一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及癌症技术领域。

背景技术：

2.结直肠癌是一种恶性消化道肿瘤，近一半的患者在初诊时已存在远处转移。结直肠癌的靶向药物包括以：以表皮生长因子受体(egfr)为靶点的单克隆药物，代表药物为西妥昔单抗和帕尼单抗；以血管内皮生长因子(vegf)为靶点的单克隆药物，代表药物是贝伐珠单抗。
3.在我国，结直肠癌中使用最广泛的egfr单抗是西妥昔单抗，它能结合egfr的胞外区域，阻断egfr激活和信号转导，从而起到抗肿瘤作用。原癌基因ras(包括kras、nras等)是egfr下游信号通路中重要的分子，ras基因的突变会影响egfr抑制剂的效果。大量文献显示，原癌基因ras突变后对西妥昔单抗等不敏感。转移性结直肠癌患者中，约50％为ras基因野生型，这部分患者可以从egfr单抗联合化疗中获益。
4.即使对ras基因野生型的结直肠癌患者来说，西妥昔单抗的中位有效时间也仅一年左右，耐药机制与肿瘤组织存在ras基因异质性、egfr信号通路改变或旁路激活或egfr的胞外区域发生突变有关。但具体机制仍有待于进一步探索。因此，探索肠癌西妥昔单抗耐药的分子机制，寻特异性预测疗效的生物标志物及有效的靶点，具有重要的临床意义。

技术实现要素：

5.本发明为了解决上述问题，提供了一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒，避免可能无效的人过多地暴露在药物中，减少副作用，提高社会经济学效益。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明的第一方面提供了一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒，包括检测天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平的试剂。
8.天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase，aep)也称为δ-分泌酶或legumain(lgmn)，是一种c13家族的半胱氨酸肽链内切酶。在人类中，aep由位于染体14q32.12上的lgmn基因编码。关于aep蛋白及其编码基因的信息可以从ncbi、genecards、kegg等生物信息数据库中获得。
9.优选地，检测天冬酰胺内肽酶蛋白水平的试剂包括可与aep特异性结合的抗体、寡肽、配体、肽核酸和适配体等，包括但不限于aep抗体(r&dsystems,af2199和r&d systems,dy4769)。
10.优选地，检测天冬酰胺内肽酶基因表达水平的试剂包括可特异性扩增aep全部或部分编码基因的引物、探针和反义核苷酸等，包括但不限于寡聚胸腺嘧啶引物组，所述的寡聚胸腺嘧啶引物组包括：
11.如seq id no.1所示的正向引物：tcgtcctacgcctgttacta；
12.如seq id no.2所示的负向引物：gatcttccacgtccgaatctt。
13.本发明所述的试剂盒还可以包括一种或多种适用于提取或检测天冬酰胺内肽酶蛋白或其编码基因表达水平的其他组分组合物、溶液或装置。
14.本发明的第二方面提供了一种用于结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性预测信息的方法，包括下述步骤：
15.获取结直肠癌患者的生物样本，利用上述技术方案所述试剂盒检测生物样本中的天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平信息。
16.优选地，所述的生物样本为患者肿瘤组织或血清。
17.优选地，所述的方法还包括，将生物样本中天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平与对照组或预先设定的限值进行比较，得出结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性预测信息。
18.优选地，所述预先设定的限值为：患者血清中天冬酰胺内肽酶蛋白表达水平为218.35pb/ml；当天冬酰胺内肽酶蛋白表达水平＞218.35pb/ml时为高表达水平，判断该结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性较高；当天冬酰胺内肽酶蛋白表达水平≤218.35pb/ml时为低表达水平，判断该结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药较低。
19.本发明的第三方面提供了天冬酰胺内肽酶抑制剂在制备预防或结直肠癌西妥昔单抗耐药的药物中的应用。
20.优选地，所述的天冬酰胺内肽酶抑制剂包括rr-11aanalog(授权专利号：cn202110256005.0)、天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂(授权专利号cn201711329218.1)、δ-secretase inhibitor 11(pubchem cid:1095027，j&k scientific ltd)中的一种或多种。
