一种艾纳香药材质量检测方法与流程

1.本发明涉及一种中药质量检测方法，特别是一种艾纳香药材质量检测方法。

背景技术：

2.艾纳香(学名：blumeabalsamifera(l.)dc.)是菊科艾纳香属多年生草本或亚灌木植物。茎粗壮，直立，高1-3米；下部叶宽椭圆形或长圆状披针形，具柄，柄两侧有3-5对狭线形的附属物；上部叶长圆状披针形或卵状披针形，无柄或有短柄，柄的两侧常有1-3对狭线形的附属物；头状花序多数，总苞钟形，花托蜂窝状，径2-3毫米，无毛，花黄，雌花多数，花冠细管状，两性花较少数，花冠管状；瘦果圆柱形，被密柔毛，冠毛红褐，糙毛状。
3.艾纳香全草入药，有祛风除湿等功效，在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着悠久的用药历史，是一种重要的民间药物，其提取物注射于动物可引起血压下降，血管扩张，抑制交感神经系统，可用于兴奋、失眠或高血压患者。艾纳香，也是一种芳香植物，由艾纳香产生的艾油，具有独特的芳香气味，被广泛应用于香料以及化妆品行业。
4.与“艾纳香”有关的原药材质量标准收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版：艾纳香)、《广西中药材标准
·
第二册》(滇桂艾纳香)、《湖南省中药材标准》(2009年版：滇桂艾纳香)、《广东省中药材标准》(2011年版：艾纳香)。但是目前的各个标准中仅有有【性状】、【鉴别】(粉末、根横切面、对照药材薄层、理化鉴别)、【检查】(水分、总灰分)项等的规定，并没有其质量的准确鉴别。而在中药材市场，千里光和大叶紫珠与艾纳香属植物的植株性状极其相似，但功效完全不同，容易混淆。因此研发建立一种艾纳香的质量检测方法对控制艾纳香药材的整体质量和保证艾纳香药材的临床用药的安全有效性具有重要意义。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种艾纳香药材质量检测方法。本发明具有准确鉴别艾纳香药材真伪的特点。
6.本发明的技术方案：一种艾纳香药材质量检测方法，包括采用薄层谱鉴别艾纳香药材，主要为：取艾纳香药材的供试品溶液和对照品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为11:1:3的石油醚-乙酸乙酯-氯仿为展开剂，喷以质量含量为5％的磷钼酸试液，加热至斑点显清晰。
7.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，供试品溶液的制备方法为：取艾纳香药材，按照料液比为1:20～40ml乙酸乙酯溶液超声提取15～60min，离心，取上清液作为供试品溶液；对照品溶液的制备方法为：取龙脑对照品加甲醇制成每1ml含龙脑0.3～0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
8.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，供试品溶液的制备方法为：取艾纳香药材1g，加20ml乙酸乙酯溶液超声提取30分钟，离心，取上清液作为供试品溶液；对照品溶液的制备方法为：取龙脑对照品加甲醇制成每1ml含龙脑0.3mg的溶液，作为对照品溶液。
9.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，供试品溶液和对照品溶液各取8μl；供试品溶液的薄层谱，与对照品溶液的薄层谱相应的位置上，显与照品溶液的薄层谱相同颜的斑点。
10.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，质量检测方法还包括采用高效液相谱法测定艾纳香药材圣草酚的含量，包括以下步骤：
11.1)制备对照品溶液：称取圣草酚对照品，制成每1ml含圣草酚1～1.1mg的溶液，为对照品溶液；
12.2)制备供试品溶液：称取艾纳香药材，按照料液比为1:30～70加入浓度为70％的乙醇，称重，超声处理30～60min，冷却至室温，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
13.3)分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相谱仪，测定圣草酚的含量。
14.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，艾纳香药材中圣草酚的含量测定方法，包括以下步骤：
15.1)制备对照品溶液：称取圣草酚对照品，制成每1ml含圣草酚1.003mg的溶液，为对照品溶液；
16.2)制备供试品溶液：称取艾纳香药材0.5g，加入浓度为70％的乙醇25ml，称重，超声处理30min，冷却至室温，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
17.3)分别取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，测定。
18.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，液相谱仪的谱条件为：谱柱为c18柱，检测波长为287nm，流速为1ml/min；柱温为35℃；流动相为乙腈与质量含量为浓度为0.1％的乙酸水等度洗脱。
