一种高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法与流程

1.本发明医药技术领域，具体涉及一种高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法。

背景技术：

2.低分子量肝素(lmwhs)通过化学或酶促解聚反应衍生自普通肝素(ufh)。与因子xa(fxa)相比，lmwhs对fiia的抑制活性降低，受益/风险比比肝素高，并且具有显著的药代动力学(pk)/药效学(pd)特性。依诺肝素是广泛使用的lmwh之一，它是通过猪肠粘膜的肝素苄基酯进行碱解聚得到的。与ufh相比，依诺肝素的fxa/fiia活性比率更高，组织因子抑制剂(tfpi)释放更一致，与血小板的相互作用更弱，对骨骼形成的抑制作用更小。与ufh相比，依诺肝素在皮下(sc)给药后具有更高且更一致的生物利用度，并且血浆半衰期更长，与血浆蛋白的结合力更弱。这些特性可转化为更可靠的抗凝作用，而无需实验室监测，并且在广泛的动脉和静脉血栓栓塞性疾病中均已确立了安全性和有效性。1990年10月依诺肝素钠注射液由sanofi在英国上市，商品名为目前上市规格有：2000axaiu(20mg)/0.2ml、4000axaiu(40mg)/0.4ml、6000axaiu(60mg)/0.6ml、8000axaiu(80mg)/0.8ml、10000axaiu(100mg)/1ml；1993年3月获得fda批准，由sanofi-aventis u.s.llc在美国上市，商品名为2008年4月在日本批准上市，商品名上市的规格为2000axaiu/0.2ml。2005年、2006年深圳市天道医药有限公司、杭州九源基因工程有限公司先后仿制国内上市。目前以依诺肝素钠、那曲肝素钠、达肝素钠为代表的低分子量肝素因抗血栓作用强、对血小板的副作用小和出血少等特点正逐步成为抗凝血药的主力品种，正在被临床各科广泛使用。
3.依诺肝素钠生产过程中，降解出此杂质，因此对成品中的苯甲醛杂质进行了研究。对于工艺中产生的苯甲醛杂质，在原料和制剂中需要进行质量控制的，因此，实现依诺肝素钠与其苯甲醛杂质的分离与分析，对于依诺肝素钠的质量控制具有重要的现实意义。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法。
5.所述的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为1:1的乙腈和水混合溶剂为流动相；柱温为25-40℃，优选30℃；检测波长为210-280nm，优选250nm；进样体积为5-50μl，优选20μl。
6.供试品溶液的配制方法：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取依诺肝素钠原料药或制剂用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.1mg依诺肝素钠的溶液。
7.对照品溶液的配制方法：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取苯甲醛精密称定，用溶剂定量稀释制成每1ml中含0.1μg苯甲醛的溶液。
8.将对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积计算苯甲醛的含量。
9.本发明的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法分离度好、专属性强、灵敏度高、精确度更高，可用于依诺肝素钠原料和制剂的质量控制。
附图说明
10.图1本发明高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的线性范围图。
具体实施方式
11.以下将通过实施例形式，对本发明的依诺肝素钠苯甲醛杂质测定方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的权利要求范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
12.1.仪器
13.电子天平(梅特勒-托利多)，高效液相谱仪(安捷伦)，烘箱(上海精宏实验设备有限公司)，容量瓶(100ml、25ml、20ml及10ml)，移液管(10ml和1ml)，量筒(1000ml)，烧杯(1000ml和5000ml)
14.2.试剂
15.乙腈(默克)
16.3.谱条件
17.采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(50:50)为流动相；柱温为25-40℃；检测波长为210-280nm；进样体积5-50μl。
18.4.检测波长的选择
19.取苯甲醛精密称定50mg，置100ml的量瓶中加20％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml的量瓶中，用20％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml的量瓶中，用20％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，精密量取20μl，注入液相谱仪。
20.通过苯甲醛光谱图可知，苯甲醛在250nm处有最大吸收，故将250nm作为检测波长。
21.5.对分析方法进行如下项目的验证
22.5.1专属性及系统适用性
23.5.1.1溶液的配制
24.稀释剂：20％甲醇水。
25.空白溶剂：稀释剂。
26.对照品储备液(1)：精密称取苯甲醛对照品50mg，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
27.对照品储备液(2)：精密量取对照品储备液(1)1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
28.对照品溶液：精密量取对照品储备液(2)1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
29.5.1.2测定法
30.精密量取空白溶剂、对照品溶液各20μl，分别注入液相谱仪，记录谱图。
31.5.1.3实验结果
32.表1 专属性实验结果1
33.名称苯甲醛保留时间(min)空白溶液/对照品溶液5.381
34.表2专属性试验结果-系统适用性
[0035][0036]
5.1.4实验结论
[0037]
系统适用性：连续测定6次的对照品溶液峰面积的rsd为0.29％(小于2.0％)，保留时间的rsd为0.14％(小于1.0％)，空白溶液不干扰苯甲醛检测，说明本方法专属性良好。
[0038]
5.2定量限及检测限
[0039]
5.2.1溶液的配制
[0040]
稀释剂：20％甲醇水。
[0041]
对照品溶液：同专属性与系统精密度项下对照品溶液。
[0042]
定量限溶液：精密量取对照品溶液1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0043]
检测限溶液：精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0044]
5.2.2测定法
[0045]
精密量取上述空白溶液、检测限与定量限溶液各20μl，注入液相谱仪。
[0046]
5.2.3实验结果
[0047]
表3检测限验证结果
[0048]
[0049][0050]
表4定量限验证结果
[0051][0052]
5.2.3实验结论
[0053]
检测限浓度为0.0006μg/ml，信噪比(s/n)为4.2，相当于供试品溶液浓度0.0006％。定量限浓度为0.0020μg/ml，相当于供试品溶液浓度0.0020％；定量限连续测定6次峰面积的rsd为2.8％，信噪比(s/n)在11.7～12.6之间。
[0054]
5.3线性和范围
[0055]
5.3.1溶液的配制
[0056]
稀释剂：20％甲醇水。
[0057]
对照品储备液(2)：同专属性与系统精密度项下对照品溶液储备液(2)。
[0058]
loq线性溶液：同定量限与检测限项下定量限溶液。
[0059]
l1(10％线性溶液)：精密量取对照品储备液(2)0.5ml，置250ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0060]
l2(20％线性溶液)：精密量取对照品储备液(2)1ml，置250ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0061]
l3(50％线性溶液)：精密量取对照品储备液(2)1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0062]
l4(100％线性溶液)：精密量取对照品储备液(2)1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0063]
l5(200％线性溶液)：精密量取对照品储备液(2)2ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0064]
5.3.2测定法
[0065]
精密量取上述空白溶液、定量限溶液、各线性溶液各20μl，注入液相谱仪。
[0066]
5.3.3实验结果
[0067]
表5线性和范围实验结果
[0068][0069]
5.3.4实验结论
[0070]
线性图见图1，在0.0020μg/ml～0.2017μg/ml范围内呈线性，线性方程为y＝144.9987x-0.0368，相关系数r为1.0000。残差平方和为0.012，剩余标准差相当于100％响应值百分比为0.38％。
[0071]
实施例1
[0072]
供试品溶液的配制方法：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取依诺肝素钠原料药用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.1mg依诺肝素钠的溶液。
[0073]
对照品溶液的配制方法：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取苯甲醛精密称定，用溶剂定量稀释制成每1ml中含0.1μg苯甲醛的溶液。
[0074]
谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为1:1的乙腈和水混合溶剂为流动相；柱温为30℃；检测波长为250nm；进样体积为20μl。
[0075]
将对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积计算苯甲醛的含量。

