区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记及方法

1.本发明属于植物分子鉴定技术领域，具体涉及区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记及方法。

背景技术：

2.党参属物种(川党参codonopsis pilosula subsp.tangshen，羊乳codonopsis lanceolata，秦岭党参codonopsis tsinlingensis)之间形态特征高度相似，在药用过程中常存在混用的情况，为了确保党参属中药材的安全和有效使用，需要对容易混淆的党参属物种进行准确鉴定。
3.基于dna的标记物适合于药用植物的鉴别；其中，主要有三种dna条形码标记：通用(universal)、超级(super)和特异(specific)dna条形码。
4.通用(universal)dna条形码适用于所有药用植物，这类标记包括its2、psba-trnh、rbcl和matk，可作为鉴别样品的第一线工具，但其主要用于远缘物种的鉴别，缺乏对密切相关物种的鉴别能力。
5.完整的叶绿体已被认为是区分相关物种的超级条形码，表现出较高的鉴别能力和足够的可靠性。然而，由于可用的dna数量不足、组装完整的基因组及产生足够的原始数据以组装完整的基因组的测序费用昂贵、数据分析的复杂性等原因，超级dna条形码使用受到一定限制。
6.从高变异区寻特异的条形码可实现通用dna条形码和超级dna条形码的权衡，在缩短时间、降低成本的同时保证密切相关物种鉴定的准确性。因此，亟待提供一种区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的特异dna条形码。

