FnCas12a突变体在核酸检测中的应用及核酸检测方法与流程

fncas12a突变体在核酸检测中的应用及核酸检测方法
技术领域
1.本技术涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种fncas12a突变体在核酸检测中的应用及核酸检测方法。

背景技术：

2.分子标记物检测广泛应用于病原体检测、肿瘤筛查、神经系统疾病诊断、免疫系统疾病诊断等医学领域，也广泛应用于孕期检测、血糖监测、尿酸检测等日常生活领域。其中，核酸检测进行分子标记物检测，是临床应用广泛的技术之一。核酸检测技术近些年发展迅速并成为感染性疾病等检测的金标准。
3.目前核酸检测主流技术是荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)，这也是很多金标准普遍采用的检测技术。例如，qpcr法的迅速普及为新冠病毒疫情防控做出了巨大贡献。qpcr技术衍生出多种定性方案，如多重溶解曲线法等。qpcr方法具有灵敏度高、特异性强等优势，其高度准确性和精确性使其能够成为金标准。但是其缺点也比较明显，例如难以进行高通量、多靶点检测等。
4.crispr系统的研究获得了2020年诺贝尔化学奖。近几年来随着cas12a的发现crispr/cas亦被运用于核酸检测。其原理是：cas12a可将pre-crrna加工成成熟的crrna，且并不从crrna上脱落，cas12a:crrna复合体靶向到双链dna上形成cas12a:crrna:dsdna三元复合体，该三元复合体具有反式切割活性，可以切割体系内任意单链dna(ssdna)，当该ssdna标记有荧光基团和淬灭基团时被切开的ssdna即发出可被检测的荧光。由于cas12a的反式切割活性效率极高，可在5分钟之内完成反应，因此其进行核酸检测反应时具有超高效率，所需时间很短。
5.目前，基于crispr系统的核酸检测技术是基于野生型cas12a的holmes/detector和基于cas13的sherlock。野生型的cas12a包括lbcas12a、fncas12a、lb5cas12a、ascas12a等，其识别的pam(protospacer adjacent motif)均为tttn，由于病原体保守dna序列普遍不长，其在保守序列中的丰度可能很低或者没有；另外，很多病原体尤其是病毒类病原体如流感病毒、冠状病毒等极易发生突变，在病原体分型时更加依赖于广谱的pam识别机制，大大限制了crispr/cas12a系统在核酸检测中的应用。

技术实现要素：

6.本技术的目的是提供一种fncas12a突变体在核酸检测中的应用及核酸检测方法。
7.为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：
8.本技术的一方面公开了一种fncas12a突变体在核酸检测中的应用，该fncas12a突变体识别pam序列为yn；其中，y表示c或t，n表示a、t、c或g。
9.crispr靶向特异性由两部分决定，一部分是rna嵌合体和靶dna之间的碱基配对，另一部分是cas9蛋白复合体和一个短dna序列，这个短的dna序列通常在靶dna的3’末端，即pam序列。
10.需要说明的是，本技术研究发现fncas12a突变体能够用于核酸检测，并且，由于fncas12a突变体识别pam序列为yn，改善了现有的crispr/cas12a系统受限于靶向序列tttn的问题。采用fncas12a突变体进行核酸检测，几乎不受靶向序列限制；尤其适用于snp位点检测。现有的crispr/cas12a系统其识别pam序列为tttn，可以理解，在基因组范围内也许可以到比较多的靶向序列tttn；但是，在用于snp位点检测时，在snp位点的附近很难到靶向序列tttn，这就使得现有的crispr/cas12a系统无法用于snp位点检测。本技术研究发现fncas12a突变体能够用于核酸检测，fncas12a突变体识别pam序列为yn，能够相对比较容易的在snp位点的附近很难到靶向序列yn。因此，本技术基于fncas12a突变体的核酸检测方法尤其适用于snp位点检测。此外，本技术研究发现，虽然fncas12a突变体几乎不受靶向序列限制，大大拓展了检测靶点范围；但是，fncas12a突变体的特异性并没有因此而降低。也就是说，本技术将fncas12a突变体应用于核酸检测，在大大拓展检测靶点范围的同时保证了其高度特异性，这是本技术率先研究发现。
11.本技术的一种实现方式中，fncas12a突变体为seq id no.1所示序列。
12.本技术的另一面公开了一种核酸检测方法，包括采用本技术的应用中的fncas12a突变体，与针对检测靶标设计的特异性crrna结合，形成fncas12a突变体和crrna的复合物，利用fncas12a突变体和crrna的复合物特异性的识别检测靶标，并对结合在检测靶标上的探针进行切割；其中，探针上标记有荧光基团和荧光淬灭基团，根据探针被切割后产生的荧光信号判断待测样本中是否含有检测靶标。
13.需要说明的是，虽然fncas12a突变体本身是已经公开的突变体，但是，本技术率先研究发现fncas12a突变体能够用于核酸检测。因此，本技术提出并研发了基于fncas12a突变体的核酸检测方法。本技术的核酸检测方法，不仅改善了现有crispr/cas12a系统靶向序列受限状况，而且fncas12a突变体在用于核酸检测时，其特异性并没有因此而降低；即在大大拓展检测靶点范围的同时保证了高度特异性。
14.本技术的一种实现方式中，本技术的核酸检测方法还包括采用多孔板或微流控芯片作为反应载体，在反应载体中进行核酸检测反应。
15.需要说明的是，多孔板或微流控芯片只是本技术的一种实现方式中采用的反应载体，不排除还可以采用其他反应载体。
16.本技术的一种实现方式中，待测样本为核酸样本或含核酸的样本。
17.需要说明的是，本技术的核酸检测方法中，其样本来源可以是未经提取的含核酸样本，也可以是经过纯化的核酸样本，也可以是经过扩增后的核酸样本。本技术不受样本类型及来源的限制，例如可以是病原体来源、血液来源、组织来源等。
18.本技术的一种实现方式中，检测靶标包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒中的至少一种。
19.本技术的一种实现方式中，针对检测靶标设计的特异性crrna，具体包括，针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性
crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna。
