微芯片、载玻片或微球大小的珠子。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针包括可以是约10至约60个碱基对的核酸，如cdna或寡核苷酸。为了测定表达水平，标记来自测试受试者的样品，任选地首先进行逆转录，并在杂交条件下与微阵列接触，导致靶核酸之间形成复合物，所述靶核酸与附着于微阵列表面的探针序列互补。然后，检测标记的杂交复合物，并可定量或半定量。标记可以通过各种方法实现，例如通过使用放射性或荧光标记。本领域技术人员可获得微阵列杂交技术的许多变体(参见例如hoheisel的综述，nature reviews,genetics,2006,7:200-210)。
[0214]
基因的表达水平可以表达为绝对表达水平或标准化表达水平。在本方法中可以使用两种类型的值。当使用定量pcr作为评估表达水平的方法时，基因的表达水平优选地表达为标准化的表达水平，因为在实验开始时的小差异可以在多个循环后提供巨大的差异。
[0215]
在一些实施方案中，分析系统用于检测固有基因表达。分析系统的基础是赋予待测定的每个核酸靶标的独特代码(国际专利申请公开号wo08/124847，美国专利号8,415,102and geiss et al.nature biotechnology.2008.26(3):317-325；其内容各自通过引用以其整体并入本文)。该代码由一系列有序的有荧光点组成，这些荧光点对每个待分析的靶标产生独特的条形码。为每个dna或rna靶标设计一对探针，生物素化的捕获探针和携带荧光条形码的报道探针。该系统在本文中也称为纳米报告基因代码系统。针对每个靶标合成特异性报告基因和捕获探针。报告基因探针可包含至少第一标记附着区，其上附着有一个或多个发射构成第一信号的光的标记单体；至少第二标记附着区，其与所述第一标记附着区不重叠，其上附着有一个或多个发射构成第二信号的光的标记单体；和第一靶特异性序列。优选地，每个序列特异性报告基因探针包含能够与不超过一个基因杂交的靶特异性序列，并且任选地包含至少三个或至少四个标记附着区，所述附着区包含一个或多个发射分别构成至少第三信号或至少第四信号的光的标记单体。捕获探针可包含第二靶特异性序列；以及第一亲和性标签。在一些实施方案中，捕获探针还可以包含一个或多个标记附着区。优选地，报告基因探针的第一靶特异性序列和捕获探针的第二靶特异性序列与待检测的同一基因的不同区域杂交。报告基因探针和捕获探针都汇集成单一杂交混合物，即“探针文库”。在单个多重杂交反应中测量每个靶标的相对丰度。该方法包括将肿瘤组织样品与探针文库接触，使得样品中靶标的存在产生探针对-靶标复合物。然后，纯化复合物。更具体地，将样品与探针文库结合，并且杂交发生在溶液中。杂交后，使用连接到与捕获和报告基因探针上存在的通用序列互补的寡核苷酸上的磁珠，以两步程序纯化三部分杂交的复合物(探针对和靶标)。这种双重纯化方法允许用大量过量的靶特异性探针驱动杂交反应完成，因为它们最终被除去，因此不干扰样品的结合和成像。所有杂交后步骤均在定制的液体处理机器人(prep station,nanostring technologies)上进行机器人处理。纯化的反应典型地通过prep station沉积到样品盒的各个流动池中，通过捕获探针结合到链霉亲和素蛋白包被的表面，电泳以延长报告基因探针，并固定。处理后，将样品盒转移到全自动成像和数据收集装置(digital analyzer,nanostring technologies)。通过对每个样品成像并计数检测该靶标的代码的次数来测量靶标的水平。对于每个样品，典型地成像600个视野(fov)(1376
×
1024像素)，代
表约10mm2的结合表面。典型的成像密度是每视野100-1200个计数的报告基因，这取决于多路复用度、样品输入量和总靶丰度。数据以简单的电子表格格式输出，其列出每个靶标，每个样品的计数数量。该系统可与纳米报告基因一起使用。关于纳米报告基因的另外的公开内容可以在国际公开号wo07/076129和wo07/076132以及美国专利公开号2010/0015607和2010/0261026中到，其内容以其整体并入本文。此外，术语核酸探针和纳米报告基因可以包括国际公开号wo2010/019826和美国专利公开号2010/0047924中描述的合理设计的(例如合成的序列)，其通过引用整体并入本文。
[0216]
典型地，通过将基因的表达与与确定患者的癌症阶段无关的基因(例如组成型表达的管家基因)的表达进行比较来校正基因的绝对表达水平，从而使表达水平标准化。用于正常化的合适基因包括管家基因，如肌动蛋白基因actb、核糖体18s基因、gusb、pgk1和tfrc。这种标准化允许将一个样品(例如患者样品)的表达水平与另一个样品的表达水平进行比较，或将来自不同来源的样品进行比较。
[0217]
根治性手术后病理应答的评估：
[0218]
在一些实施方案中，根治手术后的病理应答通过本领域任何公知的方法评估。
[0219]
在一些实施方案中，通过解剖病理学评估病理应答。特别地，通过从患者获得的肿瘤组织样品的宏观、微观、生化、免疫学和分子检查来评估病理应答。因此，在一些实施方案中，对从患者获得的组织肿瘤样品评估病理应答。
[0220]
在一些实施方案中，通过组织学和/或组织病理学评估病理应答。
[0221]
在一些实施方案中，检查宏观外观、尺寸、位置以及与近侧边缘、远侧边缘和径向边缘的关系。在一些实施方案中，还通过显微镜检查来检查诸如溃疡、纤维化区域或被粘膜和邻近粘膜覆盖的区域的病变以充分评估残余肿瘤。在一些实施方案中，还测定淋巴结的存在。
[0222]
