一种芦竹碱-铂(IV)配合物的制备方法及其在肿瘤药物中的应用

一种芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法及其在肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于抗癌化学药物技术领域，尤其是涉及一种芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法及其在肿瘤药物中的应用。

背景技术：

2.癌症是世界范围内威胁人类生命和健康的重大疾病，并且癌症的发病率有逐年递增的趋势，死亡率极高。世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布了2020年全球最新癌症负担数据，统计了185个国家中的36种癌症发病率和死亡率，以及癌症发展趋势。在2020年，全球估计有1930万新癌症病例和近1000万癌症死亡病例。全球发病率前十的癌症分别是：乳腺癌226万(11.7％)，肺癌221万(11.4％)，结直肠癌188万(9.8％)，前列腺癌141万(7.3％)，皮肤癌120万(6.2％)，胃癌109万(5.6％)，肝癌91万(4.7％)，宫颈癌60万(3.1％)，食道癌60万(3.1％)，甲状腺癌59万(3％)，这十种癌症占据新发癌症总数的63％。
3.化疗和放疗是癌症的主要手段，化疗在肿瘤的中是不可替代的，因此，化疗药物的研发依然是我们研究的重点。众所周知，顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂类药物是临床上肿瘤的重要药物，主要用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、恶性淋巴癌等。铂类药物攻击的主要靶点是dna，其抗癌作用显著，抗癌活性强；很少与其他抗癌药物产生交叉耐药性，有利于临床的联合用药；具有广谱抗癌作用。然而，铂类药物的毒副作用和耐药性限制了它的临床应用，所以寻新的铂类药物成为研究的重点，其中pt(iv)配合物由于其多样化的活性和低的全身毒性，具有广泛的应用前景。
4.pt(iv)是顺铂、奥沙利铂等经过氧化后得到的产物，与二价铂相比，pt(iv)是八面体构型，具有药代动力学惰性，使其在血液中的稳定性提高，延长铂药的作用时间，从而提高抗肿瘤活性。而且，pt(iv)具有较高的亲脂性易被癌细胞吸收。另外，通过化学修饰，在pt(iv)的两个轴向部位可以引入不同的功能分子，增加pt(iv)对癌细胞的选择性，改善pt(iv)的药理学性质，从而达到靶向、协同增敏等作用。
5.天然产物因其低毒、免疫、心血管保护等特殊优势，在药物开发和研究中发挥着重要作用。其中，芦竹碱(gramine，gm)是一种天然的吲哚生物碱，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种药理作用。芦竹碱可以通过调节多种信号通路发挥抗肿瘤作用，其中，通过抑制转化生长因子(transforming growth factor，tgf-β)可以显著抑制肿瘤的生长和转移，其机制涉及阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制emt的发生以及抑制肿瘤的侵袭与转移等，因此，本发明拟将芦竹碱作为功能配体引入四价铂的轴向位置，合成芦竹碱-铂(iv)前药，从而达到协同增敏的作用。

技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供一种芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法及其在肿瘤药物中的应用。
7.本发明采用的技术方案是：一种芦竹碱-铂(iv)配合物，四价铂配位中心轴向一侧连接有芦竹碱；或者，四价铂配位中心轴向一侧连接有芦竹碱，另一侧连接有碳氮长链基团。
8.优选地，结构如式1-1或1-2所示；
[0009][0010]
其中，
[0011]
选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，
[0012]
优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；
[0013]
r1为-cnh2n-，n为整数且1≤n≤6，优选地，-c
nh2n-为直链基团；
[0014]
r2为-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1，m为整数且1≤m≤20，优选地，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。
[0015]
优选地，n≤2，-c
nh2n-为直链基团。
[0016]
优选地，6≤m≤17，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。
[0017]
优选地，由式2-10中任一结构式表示：
[0018]
[0019][0020]
制备芦竹碱-铂(iv)配合物的方法，将式11化合物与式12化合物在第一缩合剂与第一缚酸剂存在的条件下发生酯化反应，得到式1-1化合物；