19.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，流动相中，乙腈与浓度为0.1％的乙酸水的体积比为22:78。
20.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，步骤2)中的超声处理中，功率为300w，频率为40khz。
21.前述的一种艾纳香药材质量检测方法中，艾纳香药材按干燥品计算，含圣草酚不得少于0.10％。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.本发明通过特定的薄层谱鉴别方法能够对艾纳香药材的真伪进行准确鉴别，灵敏度高、专属性强，分离效果好，简便可行，重现性强，有效地将艾纳香药材与其伪品、混淆品千里光和大叶紫珠区分开来，避免发生误用现象，提高药材使用安全性；
24.本发明还通过特定的高效液相谱法，能够准确、快速地测定出艾纳香药材中圣草酚的含量，为艾纳香药材提供有效的定性定量分析手段，从而有利于对艾纳香药材的质量进行控制，有效地控制艾纳香药材的整体质量、保证艾纳香药材临床用药的安全有效性。
25.本发明提供的艾纳香药材的质量检测方法，有助于弥补《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版：艾纳香)、《广西中药材标准
·
第二册》(滇桂艾纳香)、《湖南省中药材标准》(2009年版：滇桂艾纳香)、《广东省中药材标准》(2011年版：艾纳香)中质量检测方法的不足，实用性强。本发明方法对于艾纳香药材的进一步质量控制具有重要的意义，可为艾
纳香药材质量表混的制定提供科学依据。
附图说明
26.图1是本发明不同供试品液制备方法的薄层谱图；
27.图2是不同供试品制备溶媒的薄层谱考察图；
28.图3是不同超声提取时间的薄层谱考察图；
29.图4是供试品溶液点样量的薄层谱考察图；
30.图5是龙脑对照品和11种不同药材的薄层谱图；
31.图6是圣草酚紫外吸收图；
32.图7是流动相液相谱图；
33.图8是圣草酚标准品液相谱图；
34.图9是样品液相谱图；
35.图10是圣草酚线性关系图。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
37.实施例：
38.选用仪器为：
39.日本岛津lc-20adxr高效液相谱仪，spd-20a紫外检测器，岛津lc-solution工作站；milliporesimplicity超纯水器(默克密理博)；auw220d型电子分析天平(上海天平仪器厂)；ab135—s十万分之一天平(mettlertoledo)；谱柱：cosmosilc18(5μm，4.6mm
×
250mm)；kq250db型数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司)；kq5200型水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)；dhg－9140a电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；8－10型箱式电阻炉(中国沈阳市节能电炉厂制造)；sony717数码相机(日本索尼公司)。
40.试剂与试药
41.1.对照品
42.圣草酚(含量大于98％，批号s-076-150122，购于成都瑞芬思生物科技有限司)；龙脑(中国食品药品检定研究院，批号110881-201508)。
43.2.试剂
44.乙腈(谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)；甲醇(分析纯，上海振兴化工一厂)；甲酸(分析纯，上海振兴化工一厂)；甲醇(谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂)。
45.3.药材
46.实验所用药材由贵州百灵药业提供，经江西中医药大学民族药与中药种质资源中心钟国跃教授鉴定为菊科植物艾纳香blumeabalsamifera(l.)dc.(具体见表1)。
47.表1艾纳香药材批次
[0048][0049]
艾纳香叶含有黄酮类成分：槲皮素，(2r,3r)-二氢槲皮素-4
′‑
甲基醚，(2r,3r)-二氢槲皮素-4
′
,7-二甲基醚，(2r,3r)-7,5
′‑
二甲氧基-3,5,2
′‑
三羟基黄烷酮，(2r,3r)-5
′‑
甲基-3,5,7,2
′‑
四羟基黄烷酮，圣草酚，艾纳香素，金丝桃苷等；挥发油：l-龙脑，龙脑，异龙脑，樟脑，柳杉二醇，艾纳香内酯a、b、c等。
[0050]
鉴于龙脑为艾纳香的主要成分之一，故增加了以龙脑为对照品的薄层鉴别。同时在标准的实际应用中“对照药材”不易获得，取消了对照药材的薄层鉴别。
[0051]
一种艾纳香药材质量检测方法，包括采用薄层谱鉴别艾纳香药材，以及采用高效液相谱法测定艾纳香药材圣草酚的含量。
[0052]
其中，按照薄层谱法(通则0502)对艾纳香药材的鉴别方法为：
[0053]
1)取艾纳香药材粉末1g置于锥形瓶中，加20ml乙酸乙酯溶液超声提取30分钟，离心，取上清液作为艾纳香药材的供试品溶液；取20mg龙脑对照品加甲醇制成每1ml含龙脑0.3mg的溶液，作为对照品溶液；
