铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法与流程

1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法。

背景技术：

2.铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，其对外界各种环境及灭活措施抵抗力较强，尤其在潮湿的环境中可长期生存。在土壤、水、空气、人和动物的皮肤、粘膜、肠道及上呼吸道等多处都有该菌存在，其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力低下的病人中，如大面积烧伤、长期使用免疫抑制剂、肿瘤、低蛋白血症患者等。铜绿假单胞菌引起的感染可发生在人体任何部位，临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，包括中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等。据近年的调查报告，医院院内感染中30％以上都是由铜绿假单胞菌引起的。目前对于铜绿假单胞菌引起的感染主要靠药物，因此近年来抗生素的滥用导致大量耐药菌株的产生进而加剧了铜绿假单胞菌对患者的威胁。目前已经研究成熟的铜绿假单胞菌对抗生素的耐药机制包括以下几方面：
①
细菌外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位；
②
铜绿假单胞菌细胞通过主动外排过程，可将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外；
③
改变抗生素的作用靶点青霉素结合蛋白(pbps)的数量或结构，以降低药物与pbps的亲和力，从而产生固有耐药；
④
质粒或染体介导的β-内酰胺酶使抗生素失活。所以目前铜绿假单胞菌的感染已经到了无抗生素可用的阶段，通过免疫方式预防及控制铜绿假单胞菌感染已是大势所趋。
3.疫苗是一种能刺激机体免疫系统，活化t和b淋巴细胞产生特异性针对靶抗原(病毒、细菌等)的抗体或者免疫细胞的物质。目前全世界研究的铜绿假单胞菌疫苗制备方式已经涉及多个技术层面，如热或者甲醛处理的死菌疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、单一组分(菌毛、鞭毛、外膜蛋白opri/oprf等)疫苗等。在基础实验中，单一组分疫苗得了较好的预防效果，但由于抗原成分单一，只能针对单一的疾病(如肺炎等)的感染。灭活(热、甲醛等)或者减毒(基因突变)的全菌体疫苗抗病谱相对扩大，但由于制备过程某些未知抗原成分的灭活，细菌代谢活性降低，造成免疫原性及预防效果较差，且由于灭活不彻底，造成疫苗残留毒性较大。关于全菌体疫苗的研发已经在众多种属细菌(志贺菌，淋球菌，脑膜炎双球菌等)中实施，但这些疫苗绝大多数都已失败告终，因此制成有效的全菌体疫苗非常困难。此外，目前的铜绿假单胞菌全菌体疫苗的制备工艺仍以传统的甲醛灭活为主，甲醛已被who列为一类致癌物质，同时甲醛过敏体质不宜使用，急需采用新的灭活方法。
4.而现有技术公开的生产全菌体铜绿假单胞菌疫苗的方法仅适用于小批量生产，并不适用于大批量、工业化生产。基于此，本发明提供了一种工业化生产多组分和全菌体铜绿假单胞菌疫苗的方法，可以缓解现有问题中的一种或多种。

技术实现要素：

5.本发明提供一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，以及使用该方法制备得到
的铜绿假单胞菌疫苗，具体技术方案如下。
6.一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，包括如下步骤：
7.s1用适宜的培养基培养铜绿假单胞菌生产用菌株，制成种子液；培养基宜选用不含动物源成分的培养基，而不限于本发明实施例中所涉及的培养基。