在一些实施方案中，通过评分系统进行病理应答。在一些实施方案中，通过非连续评分系统评估病理应答。
[0223]
在一些实施方案中，通过yptnm评分系统评估病理应答。
[0224]
在一些实施方案中，通过本领域熟知的任何trg系统评估病理应答。
[0225]
已经为trg提出了各种分级系统。例如，对于结肠直肠癌，最广泛使用的trg系统是ryan等人(ryan r,gibbons d,hyland jm,treanor d,white a,mulcahy he,et al.pathological response following long-course neoadjuvant chemoradiotherapy for locally advanced rectal cancer.histopathology.2005；47:141
–
6),dworak et al.(dworak o,keilholz l,hoffmann a.pathological features of rectal cancer after preoperative radiochemotherapy.int j colorectal dis.1997；12:19
–
23),and mandard(mandard am,dalibard f,mandard jc,marnay j,henry-amar m,petiot jf,et al.pathologic assessment of tumor regression after preoperative chemoradiotherapy of esophageal carcinoma:clinicopathologic correlations.cancer.1994；73:2680
–
6)的那些。mandard和dworak trg系统根据基于残余肿瘤和纤维化的五点分级进行分类，而具有三点分级的ryan trg系统是一种改良的mandard trg系统。2010年美国癌症联合委员会(ajcc)trg系统是基于残余原发性肿瘤细胞体积的ryan trg系统的改进。这些trg系统中的每一个的细节在表a中示出。
[0226]
表a.肿瘤消退等级(trg)系统
[0227][0228][0229]
ajcc，美国癌症联合委员会。
[0230]
a)
使用改良的dworak trg整体评估原发性肿瘤和局部淋巴结。
[0231]
在一些实施方案中，当癌症是结肠直肠癌时，通过如george tj,allegra cj,yothers g.neoadjuvant rectal(nar)score:a new surrogate endpoint in rectal cancer clinical trials.curr colorectal cancer rep.2015；11:275
–
80中所述的新辅助直肠(nar)评分分类来评估病理应答。根据所述系统，如实施例中所述计算等式[5pn-3(ct-pt)+12]^2/9.61并分类为低(《8)、中(8-16)和高(》16)。
[0232]
在一些实施方案中，通过yptnm评分系统结合本领域熟知的任何trg系统来评估病理应答。
[0233]
在一些实施方案中，由两名有经验的病理学专家通过检查肿瘤组织样品独立地评估病理应答。
[0234]
使用算法：
[0235]
在一些实施方案中，本发明的方法包括使用算法。
[0236]
在一些实施方案中，本发明的方法包含以下步骤：
[0237]
a)评估至少两个参数，其中第一参数是在术前辅助前测定的免疫，并且第二参数是术前辅助后测定的临床应答。
[0238]
b)对包括或由步骤a)评估的参数组成的数据实施算法以获得算法输出，所述实施步骤是计算机实施的；和
[0239]
c)从步骤b)获得的算法输出测定复发和/或死亡的风险。
[0240]
算法的非限制性实例包括和、比率和回归算子，例如系数或指数、生物标志物值变
换和归一化(包括但不限于基于临床参数(例如性别、年龄或种族)的那些归一化方案)、规则和指南、统计分类模型和在历史体上训练的神经网络。因此，算法的非限制性实例包括逻辑回归、线性回归、随机森林、分类和回归树(c&rt)、提升树、神经网络(nn)、人工神经网络(ann)、神经模糊网络(nfn)、网络结构、诸如多层感知器的感知器、多层前馈网络、支持向量机(例如，kernel法)、多变量自适应回归样条(mars)、levenberg-marquardt算法、高斯-牛顿算法、高斯混合、梯度下降算法、学习向量量化(lvq)及其组合。结合参数的具体用途是线性和非线性方程以及统计分类分析，以测定所述参数的水平与对术前辅助的客观应答之间的关系。特别感兴趣的是结构和语法统计分类算法，以及利用模式识别特征的风险指数构造方法，包括已建立的技术，例如互相关、主成分分析(pca)、因子旋转、逻辑回归(logreg)、线性判别分析(lda)、特征基因线性判别分析(elda)、支持向量机(svm)、随机森林(rf)、递归分割树(rpart)以及其它相关的决策树分类技术、缩小重心(sc)、stepaic、k最近邻、提升、决策树、神经网络、贝叶斯网络、支持向量机和隐马尔可夫模型等。其它技术可用于生存期和事件危害时间分析，包括本领域技术人员熟知的cox、weibull、kaplan-meier和greenwood模型。
[0241]