[0054]
2)取艾纳香药材的供试品溶液和对照品溶液各8μl，点于同一硅胶gf
254
薄层板(50
×
100mm)上，以体积比为11:1:3的石油醚-乙酸乙酯-氯仿为展开剂，上行展开8cm，取出，晾干，喷以质量含量为5％的磷钼酸试液显，在80℃烘箱加热至斑点显清晰，在日光下观察。供试品溶液的薄层谱中，与对照品溶液的薄层谱相应的位置上，显与照品溶液的薄层谱相同颜的斑点。
[0055]
一、对艾纳香药材的鉴别方法进行考察
[0056]
1.1提取方法考察：
[0057]
在实验过程中，分别比较了乙酸乙酯超声30分钟、乙酸乙酯回流1.5小时和乙酸乙酯冷浸过夜三种提取方法，结果如图1所示。结果表明，不同的提取方法无显著差别。考虑到节能节时，选择超声提取法。
[0058]
1.2溶媒考察：
[0059]
采用超声提取法，对提取溶媒进行考察，选择甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇三种溶媒进行提取，提取结果如图2所示。结果表明，甲醇溶液超声提取30分钟效果最佳。
[0060]
1.3提取时间考察：
[0061]
采用超声提取法，对提取时间进行考察，取三份均为1g的药材置于锥形瓶中，加入20ml甲醇，分别超声15分钟，30分钟，1小时后，过滤待用；提取结果如图3所示。结果表明甲醇溶液超声提取30分钟效果最佳。
[0062]
1.4点样量考察：
[0063]
照薄层谱法试验，取上述对照品溶液龙脑，超声30分钟的供试品溶液2μl、4μl、8μl、10μl，分别点于同一块薄层谱板上，进行考察，结果如图4所述。供试品溶液8μl时，斑点最清晰，因此，最终选择点样量为8μl。
[0064]
1.5不同批次药材的薄层谱图：
[0065]
按照上述确定的方法，对不同批次的艾纳香药材进行试验，结果见图5。
[0066]
原标准中无艾纳香药材含量测定规定。艾纳香中主要含有黄酮类、挥发油等成分。研究表明，艾纳香中所含黄酮具有显著的抗氧化作用，是其保护急性肝损伤的作用机制之一，且含有自由羟基的黄酮类化合物的抗氧化活性大于甲基化化合物，其中圣草酚是其抗氧化活性成分之一。经对艾纳香的化学成分的研究，其黄酮类成分中圣草酚的含量较高；同时艾纳香作为药材与“艾片”不同，且在【鉴别】项中将龙脑作为薄层鉴别的对照品，故在含量测定中选择以圣草酚(c
15h12
o6)作为指标性成分，进行含量测定研究，建立含量测定方法。
[0067][0068]
本发明按照高效液相谱法(《中国药典》2015版第四部通则0512)对艾纳香药材圣草酚的含量进行测定，测定方法为：
[0069]
1)制备对照品溶液：称取圣草酚对照品，制成每1ml含圣草酚1.003mg的溶液，为对照品溶液；
[0070]
2)制备供试品溶液：称取艾纳香药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入浓度为70％的乙醇25ml，称重，超声处理30min，超声功率为300w，超声频率为40khz；冷却至室温，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
[0071]
3)分别取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，测定。
[0072]
艾纳香药材按干燥品计算，含圣草酚不得少于0.10％。
[0073]
其中，高效液相谱法的谱柱为cosmosilc18柱(5μm，4.6
×
250mm)，检测波长为287nm，流速为1ml/min；柱温为35℃；流动相为乙腈与浓度为0.1％的乙酸水等度洗脱，流动相中，乙腈与浓度为0.1％的乙酸水的体积比为22:78。
[0074]
二、对艾纳香药材圣草酚的含量测定方法进行考察：
[0075]
2.1检测波长考察：
[0076]
采用上述方法，利用高效液相谱仪中二极管阵列检测器的波长扫描功能，进行波长扫描，得到圣草酚对照品的紫外吸收光谱(如图6所示)。从图6中可知，圣草酚在287nm处有最大吸收，因此，选择287nm作为检测波长。
[0077]
2.2提取溶剂考察：
[0078]
分别称取三份艾纳香药材粉末，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、乙醇、水三种不同溶剂25ml，称重，超声处理30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述相条件进样，分析，结果见表1。
[0079]
表1艾纳香药材提取溶剂考察结果
[0080][0081][0082]
对上述三种溶剂的考察结果表明，采用甲醇和乙醇的提取效率相近，而以水为溶剂不能提出圣草酚。故继续分别考察不同浓度甲醇、乙醇以确定提取溶剂。
[0083]
2.3乙醇、甲醇不同浓度考察：
[0084]
分别称取四份艾纳香药材粉末，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入质量含量为90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇25ml，称重，超声处理30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述谱条件进样，分析，结果见表2。