[0021][0022]
其中，
[0023]
选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；
[0024]
r1为-cnh2n-，n为整数且1≤n≤6，优选地，-c
nh2n-为直链基团；
[0025]
优选地，所述第一缩合剂为tbtu；所述第一缚酸剂为三乙胺；反应中原料比为：式11化合物：式12化合物：第一缩合剂：第一缚酸剂为1-1.2：1：1.2-2：1.2-2；
[0026]
优选地，反应在避光且惰性气体保护的条件下进行。
[0027]
优选地，将式1-1化合物与式13或式14化合物发生酯化反应，得到式1-2所示化合物；
[0028][0029]
其中，
[0030]
r2为-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1，m为整数且1≤m≤20，优选地，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。
[0031]
优选地，将式15的芦竹碱与式16化合物在第二缩合剂与第二缚酸剂存在的条件下发生酰化反应得到式11化合物；
[0032][0033]
优选地，所述第二缩合剂为dmap；所述第二缚酸剂为三乙胺。
[0034]
芦竹碱-铂(iv)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0035]
优选地，用于制备抗乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、咽鳞癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌药物。
[0036]
本发明具有的优点和积极效果是：将芦竹碱与铂药结合，合成一种新的芦竹碱-铂(iv)配合物，相比母体顺铂展现出更好的生物活性，其ic
50
值低于顺铂数十倍，对多种癌细胞具有良好的抗增殖能力，尤其是对恶性程度极高的三阴性乳腺癌细胞，相较于临床铂药，效果提升最为显著。另外，脂肪长链的引入增加了药物的稳定性，同时增强了pt(iv)分子的脂溶性及跨膜能力，促进铂药的吸收。芦竹碱和脂肪链双取代的芦竹碱-铂(iv)配合物，其药物稳定性和细胞摄取均明显提升，在提高抗肿瘤活性的同时还具有减毒、缓释的功效；前药合成工艺简单，成本低，大大提高了联合用药的疗效，与传统二价铂及同类四价铂药物相比，具有疗效好、副作用小等优势，为四价铂的修饰提供了新的思路。
附图说明
[0037]
图1实施例九中化合物c的胞内释放情况；
[0038]
图2实施例十中不同给药组的小鼠体重变化；
[0039]
图3实施例十中不同给药组的小鼠肿瘤体积变化；
[0040]
图4实施例十中最终小鼠肿瘤重量；
[0041]
图5实施例十中不同给药组的小鼠存活率；
[0042]
图6实施例十中最终pt在各组织的分布情况；
[0043]
图7实施例十中肿瘤的最终图片；
[0044]
图8小鼠器官和肿瘤组织的h&e染结果。
[0045]
图9小鼠脾的免疫组化染结果。
具体实施方式
[0046]
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
[0047]
本发明公开一种芦竹碱-铂(iv)配合物，四价铂配位中心轴向一侧连接一分子芦竹碱，构成单取代四价铂配合物，结构如式1-1所示；
[0048][0049]
其中，选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；r1为-c
nh2n-，n为整数且n≥1，优选地，n≤6，更优选的，n≤2，-c
nh2n-为直链基团时效果更佳。
[0050]
将芦竹碱与铂药结合，合成一种新的芦竹碱-铂(iv)配合物，芦竹碱是一种天然的吲哚生物碱，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种药理作用。芦竹碱可以通过调节多种信号通路发挥抗肿瘤作用，其中，通过抑制tgf-β信号通路可以显著抑制肿瘤的生长和转移，其机制涉及阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制emt的发生以及抑制肿瘤的侵袭与转移等。在本发明某些实施例中，可由式2或式3结构式表示：
[0051][0052]
制备式1-1结构所示的芦竹碱-铂(iv)配合物采用如下方法：
[0053]
步骤一：将式15的芦竹碱与式16化合物在第二缩合剂与第二缚酸剂存在的条件下发生酰化反应得到式11化合物；
[0054][0055]
其中，所述第二缩合剂为dmap；所述第二缚酸剂为三乙胺。
[0056]
步骤二：将式11化合物与式12化合物在第一缩合剂与第一缚酸剂存在的条件下发生酯化反应，得到式1-1化合物；
[0057]
[0058]
其中，所述第一缩合剂为tbtu；所述第一缚酸剂为三乙胺；反应中原料比为：式11化合物：式12化合物：第一缩合剂：第一缚酸剂为1-1.2：1：1.2-2：1.2-2；反应在避光且惰性气体保护的条件下进行。
[0059]
