用于检测白血病BCR-ABL融合基因的引物组及其应用

用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组及其应用
技术领域
1.本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组及其应用。

背景技术：

2.近年来，全球白血病发病率呈现逐年上升的趋势，我国男性白血病发病率处于高位，其中尤以青少年体白血病发病率和死亡率最高。目前，根据白血病细胞分化程度，医学上分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)和慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,cml)。
3.1960年，haugerforor和nowell在慢性髓性白血病粒细胞中发现9号和22号染体发生易位，使9号染体长臂的abl基因和位于22号染体的bcr基因发生重组，形成费城染体(ph染体)，产生bcr-abl融合基因。其中，abl是原癌基因，在癌细胞中容易和多种基因发生融合，而最为常见的是与bcr基因发生融合。该bcr-abl融合基因编码一类蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，调控细胞相关蛋白质酪氨酸磷酸化程度，进而控制造血干细胞增殖及自我更新，增强细胞分裂、抑制细胞对凋亡信号的反应，使细胞存活时间延长，与白血病的发病密切相关。
4.当前临床上检测bcr-abl融合基因的诊断技术主要包括染体分析、fish、real-time pcr、巢式real-time pcr等，但是这些技术均依赖于复杂的仪器设备且依赖复杂的操作过程，难以实现快速和方便的bcr-abl融合基因鉴定。

技术实现要素：

5.基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，采用该引物组可对慢性髓性白血病常见bcr-abl融合基因进行快速方便的检测。
6.一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，包括扩增引物对，所述扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物选自与bcr-abl融合基因的bcr基因e1至b3外显子区域互补的序列，所述下游引物选自与bcr-abl融合基因的abl基因a2至a3外显子区域互补的序列。
7.本发明人在前期研究中发现，在bcr-abl融合基因形成过程中，abl基因断裂位点相对固定，通常在abl基因第二个外显子5’端与bcr基因发生融合；而bcr基因的断裂位点相对多样化，根据断裂位点不同可以将融合基因分为3种不同的转录本类型：ela2型(p190型)、b3a2或b2a2型(m或p210型)和el9a2型(u或p230型)。90％-95％的cml患者出诊时检测到ph染体出现，所有的cml患者均出现bcr-abl融合基因，其中98％的患者bcr-abl融合基因型为p210型。
8.因此，将扩增引物对按照上述设计，能够检出绝大部分白血病bcr-abl融合基因型患者，满足临床测检要求。
9.在其中一个实施例中，所述扩增引物对包括pcr引物对和/或rpa引物对，所述pcr
引物对的上游引物选自：seq id no.1-seq id no.2所示序列，所述pcr引物对的下游引物选自：seq id no.3所示序列；所述rpa引物对的上游引物选自：seq id no.4-seq id no.7所示序列，所述rpa引物对的下游引物选自：seq id no.8-seq id no.10所示序列。选取上述引物组成引物对，能够较好的进行反转录pcr扩增，以及用于恒温核酸扩增(rt-rpa或rt-raa)时具有较好的扩增效果。
10.在其中一个实施例中，所述pcr引物对的上游引物选自seq id no.2所示序列，所述pcr引物对的下游引物选自seq id no.3所示序列；所述rpa引物对的上游引物选自seq id no.7所示序列，所述rpa引物对的下游引物选自seq id no.10所示序列。具有最佳扩增效果。
11.在其中一个实施例中，还包括crrna，所述crrna包括骨架序列和靶向序列，所述骨架序列与cas蛋白结合，所述靶向序列与所述bcr-abl融合基因片段互补。可以理解的，所述骨架序列具体可根据所用cas蛋白类型和要求，按照常规设计即可，靶向序列也可根据本领域的通常设计，以bcr-abl融合基因区域内任意片段位点作为靶位点设计即可。
12.在其中一个实施例中，所述crrna选自：seq id no:11-seq id no.14所示序列。将crrna设计为上述序列，具有较好的靶向特异性，可达到较佳的检测效果。
13.在其中一个实施例中，所述crrna选自seq id no.14所示序列。具有最佳检测效果。
14.本发明还公开了上述的引物组在制备用于检测白血病bcr-abl融合基因试剂中的应用。