[0085]
表2不同浓度乙醇考察结果
[0086][0087]
分别称取四份艾纳香药材粉末，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入90％甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇25ml，称重，超声处理30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述谱条件进样，分析，结果见表3。
[0088]
表3不同浓度甲醇考察结果
[0089][0090]
对不同浓度甲醇、乙醇的提取效果考察结果表明，70％乙醇和70％甲醇对圣草酚的提取效率相近，综合考虑选择以70％乙醇为提取溶剂。
[0091]
2.4不同提取方法考察：
[0092]
分别称取三份艾纳香药材粉末，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入70％乙醇25ml，称重，考察回流30min、超声30min、冷浸1h三种提取方式，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述谱条件进样，测定。结果见表4。
[0093]
表4不同提取方式考察结果
[0094][0095]
从三种提取方式结果可见，回流提取与超声提取圣草酚的含量相近，从超声提取操作简易节能的角度考虑，选择超声提取法。
[0096]
2.5提取时间考察：
[0097]
分别称取三份艾纳香药材粉末，每份0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入70％甲醇25ml，称重，分别超声15、30、60min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述谱条件进样，测定。结果见表5。
[0098]
表5提取时间考察结果
[0099][0100]
上表显示，超声提取30min和60min的提取效率相近，确定超声提取时间为30min。
[0101]
2.6溶剂用量考察
[0102]
分别称取三份艾纳香药材粉末，每份0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入70％乙醇15、25、35ml，称重，分别超声30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述谱条件进样，测定。结果见表6。
[0103]
表6溶剂用量考察结果
[0104][0105][0106]
结果表明：使用25ml溶剂即可将大部分成分提取出来，考虑节约成本，故确定溶剂用量为25ml。
[0107]
综合上述方法学考察结果，确定供试品溶液制备方法为：精密称取艾纳香药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入浓度为70％的乙醇25ml，称重，超声处理30min，超声功率为300w，超声频率为40khz；冷却，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
[0108]
三、方法学验证：
[0109]
3.1系统适应性：
[0110]
采用高效液相谱法进行测定，其中流动相的液相谱图见图7，圣草酚标准品的液相谱图见图8，艾纳香药材样品的液相谱图见图9，表明乙腈-0.1％乙酸水溶液(体积比为22:78)分离良好。
[0111]
3.2线性关系考察：
[0112]
精密取圣草酚对照品溶液的不同浓度稀释液6份，分别进样10μl测定，以峰面积(y)为纵坐标，进样对照品浓度(x)为横坐标进行线性回归，得圣草酚的线性回归方程为：y＝36.694x+44967，r2＝0.9994。结果见表7和图10。
[0113]
表7线性关系考察结果
[0114][0115]
结果表明，圣草酚在1.5875～250ug
·
ml-1浓度范围内，与峰面积呈良好线性关系。
[0116]
3.3精密度试验
[0117]
取同一份圣草酚对照品溶液，连续进样六次，计算其rsd值，结果见表8。
[0118]
表8精密度试验结果
[0119][0120]
3.4重复性试验
[0121]
按上述确定的供试品溶液制备方法，平行制备6份艾纳香药材供试品溶液进行测定，计算其rsd值，结果见表9。
[0122]
表9重复性试验结果
[0123][0124]
结果表明，平行制备6份艾纳香药材供试品溶液进行测定，圣草酚rsd值为1.032％，说明该法重复性良好。
[0125]
3.5溶液稳定性试验
[0126]
取同一份艾纳香药材供试品溶液，分别在0、3、6、9、12h后进行测定，记录峰面积，计算rsd值，结果见表10。
[0127]
表10溶液稳定性试验结果
[0128][0129][0130]
结果表明，同一份艾纳香药材供试品溶液分别于0、3、6、9、12h各取10μl进行测定，圣草酚峰面积rsd值为0.408％，说明该方法下溶液稳定性良好。
[0131]
3.6加样回收率
[0132]
精密称取已知含量的同一批次艾纳香样品，共6份，精密加入圣草酚适量，按供试品项下方法进行测定，结果见表11。
[0133]
表11加样回收率试验结果(n＝6)