本发明的芦竹碱-铂(iv)配合物是前药形式，在胞内能够释放出芦竹碱配体和母体铂药，旨在降低铂药毒副作用的同时达到协同增敏的作用。为了提高pt(iv)的摄取以及稳定性，四价铂配位中心轴向一侧连接有芦竹碱，在铂的另一轴向羟基引入不同长度的脂肪链，结构如式1-2所示。
[0060][0061]
其中，选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；r1为-c
nh2n-，n为整数且n≥1，优选地，n≤6，更优选的，n≤2，-c
nh2n-为直链基团时效果更佳；r2为-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1且m≥1，优选地，m≤20，更优选的m≤17，进一步优选的，2≤m≤17，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团是效果更佳。
[0062]
脂肪长链的引入增加了药物的稳定性，同时增强了pt(iv)分子的脂溶性及跨膜能力，促进铂药的吸收。芦竹碱和脂肪链双取代的芦竹碱-铂(iv)配合物，其药物稳定性和细胞摄取均明显提升，在提高抗肿瘤活性的同时还具有减毒、缓释的功效；前药合成工艺简单，成本低，大大提高了联合用药的疗效，与传统二价铂及同类四价铂药物相比，具有疗效好、副作用小等优势。
[0063]
在本发明某些实施例中，可由式4-10中任一结构式表示：
[0064]
[0065][0066]
制备式1-2结构所示的芦竹碱-铂(iv)配合物采用如下方法：
[0067]
将式1-1化合物与式13或式14化合物发生酯化反应，得到式1-2所示芦竹碱-铂(iv)配合物；
[0068][0069]
上述制备得到的芦竹碱-铂(iv)配合物能够用于制备抗肿瘤药物，例如可用于制备抗乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、咽鳞癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌药物。芦竹碱-铂(iv)配合物相比母体顺铂展现出更好的生物活性，其ic
50
值低于顺铂数十倍，对多种癌细胞具有良好的抗增殖能力，尤其是对恶性程度极高的三阴性乳腺癌细胞，相较于临床铂药，效果提升最为显著。
[0070]
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
[0071]
实施例1：
[0072]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物a3结构式如下式：
[0073][0074]
本实施例所述的芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法合成路线如下：
[0075][0076]
步骤1：精确称取芦竹碱(2g,11.5mmol)于50ml的圆底烧瓶中后加入20ml二氯甲烷，在搅拌下依次加入丁二酸酐(2.30g,23mmol)，4-二甲氨基吡啶dmap(0.14g,1.15mmol)和三乙胺(3.18ml,23mmol)，室温反应过夜。tcl检测反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，用甲
醇重结晶得到白固体，真空干燥后得到化合物a1(2.74g，产率为86.9％)。
[0077]
步骤2：精确称取顺铂(1.00g,3.30mmol)于25ml的圆底烧瓶中，加入2ml蒸馏水搅拌后缓慢逐滴滴加h2o2(30％w/v,10.0ml)避光下70℃反应5h。反应结束后，将反应液冷却至室温后置于4℃过夜，然后离心除去上清液得到淡黄固体，固体分别用蒸馏水、乙醇和乙醚洗两次，然后真空干燥得到化合物a2(858.60mg，产率为76％)。
[0078]
步骤3：精确称取化合物a1(100mg,0.36mmol)置于10ml圆底烧瓶中，向其中加入1ml的超干dmso，搅拌下加入tbtu(174mg,0.54mmol)，tea(75μl,0.54mmol)，15min后加入化合物a2(120mg,0.36mmol)，避光氩气保护室温反应过夜。待反应液澄清透明时tcl检测随后将反应液倒入20ml的二氯甲烷中，超声，离心收集沉淀。沉淀分别用二氯甲烷、甲醇洗涤后于真空干燥箱干燥的淡黄固体a3(91.76mg，产率为43.2％)。
[0079]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.33 8.35(d,j＝7.9hz,1h),8.01(s,1h),7.80(d,j＝7.3hz,1h),7.45
–
7.29(m,2h),6.11
–
5.78(m,6h),3.42(s,2h),3.26
–
3.14(m,2h),2.67(t,j＝10.6hz,2h),2.51(s,6h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.37,171.41,135.08,129.70,125.02,123.90,123.38,119.65,118.76,115.99,54.90,42.91,31.43,30.61.hr-ms(m/z):calcd for c
15h24
cl2n4o4pt(m+h)
+
,591.08223；found:591.08801.