8.s2将所述种子液按照发酵体积的2％～10％接种至发酵罐中进行发酵，其中发酵温度为30～40℃，ph值为5～9，转速为100～400rpm，通气量为2～5l/min，溶氧为10％～30％，发酵时间为3～8h；
9.s3监测所述发酵罐内的菌体密度，待所述发酵罐内的菌体密度达标后，取所述发酵罐内的菌液直接按照离心力3000～8000
×
g进行离心，10～30min后收集菌体；
10.s4将所述菌体用等渗注射液重悬并调整浓度，然后进行射线辐照使所述菌体失去增殖活性，所述射线辐照的射线包括x射线、γ射线和同位素放射源co
60
产生的射线中的一种或多种，所述等渗注射液包括生理盐水等溶液；
11.s5取所述射线辐照后的菌液进行检查，所述菌液含有全菌体和菌内免疫原性成分，所述全菌体的占比大于80％为合格；
12.s6将所述步骤s5中检查合格的所述菌液再用所述等渗注射液重悬并调整浓度到1.0
×
107～3.0
×
107个/ml，制得一种铜绿假单胞菌疫苗。
13.进一步，所述发酵罐内的菌体密度的吸光值达到1～3od为达标。
14.进一步，所述菌内免疫原性成分包括膜囊泡、核酸和菌体碎片。
15.进一步，所述步骤s4后进一步包括检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的步骤，所述检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的方法包括分光光度计法、密度梯度离心法、扫描电镜和透射电镜中的一种或多种。
16.进一步，所述射线辐照的基本灭活剂量不得低于1000gy，所述射线辐照的总剂量大于所述射线辐照的基本灭活剂量。
17.进一步，所述射线辐照的方式为低剂量率，长时间，持续照射；所述剂量率优选为5～15gy/min，所述持续照射的时间优选为大于2h。
18.进一步，确定所述射线辐照的灭活时间或灭活剂量的步骤包括：
19.a)确定装载辐照样品的容器的材质和形状，所述材质为医用级塑料材质，所述医用级塑料材质包括但不限于聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)等，所述形状优选为柱状、桶装或袋状；
20.b)确定灭活的最大装量；
21.c)确定菌液浓度：根据产量设计确定每批次灭活的总菌体量，再根据装量要求，选择合适的所述菌液浓度，所述菌液浓度的计算公式为：其中n表示菌液浓度，a表示产量人份，b表示每人份菌体剂量，v表示菌液总体积，v≤最大装量；
22.d)选择剂量率：设计不同剂量率组别，根据所述步骤a)～步骤c)进行所述最大装量的灭活，持续辐照时间设置为不低于2h，具体的，可设置为2h或大于等于2h的任意时间；
23.e)杀菌曲线的测定：根据步骤d)确定的所述剂量率和所述辐照时间，进行多批次辐照，并对中间时间点或延长时间点进行活菌计数，或者，对中间辐照剂量点或延长辐照剂
量点进行活菌计数，测定所述杀菌曲线；
24.6)确定灭活时间或灭活剂量：根据所述杀菌曲线，取相邻的第一时间点、第二时间点、第三时间点或者取相邻的第一辐照剂量点、第二辐照剂量点、第三辐照剂量点进行活菌计数，所述时间点间隔不小于20min，所述辐照剂量点间隔不小于200gy，计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述第二时间点为灭活时间，所述第二辐照剂量点为灭活剂量。
25.进一步优化，初步确定灭活时间或灭活剂量后，进一步优化的关键参数包括剂量率、辐照时间、装量、菌浓度等，还可以包括灭活剂量；上述参数均可进行适宜范围内的调整，以期适应工业化生产。
26.进一步，确定所述灭活时间或所述灭活剂量后进一步包括进行灭活验证，所述灭活验证包括灭活后无菌检查和稳定性考察；所述稳定性考察包括在25℃或37℃条件下的加速考察和2～8℃条件下的实时考察，该步骤的目的是确保疫苗不会在长时间放置过程中有本菌增殖。
27.进一步，进行工业化生产验证，选择合适的工业化生产参数后，应进行多批次的生产验证，以确保每批次均能达到细菌完全灭活。