在一些实施方案中，本发明的方法包括使用机器学习算法。机器学习算法可以包括监督学习算法。监督学习算法的实例可包括平均单依赖性估计器(aode)、人工神经网络(例如，反向传播)、贝叶斯统计(例如，朴素贝叶斯分类器、贝叶斯网络、贝叶斯知识库)、基于案例的推理、决策树、归纳逻辑编程、高斯过程回归、数据处理的方法(gmdh)、学习自动机、学习矢量量化、最小消息长度(决策树、决策图等)、即时学习、基于实例的学习最近邻算法、模拟建模、概率近似正确学习(pac)学习、下波规则、知识获取方法、符号机器学习算法、子符号机器学习算法、支持矢量机器、随机森林、分类器集合、引导聚合(bagging)和提升。监督学习可以包括序数分类，如回归分析和信息模糊网络(ifn)。或者，监督学习方法可包括统计分类，如aode、线性分类器(例如，fisher线性判别式、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知器和支持向量机)、二次分类器，k最近邻、提升、决策树(例如，c4.5、随机森林)、贝叶斯网络和隐马尔可夫模型。机器学习算法还可以包括无监督学习算法。无监督学习算法的实例可以包括人工神经网络、数据聚类、期望最大化算法、自组织映射、径向基函数网络、矢量量化、生成地形图、信息瓶颈方法和ibsead。无监督学习还可以包括关联规则学习算法，如apriori算法、eclat算法和fp生长算法。也可以使用分级聚类，例如单链接聚类和概念聚类。或者，无监督学习可以包括分区聚类，如k均值算法和模糊聚类。在一些实施方案中，机器学习算法包括强化学习算法。强化学习算法的实例包括但不限于时差学习、q学习和学习自动机。或者，机器学习算法可以包括数据预处理。
[0242]
在一些实施方案中，使用公知的计算机处理器、存储器单元、存储设备、计算机软件和其它组件在计算机上实施该算法。典型地，计算机包含处理器，其通过执行定义这种操作的计算机程序指令来控制计算机的整体操作。计算机程序指令可以被存储在存储设备(例如磁盘)中，并且当期望执行计算机程序指令时被加载到存储器中。计算机还包括允许用户与计算机交互的其它输入/输出设备(例如，显示器、键盘、鼠标、扬声器、按钮等)。本领域技术人员将认识到，实际计算机的实施也可以包含其它组件。
[0243]
在一些实施方案中，使用以客户端-服务器关系操作的计算机来实施该算法。典型地，在这样的系统中，客户端计算机位于远离服务器计算机的位置，并通过网络进行交互。
客户端-服务器关系可以由在相应的客户端和服务器计算机上运行的计算机程序来定义和控制。在一些实施方案中，结果可以显示在用于显示的系统上，例如用led或lcd。因此，在一些实施方案中，该算法可以在计算系统中实施，该计算系统包括后端组件(例如，作为数据服务器)，或者包括中间件组件(例如，应用服务器)，或者包括前端组件(例如，具有图形用户界面或web浏览器的客户端计算机，用户可以通过该图形用户界面或web浏览器与实现交互)，或者一个或多个这样的后端、中间件或前端组件的任何组合。系统的组件可通过任何形式或介质的数字数据通信(例如，通信网络)互连。通信网络的实例包括局域网(“lan”)和广域网(“wan”)，例如因特网。计算系统可以包括客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离，并且典型地通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系是借助于在各个计算机上运行的并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序而产生的。
[0244]
在一些实施方案中，算法在基于网络的云计算系统内实施。在这种基于网络的云计算系统中，连接到网络的服务器或另一处理器经由网络与一个或多个客户端计算机通信。例如，客户端计算机(例如移动设备，如电话、平板或膝上型计算机)可以经由驻留并运行在客户端计算机上的网络浏览器应用与服务器通信。客户端计算机可以在服务器上存储数据并通过网络访问数据。客户端计算机可以通过网络向服务器发送对数据的请求或对在线服务的请求。服务器可以执行所请求的服务并向客户端计算机提供数据。服务器还可以发送适于使客户端计算机执行指定功能的数据，例如执行计算、在屏幕上显示指定数据等。例如，医生可以注册参数(即输入数据)，然后通过诸如广域网(wan)的长距离通信链路通过因特网将数据发送到具有数据分析模块的服务器，数据分析模块将实施算法并最终将输出(例如分数)返回到移动设备。
[0245]
在一些实施方案中，可以将输出结果合并到临床决策支持(cds)系统中。可以将这些输出结果集成到电子医疗记录(emr)系统中。
[0246]
换言之，计算机程序产品和系统之间的交互能够执行本发明的方法。因此，本发明的方法是计算机实施的方法。这意味着该方法至少部分是计算机实施的。特别地，每个步骤可以是计算机实施的，只要一些步骤通过接收数据来实现。
[0247]
该系统是台式计算机。在变体中，该系统是机架式计算机、膝上型计算机、平板计算机、个人数字助理(pda)或智能电话。
[0248]
在一些实施方案中，计算机适于实时操作和/或是嵌入式系统，特别是在诸如飞机的交通工具中。在当前情况下，该系统包括计算器、用户接口和通信设备。计算器是电子电路，其适于操纵和/或变换由系统x的寄存器和/或存储器中的电子或物理量表示的数据，以对应于寄存器或其它类型的显示设备、传输设备或存储设备的存储器中的物理数据的其它类似数据表示。作为特定实例，计算器包含单芯或多芯处理器(例如中央处理单元(cpu)、图形处理单元(gpu)、微控制器和数字信号处理器(dsp))、可编程逻辑电路(例如专用集成电路(asic)、现场可编程门阵列(fpga)、可编程逻辑装置(pld)和可编程逻辑阵列(pla))、状态机、门控逻辑和离散硬件组件。该计算器包括适于处理数据(特别是通过执行计算)的数据处理单元、适于存储数据的存储器和适于读取计算机可读介质的读取器。用户接口包括输入设备和输出设备。输入设备是使系统用户能够向系统输入信息或命令的设备。在当前情况下，输入设备是键盘。或者，输入设备是指点设备(诸如鼠标、触摸板和数字化输入板)、语音识别设备、眼睛跟踪器或触觉设备(运动手势分析)。输出设备是图形用户界面，即适于