[0080]
实施例2：
[0081][0082]
本实施例所述的芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法合成路线如下：
[0083][0084]
步骤1：精确称取化合物a3(118.0mg,0.20mmol)置于10ml圆底烧瓶中，向其中加入2ml的超干dmf，磁力搅拌下加入异氰酸己酯(50μl)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测待反应结束后，60℃水浴下旋蒸除去dmf将残渣溶于1ml甲醇中，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗除去残留dmf后真空干燥得化合物a(50.62mg，产率为49.3％)。
[0085]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.33(d,j＝8.0hz,1h),7.80(s,1h),7.71(d,j＝7.5hz,1h),7.32(t,j＝7.6hz,1h),7.26(t,j＝7.3hz,1h),6.77(s,6h),6.53(s,1h),3.54(s,2h),3.22
–
3.14(m,2h),2.88(d,j＝5.5hz,2h),2.72(t,j＝5.6hz,2h),2.20(s,6h),
1.34(s,2h),1.22(s,6h),0.85(t,j＝6.6hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.67,171.18,164.01,135.22,130.30,124.75,124.51,122.77,119.82,118.50,115.88,53.89,45.05,41.04,31.15,31.09,29.85,29.69,26.08,21.97,13.73.hr-ms(m/z):calcd for c
22h37
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+
,717.18195；found:717.18939.
[0086]
实施例3：
[0087]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物b结构式如下式：
[0088][0089]
合成路线如下：
[0090][0091]
步骤1：精确称取化合物a3(118.0mg,0.20mmol)置于10ml圆底烧瓶中，向其中加入2ml的超干dmf，磁力搅拌下加入异氰酸辛酯(50μl)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测待反应结束后，60℃水浴下旋蒸除去dmf将残渣溶于1ml甲醇中，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗除去残留dmf后真空干燥得化合物b(54.68mg，产率为56.7％)。
[0092]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.33(d,j＝8.1hz,1h),7.79(s,1h),7.70(d,j＝7.6hz,1h),7.32(t,j＝7.5hz,1h),7.26(t,j＝7.3hz,1h),6.74(s,6h),6.53(s,1h),3.54(s,2h),3.22
–
3.12(m,2h),2.88(d,j＝5.5hz,2h),2.72(t,j＝6.1hz,2h),2.20(s,6h),1.34(s,2h),1.23(s,10h),0.85(d,j＝6.9hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.33,171.18,164.02,135.56,130.30,124.64,124.48,123.08,119.92,118.96,115.98,53.91,45.07,40.92,31.30,31.14,29.91,29.81,28.78,28.70,26.39,22.08,13.94.hr-ms(m/z):calcd for c
24h41
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+
,745.21325；found:745.22064.
[0093]
实施例4：
[0094]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物c结构式如下式：
[0095][0096]
合成路线如下：
[0097][0098]
步骤1：精确称取化合物a4(118.0mg,0.20mmol)置于10ml圆底烧瓶中，向其中加入2ml的超干dmf，磁力搅拌下加入十二烷基异氰酸酯(50μl)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测待反应结束后，60℃水浴下旋蒸除去dmf将残渣溶于1ml甲醇中，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗除去残留dmf后真空干燥得化合物c(49.02mg，产率为60.6％)。
[0099]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.33(d,j＝8.1hz,1h),7.78(s,1h),7.70(d,j＝7.5hz,1h),7.34
–
7.30(m,1h),7.26(t,j＝7.4hz,1h),6.68(s,6h),6.54(s,1h),3.54(s,2h),3.17(t,j＝6.4hz,2h),2.88(d,j＝6.0hz,2h),2.73(t,j＝6.3hz,2h),2.20(s,6h),1.33(s,2h),1.23(s,14h),0.84(d,j＝6.9hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.39,171.18,163.76,135.47,130.13,124.73,124.55,123.04,120.00,118.75,116.04,53.87,45.08,41.02,31.24,31.08,31.05,29.82,29.06,29.03,29.00,28.88,28.60,26.44,26.39,22.07,13.94.hr-ms(m/z):calcd for c
28h49
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+
,801.27585；found:801.28473.