21.本发明的第四方面一种用于预防或结直肠的药物组合物，包括西妥昔单抗和天冬酰胺内肽酶抑制剂。
22.优选地，所述的天冬酰胺内肽酶抑制剂包括rr-11aanalog(授权专利号：cn202110256005.0)、aep抑制剂(授权专利号cn201711329218.1)、δ-secretase inhibitor 11(pubchem cid:1095027，j&k scientific ltd)中的一种或多种。
23.优选地，西妥昔单抗与天冬酰胺内肽酶抑制剂的比值为5～50μg/ml：20～40μm；进一步优选为10μg/ml：30μm。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果：
25.本发明通过生物信息学分析，筛选出与西妥昔单抗疗效有关的aep基因，实验发现aep与临床上西妥昔单抗的无进展生存期(pfs)有关，aep高表达的患者pfs短。进一步研究显示，aep过表达的结直肠癌细胞对西妥昔单抗的敏感性下降，耐药性增强。采用aep抑制剂处理aep过表达的结直肠癌细胞后，恢复对西妥昔单抗的敏感性。
26.本发明首次发现天冬酰胺内肽酶(aep)与结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性有关，aep可作为预测晚期肠癌西妥昔单抗疗效的特异性标志物，从而进一步提供了一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒。基于本发明的研究，aep也可以作为改善肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药性或增强西妥昔单抗敏感性的靶点，从而进一步提供了aep抑制剂在制备预防或结直肠癌西妥昔单抗耐药的药物中的应用、以及一种包括西妥昔单抗和天冬酰胺内肽酶抑制剂的结直肠药物组合物。
附图说明
27.图1为生物信息学分析天冬酰胺内肽酶表达水平与西妥昔单抗疗效的生存曲线图；
28.图2为免疫组化检测患者肿瘤组织中aep表达水平图；
29.图3为aep表达水平与患者pfs密切相关性图；
30.图4为验证细胞中aep敲低或过表达的效果图；
31.图5为aep敲低或过表达的细胞对西妥昔单抗的敏感性图；
32.图6为西妥昔单抗联合aep抑制剂的作用图。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.从geo数据库(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝gse5851)下载含80例kras野生型且接受西妥昔单抗的肠癌患者的基线肿瘤组织表达谱芯片数据(gse5851)，以基因表达量中位数为cutoff值，采用单因素分析(log-rank)，p《0.05为具有统计学意义。
36.分析结果如图1所示，天冬酰胺内肽酶(aep)基因的表达水平与患者无进展生存期(pfs)密切相关(p＝0.00133)，天冬酰胺内肽酶(aep)基因高表达的患者pfs短。
37.实施例2
38.收集2016年8月至2017年4月复旦大学附属中山医院肿瘤内科收治的44例转移性结直肠癌患者，这些患者为初诊晚期结直肠腺癌、既往未经过全身姑息、姑息一线拟使用西妥昔单抗。收集患者初诊时的肿瘤活检标本(肠镜或手术取得)和外周血。通过免疫组化和elisa方法分别检测受试患者的肿瘤组织和外周血血清中天冬酰胺内肽酶(aep)表达水平。
39.免疫组化操作步骤如下：
40.(1)将组织白片置于60度烘箱中30分钟或37℃过夜，然后置于二甲苯溶液中浸泡30分钟；
41.(2)将组织切片依次放入二甲苯溶液i、ii，各浸泡10分钟；
42.(3)将组织切片置于95％、80％、75％浓度乙醇溶液中浸泡各5分钟；
43.(4)采用pbs溶液清洗切片2～3次，每次各5分钟；
44.(5)将5％过氧化氢加入湿盒中，使组织完全被覆盖，灭活内源性过氧化物酶；
45.(6)然后用pbs溶液清洗切片2～3次，每次各5分钟；
46.(7)微波炉热修复：在微波炉里加热柠檬酸盐修复液，放入组织切片，持续用微波炉低火加热7分钟，断电冷却2分钟，再继续低火2分钟。取出切片置于通风处，冷却至室温。采用pbs溶液清洗切片3次，每次各5分钟；
47.(8)滴加65％bsa封闭切片，室温40分钟，甩去多余液体；
48.(9)加入一抗aep抗体，37℃下1～2小时或4℃过夜。过夜次日需37℃复温45分钟；
49.(10)采用pbs溶液清洗3次，各5分钟；
50.(11)滴加a液二抗(不必稀释)，浸润整张组织切片，常温孵育1小时，后使用pbs溶液清洗3次，每次5分钟；
51.(12)加入b液1ml和dab 20ul混匀，将此工作液滴加在切片上，显5～10分钟，在显微镜下观察染程度。以出现阳性，并且没有黄背景为宜；
52.(13)采用pbs或自来水冲洗10分钟，终止反应；
53.(14)将少量苏木素均匀滴加至切片上，复染2分钟，后于流水下缓慢冲洗10-15分钟；
54.(15)将组织切片依次置于75％、80％、90％浓度的乙醇溶液中各5分钟；
55.(16)后置于二甲苯溶液i、ii中，各10分钟；
56.(17)中性树胶封片，加盖玻片，组织部位不留气泡，显微镜下观察并拍照。