20.本技术的一种实现方式中，针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.2所示序列，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.3所示序列，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna为seq id no.4所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna为seq id no.5所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna为seq id no.6所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna为seq id no.7所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna为seq id no.8所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna为seq id no.9所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna为seq id no.10所示序列。
21.需要说明的是，甲型流感病毒pb1保守区域、乙型流感病毒pb1保守区域、呼吸道腺病毒保守区域、新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域、新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域、新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体及其野生型、新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体及其野生型，这些只是本技术的一种实现方式中针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒，四种病原体设计的9个检测靶标位点。可以理解，本技术的核酸检测方法，并不局限于这四种病原体的9个靶标的检测，在本技术的构思下，还可以用于更多样本的检测。
22.还需要说明的是，本技术的核酸检测方法，在对四种病原体进行检测时，其关键在于针对四种病原体的检测靶标区域设计的特异性crrna；至于其他，例如探针，可以根据特异性crrna的结合位置设计满足使用需求的探针，并对探针进行常规的荧光基团和荧光淬灭基团的标记。此外，本技术中没有提及的试剂或步骤，都可以参考现有的crispr/cas12a系统。
23.本技术的再一面公开了一种病原体检测试剂盒，其中，病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒；试剂盒包括反应载体，反应载体中承载有fncas12a突变体和crrna的复合物；fncas12a突变体为本技术的应用中的fncas12a突变体，crrna为针对病原体的检测靶标设计的特异性crrna；针对病原体的检测靶标设计的特异性crrna，具体包括，针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna；针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.2所示序列，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.3所示序列，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna为seq id no.4所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna为seq id no.5所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基
因保守区域设计的特异性crrna为seq id no.6所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna为seq id no.7所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna为seq id no.8所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna为seq id no.9所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna为seq id no.10所示序列。
24.需要说明的是，本技术的试剂盒能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒，四种病原体的9个检测靶标位点，极大的方便了四种病原体的检测。尤其是，本技术的试剂盒能够更加精准地检测点突变，这对于检测易突变病原体如流感病毒、冠状病毒等非常重要。可以理解，本技术的病原体检测试剂盒中，除了fncas12a突变体和crrna的复合物以外，还可以包含其他试剂，例如crispr/cas12a系统中常规使用的试剂；当然，这些常规使用的试剂也可以通过市售购买获得，在此不作具体限定。
25.本技术的一种实现方式中，本技术的试剂盒采用的反应载体为多孔板或微流控芯片。
26.本技术的一种实现方式中，本技术的试剂盒还包括阳性对照样本，阳性对照样本包括选自甲型流感病毒pb1保守区域的靶标序列，选自乙型流感病毒pb1保守区域的靶标序列，选自呼吸道腺病毒保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的靶标序列。
27.本技术的一种实现方式中，选自甲型流感病毒pb1保守区域的靶标序列为seq id no.11所示序列，选自乙型流感病毒pb1保守区域的靶标序列为seq id no.12所示序列，选自呼吸道腺病毒保守区域的靶标序列为seq id no.13所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域的靶标序列为seq id no.14所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的靶标序列为seq id no.15所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体的靶标序列为seq id no.16所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的靶标序列为seq id no.17所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的靶标序列为seq id no.18所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的靶标序列为seq id no.19所示序列。