[0100]
实施例5：
[0101]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物d结构式如下式：
[0102][0103]
合成路线如下：
[0104][0105]
步骤1：精确称取化合物a4(118.0mg,0.20mmol)置于10ml圆底烧瓶中，向其中加入2ml的超干dmf，磁力搅拌下加入棕榈酸酐(200.1mg,0.40mmol)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测待反应结束后，60℃水浴下旋蒸除去dmf将残渣溶于1ml甲醇中，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗除去残留dmf后真空干燥得化合物d(55.53mg，产率为53.5％)。
[0106]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.33(d,j＝8.1hz,1h),7.81(s,1h),7.72(d,j＝7.3hz,1h),7.29(dt,j＝15.9,7.3hz,2h),6.54(s,6h),3.60(s,2h),3.17(t,j＝6.6hz,2h),2.74(t,j＝6.5hz,2h),2.24(s,6h),1.33(d,j＝81.8hz,28h),0.85(s,2h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ180.91,179.51,171.06,135.47,130.12,124.78,124.72,123.08,119.92,118.30,115.87,53.66,44.85,35.59,31.22,31.05,30.99,29.84,29.09,29.03,28.99,28.96,28.90,28.76,28.68,28.61,25.46,22.04,21.09,13.93.hr-ms(m/z):calcd for c
31h55
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+
828.31918；found:828.31964.
[0107]
实施例6：
[0108]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物e结构式如下式：
[0109][0110]
合成路线如下：
[0111][0112]
步骤1：向含有2ml双蒸水和10ml浓度为30％的双氧水的圆底烧瓶中精确加入奥沙
利铂(1.31mg,3.3mmol)，避光条件下，70℃加热回流5h。随后停止加热，待反应液恢复室温后置于4℃冰箱过夜。离心收集沉淀，蒸馏水、无水乙醇和无水乙醚各洗两次后，真空干燥得类白晶体e2(0.87g，产率为80.60％)。
[0113]
步骤2：精确称取化合物a1(63.4mg,0.23mmol)溶于1ml超干dmso后，然后依次加入tbtu(110.8mg,0.35mmol)，tea(48.3μl,0.35mmol)搅拌15min后，加入化合物e2(100mg,0.23mmol)，避光氩气保护下反应过夜。待反应液处于澄清状态时，tlc监测反应，待反应结束后，加入适量二氯甲烷得到絮状沉淀，超声、离心收集沉淀。沉淀分别用二氯甲烷、甲醇洗涤后于真空干燥箱干燥的淡黄固体e3(58.9mg，产率为37.3％)。
[0114]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.38(s,1h),8.33(d,j＝7.4hz,1h),7.97
–
7.85(m,2h),7.85(d,j＝6.8hz,1h),7.46(s,1h),7.36(t,j＝7.5hz,2h),4.24(s,2h),3.26
–
3.18(m,2h),2.73
–
2.68(m,2h),2.67(s,6h),2.51
–
2.50(m,2h),2.05(d,j＝11.2hz,2h),1.49(d,j＝7.6hz,2h),1.28
–
1.20(m,1h),1.12(t,j＝16.8hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ180.50,171.46,163.94,163.90,135.05,129.43,125.06,124.07,123.44,119.58,115.72,109.86,61.24,59.96,51.09,42.61,31.34,30.79,30.73,30.64,23.64,23.54.hr-ms(m/z):calcd for calcd for c
23h32
n4o8pt(m+h)
+
688.19406；found:688.19440.
[0115]
实施例7：
[0116]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物e结构式如下式：
[0117][0118]
合成路线如下：
[0119][0120]
步骤1：精确称取化合物e3(137.5mg,0.20mmol)置于含有2ml超干dmf的10ml圆底烧瓶中，待其充分溶解后搅拌下加入异氰酸辛酯(50μl)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测，待反应结束，旋蒸除去dmf，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗涤后真空干燥得化合物e(52.6mg，产率为51.2％)。
[0121]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.30(d,j＝8.0hz,1h),8.31
–
7.64(m,4h),7.79(s,1h),7.70(d,j＝11.3hz,1h),7.28(dt,j＝18.5,6.9hz,2h),6.79(s,1h),3.54(s,2h),3.23(s,2h),2.97
–
2.84(m,2h),2.79
–
2.69(m,2h),2.21(s,6h),2.11(s,2h),1.51(s,2h),1.33(s,4h),1.22(s,14h),0.85(t,j＝6.7hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.42,171.11,164.44,163.52,163.31,135.40,130.16,124.59,124.47,123.11,120.00,118.93,115.67,
61.00,60.62,53.91,45.05,40.81,31.25,31.22,31.08,31.02,29.61,28.74,28.69,26.32,26.26,23.66,23.35,22.06,13.91.hr-ms(m/z):calcd for c
32h50
n5o9pt(m+h)
+
843.32508；found:843.32526.实施例8：
[0122]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物f结构式如下式：
[0123][0124]
合成路线如下：
[0125][0126]
步骤1：精确称取化合物e3(137.5mg,0.20mmol)置于含有2ml超干dmf的10ml圆底烧瓶中，待其充分溶解后搅拌下加入十二烷基异氰酸酯(50μl)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测，待反应结束，旋蒸除去dmf，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗涤后真空干燥得化合物e(52.7mg，产率为59.3％)。
[0127]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.30(d,j＝8.0hz,1h),8.20(s,1h),7.71(d,j＝7.7hz,1h),7.65(s,1h),7.48(s,1h),7.28(dt,j＝13.5,7.7hz,2h),7.11(s,1h),6.78(s,1h),3.54(s,2h),3.22(s,2h),2.94
–
2.83(m,2h),2.73(t,j＝6.5hz,2h),2.20(s,6h),2.11(s,2h),1.50(s,2h),1.33(s,4h),1.23(s,20h),0.85(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.43,171.18,164.37,163.63,163.42,135.42,130.19,124.58,124.48,122.38,118.93,118.05,115.73,60.90,60.51,53.91,45.09,40.43,31.27,31.07,30.95,29.62,29.05,29.01,28.98,28.80,28.73,28.69,26.29,26.26,23.63,23.30,22.06,13.91.hr-ms(m/z):calcd for c
36h58
n5o9pt(m+h)
+
899.38768；found:899.38788.