15.可以理解的，采用上述引物组中的扩增引物对扩增目标片段后，即可用于常规基因检测中，也可用于crispr/cas检测系统中，且用于crispr/cas检测系统中具有快速、灵敏度高的优点。
16.本发明还公开了一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的试剂盒，包括上述的引物组。
17.在其中一个实施例中，该试剂盒还包括crrna，cas蛋白和信号报告探针，所述crrna包括骨架序列和靶向序列，所述骨架序列与cas蛋白结合，所述靶向序列与所述bcr-abl融合基因片段互补。
18.在其中一个实施例中，所述cas蛋白为cas12a，所述crrna选自：seq id no:11-seq id no.14所示序列。以上述crrna配合cas12a蛋白进行检测，具有较好的检测效果，特别是其中seq id no:10所示的lbacrrna-a2，具有最佳检测效果。
19.在其中一个实施例中，该试剂盒还包括侧向流试纸，所述侧向流试纸由底板，以及依次层叠附着在所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述结合垫包埋偶联有抗fam抗体的金纳米粒子，所述硝酸纤维素膜上设有对照线和检测线，且所述对照线包埋有链霉亲和素，所述检测线包埋有二抗。可以理解的，该侧向流试纸的具体装配和制造，可参考常规技术中用于其它目标物检测的试纸，本技术方案的关键在于进行crispr反应所用试剂。
20.本发明还公开了一种非诊断目的检测白血病bcr-abl融合基因的方法，包括以下步骤：
21.样本提取：取待测样本，提取其中rna；
22.rpa扩增：以上述扩增引物对，扩增上述提取得到的待测样本的bcr-abl融合基因片段，得扩增产物；
23.crispr反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告探针、cas蛋白和上述crrna，进行crispr反应，将反应液滴加到上述的侧向流试纸的样品垫区域，通过该试纸检测线的显情况获得检测结果。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明的一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，可用于crispr/cas检测系统中，能够实现bcr-abl融合基因的检测，且具有检测过程简单、快速，检测灵敏度高，不依赖复杂仪器设备及专业操作人员等优势。
附图说明
26.图1为实施例中引物设计示意图；
27.图2为实施例1中rt-pcr产物电泳结果图；
28.图3为实施例1中rpa产物电泳结果图；
29.图4为实施例2中crrna的设计原理示意图；
30.图5为实施例2中体外转录crrna的电泳鉴定图；
31.图6为实施例3中靶向识别bcr-abl融合基因的典型crrna的活性评价结果；
32.图7为实施例4中侧向流试纸检测原理示意图；
33.其中：a为阴性结果检测原理；b为阳性结果检测原理；
34.图8为实施例4中检测灵敏度的评价结果；
35.图9为实施例5中侧向流试纸检测结果；
36.其中：a为侧向流试纸显结果；b为显条带灰度统计结果；c为roc曲线。
具体实施方式
37.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
38.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
39.以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
40.实施例1
41.扩增bcr-abl融合基因的特异性引物的设计与验证。
42.考虑到bcr-abl融合基因型包括ela2型、b3a2型、b2a2型等，按照如下方法步骤进行设计与验证。
43.1、扩增引物设计
44.从ncbi数据库中检索bcr基因e1、b2外显子基因序列及abl基因a2外显子基因序列，分别以bcr基因和abl基因序列区域为上游和下游的靶点设计特异性扩增引物(如图1所示)，其中部分引物如下表所示。
45.表1.bcr-abl融合基因扩增引物
[0046][0047]
2、扩增引物验证
[0048]
本方法中对目标基因的扩增可以通过rt-pcr和rt-rpa两种扩增方式实现。
[0049]
(1)rt-pcr法
[0050]
在使用rt-pcr扩增法时，使用经过试验筛选后的rt-pcr引物为例(b2-f1和a2-r1)，采用一步法rt-pcr，扩增临床样本(来源于本院收集样本)中的bcr-abl融合基因，反应试剂为primescript
tm one step rt-pcr kit。
[0051]
以25μl扩增反应为例，每个反应中加入12.5μl 2
×
1step buffer及1μl primescript 1step enzyme mix，上下游引物终浓度均为400nm，9μl rnase-free水，1μl rna样品，充分混匀后置于pcr仪反应，反应程序为50℃,30min5 94℃,2min5(94℃,30s5 58℃,30s572℃,1min5 35cycles)5 72℃,3min。反应结束后取6μl扩增产物进行电泳检测。