57.免疫组化评分方法如下：依据染强度，可分为0分(无染)、1分(浅染)、2分(中等染)、3分(强染)；依据染面积，可分为1分(≤25％)、2分(＞25％，≤50％)、3分(＞50％，≤75％)，4分(＞75％)。将染强度和染面积的评分相乘，乘积介于0-12分，将0-6定义为低表达，7-12分定义为高表达。结果如图2所示：左侧两张图为aep高表达的示例，右侧两张图为aep低表达的示例。
58.elisa方法检测方法为酶联免疫吸附实验。操作步骤如下：
59.(1)将capture抗体经不含载体蛋白的pbs溶液稀释至适当浓度，在96孔板中每孔加入100μl稀释的capture抗体，室温下孵育过夜；
60.(2)采用wash buffer洗涤三次，完全弃去洗涤液，倒置于干净的吸水纸上；
61.(3)每孔加入300μl reagent diluent，室温下培养至少1小时；按步骤(2)重复洗涤；
62.(4)每孔加入100μl稀释后的样品或标准品，室温下密封孵育2小时，按照步骤(2)重复洗涤；
63.(5)每孔加入100μlaep抗体，室温下密封孵育2小时，按照步骤(2)洗涤；
64.(6)每孔加入100μl substrate solution，常温下避光孵育20分钟；
65.(7)每孔加入50μl stop solution，轻轻震荡，使之混匀，孔中颜由蓝变黄；
66.(8)30分钟内读取波长450nm处的od值；
67.(9)制作标准曲线，计算蛋白表达水平。
68.检测结果显示患者血清aep表达水平平均值为234.88
±
87.11pg/ml，中位数为218.35
±
pg/ml，范围为101.67-423.33pg/ml。以中位数为临界值，将aep的表达水平分为高表达(》218.35pg/ml)和低表达(≤218.35pg/ml)。如图3所示，结果发现患者肿瘤组织(左图)和血清(右图)中aep的表达水平与患者无进展生存期(pfs)密切相关，高表达的患者中位pfs短于低表达患者。
69.以上结果显示aep高表达与西妥昔单抗后的无进展生存时间短有关。
70.实施例3
71.采用慢病毒转染直肠癌细胞caco2和直肠癌细胞nci-h508，敲低aep(aep-kd)或过表达aep(aep-oe)，并筛选出稳定表达的细胞株。具体步骤如下：
72.(1)构建aep干扰或过表达质粒载体；
73.(2)慢病毒转染前18～24小时，将细胞均匀铺入六孔板中，继续培养；
74.(3)待细胞密度达60-80％左右，弃去培养基，pbs清洗2遍；
75.(4)加入含0.1％polybrene的无血清培养基，按照慢病毒操作手册，加入适量病毒悬液，充分混匀；
76.(5)继续培养24小时，观察细胞状态，弃去含病毒的培养基，更换为新鲜完全培养基；
77.(6)继续培养，72小时后于荧光显微镜下观察其转染情况；
78.(7)采用western blot和elisa方法检测敲低或过表达的效果，筛选得到稳定表达的aep敲低细胞株aep-kd(caco2-aep-kd和nci-h508-aep-kd)和稳定表达的aep过表达细胞株aep-oe(caco2-aep-oe和nci-h508-aep-oe)。
79.结果如图4所示，4a为caco2和nci-h508两株细胞western blot的检测结果，4b为caco2和nci-h508两株细胞上清中elisa的检测结果。结果显示相对于空白对照组(control)和敲低空质粒组(kd-nc)，aep敲低组1(aep-kd1)和aep敲低组2(aep-kd2)细胞中aep的表达量明显下降。相对于空白对照组(control)和过表达空质粒组(oe-nc)aep过表达组(aep-oe)组细胞的aep表达量明显升高。
80.根据细胞ic
50
值(caco2细胞约为50μg/ml，nci-h508细胞约为1μg/ml)设置一系列浓度梯度的西妥昔单抗处理48小时，培养条件为5％co2条件下37℃饱和湿度培养箱内常规培养。caco2细胞中西妥昔单抗浓度范围0-250μg/ml，浓度梯度设置为0、5、10、50、100、250μg/ml；nci-h508细胞中西妥昔单抗浓度范围0-50μg/ml，浓度梯度设置为0、0.5、1、5、10、50μg/ml。采用cck-8法检测细胞增殖能力，结果如图5所示，左图为caco2细胞，右图为nci-h508细胞。结果显示在西妥昔单抗干预后，相对于空白对照组(control)和aep敲低空质粒组(aep-kd-nc)，aep敲低组1(aep-kd1)和aep敲低组2(aep-kd2)细胞增殖明显降低，即对西妥昔单抗的敏感性增加；相对于空白对照组(control)和aep过表达空质粒组(aep-oe-nc)，aep过表达组(aep-oe)细胞增殖明显升高，即对西妥昔单抗的敏感性降低。
81.以上结果显示，aep过表达的细胞对西妥昔单抗的敏感性下降，耐药性增强。
82.实施例4
83.采用天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂(授权专利号cn201711329218.1)(20μm和40μm)加入到caco2-aep-oe及nci-h508-aep-oe细胞培养液中，与西妥昔单抗(分别为50μg/ml和5μg/ml)同时处理细胞，并将细胞放置于5％co2条件下37℃饱和湿度培养箱内常规培养。采用cck8法检测细胞活性。操作步骤如下：