[0128]
实施例9：
[0129]
本实施例的芦竹碱-铂(iv)配合物g结构式如下式：
[0130]
[0131]
合成路线如下：
[0132][0133]
步骤1：精确称取化合物e3(137.5mg,0.20mmol)置于含有2ml超干dmf的10ml圆底烧瓶中，待其充分溶解后搅拌下加入棕榈酸酐(200.1mg,0.40mmol)，避光氩气保护60℃反应过夜。tcl检测，待反应结束，旋蒸除去dmf，制备硅胶板纯化得到白固体。无水乙醚洗涤后真空干燥得化合物e(53.3mg，产率为52.8％)。
[0134]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.30(d,j＝8.0hz,1h),8.28(t,j＝16.9hz,3h),7.79(s,1h),7.71(d,j＝7.5hz,1h),7.32
–
7.23(m,2h),6.77(s,1h),3.55(s,2h),2.94
–
2.84(m,2h),2.73(d,j＝5.9hz,2h),2.21(s,6h),2.11(s,2h),1.51(s,2h),1.33(s,4h),1.23(s,26h),0.86(d,j＝6.4hz,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6):δ179.49,171.15,164.38,163.47,135.40,130.13,124.58,124.51,123.10,119.99,118.83,115.67,60.75,53.87,45.01,40.81,31.41,31.08,30.93,29.82,29.79,29.63,29.58,29.09,29.06,29.01,28.80,28.72,28.67,26.26,23.71,23.37,22.10,14.01.hr-ms(m/z):calcd for c
40h66
n5o9pt(m+h)+926.41591；found:926.57.
[0135]
实施例10：体外抗肿瘤活性测定
[0136]
将上述实施例制备得到的芦竹碱-铂(iv)配合物进行体外抗肿瘤活性测定。
[0137]
本实验通过mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法对所合成化合物的抗肿瘤活性进行研究，本实验采用8种癌细胞mda-mb-231(人乳腺癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)、hct-116(人结肠癌细胞)、hela(人宫颈癌细胞细胞)、fadu(人咽鳞癌细胞)、5637(人膀胱癌细胞)、ovcar3(人卵巢癌细胞)、hccc9810(人肝癌细胞)和一种正常人细胞lo2(人肝细胞)进行细胞毒实验研究，所有细胞株均在5％co2浓度下，37℃饱和湿度的培养箱中培养。具体实验步骤如下：
[0138]
收集对数生长期细胞，计数后，调整细胞浓度为3
×
104cells/ml接种至96孔板，每孔100μl，设置空白组(blank，纯培养基)和对照组(control，不加药组)。板子于细胞培养箱培养过夜。贴壁后，用培养基将化合物稀释至首列给药孔所需浓度，之后倍半稀释进行后续孔给药，轻轻吹打混匀。孵育72h后，分别向各孔加入10μl(5mg/ml)mtt溶液。孵箱内再培养4h，除去上清，加入100μl/welldmso，充分震荡后用酶标仪λ＝570nm测定od值。进行三次独立重复实验来保证实验结果的可靠性。
[0139]
表1化合物作用细胞72小时后的ic
50
值
[0140][0141][0142]
如表1所示，检测了化合物对hela、mcf-7、mda-mb-231、hct-116、fadu、5637、ovcar3、hccc9810以及lo2细胞的抗增殖活性，化合物a、b、c、d、e、f、g的ic
50
值明显低于顺铂、奥沙利铂、gm以及联合给药，表现出对癌细胞具有较好的抗增殖能力。与化合物a3结构相比，化合物c轴向位置多一个12碳的疏水链，在所研究的癌细胞系中其ic
50