28.需要说明的是，本技术的试剂盒中，阳性对照样本实际上就是包含本技术的特异性crrna和探针结合位置的核酸片段，这些核酸片段也可以克隆到常规的载体中作为阳性质粒。
29.由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：
30.本技术研究发现fncas12a突变体能够用于核酸检测，并基于此提出了一种新的基于fncas12a突变体的核酸检测方法，以及能够同时检测四种病原体的9个靶标位点的病原体检测试剂盒。本技术基于fncas12a突变体的核酸检测方法和病原体检测试剂盒，在拓展检测靶点范围的同时具有高度特异性，尤其适用于snp位点检测。
附图说明
31.图1是本技术实施例中基于fncas12a突变体的核酸检测结果。
具体实施方式
32.fncas12a识别的pam序列为tttn，因此其识别序列比较受限，大大限制了其检测靶点范围。本技术研究发现，fncas12a突变体的识别pam序列为yn，即cn/tn，大大改善了其靶向序列受限状况，fncas12a突变体几乎不受限。本技术进一步的研究证明，fncas12a突变体的特异性并没有因此而降低，在大大拓展检测靶点范围的同时保证了其高度特异性。因此，本技术创造性的将fncas12a突变体应用于核酸检测，并提出了一种基于fncas12a突变体的核酸检测方法，以及基于fncas12a突变体的病原体检测试剂盒。
33.下面通过具体实施例对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。
34.实施例
35.本实施例的检测靶标由合成的dna序列经过rpa扩增而来。本例选取甲型流感病毒pb1保守区域、乙型流感病毒pb1保守区域、呼吸道腺病毒保守区域、新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域、n基因保守区域、s基因614位、453位突变体等靶点；分别设计约300bp长度作为扩增靶标交付上海生工进行dna合成。各靶点的具体序列如下：
36.甲型流感病毒pb1保守区域的扩增靶标为seq id no.11所示序列，seq id no.11：
[0037]5’‑
atggaaattgttcagcaaacaagagtggataaactgacccaaggccgccagacctatgactggacgttgaatagaaatcagccggctgctaccgcattggccaacactatagaggtattcagatcgaatggcctgacagccaatgaatcaggaaggttgatcgatttcctcaaggacgtgatggattcaatggataaggaagaaatggagattacaacacatttccagaggaagaggagagtgagggacaacatgaccaagaaaatggtcacacagagaacaataggaaagaaaaaacaaagactgaacaaaaggagctacctaataagagcacttacattgaacacaatgacaaaggatgctgaaagaggcaagctgaaaaggagggcaatcgcaacacccgggatgcaaatcagaggattcgtgtattttgtagaagcactagcgaggagcatctgtgagaaacttgagcaatctggcctccctgtcggagggaatgagaagaaagctaaattggcaaatgttgtgaggaagatgatgactaattcacaagatacagagctctccttcacaattactggggacaacaccaaatggaatgagaatcaaaacccccggatgtttctagcaatgataacatacatcacaagaaaccagccagaatggtttagaaatgtcttaagcattgctcctataatgttctcaaacaagatggcgagattaggaaaagggtacatgttcgaaagtaagagtatgaagttacggacacaagtaccagcggaaatgctcgcaaatattgacctgaaatacttcaacaaatcaacaagagagaaaatcgagaaaataagacctctactgatagatggcacagcctcattgagtcctggaatgatgatgggcatgttcaacatgttgagtacagtcttaggagtttcaattctgaatctcgggcagaagaagtacaccaaaaccacatattggtgggacgga-3’。
[0038]
乙型流感病毒pb1保守区域的扩增靶标为seq id no.12所示序列，seq id no.12：
[0039]5’‑
tctcatggaacgggaacaggctacacaatagacaccgtgattagaacacacgagtactcaaacaagggaaaacaatacatttctgatgttacaggatgtgtaatggtagatccaacaaatgggccattacccgaagacaatgaaccgagtgcctatgcacaattggattgtgttctggaggctttggatagaatggatgaagaacatccaggtctgtttcaagcagggtcacagaatgccatggaggcactaatggtcacaacagtggacaaattgactcaggggagacagacctttgattggacggtgtgtagaaaccaacctgctgcaacggcactgaacacaacaataacctcttttaggttgaatgatttaaatggagccgacaagggtggattagtgcccttttgccaagatatcattgattcattagacaaacctgaaa