28.由本发明提供的工业化生产方法制得的铜绿假单胞菌疫苗，所述疫苗的剂型优选为注射剂和/或冻干粉剂，所述疫苗的接种方式可选地包括皮下注射、肌肉注射、皮上划痕接种、鼻腔给药和口服给药中的一种或多种。所述疫苗是一种全菌体疫苗，也可以是一种多组分疫苗，既包含全菌体，也包含膜囊泡、核酸和菌体碎片等菌内免疫原性成分。
29.本发明制备得到的铜绿假单胞菌疫苗在制备预防铜绿假单胞菌引起的感染性疾病药物中的用途，所述感染性疾病通常可以包括铜绿假单胞菌肺炎、慢性阻塞性肺病合并铜绿假单胞菌感染、烧伤合并铜绿假单胞菌感染、铜绿假单胞菌感染角膜炎等。
30.名词解释
31.本发明所述的“基本灭活剂量”指的是使菌体基本上能被灭活的剂量，该剂量的下限为1000gy。
32.本发明所述的“总剂量”指的是辐照过程中随着时间累积的总辐照剂量。
33.本发明所述的“灭活剂量”指的是使被灭活的菌液(也可以理解为“灭活原液”)中所有菌体刚好被灭活的辐照剂量(也可以理解为“最优灭活剂量”)，“刚好被灭活”指的是被灭活的菌液中菌体刚好全部达到不可逆的死亡。在本发明一些实施例中，根据绘制的杀菌曲线，取相邻3个辐照剂量点进行活菌计数且计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述相邻3个辐照剂量点中处于中间的辐照剂量点为灭活剂量，其中所述辐照计量点之间的间隔相同且不小于200gy；进一步地，例如，当剂量处于“灭活剂量-200gy”条件时，灭活原液含有活菌数小于100cfu/ml；当剂量为灭活剂量时，灭活原液所含有活菌数为0cfu/ml；当剂量处于“灭活剂量+200gy”条件时，灭活原液含有活菌数为0cfu/ml。同理，在本发明一些实施例中，根据绘制的杀菌曲线，取相邻3个时间点进行活菌计数且计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述相邻3个时间点中处于中间的时间点为灭活时间，其中所述时间点之间的间隔相同且不小于20min；进一步地，例如，当时间处于“灭活时间-20min”条件时，灭活原液所含有活菌数小于100cfu/ml；当时间为灭活时间时，灭活原液所含有活菌数为0cfu/ml；当时间处于“灭活时间+20min”条件时，灭活原液所含有活菌
数为0cfu/ml。
34.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
35.(1)本发明提供了一种工业化生产铜绿假单胞菌疫苗的方法，即采用一系列标准化、程序化、数字化的设定，来工业化生产出一种质量稳定的含有铜绿假单胞菌全菌体和菌内多种免疫原性成分的疫苗。具体而言，本发明将菌体密度达标的菌液直接离心，省掉了反复离心洗涤的纯化步骤，提高了工业化生产效率的同时，避免了因大批量、工业级生产过程中的反复离心洗涤而造成的菌体破裂。菌体在破裂后会释放更多如内毒素的有害物质，因此在工业级生产过程中，反复离心洗涤反而会增加制得的疫苗的安全风险；反复离心洗涤造成的大量菌体破裂，会使全菌体数量降低并产生更多的菌体碎片，这些菌体碎片却又会通过离心洗涤而去除。此外，反复离心洗涤的纯化步骤还会将本发明制备的疫苗的免疫原性成分中的膜囊泡和核酸去除，最终导致工业化生产出的疫苗的质量不稳定且免疫原性成分的种类和数量降低。基于此，本发明提供的工业化生产方法中的直接离心，避免了因纯化步骤造成的上述风险，提高了疫苗的有效性和安全性。
36.(2)本发明优化了射线辐照的辐照方式，即采用低剂量率(5～15gy/min)、长时间、持续照射(大于2h)，降低了射线辐照的总剂量(≤2000gy)，从而避免了大剂量射线对菌体的破坏，提高了疫苗的免疫效力和安全性。
37.(3)本发明制得的疫苗具备良好的免疫原性，不仅实际接种量低，而且可以预防多种铜绿假单胞菌引起的感染性疾病，例如铜绿假单胞菌肺炎、慢性阻塞性肺病合并铜绿假单胞菌感染、烧伤合并铜绿假单胞菌感染、铜绿假单胞菌感染角膜炎等。且本发明制得的疫苗通常可以不含佐剂(即无需佐剂来增强机体的免疫应答)，当然在某些场景下(例如，需要制得免疫原性极强的铜绿假单胞菌疫苗)也可以搭配佐剂。上述良好的免疫原性(疫苗的保护效力)的实现不仅得益于如上所述的制备方法中的优化，还在于对疫苗的实际免疫程序的优化：降低接种总次数的同时，延长免疫间隔。本发明发现，这种优化的免疫程序有利于提高疫苗的实际效力，且延长免疫间隔更符合机体对疫苗的免疫应答规律。