为0.11－1.34μm，其中，在mda-mb-231细胞系中，化合物c的抗增殖活性较顺铂提高了111倍。此外，化合物c对lo2细胞有相对较小的毒性，其对肿瘤细胞系mda-mb-231和正常细胞系lo2的选择指数达到8.36，而顺铂的选择指数仅为0.33。综上，化合物c具有高效低毒的抗肿瘤效果。
[0143]
实施例11：胞内还原实验
[0144]
探索前药的胞内释放能力对于研究四价铂的作用机制至关重要，四价铂需要在体内还原成二价铂形式才能发挥作用。为了探究芦竹碱-铂(iv)配合物是否能在细胞内被还原型物质(谷胱甘肽、抗坏血酸等)还原，释放出二价铂，同时起到药物缓释效果，我们进行了胞内还原实验。以化合物c为例，具体实验步骤如下：
[0145]
将1
×
106个mda-mb-231细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后，100μm化合物c作用于细胞，继续培养4h，弃去培养基，用pbs洗三次细胞，离心除去pbs，将细胞用一定的甲醇和二氯甲烷重悬，转入研磨器中研磨十分钟至细胞完全裂解，研磨完毕后静置一段时间，离心收集上清液，室温下挥干溶剂，然后用200μl的谱甲醇重悬固体，用液相进行检测，液相分析条件：紫外(uv)检测波长260nm，流动相甲醇和水(含0.1％的甲酸)，venusil xbp c18柱(50
×
4.6mm,5μm)，日本岛精(lc-20a)高效液相分析仪，梯度洗脱，甲醇5％-95％(0-10min)，95％甲醇25min，流速1ml/min。
[0146]
hplc检测结果如图1所示，图中，从下向上条带依次代表无药物处理的细胞空白对照组，化合物c的胞内提取样品，化合物c标准品，gm-cooh标准品和gm配体标准品。从化合物c的胞内提取样品所示条带上可以观察到三个吸收峰，一个峰的出峰时间在9.8min，与gm配体标准品的出峰时间相同，一个峰的出峰时间在10.7min，与gm-cooh标准品的出峰时间相同，另一个峰的出峰时间在12.5min，与化合物c标准品的出峰时间相同，证明化合物c在体内能被释放。由于药物处理时长仅4h，gm配体和gm-cooh的释放比较少，化合物c还会在后续作用下被进一步释放。综上，本专利所合成的芦竹碱-铂(iv)配合物可以在细胞内被还原，且具有缓释效果。
[0147]
实施例12：药物体内抗肿瘤的活性研究
[0148]
为了探究本发明所述芦竹碱-铂(iv)配合物的抗肿瘤效果，我们进行了药物体内抗肿瘤的活性研究，具体步骤如下：
[0149]
首先用4-5周龄balb/c雌鼠建立4t1-luc肿瘤模型，待肿瘤体积达到50－100cm3后，将小鼠随机分为4组，分别为pbs，cddp，cddp+gm，化合物c组。按2.0mg/kg pt浓度配置药物，每3天给一次药，每两天测量小鼠体重及肿瘤体积，共给药6次。处死小鼠，提取器官(心、肝、脾、肺、肾)及肿瘤。器官及肿瘤用于h&e染、免疫组化染及icp-ms铂含量测定。
[0150]
实验结果如图2-9所示。从肿瘤生长曲线图3、肿瘤重量图4及肿瘤最终图片图7可以看出，化合物c相较于空白组明显地抑制了肿瘤生长，较顺铂组和联合给药组抑制效果有明显提升。最重要的是，相较顺铂和联合组，化合物c对小鼠毒性明显下降。从小鼠体重变化图2可以看出，化合物c给药组的小鼠体重基本维持稳定，与空白组小鼠体重无明显差异，而顺铂及联合给药组小鼠体重呈明显下降趋势。从存活率曲线图5分析，化合物c组小鼠最终存活率为100％，而联合组最终存活率为33.33％，顺铂组存活率下降16.67％(其中死亡的小鼠包括死亡鼠和体重下降到自身体积的20％的小鼠)。从icp-ms结果图6可以看出，化合物c与顺铂相比在肾脏中和脾中的累积量明显下降，顺铂的肾毒性是最严重的毒性之一，化合物c在肾脏中低的累积量将能有效的缓解铂药对肾脏的毒副作用。h&e中能观察到顺铂组和化合物c都对肿瘤组织造成了严重损伤，化合物c组对小鼠器官的损伤很小，而顺铂组对脾、肾脏以及肝脏都造成了严重损伤，表明相比顺铂，化合物c的毒性明显下降。此外，免疫组化结果表明化合物c可以激活免疫调节，增强抗肿瘤免疫反应，例如，图9中cd4+和cd8+细
胞的数量增加，treg细胞(foxp3标记)的数量减少。以上体内抗肿瘤实验证明了化合物c相比顺铂，抗肿瘤活性明显提升且毒副作用显著下降，初步达成了抗肿瘤新药物增效低毒的目标。