tgattttcttcacagtaaagaatataaagaaaaaattgcctgctaaaaacagaaagggtttccttataaaaagaatacctatgaaggtaaaagacagaataacaagagtggaatacatcaaaagagcattatcattaaacacaatgactaaagatgctgaaagaggcaaactaaaaagaagagcaattgccaccgctgggatacaaatcagaggatttgtattagtagttgaaaacttggctaaaaatatctgtgaaaatctagagcaaagtggtttacccgtaggtggaaacgaaaagaaggccaaactatcaaatgcagtggctaaaatgctcagtaattgtccaccaggagggatcagtatgactgtgacaggagacaatactaaatggaatgaatgcttaaatccaagaatctttttggctatgactgaaagaataaccagagacagcccaatttggttccgggatttttgtagtatagcaccggtcttgttctccaataaaatagctagattgggaaaagggttcatgataacaagtaaa-3’。
[0040]
呼吸道腺病毒保守区域的扩增靶标为seq id no.13所示序列，seq id no.13：
[0041]5’‑
cagctgctgcagaagctaaggcaaacatagttgccagcgactctacaagggttgctaacgctggagaggtcagaggagacaattttgcgccaacacctgttccgactgcagaatcattattggccgatgtgtctgaaggaacggacgtgaaactcactattcaacctgtagaaaaagatagtaagaatagaagctataatgtgttggaagacaaaatcaacacagcctatcgcagttggtatctttcgtacaattatggcgatcccgaaaaaggagtgcgttcctggacattgctcaccacctcagatgtcacctgcggagcagagcaggtctactggtcgcttccagacatgatgaaggatcctgtcactttccgctccactagacaagtcagtaactaccctgtggtgggtgcagagcttatgcccgtcttctcaaagagcttctacaacgaacaagctgtgtactcccagcagctccgccagtccacctcgcttacgcacgtcttcaaccgctttcctgagaaccagattttaatccgtccgccggcgcccaccattaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggaccctgccgttgcgcagcagtatccggggagtccaacgtgtgaccgttactgacgccagacgccgcacctgtccctacgtgtacaaggcactgggcatagtcgcaccgcgcgtcctttcaagccgcactttctaaaaaaaaaaaaaatgtccattcttatctcgcccagtaataacaccggttggggtctgcgcgctccaagcaagatgtacggaggcgcacgcaaacgttctacccaacatcctgtccgtgttcgcggacattttcgcgctccatggggcgccctcaagggccgcactcgcgttcgaaccaccgtcgatgatgtaatcgatcaggtggttgccgacgcccgtaattatactcctactgcgcctacatctactgtgga-3’。
[0042]
新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域的扩增靶标为seq id no.14所示序列，seq id no.14：
[0043]5’‑
gttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaatcctaaaggattttgtgacttaaaaggtaagtatgtacaaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtttttaaacgggtttgcggtgtaagtgcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggcactagtactgatgtcgtatacagggcttttgacatctacaatgat-3’。
[0044]
新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的扩增靶标为seq id no.15所示序列，seq id no.15：
[0045]5’‑
cacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagct-3’。
[0046]
新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体的扩增靶标为seq id no.16所
示序列，seq id no.16：
[0047]5’‑
caaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaa-3’。
[0048]
新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的扩增靶标为seq id no.17所示序列，seq id no.17：
[0049]5’‑
caaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaa-3’。
[0050]
新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的扩增靶标为seq id no.18所示序列，seq id no.18：
[0051]5’‑
ttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtttagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaac-3’。
[0052]
新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的扩增靶标为seq id no.19所示序列，seq id no.19：
[0053]5’‑
ttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaac-3’。
[0054]
以上序列合成后，定量至100copy/μl作为rpa扩增模板。rpa试剂盒(rt-basic 48t)采购自武汉君诺德生物技术有限公司。
[0055]
针对以上9个靶标设计的rpa扩增引物如表1所示。
[0056]
表1 rpa引物
[0057][0058][0059]
rpa引物由上海生工合成，引物定量至10μm。rpa试剂盒使用时提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