技术实现要素：

7.本发明公开了区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记及方法，将其用于川党参、羊乳和秦岭党参的鉴定，结果准确可靠。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记，
10.分子标记1包括seq id no：1所示核苷酸序列中的2个snp位点：
11.第34位的snp位点c/a和第38位的snp位点g/t；
12.seq id no：1为tcgtacaagtattttagcaatactttcactgatmgtaktaaatgctattcgaac；
13.分子标记4包括seq id no：2所示核苷酸序列中：
14.第4-6位的indel位点tcg/gat和第127位的snp位点a/g；
15.seq id no：2为atckmkcctctattttctacttttcttgaaaaagtgttttctctctttgatttcttgtctatcttctttcatcttctctagtagggaattcaattagtattctaattgaattgttaatagcagtaargattctg。
16.进一步地，分子标记1中，
17.川党参的2个snp位点分别为a、t；
18.羊乳的2个snp位点分别为c、g；
19.秦岭党参的2个snp位点分别为a、g；
20.分子标记4中，
21.川党参的indel位点为tcg，snp位点为a；
22.羊乳的indel位点为gat，snp位点为a；
23.秦岭党参的indel位点为tcg，snp位点为g。
24.基于上述区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记的引物：
25.分子标记1的引物为：
26.上游引物：5
’‑
gtcattatccctcgagaagtag-3’，seq id no：3；
27.下游引物：5
’‑
gctgacctgctaacctctatac-3’，seq id no：4；
28.分子标记4的引物为：
29.上游引物：5
’‑
tagaaggtgggttgaaaggagt-3’，seq id no：5；
30.下游引物：5
’‑
agcctactctcaaaatcgaacc-3’，seq id no：6。
31.上述分子标记或上述引物可用于区分川党参、羊乳和秦岭党参物种。
32.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的试剂盒，包括上述引物。
33.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的方法，包括如下步骤：
34.(1)取待检测样品，提取dna；
35.(2)以步骤(1)提取的dna为模板，使用上述引物进行pcr扩增；
36.(3)对步骤(2)扩增产物进行测序。
37.优选地，步骤(2)中扩增体系为：
[0038]2×
taq pcrmaster mix 25μl，每个引物1μm，模板dna 1μl，加ddh2o至最终体积为50μl。
[0039]
优选地，步骤(2)中扩增程序为：
[0040]
94℃变性2min；
[0041]
94℃30s，退火温度30s，72℃60s，35个循环；
[0042]
72℃2min。
[0043]
综上所述，本发明分子标记及方法能够有效区分川党参、羊乳和秦岭党参物种，有利于党参属物种分类以及党参属物种衍生的药用产品判别。
附图说明
[0044]
图1所示为筛选出的五个高变异区；
[0045]
图2所示为pcr扩增结果；
[0046]
图3所示为com1测序结果；
[0047]
图4所示为com4测序结果。
具体实施方式
[0048]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049]
实施例
[0050]
1.高可变区的分析
[0051]
从3个质体党参属物种(川党参codonopsis pilosula subsp.tangshen，羊乳codonopsis lanceolata，秦岭党参codonopsis tsinlingensis)叶绿体的genbank文件中提取高度可变的基因间隔区(igs)，并使用extractseq提取igs序列。
[0052]
使用clustalw2对提取的序列进行比对，选项为"-type＝dna-gapopen＝10-gapext＝2"。
[0053]
用emboss软件包中的distmat程序实现的k2p进化模型计算基因间区域的遗传距离，参数为"-nucmethod 2"。映射的阈值为5，即在图中直观地显示出k2p值最高的前五个结果。这五个高变异区可以作为潜在的分子标记来区分3个党参属物种(图1)。
[0054]
2.模板dna的提取
[0055]
收集川党参、羊乳、秦岭党参三个品种各5株植物材料，共15株，使用dna提取试剂盒分别对15株植物材料提取dna作为pcr扩增的模板。
[0056]
3.pcr扩增：
[0057]
根据每个高可变区两端的保守序列设计引物，如表1所示。
[0058]
表1用于分析标记开发的5对引物
[0059][0060]
pcr扩增的最终体积为50μl，包括25μl 2
×
taq pcr master mix，每个引物1μm，1μl模板dna，和22μl ddh2o。
[0061]
所有扩增均在pro-flex pcr系统(applied biosystems,waltham,ma,usa)中进行，条件如下：94℃变性2分钟，然后进行35个循环，94℃30秒，特定退火温度(tm)30秒，72℃60秒，72℃2分钟作为最后延伸。
[0062]
pcr扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上观察，其中只有两对引物(com1和com4)获得扩增产物(图2)。
[0063]
4.sanger测序：
[0064]
在abi 3730xl仪器(applied biosystems,usa)上使用pcr扩增所用的相同引物对扩增成功的产物进行sanger测序。最终获得两个可以用于区分3个党参属物种的分子标记，测序结果见图3和图4。图3中两个方框标记的snp组合起来可以区分3个党参属物种，图4中一个方框标记的indel和一个方框标记的snp组合起来可以区分3个党参属物种。
[0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括分子标记1和/或分子标记4，所述分子标记1包括seq id no：1所示核苷酸序列中的2个snp位点：第34位的snp位点c/a和第38位的snp位点g/t；seq id no：1为tcgtacaagtattttagcaatactttcactgatmgtaktaaatgctattcgaac；所述分子标记4包括seq id no：2所示核苷酸序列中：第4-6位的indel位点tcg/gat和第127位的snp位点a/g；seq id no：2为atckmkcctctattttctacttttcttgaaaaagtgttttctctctttgatttcttgtctatcttctttcatcttctctagtagggaattcaattagtattctaattgaattgttaatagcagtaargattctg。2.根据权利要求1所述的区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记，其特征在于，所述分子标记1中，川党参的2个snp位点分别为a、t；羊乳的2个snp位点分别为c、g；秦岭党参的2个snp位点分别为a、g；所述分子标记4中，川党参的indel位点为tcg，snp位点为a；羊乳的indel位点为gat，snp位点为a；秦岭党参的indel位点为tcg，snp位点为g。3.基于权利要求1或2所述区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记的引物，其特征在于，分子标记1的引物为：上游引物：5
’‑
gtcattatccctcgagaagtag-3’，seq id no：3；下游引物：5
’‑
gctgacctgctaacctctatac-3’，seq id no：4；分子标记4的引物为：上游引物：5
’‑
tagaaggtgggttgaaaggagt-3’，seq id no：5；下游引物：5
’‑
agcctactctcaaaatcgaacc-3’，seq id no：6。4.权利要求1或2所述分子标记或权利要求3所述引物在区分川党参、羊乳和秦岭党参物种中的应用。5.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述引物。6.区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待检测样品，提取dna；(2)以步骤(1)提取的dna为模板，使用权利要求3所述引物进行pcr扩增；(3)对步骤(2)扩增产物进行测序。7.根据权利要求6所述的区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增体系为：2
×
taq pcr master mix 25μl，每个引物1μm，模板dna 1μl，加ddh2o至最终体积为50μl。8.根据权利要求6所述的区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增程序为：
94℃变性2min；94℃30s，退火温度30s，72℃60s，35个循环；72℃2min。

技术总结

本发明公开了区分川党参、羊乳和秦岭党参物种的分子标记及方法，属于植物分子鉴定技术领域。本发明分子标记包括分子标记1和/或分子标记4，分子标记1包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的2个SNP位点：第34位的SNP位点C/A和第38位的SNP位点G/T；分子标记4包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中：第4-6位的INDEL位点TCG/GAT和第127位的SNP位点A/G。利用本发明分子标记及方法能够有效区分川党参、羊乳和秦岭党参，有利于党参属物种分类以及党参属物种衍生的药用产品判别。的药用产品判别。的药用产品判别。