38.(4)本发明技术方案采用物理方法(即射线)进行灭活，与传统的化学方法(例如，采用甲醛作为化学灭活剂)相比，无化学物质(化学灭活剂)残留，在一定程度上避免了化学灭活剂造成的过敏反应和致癌风险，提高了疫苗的安全性并降低了副作用。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
40.图1示出了本发明提供的方法制得的疫苗在小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型中的保护作用；
41.图2示出了本发明提供的方法制得的疫苗在copd合并铜绿假单胞菌感染模型中的保护作用；
42.图3示出了本发明提供的方法制得的疫苗在小鼠烧伤模型中的保护作用；
43.图4示出了本发明提供的方法制得的疫苗在小鼠眼角膜感染模型中的保护作用；
44.图5示出了杀菌曲线的示意图。
具体实施方式
45.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
47.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
48.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
49.实施例一：铜绿假单胞菌疫苗的制备方法
50.s1用适宜的培养基培养铜绿假单胞菌生产用菌株，制成种子液，其中培养基宜选用不含动物源成分的培养基，例如，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soy broth,tsb)。
51.s2将所述种子液按照发酵体积的2％～10％接种至发酵罐中进行发酵，其中发酵温度为30～40℃，ph值为5～9(优选为7)，转速为100～400rpm，通气量为2～5l/min，溶氧为10％～30％，发酵时间为3～8h。
52.s3监测发酵罐内的菌体密度，待发酵罐内的菌体密度达标(即菌体密度吸光值达到1～3od)后，取发酵后的菌液直接按照离心力3000～8000
×
g进行离心，10～30min后收集菌体。
53.s4将菌体用等渗注射液重悬并调整浓度，然后进行射线辐照使菌体失去增殖活性，所述射线辐照的射线包括x射线、γ射线和同位素放射源co
60
产生的射线中的一种或多种，所述等渗注射液包括生理盐水等溶液。辐照后还可以进行检定菌液成分和含量的步骤，可采用分光光度计法、密度梯度离心法、扫描电镜和透射电镜中的一种或多种方法来检定菌液成分和含量。
54.s5取辐照后的菌液进行检查，所述菌液含有全菌体和菌内免疫原性成分，所述全菌体的占比大于80％为合格；所述的菌内免疫原性成分包括膜囊泡、核酸和菌体碎片。通常情况下，本发明提供的工业化生产方法得到的菌液中全菌体的占比应保持在80％以上，检查菌液的目的在于确保在调整其他参数的情况下，菌液中的成分(全菌体和菌内免疫原性
成分)的数量保持稳定。
55.s6将步骤s5中检查合格的菌液再用等渗注射液重悬并调整浓度到1.0
×
107～3.0
×
107个/ml，制得铜绿假单胞菌疫苗。
56.进一步地，所述射线辐照的基本灭活剂量不得低于1000gy，所述射线辐照的总剂量大于所述射线辐照的基本灭活剂量。所述射线辐照的方式为低剂量率，长时间，持续照射。所述射线辐照的剂量率为5～15gy/min，持续辐照时间大于2h。在一些实施例中，本发明中射线辐照的总剂量可控制在≤2000gy范围。
57.确定所述射线辐照的灭活时间或灭活剂量的步骤为：
58.a.确定装载辐照样品的容器的材质和形状。所述材质为医用级塑料材质，所述医用级塑料材质包括但不限于聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)等。所述形状优选为柱状、桶装和袋状中的一种或多种。