[0060]
1)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer；
[0061]
2)每个反应管分别加入2μl上游引物和2μl下游引物，引物浓度10μm，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中；
[0062]
3)向反应管中依次加入12.1μl ddh2o和2μl核酸模板；
[0063]
4)最后向反应管中加入2.5μl b buffer并充分混合；
[0064]
5)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中42℃孵育30mins。
[0065]
产物用普洛麦格(北京)生物技术有限公司生产的wizard sv gel and pcr clean-up system(a9284)进行回收纯化并用nano drop 2000c(thermofisher)定量至10μm，作为阳性样本。
[0066]
针对以上9个靶标设计特异性crrna，具体序列如表2所示。
[0067]
表2特异性crrna
[0068][0069][0070]
针对以上9个靶标设计非特异性报告探针，具体序列：fam-cacta-bhq1。非特异性探针的5’端标记荧光基团fam，3’端标记淬灭基团bhq1。
[0071]
cas12a切割所用的特异性crrna和特异性探针都由上海生工合成，稀释定量至10μm。
[0072]
fncas12a突变体为seq id no.1所示序列。
[0073]
seq id no.1：
[0074]
mssyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdmsiyqefvnkyslsktlrfelipqgktlenikarglilddekrakdykkakqiidkyhqffieeilssvcisedllqnysdvyfklkksdddnlqkdfksakdtikkqiseyikdsekfknlfnqnlidakkgqesdlilwlkqskdngielfkansditdidealeiiksfkgwttyfsgfhenrknvyssndiptsiiyrivddnlpkflenkakyeslkdkapeainyeqikkdlaeeltfdidyktsevnqrvfsldevfeianfnnylnqsgitkfntiiggkfvngentkrkgineyinlysqqindktlkkykmsvlfkqilsdtesksfvidkleddsdvvttmqsfyeqiaafktveeksiketlsllfddlkaqkldlskiyfkndksltdlsqqvfddysvigtavleyitqqiapknldnpskkeqeliakktekakylsletiklaleefnkhrdidkqcrfeeilanfaaipmifdeiaqnkdnlaqisikyqnqgkkdllqasaeddvkaikdlldqtnnllhklkifhisqsedkanildkdehfylvfeecyfelanivplynkirnyitqkpysdekfklnfenstlargwdknvepnrtailfikddkyylgvmnkknnkifddkaikenkgegykkivyrllpgankmlpkvffsaksikfynpsedilrirnhsthtkngspqkgyekfefniedcrkfidfykqsiskhpewkdfgfrfsdtqrynsidefyrevenqgykltfenisesyidsvvnqgklylfqiynkdfsayskgrpnlhtlywkalfdernlqdvvyklngeaelfyrkqsipkkithpakeaianknkdnpkkesvfeydlikdkrftedkfffhcpitinfkssgankfndeinlllkekandvhilsidrgerhlayytlvdgkgniikqdtfniigndrmktnyhdklaaiekdrdsarkdwkkinnikemkegylsqvvheiaklvieynaivvfedlnfgfkrgrfkvekqvyqklekmlieklnylvfkdnefdktggvlrayqltapfetfkkmgkqtgiiyyvpagftskicpvtgfvnqlypkyesvsksqeffskfdkicynldkgyfefsfdyknfgdkaakgkwtiasfgsrlinfrnsdknhnwdtrevyptkelekllkdysieyghgecikaaicgesdkkffakltsvlntilqmrnsktgteldylispvadvngnffdsrqapknmpqdadangayhiglkglmllgriknnqegkklnlvikneeyfefvqnrnn*
[0075]
根据seq id no.1所示序列的fncas12a突变体，由上海生工合成其核酸表达序列，并转化至表达载体中。将表达载体转化至bl21(de3)并涂布于lb-卡纳霉素平板上于37℃过夜培养，挑取单克隆接种至50ml的lb添加有50μg/ml卡那霉素培养基中于37℃过夜震荡培
养，在以1％比例转接至5
×
1l的lb培养基中于37℃震荡培养至od≈0.6，将培养温度调整至16℃，并添加终浓度0.2mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，培养16h，离心收集菌体。用ni-nta亲和层析平衡buffer悬浮菌体并加入终浓度2mm的pmsf，使用超声破碎仪裂解细胞，超声3s暂停3s处理20min。破碎后的细胞15000rpm离心30min，转移上清到干净离心管中，再次离心30min。用0.25μm孔径的过滤器过滤上清液，补加pmsf到终浓度为1mm。以2ml/min速度将上清液样品流经ni-nta亲和层析平衡buffer平衡好的histrap hp柱子，收集流穿液。用ni-nta亲和层析平衡buffer以2ml/min速度继续冲洗柱子，直至紫外和电导稳定。ni-nta亲和层析洗脱buffer梯度洗脱结合到柱子上的蛋白，用分布收集器收集。sds-page电泳检测收集到的蛋白，富集目的蛋白。将收集到的蛋白溶液中nacl浓度逐步透析到50mm。以2ml/min速度将透析过样品流经用离子交换柱hitrap q/sp hp平衡buffer平衡好的hitrap q/sp柱子，收集流穿液。用离子交换柱hitrap q/sp hp洗脱buffer梯度洗脱结合到柱子上的蛋白，用分布收集器收集。sds-page电泳检测收集到的蛋白，富集目的蛋白，并将蛋白体积浓缩至10ml以内。用分子筛分选浓缩后的蛋白，分布收集器收集到的蛋白用sds-page检测，把seq id no.1所示序列大小的蛋白收集起来，用bradford定量并将蛋白稀释或浓缩到6mg/ml，再将蛋白用预冷的甘油1:1稀释，分装冻存备用，即获得fncas12a突变体。使用时，将fncas12a突变体定量至10μm。