[0052]
电泳结果如图2所示，图2为以引物对b2-f1和a2-r1扩增rna临床样本中bcr-abl融合基因的扩增产物电泳结果。其中样本1-8为bcr-abl融合基因阳样本扩增结果，其中样本9-20为bcr-abl融合基因阴性样本扩增结果，从上述结果可看出，该引物对能够特异性扩增出bcr-abl融合基因片段，阴性无干扰。
[0053]
上述样本1-8分别为临床收集得到的不同病例样本。
[0054]
(2)恒温扩增法(rt-rpa)
[0055]
为了筛选出扩增能力更好的rpa引物，首先评价引物对靶标的扩增灵敏度。由于市场上没有商业化的bcr-abl mrna标准物质，因此采用订购合成的b2a2 bcr-abl融合基因dna作为模板(模板序列如seq id no.19所示)，评价比较不同rpa引物对的指标，rpa反应试剂为twistamp basic kit。
[0056]
以50μl rpa扩增反应为例，向每管rpa twistamp basic kit冻干粉中加入29.5μl primer free rehydration buffer、2.4μl上游引物(10μl)、2.4μl下游引物(10μl)、9.2μl h2o、2μl靶标基因，充分混匀后加入2.5μl mgoac(280mm)，在39℃孵育20min，反应结束后取4μl扩增产物进行电泳检测。
[0057]
部分电泳结果如图3所示，引物b2-f4/a2-r4对靶标的扩增灵敏度达到100am，且阴性对照中产生的引物二聚体为三对引物中最少，因此选择b2-f4/a2-r4为作为最优扩增引物。
[0058]
实施例2
[0059]
靶向bcr-abl融合基因的crrna的设计、制备与验证。
[0060]
1、设计
[0061]
crrna的制备有两种方式，包括化学合成或体外转录，由于rna化学合成成本过高，因此通常采用体外转录方法进行crrna制备。
[0062]
crrna体外转录可以以合成的双链dna或局部双链的dna为模板，dna模板由t7rna聚合酶启动子区和crrna序列编码区组成，crrna的设计原理如图4所示，其中a为crrna的骨架序列和靶向序列的设计原理，b为crrna的转录模板设计原理。
[0063]
根据检索到的bcr及abl基因的序列，分别选取bcr-abl融合基因的不同区域作为crrna的靶点进行crrna的设计。以p190和p210型bcr-abl融合基因型为例，crrna有三种设计策略：
[0064]
1)以bcr-abl融合基因的bcr区域为靶点；
[0065]
2)以bcr-abl融合基因的融合区域为靶点，包括e1、a2外显子融合区，b2、a2外显子融合区，b3、a2外显子融合区；
[0066]
3)以bcr-abl融合基因的abl区域为靶点。
[0067]
从设计原理而言，以bcr-abl融合基因的融合区为crrna的靶点，可以实现crrna对不同融合基因型的特异性检测，然而由于cas12a体系对靶向位点有pam位点要求，一般为tttn(或ttn)序列，因此会受限于融合位点区域碱基序列的组成，本实施例综合了检测靶区域和pam位点要求，设计以靶向a2外显子区域为目标的crrna，其中部分如表2所示。
[0068]
表2.crrna
[0069][0070][0071]
注：上述序列为rna序列，其中t为wipo sequence序列表中的字母规范表示，为尿嘧啶u。
[0072]
由于对融合基因扩增的引物为具有bcr-abl融合基因特异性的引物对，不能扩增未发生基因融合的bcr和abl基因，保证了扩增产物的特异性，再结合靶向a2基因的crrna，可以保证检测bcr-abl融合基因的特异性。且结合使用扩增引物和靶向a2基因的crrna，可以实现同一条crrna对不同融合基因的判断，能够使检测体系简化。
[0073]
2、制备
[0074]
用于转录crrna的dna模板序列如下表3所示。
[0075]
表3.用于转录crrna的dna模板序列
[0076][0077]
注：下划线部分为t7启动子序列互补区。
[0078]
以25μl rna体外转录体系为例，t7 rna聚合酶购自neb，每个转录反应体系由13μlrnase-free水、2.5μl 10
×
rna polymerase buffer、5μl 10mm ntp mixture、2.5μl t7 rna polymerase、1μl recombinant rnase inhibitor(大连宝生物)、1μl模板dna(终浓度至200-1000nm)，充分混匀后置于pcr仪37℃孵育4
–
16小时进行转录。
[0079]
3、验证
[0080]
取1μl转录产物进行page电泳鉴定。向rna转录反应液中加入1μl dnase i并充分混匀，37℃孵育30分钟后，用rna纯化试剂盒(购自天根生物公司)将转录的crrna纯化，并取rna产物进行page电泳验证。
[0081]
验证结果如图5所示，图5为体外转录crrna的电泳鉴定图，电泳结果显示crrna制备成功，可用于后续实验。