向系统用户提供信息的显示单元。在当前情况下，输出设备是用于输出的可视呈现的显示屏。在其他实施方案中，输出设备是打印机、增强和/或虚拟显示单元、用于输出的可听呈现的扬声器或另一声音生成设备、产生振动和/或气味的单元或适于产生电信号的单元。
[0249]
在一些实施方案中，输入设备和输出设备是形成人机接口的相同组件，诸如交互式屏幕。
[0250]
通信设备允许系统的组件之间的单向或双向通信。例如，通信设备是总线通信系统或输入/输出接口。
[0251]
在一些实施方案中，通信设备的存在使得计算器的组件彼此远离。
[0252]
该计算机程序产品包括计算机可读介质。计算机可读介质是可由计算器的读取器读取的有形设备。值得注意的是，计算机可读介质本身不是瞬时信号，例如无线电波或其它自由传播的电磁波，例如光脉冲或电信号。这种计算机可读存储介质例如是电子存储装置、磁存储装置、光存储装置、电磁存储装置、半导体存储装置或其任意组合。作为更具体实例的非穷举清单，计算机可读存储介质是机械编码设备，诸如凹槽中的穿孔卡或凸起结构、磁盘、硬盘、只读存储器(rom)、随机存取存储器(ram)、可擦除可编程只读存储器(erom)、电可擦除可编程只读存储器(eeprom)、磁光盘、静态随机存取存储器(sram)、光盘只读存储器(cd-rom)、数字多功能盘(dvd)、记忆棒、软盘、闪存、固态驱动盘(ssd)或pc卡，诸如个人计算机存储卡国际协会(pcmcia)。
[0253]
在一些实施方案中，计算机程序存储在计算机可读存储介质中。计算机程序包括一个或多个存储的程序指令序列。当由数据处理单元运行时，这种程序指令引起本发明的方法步骤的执行。例如，程序指令的形式是源代码形式、计算机可执行形式或源代码和计算机可执行形式之间的任何中间形式，例如通过解释器、汇编器、编译器、链接器或定位器对源代码进行转换而得到的形式。在变体中，程序指令是微代码、固件指令、状态设置数据、用于集成电路的配置数据(例如vhdl)或目标代码。典型地，程序指令以一种或多种语言的任意组合来编写，例如面向对象的编程语言(fortran、c++、java、html)、过程编程语言(例如语言c)。
[0254]
在一些实施方案中，程序指令通过网络从外部来源下载，这在应用的情况下尤为明显。在这种情况下，计算机程序产品包括其上存储有程序指令的计算机可读数据载体或其上编码有程序指令的数据载体信号。在每种情况下，计算机程序产品包括可加载到数据处理单元中并且适于在由数据处理单元运行时使本发明的方法执行的指令。根据这些实施方案，该执行完全或部分地在作为单个计算机的系统上实现，或在若干计算机之间的分布式系统中实现(特别是经由云计算)。
[0255]
在一些实施方案中，上述方法以多种方式实施，特别是使用硬件、软件或其组合。具体地，每个步骤由适于实现该步骤的模块或适于通过与该系统或包括该系统的特定装置交互来引起该步骤的执行的计算机指令来实施。还应当注意，取决于所考虑的实施方案，连续的两个步骤实际上可以基本上同时或以相反的顺序执行。
[0256]
本发明方法的应用：
[0257]
本发明的方法特别适于在术前辅助和根治性手术之后确定临床决策的方向。
[0258]
在一些实施方案中，当结论是患者将具有复发和/或死亡的高风险，和/或短生存时间(例如dfs)时，则然后决定术后辅助疗法。因此，本发明的方法特别适合于确定患者是
否适合于术后辅助。在一些实施方案中，术后辅助疗法由放疗、化疗、靶向疗法、激素疗法、免疫疗法或其组合组成。所述如上所述。
[0259]
特别地，当病理应答为yptnm＝ii-iv(例如yptnm＝ii)时，免疫评分(例如百分位数的算术平均值或中值)越低，复发和/或死亡的风险越高，且患者的生存时间(例如无疾病生存时间)越短，因此患者符合术后辅助的条件。
[0260]
特别地，当确定病理应答为yptnm＝ii-iv(例如yptnm＝ii)，并且免疫评分被分类为“低”(例如百分位数的算术平均值或中值被分类为“低”)时，可以得出结论，患者将具有更高的复发和/或死亡风险，并且因此患者的生存时间将更短，并且因此患者适合于术后辅助。
[0261]
在一些实施方案中，当结论是患者将具有低复发和/或死亡风险，并且特别是长的复发时间和/或生存时间(例如dfs)时，可决定不施用术后辅助疗法。在过去的几十年中，在局部晚期癌症中标准使用术前辅助、肿瘤切除和术后辅助极大地改进了肿瘤学结果。然而，这些改进伴随着显著发病率和生活质量差的成本。本发明的方法提供了识别具有特别好的临床结果同时保持生活质量的患者的特定亚组的优点。由于患者对保持生活质量的需求和兴趣，本发明的方法提供了避免术后辅助的有力工具。
[0262]
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0263]
图1.在患有yptnm 0期或i期肿瘤的患者中根据isb低、isb中(int.)和isb高的a)无疾病生存(dfs)和b)复发时间(ttr)的kaplan-meier曲线。
[0264]
通过趋势的对数秩检验测定趋势的p检验(p(tft))。
[0265]