59.b.确定灭活的最大装量。装量由容器形状和液位高度决定，射线穿过液位最高(近)处的剂量率与穿过液位最低(远)处的剂量率之差不超过液位最高(近)处剂量率的20％，而所述液位最高(近)处对应的菌液的体积即为灭活的最大装量。用辐射剂量检测仪，将检测探头分别放置在距辐射源的液位最高(近)处和最低(远)处，启动辐照仪，辐射剂量检测仪即可读取辐照剂量率。20％是基于质量控制要求，为保证辐照样品所接受的辐照剂量的均一性。
60.c.确定菌液浓度。根据产量设计确定每批次灭活的总菌体量，再根据装量要求，选择合适的菌液浓度，计算公式为：择合适的菌液浓度，计算公式为：其中n表示菌液浓度，a表示产量人份，b表示每人份菌体剂量，v表示菌液总体积，v≤最大装量。
61.d.选择剂量率。设计不同剂量率组别，根据步骤a～步骤c进行最大装量的灭活，持续辐照时间设置为不低于2h，具体的，可设置为2h或大于等于2h的任意时间。
62.e.杀菌曲线的测定。根据步骤d确定的剂量率和辐照时间，进行多批次辐照，并对中间时间点或延长时间点进行活菌计数，或者，对中间辐照剂量点或延长辐照剂量点进行活菌计数，测定杀菌曲线。需要说明的是，可以通过控制辐照时间或控制辐照剂量来控制灭活的过程，进而，可以从控制时间或控制剂量上来考察灭活参数。举例来说，确定灭活时间后，可以对该灭活时间之前的时间点(例如，“中间时间点”)和之后的时间点(例如，“延长时间点”)进行取样，以验证该灭活时间能否满足完全灭活的要求；同理，确定灭活剂量后，可以对该灭活剂量之前的辐照剂量点(例如，“中间辐照剂量点”)和之后的辐照剂量点(例如，“延长辐照剂量点”)进行取样，以验证该灭活剂量能否满足完全灭活的要求。
63.f.确定灭活剂量或灭活时间。根据杀菌曲线，灭活时间或灭活剂量为取相邻3个时间点(第一时间点、第二时间点、第三时间点)或者相邻3个辐照剂量点(第一辐照剂量点、第二辐照剂量点、第三辐照剂量点)，时间点间隔不小于20min，辐照剂量点间隔不小于200gy，进行活菌计数，计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，位于中间的时间点(即第二时间点)为灭活时间，位于中间的辐照剂量点(即第二辐照剂量点)为灭活剂量。杀菌曲线的示意图如图5所示，根据杀菌曲线，取相邻3个辐照剂量点“1200gy”、“1400gy”、“1600gy”进行活菌计数且计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述相邻3个辐照剂量点中处于中间的辐照剂量点“1400gy”为灭活剂量；同理，根据绘制的杀菌曲线，
取相邻3个时间点“120min”、“140min”、“160min”进行活菌计数且计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述相邻3个时间点中处于中间的时间点“140min”为灭活时间。
64.初步确定灭活时间或灭活剂量后，进一步优化的关键参数包括剂量率、辐照时间、装量、菌液浓度等，还可以包括灭活剂量；上述参数均可进行适宜范围内的调整，以期适应工业化生产。
65.确定灭活时间或灭活剂量后进行灭活验证，包括灭活后无菌检查和稳定性考察；所述稳定性考察包括在25℃或37℃条件下的加速考察和2～8℃条件下的实时考察，该步骤的目的是确保疫苗不会在长时间放置过程中有本菌增殖。
66.进行工业化生产验证，选择合适的工业化生产参数后，应进行多批次的生产验证，以确保每批次均能达到细菌完全灭活。
67.由本发明提供的工业化生产方法制得的铜绿假单胞菌疫苗，所述疫苗是一种全菌体疫苗，也可以是一种多组分疫苗，既包含全菌体，也包含膜囊泡、核酸和菌体碎片等菌内免疫原性成分。所述疫苗的剂型为注射剂和/或冻干粉剂。所述疫苗的接种方式可选地包括皮下注射、肌肉注射、皮上划痕接种、鼻腔给药和口服给药中的一种或多种。
68.在本发明的一些实施例中，全菌体、膜囊泡、核酸和菌体碎片的质量比优选为98:1:0.1:1。在该比例条件下，疫苗的免疫原性较优，副作用较小。
69.实施例二：疫苗在小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型中的保护作用