[0151]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

技术特征：

1.一种芦竹碱-铂(iv)配合物，其特征在于：四价铂配位中心轴向一侧连接有芦竹碱；或者，四价铂配位中心轴向一侧连接有芦竹碱，另一侧连接有碳氮长链基团。2.根据权利要求1所述的芦竹碱-铂(iv)配合物，其特征在于：结构如式1-1或1-2所示；其中，选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；r1为-cnh2n-，n为整数且1≤n≤6，优选地，-c
n
h
2n-为直链基团；r2为-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1，m为整数且1≤m≤20，优选地，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。3.根据权利要求2所述的芦竹碱-铂(iv)配合物，其特征在于：n≤2，-c
n
h
2n-为直链基团。4.根据权利要求2所述的芦竹碱-铂(iv)配合物，其特征在于：6≤m≤17，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。5.根据权利要求1-4中任一所述的芦竹碱-铂(iv)配合物，其特征在于：由式2-10中任一结构式表示：
6.制备权利要求1-4中任一所述的芦竹碱-铂(iv)配合物的方法，其特征在于：将式11化合物与式12化合物在第一缩合剂与第一缚酸剂存在的条件下发生酯化反应，得到式1-1化合物；其中，选自顺铂、奥沙利铂、卡铂、庚铂、奈达铂、乐铂或米铂，优选地为顺铂、奥沙利铂或卡铂；r1为-cnh2n-，n为整数且1≤n≤6，优选地，-c
n
h
2n-为直链基团；优选地，所述第一缩合剂为tbtu；所述第一缚酸剂为三乙胺；反应中原料比为：式11化合物：式12化合物：第一缩合剂：第一缚酸剂为1-1.2：1：1.2-2：1.2-2；优选地，反应在避光且惰性气体保护的条件下进行。7.根据权利要求6所述的芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法，其特征在于：将式1-1化合物与式13或式14化合物发生酯化反应，得到式1-2所示化合物；其中，r2为-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1，m为整数且1≤m≤20，优选地，-cmh2m+1或-nh-cmh2m+1为直链基团。8.根据权利要求6所述的芦竹碱-铂(iv)配合物的制备方法，其特征在于：将式15的芦竹碱与式16化合物在第二缩合剂与第二缚酸剂存在的条件下发生酰化反应得到式11化合物；
优选地，所述第二缩合剂为dmap；所述第二缚酸剂为三乙胺。9.权利要求1-5中任一所述的芦竹碱-铂(iv)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。10.根据权利要求9所述的芦竹碱-铂(iv)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：用于制备抗乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、咽鳞癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌药物。

技术总结

本发明公开一种芦竹碱-铂(IV)配合物的制备方法及其在肿瘤药物中的应用，铂(IV)配位中心轴向一侧引入一分子芦竹碱，构成单取代的四价铂配合物；或铂(IV)配位中心轴向一侧引入一分子芦竹碱，另一侧引入一分子碳氮长链基团，构成双取代的四价铂配合物，制得的化合物对肿瘤细胞的杀伤能力更强，在多种细胞系中抗增殖活性都有明显提高，其中，在恶性程度极高的三阴性乳腺癌细胞中，相较于临床铂药，效果提升最为显著。本发明的芦竹碱-铂(IV)配合物合成工艺简单，成本低，大大提高了联合用药的疗效，与传统二价铂及同类四价铂药物相比，具有疗效好、副作用小等优势。副作用小等优势。副作用小等优势。