图2.在患有yptnm ii期或iv期肿瘤的患者中根据isb低、isb中(int.)和isb高的a)无疾病生存(dfs)和b)复发时间(ttr)的kaplan-meier曲线。
[0266]
通过趋势的对数秩检验测定趋势的p检验(p(tft))。
[0267]
图3.在患有yptnm ii期肿瘤的患者中根据isb低、isb中(int.)和isb高的a)无疾病生存(dfs)和b)复发时间(ttr)的kaplan-meier曲线。
[0268]
通过趋势的对数秩检验测定趋势的p检验(p(tft))。
[0269]
图4.在cox比例风险回归模型下，在患有yptnm a)0或i期，b)ii期和c)ii、iii或iv期肿瘤的患者中，根据isb的2年和5年无疾病生存期概率表示为连续变量(isb平均评分，以百分位数表示)。
[0270]
图5.无疾病生存期(dfs)森林图，说明yptnm ii期和yptnm ii-iv期患者中根据isb低vs中(int.)和低vs高的危害比。
具体实施方式
[0271]
患者和方法：
[0272]
患者
[0273]
对larc患者的两个回顾性连续队列(n1＝131,n2＝118)进行了分析，这些患者具有可用的活检，通过nt和全直肠系膜切除术(tme)进行根治性手术。队列1是单中心队列
并且队列2是多中心队列(表1)。入选时间范围为1999-2016年。新辅助和手术标准由各机构定义。总体而言，64.2％的患者为男性，并且诊断时的中位年龄为65岁(四分位差[iqr]＝53.3-74.1)。通过nt(短[3.7％]或长[96.3％]辐射疗程；基于5-氟尿嘧啶的化疗[ct；82％]；18％未接受ct)患者。根据骨盆磁共振和胸部/腹部计算机断层扫描成像提供的基线分期信息，将直肠肿瘤分类为ctnm(uicc tnm第8版)i(1.2％)、ii(27.3％)，iii(71.5％)。分析了对nt(yctnm 0-1)具有完全/几乎完全应答的另外一组患者(n＝73)，随后是观察等待策略(表2)。队列1+2的dfs的中位随访持续时间为45.4个月(iqr＝25,7-65,6)。表3中提供了dfs、ttr和os的每个队列的随访持续时间以及事件数量。本研究得到各中心伦理审查委员会的批准。
[0274]
临床结果
[0275]
使用不同的肿瘤消退等级(trg)评分系统，根据肿瘤对nt的应答程度比较患者：i/dworak分类(21)定义为完全(dworak 4)、几乎完全(dworak 3)、中度(dworak 2)、最小(dworak 1)和无消退(dworak 0)，ii/新辅助直肠(nar)评分分类(5)，使用等式[5pn-3(ct-pt)+12]^2/9.61计算，并分类为低(《8)，中(8-16)和高(》16)，iii/yptnm期，即手术后病理t和n评价，和iv/肿瘤降低分期(4)，定义为完全(ypt0n0)、中(ypt1-2n0)或弱/不存在(ypt3-4或n+)。对于接受手术的患者，事件为局部、全身复发和从手术之日起死亡(对于无疾病生存期(dfs))、复发(对于复发时间(ttr))和因任何原因死亡(对于总生存期(os))。采用监视和等待策略进行管理的所有患者均被视为具有临床完全缓解(yctnm0)，并提供了严格的监督方案。
[0276]
免疫组化
[0277]
从所有中心中取出用于诊断目的的所有患者的初始活检。根据前述方案(17)，用抗cd3+(2gv6,0.4μg/ml；ventana,tuscon,az,usa)和cd8+(c8/144b,3μg/ml；dako,glostrup,denmark)的抗体对两个4μm福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的肿瘤组织切片进行免疫化学处理，用紫外通用ultraview universal dab ihc检测试剂盒(ventana,tuscon,az,usa)显示，并用mayer苏木精复染。
[0278]
基于活检的免疫评分(isb)测定
[0279]
以20x放大倍数和0.45μm/像素的分辨率(nanozoomer ht,hamamatsu,japan)获得染组织切片的数字图像。由经验丰富的病理学家(cl)对除正常组织和低/高度异型增生相关病变以外的肿瘤部分进行界定。用developer xd图像分析软件(definiens,munich,germany)的专用is模块测定肿瘤区域中cd3+和cd8+t细胞的平均密度。监测染强度的平均值和分布，提供内部染质量控制。进行最终质量检查以去除软件检测到的非特异性染。isb的测定直接衍生自用于测定结肠癌中is的国际验证队列中的免疫评分(is)的方法，其表明强的观察者间再现性(17)。将每个患者的肿瘤区域中的cd3+和cd8+t细胞密度与整个患者队列中获得的cd3+和cd8+t细胞密度进行比较，并相应地转换成百分位数。然后，将两个百分位数(cd3和cd8)的平均值转化为三个isb类别之一(图1b)：isb低(0-25％)，isb中(》25-70％)和isb高(》70-100％)。对研究终点盲法进行isb测定。
[0280]
通过nanostring技术的rna提取和转录组分析
[0281]
将来自活检和nt后相应的手术样本均可用的所有患者(队列1和2；n＝62)和来自未接受nt的结直肠癌患者(n＝13)的20μm ffpe肿瘤组织切片的总rna使用
recoverall
tm