70.铜绿假单胞菌有20个血清型，在临床上分离的铜绿假单胞菌的主流血清型是o6、o11、o4，分别占比约20％、15％、10％。本实施例以铜绿假单胞菌pa1(血清型o5)按上述工艺制备疫苗。疫苗按0、14、28天免疫程序，于小鼠皮下免疫含菌1.0
×
107个的疫苗0.5ml。末次免疫后7天，从小鼠气道分别感染铜绿假单胞菌pa1(o5)，临床分离的碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌c58(o6)，标准菌株atcc33358(o11)、atcc33351(o4)和实验室菌株pa14(o14)。感染24h后取肺组织作细菌荷载量计数，结果详见图1。疫苗能有效降低pa1(o5)(p《0.001)、c58(o6)(p《0.05)、atcc33358(o11)(p《0.01)、atcc33351(o4)(p＞0.05)、pa14(p《0.01)的荷载量，结果表明，本疫苗对不同血清型铜绿假单胞菌感染有保护作用，能够预防多种铜绿假单胞菌引起的感染。
71.实施例三：疫苗在小鼠慢性肺阻塞性疾病(copd)合并铜绿假单胞菌感染模型中的保护作用
72.本实施例以铜绿假单胞菌pa1(血清型o5)按上述工艺制备疫苗。疫苗以0、3、7天和0、7、14天2种免疫程序，于小鼠皮下免疫含菌1.0
×
107个的疫苗0.5ml，感染前10天气管灌注弹性蛋白酶诱导建立copd模型，末次免疫后7天通过气道肺部感染本菌，感染后24h以处死小鼠，取肺组织作细菌荷载量计数，结果详见图2。按2种程序免疫本疫苗，对copd合并铜绿假单胞菌肺部感染均有明显的体内保护作用(p《0.01)，可使肺组织细菌荷载量下降约2个log
10
值(清除99％细菌)。结果表明，本疫苗对copd合并铜绿假单胞菌肺部感染有明显保护作用。
73.实施例四：疫苗在小鼠烧伤模型中的保护作用
74.本实施例以铜绿假单胞菌pa1(血清型o5)按上述工艺制备疫苗。疫苗按0、14、28天免疫程序，于小鼠皮下免疫含菌1.0
×
107个的疫苗0.5ml，末次免疫后7天，用热风机烫伤小
鼠背侧皮肤，建立烧伤模型，烧伤后2h于创面皮下感染铜绿假单胞菌pa1，24h后取创面皮肤作细菌荷载量计数，结果详见图3。疫苗免疫能够显著降低烧伤合并铜绿假单胞菌感染创面细菌荷载量(p《0.001)。结果表明，本疫苗对烧伤合并铜绿假单胞菌感染有明显保护作用。
75.实施例五：疫苗在小鼠眼角膜感染模型中的保护作用
76.本实施例以铜绿假单胞菌pa1(血清型o5)按上述工艺制备疫苗。疫苗按0、3、7天和0、7、14天2种免疫程序，以滴鼻方式免疫小鼠(含菌1.0
×
107个的疫苗20μl)，末次免疫后7天，用针尖划伤小鼠眼角膜后感染本菌，24h后取角膜作细菌荷载量计数，结果详见图4。按2种程序免疫本疫苗，对铜绿假单胞菌角膜感染均有明显的保护作用(p《0.01)。结果表明，本疫苗对角膜感染铜绿假单胞菌有明显保护作用。
77.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

技术特征：

1.一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：s1用适宜的培养基培养铜绿假单胞菌生产用菌株，制成种子液；s2将所述种子液按照发酵体积的2％～10％接种至发酵罐中进行发酵，其中发酵温度为30～40℃，ph值为5～9，转速为100～400rpm，通气量为2～5l/min，溶氧为10％～30％，发酵时间为3～8h；s3监测所述发酵罐内的菌体密度，待所述发酵罐内的菌体密度达标后，取所述发酵罐内的菌液直接按照离心力3000～8000
×
g进行离心，10～30min后收集菌体；s4将所述菌体用等渗注射液重悬并调整浓度，然后进行射线辐照使所述菌体失去增殖活性，所述射线辐照的射线包括x射线、γ射线和同位素放射源co
60
产生的射线中的一种或多种；s5取所述射线辐照后的菌液进行检查，所述菌液含有全菌体和菌内免疫原性成分，所述全菌体的占比大于80％为合格；s6将所述步骤s5中检查合格的所述菌液再用所述等渗注射液重悬并调整浓度到1.0