技术特征：

1.一种高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法，其特征在于，所述方法的谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为1:1的乙腈和水混合溶剂为流动相；柱温为25-40℃，优选30℃；检测波长为210-280nm，优选250nm；进样体积为5-50μl，优选20μl。2.根据权利要求1所述的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法，其特征在于，供试品溶液的配制方法为：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取依诺肝素钠原料药或制剂用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.1mg依诺肝素钠的溶液。3.根据权利要求1所述的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法，其特征在于，对照品溶液的配制方法为：以体积比为20:80的甲醇和水混合液为溶剂，取苯甲醛精密称定，用溶剂定量稀释制成每1ml中含0.1μg苯甲醛的溶液。4.根据权利要求1所述的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法，其特征在于，将对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积计算苯甲醛的含量。

技术总结

本发明公开了一种高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法。该方法的谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为1:1的乙腈和水混合溶剂为流动相；柱温为25-40℃；检测波长为210-280nm；进样体积为5-50μL。将对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积计算苯甲醛的含量。本发明的高效液相谱分离测定依诺肝素钠中苯甲醛杂质的方法分离度好、专属性强、灵敏度高、精确度更高，可用于依诺肝素钠原料和制剂的质量控制。诺肝素钠原料和制剂的质量控制。诺肝素钠原料和制剂的质量控制。