总核酸分离试剂盒(ambion thermofisher,monza,italy)进行分离。在有或无nt的患者中肿瘤延伸t和n期的分布没有显示任何统计学差异。使用agilent rna 6000纳米试剂盒(agilent technologies,santa clara,ca)和nanodrop 2000(thermofisher scientific,waltham,usa)测量分离的rna的质量和量，并使用44个免疫相关基因的内部组(nanostring technologies,seattle,wa,usa)处理每个样品的100-400ng rna。将报告基因-捕获探针对杂交，将探针/靶复合物固定并在ncounter分析仪上计数。将背景扣除应用于原始数据，并使用nsolver分析软件，版本2.5进行基于阳性对照和内部管家基因(gusb，sp2)的几何平均值的归一化。
[0282]
统计分析和数据可视化
[0283]
使用r软件版本3.5.1和附加生存、surveminer、ggpubr、ggplot2、rms和硬币包装进行统计分析和数据可视化。通过卡方检验或fisher独立性检验评估isb与临床特征之间的相关性。通过pearson相关系数r和相关p值测量cd3+和cd8+细胞密度之间的关联水平。使用对数秩检验和cox比例危害模型进行生存单变量分析。通过kaplan-meier法估算生存曲线。对surveminer软件包的趋势进行对数秩检验，以检测生存曲线中的有序差异。用cox比例风险模型进行多变量生存分析以测试所有协变量的同时影响。使用cox.zph函数测试每个协变量的比例危害假设(pha)。通过来自harrell’s rms r软件包的卡方评估每个参数对生存风险的相对重要性。使用单侧逐线性关联测试评估isb和nt序数反应水平之间的关联。通过kendall相关性检验、t检验和mann-whitney u检验评价nt应答水平与cd3+、cd8+t细胞密度和基因强度之间的关联。用benjamini和hochberg方法调整以控制错误发现率的wilcoxon检验来测试转录分析中的反应水平。yctnm分期和isb包括在比例几率序数逻辑回归模型中以预测对nt的良好组织病理应答。p值《0.05被认为具有统计学显著性。使用来自软件包factominer和factoextra的pca和fviz_pca_ind函数进行主成分分析(pca)。在is计算中，线性加权kappa用于测量切除肿瘤和活检样本之间的一致性。
[0284]
结果：
[0285]
在直肠癌诊断组织上的基于活检的免疫评分(isb)测定
[0286]
在为诊断目的用nt的larc(n＝322)进行的初始肿瘤活检中评估cd3+淋巴细胞和细胞毒性cd8+细胞。监测免疫染强度以确保用图像分析软件(未示出)对染细胞进行有效检测和计数。生物标志物质量控制后排除7例患者(2.8％)，并且临床数据质量控制后排除4例患者(1.2％)。肿瘤中cd3+和cd8+t细胞的中值密度分别为1363个细胞/mm2和274个细胞/mm2(数据未显示)。cd3+/cd8+t细胞比率在患者中是高度可变的，其中两个标志物之间的测定系数(r2)为0.58(数据未显示)。isb衍生自cd3+和cd8+t细胞密度(数据未显示)。将肿瘤中的cd3和cd8密度转化成百分位数，其表示在所有患者中观察到的密度。计算每次活检的cd3和cd8的isb平均百分位数(isb平均得分)。在两个队列之间没有观察到平均得分的差异(数据未显示)。将平均得分转换为isb评分系统后，总体22.7％、52.5％和24.8％的患者分别具有isb低、中和高。值得注意的是，与队列1(43.5％)相比，队列2(61.9％)中的isb中分类更多。
[0287]
基于活检的免疫评分(isb)相关预后价值
[0288]
isb的分布分析没有显示与年龄、性别或肿瘤位置的任何关联(表1)。在两个独立队列中测试isb预后性能的量值和再现性。在队列1(n1＝131)中，观察到按isb分层的患者之
0-1)的预测准确性。32名对nt应答良好的患者中有3名(yctnm＝0-i,n＝32)发生了远处复发，并且未观察到局部复发。重要的是，在isb高患者中没有观察到复发(数据未显示)。因此，isb可以帮助选择可以实现非常有利的结果并且符合观察和等待策略的患者。
[0293]
用观察和等待策略管理患者的isb[0294]
在通过监视和观察和等待策略的一系列患者(n＝73)中，我们检索了初始诊断活检以评价isb和相关临床结果。总体而言，23％、51％和26％分别被分类为isb高、isb中和isb低。isb分层患者的复发时间显著不同(p
[高对低]
＝0.025；数据未显示)。isb高患者随访期间未发现复发证据。根据isb平均得分(数据未显示)，在cox比例风险回归模型下，无复发的5年生存概率范围为46％-89％。在cox多变量分析中，isb与患者的ttr相关，与年龄、肿瘤位置和ctnm分类无关(uicc tnm第8版)(p
[高对低]
＝0.04；数据未显示)。
[0295]
讨论：
[0296]
这项工作强调了(i)通过isb评估的天然肿瘤内免疫的质量(ii)nt后原位免疫反应的强度(iii)nt后肿瘤消退的程度和(iv)在预防肿瘤复发和生存期方面的临床影响之间的联系。从临床角度来看，isb提供了对nt后应答质量和larc患者复发和死亡风险的可靠估计。结合成像，isb可进一步识别具有完全临床应答的患者，其可受益于nt后的密切监测策略，从而避免致残性和无用的直肠截肢手术。
[0297]
isb可在常规诊断活检上进行，无需任何额外的医疗程序。对于is结肠研究，实现了免疫细胞浸润物的严格和标准化的定量(17)。
[0298]