84.(1)将实施例3制备得到的nci-h508-aep-oe、caco2-aep-oe细胞用胰酶消化，适当延长消化时间，保证贴壁细胞可被吹散形成单个悬浮细胞；
85.(2)用细胞计数仪进行计数，计算细胞密度，将细胞稀释到密度为20000个细胞/ml。细胞铺于96孔板，每孔100μl培养基，其中每孔细胞数为2000个；
86.(3)次日按浓度梯度加入药物，每个浓度3复孔，处理细胞48小时；
87.(4)cck8试剂检测细胞活性
88.(5)将cck8用无血清培养基以1:10稀释后避光保存；
89.(6)用真空泵洗净孔内培养基，但应避免吸头接触底部而致贴壁细胞被吸出；
90.(7)每次操作12孔，以防孔内残余培养基完全蒸发而影响细胞活性；
91.(8)将避光保存的稀释后cck8试剂加入孔内，每孔100μl；
92.(9)96孔板37℃避光孵育2小时；
93.(10)用酶标仪检测od450nm时的吸光度。
94.结果如图6所示，上图为caco2-aep-oe细胞检测结果，下图为nci-h508-aep-oe细胞检测结果，结果显示aep过表达的细胞经aep抑制剂处理(黑)后，恢复对西妥昔单抗的敏感性。
95.以上结果显示，aep抑制剂可以恢复耐药细胞对西妥昔单抗的敏感性。
96.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒，其特征在于，包括检测天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测天冬酰胺内肽酶蛋白水平的试剂包括天冬酰胺内肽酶抗体。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测天冬酰胺内肽酶基因表达水平的试剂包括寡聚胸腺嘧啶引物组，所述的寡聚胸腺嘧啶引物组包括：如seq id no.1所示的正向引物：tcgtcctacgcctgttacta；如seq id no.2所示的负向引物：gatcttccacgtccgaatctt。4.一种提供用于结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性预测信息的方法，其特征在于，包括下述步骤：获取结直肠癌患者的生物样本，利用权利要求1-3任意一项所述试剂盒检测生物样本中的天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平信息。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的生物样本为患者肿瘤组织或血清。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括，将生物样本中天冬酰胺内肽酶蛋白水平或其编码基因表达水平与对照组或预先设定的限值进行比较，得出结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性预测信息。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预先设定的限值为：患者血清中天冬酰胺内肽酶蛋白水平为218.35pb/ml；当天冬酰胺内肽酶蛋白表达水平＞218.35pb/ml时为高表达水平，判断该结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性较高；当天冬酰胺内肽酶蛋白表达水平≤218.35pb/ml时为低表达水平，判断该结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药较低。8.天冬酰胺内肽酶抑制剂在制备预防或结直肠癌西妥昔单抗耐药的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的天冬酰胺内肽酶抑制剂包括rr-11aanalog、天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂和δ-secretaseinhibitor 11中的一种或多种。10.一种用于预防或结直肠的药物组合物，其特征在于，包括西妥昔单抗和天冬酰胺内肽酶抑制剂。11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的天冬酰胺内肽酶抑制剂包括rr-11aanalog、天冬酰胺内肽酶小分子抑制剂和δ-secretase inhibitor 11中的一种或多种。12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其特征在于，西妥昔单抗与天冬酰胺内肽酶抑制剂的比值为5～50μg/ml：20～40μm。

技术总结

本发明提供一种预测结直肠癌患者对西妥昔单抗耐药性或西妥昔单抗疗效的试剂盒，包括检测天冬酰胺内肽酶(AEP)蛋白水平或其编码基因表达水平的试剂。本发明还提供了天冬酰胺内肽酶抑制剂在制备预防或结直肠癌西妥昔单抗耐药的药物中的应用，以及一种包括天冬酰胺内肽酶抑制剂和西妥昔单抗的用于结直肠癌的药物组合物。本发明首次发现AEP可作为预测晚期肠癌西妥昔单抗疗效的特异性标志物，可以作为改善肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药性或增强西妥昔单抗敏感性的靶点。药性或增强西妥昔单抗敏感性的靶点。