[0076]
其中最终储存液组分为500mm nacl；20mm sodium acetate；0.1mm edta、0.1mm tcep以及50％glycerol，ph为6.5。akta蛋白纯化仪和层析柱购自ge health care。
[0077]
向384孔板中分别加入1μl的nebuffer 2.1(购自neb公司)、1μl的fncas12a突变体、1μl的同样探针和5μl的rtw；再向每列孔中加入对应的crrna 1μl。检测时，向孔中加入对应的阳性样本1μl；然后，将384孔板转移至37℃温箱孵育15分钟，再将孔板置于荧光显微镜(尼康倒置荧光显微镜t2-e)载物台上扫板观察拍摄图像。
[0078]
检测结果如图1所示，图1为阳性样本的检测结果，其中横坐标：rtw的列表示该列所有孔中都没有添加任何crrna，influa的列表示该列所有孔中都添加有针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，influb的列表示该列所有孔中都添加有针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，adv表示该列所有孔中都添加有针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna，orflab表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna，n表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna，d614表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna，g614表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna，y453表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna，f453表示该列所有孔中都添加有针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna；纵坐标，例如influa表示该排所有孔都添加甲型流感病毒pb1保守区域的阳性样本，influb表示该排所有孔中都添加有乙型流感病毒pb1保守区域的阳性样本，adv表示该排所有孔中都添加有呼吸道腺病毒保守区域的阳性样本，orflab表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的阳性样本，n表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的阳性样本，d614表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位
突变体的阳性样本，g614表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的阳性样本，y453表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的阳性样本，f453表示该排所有孔中都添加有新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的阳性样本。
[0079]
图1的结果显示，只有crrna和靶dna完全匹配的情况下才会有强烈的荧光斑点，不完全对应的突变体之间区辨度极好，所有靶标均可检出，且所有靶标之间均无交叉信号，说明本例的核酸检测方法及所设计的crrna和特异性探针具有良好的灵敏度和特异性。
[0080]
为了保证效果，本例将rpa体系和crispr反应体系分开进行，在384孔板内完成检测反应。需要特别指出的是crispr反应体系也可以和rpa反应体系置于一个反应体系内完成，反应器也可以是例如微流控芯片等其他反应器。除了rpa外，也可以采用其他扩增技术和fncas12a突变体结合。
[0081]
按照以上方法，本例分别对20列疑似含有甲型流感病毒的咽拭子样本，20列疑似含有乙型流感病毒的咽拭子样本，20列疑似含有呼吸道腺病毒的咽拭子样本以及20列疑似含有新型冠状病毒的咽拭子样本进行检测。以上样本最终都经过荧光定量聚合酶链式反应和临床检测确定实际感染情况。
[0082]
结果显示，20列疑似含有甲型流感病毒的咽拭子样本中检出甲型流感病毒阳性样本17列，20列疑似含有乙型流感病毒的咽拭子样本中检出乙型流感病毒阳性样本19列，20列疑似含有呼吸道腺病毒的咽拭子样本中检出呼吸道腺病毒16列，20列疑似含有新型冠状病毒的咽拭子样本中7列样本都能够检出orf1ab保守区域和n基因保守区域，并且这7列样本中1列为s基因614位突变体，1列为s基因614位野生型，2列为s基因453位突变体，3列为s基因453位野生型。以上结果与实际情况相符。
[0083]
以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

技术特征：

1.一种fncas12a突变体在核酸检测中的应用，其特征在于：所述fncas12a突变体识别pam序列为yn；其中，y表示c或t，n表示a、t、c或g。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述fncas12a突变体为seq id no.1所示序列。3.一种核酸检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1或2所述的应用中的fncas12a突变体，与针对检测靶标设计的特异性crrna结合，形成fncas12a突变体和crrna的复合物，利用fncas12a突变体和crrna的复合物特异性的识别检测靶标，并对结合在检测靶标上的探针进行切割；所述探针上标记有荧光基团和荧光淬灭基团，根据探针被切割后产生的荧光信号判断待测样本中是否含有检测靶标。4.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于：包括采用多孔板或微流控芯片作为反应载体，在反应载体中进行核酸检测反应。5.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于：所述待测样本为核酸样本或含核酸的样本。