在本研究中，isb与肿瘤对nt的应答呈正面且显著的相关。该观察结果与我们以前的初步结果(18)和使用免疫细胞浸润物的光学半定量评价的研究(19，20，25)一致。在isb低组(22.7％的队列)中，仅5％的患者经历完全应答(低nar得分)，表明nt的优化或修饰(如辅助疗法(26)、免疫疗法(27)或药物重新定位)可为这些患者提供更大的益处以实现更好的应答。我们证明了原位细胞毒性适应性免疫应答和炎症干扰素i型相关分子在nt后产生的体征与对的应答之间的关联。i型ifn通过促进树突细胞的成熟和呈递能力以及它们向淋巴结的迁移而在抗肿瘤免疫中起关键作用(28)。这种免疫状态受到nt之前预先存在的天然免疫应答的质量和强度的影响。isb高不仅有利于nt依赖性肿瘤细胞死亡，而且促进常驻免疫组分的存在，所述常驻免疫组分对于在器官保存策略如观察和等待中避免局部复发可能是必需的。值得注意的是，很少有isb高的患者没有获得良好的应答，强调抗性也由独立的肿瘤内在因素(29)或抑制性微环境的存在(30)的指导。开发nt后临床完全应答的新辅助提高了器官保护策略的可能性，因为直肠的根治性切除导致功能性结果、即刻发病率和甚至死亡率(31)。然而，ncrt(yctnm)后的成像在预测由于分期过度或分期不足引起的病理完全应答方面具有低准确性(32)。重要的是，在isb高的患者的良好应答者中没有观察到复发。此外，isb提高了通过成像评估的非常好的应答者(yptnm 0-1)的准确性预测，并鉴定了用器官保存策略(观察和等待)的患者亚组，其具有非常有利的结果。目前没有生物标志物可用于帮助选择符合监视和观察和等待策略的良好应答者(9)。这些结果可能在选择用于器官保存的潜在候选者中具有重要意义，所述候选者包括对nt具有高isb和完全临床应答的患者，以及目前被分类为不完全应答者的具有延迟的完全临床应答的患者(即“几乎完全应答者”)(33)。
[0299]
本研究存在一些局限性。与预定切割点(即第25和第70百分位数)相关的免疫密度
与所研究队列的临床特征密切相关。用作切割点的密度与手术前接受nt的larc患者相关。此外，对初次活检进行了isb评估；这意味着仅分析一小部分肿瘤(tme后可获得的肿瘤块切割表面的10-15％)，而不分析活检中不存在的侵入性边缘。为了评估isb和is在切除肿瘤中的对应性，我们分析了33例结肠癌活检及其相关切除肿瘤，我们发现这两个样本之间存在部分相关性(数据未显示，kappa＝0.45，p＝0.0004)。所有差异仅在is的2个连续类别之间观察到。尽管该有限的表面分析和没有侵入性边缘，但isb的预后值被保留，表明当手术部分不可用或由于新辅助继发的结构变化而不可能分析时，对初始诊断活检的免疫评价的准确性。此外，对术后样本进行is不允许评估其对nt的应答预测值。此外，由于nt后的深度组织学改变(没有清楚地界定肿瘤及其侵入性边缘)，nt后标本上的is是不可行的。本研究对来自不同国家并在真实临床实践中接受标准护理的患者进行。尽管有样本量和多种类型的患者护理，与isb相关的强且恒定的预后价值突出了测试的稳健性及其可推广性。在我们的研究中不可用的预后参数(如错配修复、kras和braf状态)不包括在使用is评分系统的多变量分析中。然而，msi+病例在直肠癌中是罕见的(《5％)(34)，并且我们最近证明当与结肠癌中的msi、kras和braf状态相关时，is是生存期的独立预后参数(35)。本研究中包括的大多数直肠癌是腺癌。由于所研究队列的多中心特征较大，组织病理学描述水平不均匀，且粘蛋白性癌、印戒细胞癌或肿瘤出芽的明显有效性较小，无法进行组织学亚型的子分析，以足够的效力解决其相对预后影响。本研究强调了初始诊断活检的重要性，通常在私人诊所进行，在某些情况下不易获得。直肠癌患者将受益于私人病理学实践、诊所和教学医院之间的密切合作，以便初步评估其免疫状态(isb)。该材料在不久的将来可能变得必不可少，并且是直肠癌患者的个人医疗档案的一部分，因为它是任何新辅助之前可用的唯一材料。isb可以促进直肠癌的个性化多模式，特别是在基线时具有isb高肿瘤和通过成像具有肿瘤消退体征的患者中。这些患者应从保守策略中获益最大，从而保持其生活质量。
[0300]
总之，我们的结果表明，isb可用于(i)预测nt后的肿瘤应答，(ii)预测nt后局部疾病的再分期，和(iii)预测临床结果。该方法可以促进直肠癌的个性化多模式，特别是在基线时具有isb高肿瘤和通过成像具有肿瘤消退体征的患者中。这些患者应从保守策略中获益最大，从而保持其生活质量。isb还将在更大的观察和等待队列中进行回顾性和前瞻性确认。此类确认计划在使用国际观察等待数据库的国际合作研究和opera正在进行的临床试验(nct 02505750)中进行。
[0301]
表格：
[0302]
[0303][0304][0305]
表4.根据活检适应的免疫评分(isb)结合可用临床参数的无疾病生存的多变量cox模型
[0306][0307]
*用wald检验评价多变量cox回归模型的显著性。
[0308]-不适用
[0309]
is，免疫评分；pha，比例危害假设；hr，风险比
[0310]
参考文献
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贯穿本技术中，各种参考文献描述了本发明所属领域的状态。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开。
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value in patients with colon cancer.j immunother cancer.bmj specialist journals；2020；8:e000272.