[0134][0135]
结果表明，同一批次艾纳香中圣草酚的回收率为100.35％(rsd＝0.48％)，表明所建方法回收率良好。
[0136]
3.7样品含量测定
[0137]
取10批次艾纳香药材各0.5g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，各取10μl进样，记录峰面积，以回归方程计算各成分的质量分数，结果见表12。
[0138]
表1210批艾纳香含量测定结果(mg/g)
[0139][0140][0141]
实验结果显示，艾纳香药材测定含量范围在0.10％～0.18％，平均为0.13％，取均值下浮20％，为0.10％，10批样品均合格，故确定圣草酚含量限量为不得少于0.10％。

技术特征：

1.一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：包括采用薄层谱鉴别艾纳香药材，主要为：取艾纳香药材的供试品溶液和对照品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为11:1:3的石油醚-乙酸乙酯-氯仿为展开剂，喷以质量含量为5％的磷钼酸试液，加热至斑点显清晰。2.根据权利要求1所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：供试品溶液的制备方法为：取艾纳香药材，按照料液比为1:20～40ml乙酸乙酯溶液超声提取15～60min，离心，取上清液作为供试品溶液；对照品溶液的制备方法为：取龙脑对照品加甲醇制成每1ml含龙脑0.3～0.5mg的溶液，作为对照品溶液。3.根据权利要求2所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：供试品溶液的制备方法为：取艾纳香药材1g，加20ml乙酸乙酯溶液超声提取30min，离心，取上清液作为供试品溶液；对照品溶液的制备方法为：取龙脑对照品加甲醇制成每1ml含龙脑0.3mg的溶液，作为对照品溶液。4.根据权利要求1所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：供试品溶液和对照品溶液各取8μl；供试品溶液的薄层谱，与对照品溶液的薄层谱相应的位置上，显与照品溶液的薄层谱相同颜的斑点。5.根据权利要求1所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：质量检测方法还包括采用高效液相谱法测定艾纳香药材圣草酚的含量，包括以下步骤：1)制备对照品溶液：称取圣草酚对照品，制成每1ml含圣草酚1～1.1mg的溶液，为对照品溶液；2)制备供试品溶液：称取艾纳香药材，按照料液比为1:30～70加入浓度为70％的乙醇，称重，超声处理30～60min，冷却至室温，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液；3)分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相谱仪，测定圣草酚的含量。6.根据权利要求5所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：艾纳香药材中圣草酚的含量测定方法，包括以下步骤：1)制备对照品溶液：称取圣草酚对照品，制成每1ml含圣草酚1.003mg的溶液，为对照品溶液；2)制备供试品溶液：称取艾纳香药材0.5g，加入浓度为70％的乙醇25ml，称重，超声处理30min，冷却至室温，再用浓度为70％的乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，得供试品溶液；3)分别取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，测定圣草酚的含量。7.根据权利要求5或6所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：液相谱仪的谱条件为：谱柱为c18柱，检测波长为287nm，流速为1ml/min；柱温为35℃；流动相为乙腈与浓度为0.1％的乙酸水等度洗脱。8.根据权利要求7所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：流动相中，乙腈与浓度为0.1％的乙酸水的体积比为22:78。9.根据权利要求5或6所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：步骤2)中的超声处理中，功率为300w，频率为40khz。10.根据权利要求5或6所述的一种艾纳香药材质量检测方法，其特征在于：艾纳香药材
按干燥品计算，含圣草酚不得少于0.10％。

技术总结

本发明公开了一种艾纳香药材质量检测方法，包括采用薄层谱鉴别艾纳香药材，主要为：取艾纳香药材的供试品溶液和对照品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为11:1:3的石油醚-乙酸乙酯-氯仿为展开剂，喷以质量含量为5％的磷钼酸试液，加热至斑点显清晰。本发明具有准确鉴别艾纳香药材的真伪特点。具有准确鉴别艾纳香药材的真伪特点。具有准确鉴别艾纳香药材的真伪特点。