6.根据权利要求3-5任一项所述的核酸检测方法，其特征在于：所述检测靶标包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒中的至少一种。7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于：针对检测靶标设计的特异性crrna，具体包括，针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna。8.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于：针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.2所示序列，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.3所示序列，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna为seq id no.4所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna为seq id no.5所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna为seq id no.6所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna为seq id no.7所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna为seq id no.8所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna为seq id no.9所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna为seq id no.10所示序列。9.一种病原体检测试剂盒，其特征在于：所述病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒和新型冠状病毒；所述试剂盒包括反应载体，反应载体中承载有fncas12a突变体和crrna的复合物；所述fncas12a突变体为权利要求1或2所述的应用中的fncas12a突变体，所述crrna为针对病原体的检测靶标设计的特异性crrna；
针对病原体的检测靶标设计的特异性crrna，具体包括，针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna；针对甲型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.2所示序列，针对乙型流感病毒pb1保守区域设计的特异性crrna为seq id no.3所示序列，针对呼吸道腺病毒保守区域设计的特异性crrna为seq id no.4所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域设计的特异性crrna为seq id no.5所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域设计的特异性crrna为seq id no.6所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体设计的特异性crrna为seq id no.7所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型设计的特异性crrna为seq id no.8所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体设计的特异性crrna为seq id no.9所示序列，针对新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型设计的特异性crrna为seq id no.10所示序列。10.根据权利要求9所述的病原体检测试剂盒，其特征在于：所述反应载体为多孔板或微流控芯片；优选的，所述试剂盒还包括阳性对照样本，所述阳性对照样本包括选自甲型流感病毒pb1保守区域的靶标序列，选自乙型流感病毒pb1保守区域的靶标序列，选自呼吸道腺病毒保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的靶标序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的靶标序列；优选的，选自甲型流感病毒pb1保守区域的靶标序列为seq id no.11所示序列，选自乙型流感病毒pb1保守区域的靶标序列为seq id no.12所示序列，选自呼吸道腺病毒保守区域的靶标序列为seq id no.13所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的orf1ab保守区域的靶标序列为seq id no.14所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的n基因保守区域的靶标序列为seq id no.15所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位突变体的靶标序列为seq id no.16所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因614位野生型的靶标序列为seq id no.17所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位突变体的靶标序列为seq id no.18所示序列，选自新型冠状病毒sars-cov2019的s基因453位野生型的靶标序列为seq id no.19所示序列。

技术总结

本申请公开了FnCas12a突变体在核酸检测中的应用及核酸检测方法。本申请研究发现FnCas12a突变体能够用于核酸检测，并基于此提出了一种新的基于FnCas12a突变体的核酸检测方法，以及能够同时检测四种病原体的9个靶标位点的病原体检测试剂盒。其中，FnCas12a突变体识别PAM序列为YN；Y表示C或T，N表示A、T、C或G。本申请基于FnCas12a突变体的核酸检测方法和病原体检测试剂盒，在拓展检测靶点范围的同时具有高度特异性，尤其适用于SNP位点检测。尤其适用于SNP位点检测。尤其适用于SNP位点检测。