×
107～3.0
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107个/ml，制得所述铜绿假单胞菌疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐内的菌体密度的吸光值达到1～3od为达标。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌内免疫原性成分包括膜囊泡、核酸和菌体碎片。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s4后进一步包括检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的步骤，所述检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的方法包括分光光度计法、密度梯度离心法、扫描电镜和透射电镜中的一种或多种。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述射线辐照的基本灭活剂量不得低于1000gy，所述射线辐照的总剂量大于所述射线辐照的基本灭活剂量。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述射线辐照的方式为低剂量率，长时间，持续照射；所述剂量率优选为5～15gy/min，所述持续照射的时间优选为大于2h。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述射线辐照的灭活时间或灭活剂量的步骤包括：a)确定装载辐照样品的容器的材质和形状；b)确定灭活的最大装量；c)确定菌液浓度：根据产量设计确定每批次灭活的总菌体量，再根据装量要求，选择合适的所述菌液浓度，所述菌液浓度的计算公式为：其中n表示菌液浓度，a表示产量人份，b表示每人份菌体剂量，v表示菌液总体积，v≤最大装量；d)选择剂量率：设计不同剂量率组别，根据所述步骤a)～步骤c)进行所述最大装量的灭活，持续辐照时间设置为不低于2h；e)测定杀菌曲线：根据所述步骤d)确定的所述剂量率和所述辐照时间，进行多批次辐照，并对中间时间点或延长时间点进行活菌计数，或者，对中间辐照剂量点或延长辐照剂量点进行活菌计数，测定所述杀菌曲线；f)确定灭活时间或灭活剂量：根据所述杀菌曲线，取相邻的第一时间点、第二时间点、
第三时间点或者取相邻的第一辐照剂量点、第二辐照剂量点、第三辐照剂量点进行活菌计数，其中所述时间点间隔不小于20min，所述辐照剂量点间隔不小于200gy，计数结果分别为小于100cfu/ml、0cfu/ml、0cfu/ml时，所述第二时间点为灭活时间，所述第二辐照剂量点为灭活剂量。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，确定所述灭活时间或所述灭活剂量后进一步包括进行灭活验证，所述灭活验证包括灭活后无菌检查和稳定性考察；所述稳定性考察包括在25℃或37℃条件下的加速考察和2～8℃条件下的实时考察。9.权利要求1-8任一项所述的工业化生产方法制得的铜绿假单胞菌疫苗，所述疫苗的剂型优选为注射剂和/或冻干粉剂，所述疫苗的接种方式可选地包括皮下注射、肌肉注射、皮上划痕接种、鼻腔给药和口服给药中的一种或多种。10.权利要求9所述的疫苗在制备预防铜绿假单胞菌引起的感染性疾病药物中的用途。

技术总结

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法。本发明提供的一种工业化生产铜绿假单胞菌疫苗的方法，采用一系列标准化、程序化、数字化的设定，确保生产出一种质量稳定的含有铜绿假单胞菌全菌体和菌内多种免疫原性成分的疫苗。由本发明提供的方法制备得到的疫苗具备良好的免疫原性，可以预防多种铜绿假单胞菌引起的感染性疾病，同时副作用小，安全性高。安全性高。安全性高。