技术特征：

1.预测患有实体癌的患者在术前辅助和根治性手术后复发和/或死亡风险的方法，其包括评估至少两个参数的步骤，其中第一参数是术前辅助前测定的免疫应答，并且第二参数是根治性手术后测定的病理应答，并且其中所述参数的组合指示复发和/或死亡的风险。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有原发性癌症或转移性癌症。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有局部晚期癌症。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有局部晚期直肠癌。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述术前辅助疗法由放疗、化疗、靶向疗法、激素疗法、免疫疗法或其组合组成。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述术前辅助由放疗和化疗的组合组成。7.根据权利要求1所述的方法，其中通过定量在术前辅助化疗前从患者获得的活检肿瘤样品中测定的一种或多种免疫标志物来评估免疫应答。8.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫标志物包括cd3+细胞的密度、cd8+细胞的密度、cd45ro+细胞的密度、gzm-b+细胞的密度、cd103+细胞的密度和/或b细胞的密度。9.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫标记物包括cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度、cd3+细胞的密度和cd45ro+细胞的密度、cd3+细胞的密度和gzm-b+细胞的密度、cd8+细胞的密度和cd45ro+细胞的密度、cd8+细胞的密度和gzm-b+细胞的密度；cd45ro+细胞的密度和gzm-b+细胞的密度或cd3+细胞的密度和cd103+细胞的密度。10.根据权利要求9所述的方法，其中在肿瘤活检样品中测定cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度。11.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫标志物包含选自下组的一种或多种基因的表达水平：ccr2、cd3d、cd3e、cd3g、cd8a、cxcl10、cxcl11、gzma、gzmb、gzmk、gzmm、il15、irf1、prf1、stat1、cd69、icos、cxcr3、stat4、ccl2和tbx21。12.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫标志物包含选自下组的一种或多种基因的表达水平：gzmh、ifng、cxcl13、gnly、lag3、itgae、ccl5、cxcl9、pf4、il17a、tslp、ren、ihh、prom1和vegfa。13.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫标志物包含至少一种代表人适应性免疫应答的基因的表达水平和至少一种代表人免疫抑制应答的基因的表达水平。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种代表人适应性免疫应答的基因选自下组：ccl5、ccr2、cd247、cd3e、cd3g、cd8a、cx3cl1、cxcl11、gzma、gzmb、gzmh、gzmk、ifng、il15、irf1、itgae、prf1、stat1和tbx21，并且所述至少一种代表人免疫抑制应答的基因选自下组：cd274、ctla4、ihh、il17a、pdcd1、pf4、prom1、ren、tim-3、tslp和vegfa。15.根据权利要求7所述的方法，其中通过包括以下步骤的评分系统评估所述免疫应答：a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中的一种或多种免疫标志物；b)将在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值的分布进行比较；c)对于在步骤a)获得的针对所述一种或多种免疫标志物的每个值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；
d)计算百分位数的算术平均值或中值。16.根据权利要求15所述的方法，其中通过包括以下步骤的连续评分系统评估免疫应答：a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；d)计算百分位数的算术平均值。17.根据权利要求15所述的方法，其中通过包括以下步骤的非连续评分系统评估免疫应答：a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；d)计算百分位数的算术平均值；和e)将在步骤d)获得的算术平均值与百分位数的预定参考算术平均值进行比较，和f)根据百分位数的算术平均值是否分别低于或高于百分位数的预定参考算术平均值来指定“低”或“高”得分。18.根据权利要求15所述的方法，其中通过包括以下步骤的非连续评分系统评估免疫应答：a)定量从所述患者获得的肿瘤活检样品中cd3+细胞的密度和cd8+细胞的密度；b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者的参照组获得的值的分布进行比较；c)对于在步骤a)获得的每个密度值，测定在步骤a)获得的值所对应的分布的百分位数；d)计算百分位数的算术平均值；和e)将在步骤d)获得的百分位数的算术平均值与2个百分位数的预定参考算术平均值进行比较，和f)根据算术平均值指定“低”、“中”或“高”得分：－低于最低预定参考百分位数的算术平均值(“低”)－在2个百分位数的预定参考算术平均值之间(“中”)－高于最高预定参考百分位数的算术平均值(“高”)。19.根据权利要求1所述的方法，其中通过评估ctdna的水平来测定所述临床应答。20.根据权利要求1所述的方法，其中通过解剖病理学来评估所述临床应答。21.根据权利要求1所述的方法，其中通过对从患者获得的肿瘤组织样品进行宏观、微观、生物化学、免疫学和分子检查来评估病理应答。22.根据权利要求1所述的方法，其中通过组织学和/或组织病理学评估病理应答。23.根据权利要求1所述的方法，其中通过yptnm评分系统评估病理应答。24.根据权利要求1所述的方法，其中通过肿瘤消退分级系统评估病理应答。
25.根据权利要求1所述的方法，其中通过yptnm评分系统联合肿瘤消退分级系统评估病理应答。26.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：a)评估至少两个参数，其中第一参数是在术前辅助前测定的免疫，并且第二参数是术前辅助后测定的临床应答，b)对包括或由步骤a)评估的参数组成的数据实施算法以获得算法输出，所述实施步骤是计算机实施的；和c)从步骤b)获得的算法输出测定复发和/或死亡的风险。27.根据权利要求1所述的方法，其中当病理应答为yptnm＝ii-iv(例如yptnm＝ii)时，免疫评分(例如百分位数的算术平均值或中值)越低，复发和/或死亡的风险越高，并且患者的生存时间(例如无疾病生存时间)越短，因此患者符合术后辅助的条件。28.根据权利要求1所述的方法，其中当确定病理应答为yptnm＝ii-iv(例如yptnm＝ii)，并且免疫评分被分类为“低”(例如百分位数的算术平均值或中值被分类为“低”)时，推断患者符合术后辅助的条件。

技术总结

本发明人在局部晚期直肠癌中评估了诊断性活检适应的免疫评分(IS

技术研发人员：

B

受保护的技术使用者：

巴黎公共救济院 索邦大学 巴黎西岱大学

技术研发日：

2021.06.28

技术公布日：

2023/3/24