[0082]
实施例3
[0083]
crrna的筛选。
[0084]
以ncbi得到的bcr-abl融合基因的碱基序列，订购合成双链dna靶标片段，模拟bcr-abl融合基因，进行crrna活性评价及筛选。
[0085]
以20μl反应体系为例，向ep管中加入12μl rnase-free水、2μl neb buffer 2.1、1μl10um dna reporter(fam-ttttt-bhq)、2μl crrna(1um)、1μl lbacas12a(1um)、2μl靶标dna(100nm)，充分混匀后置于荧光定量pcr仪37℃孵育30分钟后，每1分钟读取一次荧光值。统计不同crrna识别靶标dna的反应速率。
[0086]
结果如图6所示，图6为靶向识别bcr-abl融合基因的典型crrna的活性评价结果。crrna-a2、crrna-b2a2、crrna-b3a2、crrna-e1a2分别靶向bcr-abl融合基因b2和a2外显子融合区、b3和a2外显子融合区、e1和a2外显子融合区的活性结果。
[0087]
上述结果显示，crrna-a2针对不同融合基因片段(b2a2、b3a2、e1a2)均表现出最好的检测活性，因此，选择反应速率最优的crrna-a2(lbacrrna-a2，即seq id no.14)开展后续实验。
[0088]
实施例4
[0089]
检测灵敏度的评价。
[0090]
基于反应速率最优的lbacrrna-a2构建cas12a基因识别体系，评估用于临床样品bcr-abl融合基因的cas12a-侧向流试纸法的检测灵敏度。
[0091]
侧向流试纸由底板和依次层叠附着在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装而成。在结合垫包埋偶联有抗fam抗体的金纳米粒子；在硝酸纤维素膜上划线包埋链霉亲和素和二抗，分别作为对照线(c)和检测线(t)。侧向流试纸检测原理如图7所示：在阴性样品的检测中(图7a),cas12a/crrna未识别到靶基因序列(即融合基因片段)，cas12a无核酸酶活性，因此单链dna报告探针未被切割从而保持完整，当cas反应液被滴加到侧向流试纸后，报告探针末端的fam与偶联有抗fam抗体的金纳米粒子(fam-gnp)结合，在进一步流经c线时，链霉亲和素结合报告探针另一末端标记的生物素，时胶体金被拦截在c线，因此可以观察到c线红条带和t线无条带。在阳性样品的检测中(图7b),靶基因被扩增为双链dna，因而cas12a/crrna识别到靶基因序列，cas12a被激活而表现出核酸酶活性，单链dna报告探针被切割，因而当cas反应液被滴加到侧向流试纸后，fam-gnp不会被c线的链霉亲和素截留而流过c线，在流经t线时，包埋的抗fam抗体的二抗结合标记在gnp表面的fam抗体，使fam-gnp在t线积累，因此可以观察到t线为红条带。
[0092]
以实施例1中订购合成的bcr-abl dna模拟靶基因，采用引物b2-f4/a2-r4对不同浓度模拟靶基因的rpa扩增，并取2μl rpa扩增产物，加入12μl rnase-free水、2μl neb buffer2.1、1μl 10um dna reporter(biotin-ttattatt-fam)、2μl crrna(crrna-a2，1um)、1μl lbacas12a(1um)，充分混匀后置于荧光定量pcr仪37℃孵育20分钟后，向反应液中加入60μl hybridetect assay buffer，滴加到侧向流试纸条上并观察结果。
[0093]
结果如图8所示，本方法对模拟靶标基因的检测灵敏度达到100am，约相当于60copies/μl。
[0094]
实施例5
[0095]
基于反应速率最优的lbacrrna-a2构建cas12a基因识别体系，评估用于临床样品bcr-abl融合基因的cas12a-侧向流试纸法的检测灵敏度。
[0096]
该检测所含步骤包括：血液中细胞rna的提取、融合基因扩增、crispr识别反应、侧向流试纸分析检测结果等步骤。
[0097]
该侧向流试纸检测方法包括以下步骤：
[0098]
1、样本提取：
[0099]
取待测样本，用市售rna提取试剂盒提取其中rna。
[0100]
2、核酸扩增(rpa)：
[0101]
使用引物b2-f1和a2-r1，按照实施例1中的条件，扩增上述提取得到的待测样本的bcr-abl融合基因片段，得扩增产物。
[0102]
3、crispr反应：
[0103]
取上述扩增产物，加入12μl rnase-free水、2μl neb buffer 2.1、1μl 10um dna reporter(biotin-ttattatt-fam)、2μl crrna(crrna-a2，1um)、1μl lbacas12a(1um)、2μl靶标bcr-abl融合基因的rt-pcr扩增结果，充分混匀后置于荧光定量pcr仪37℃孵育20分钟后，向反应液中加入60μl hybridetect assay buffer。
[0104]
4、侧向流试纸：
[0105]
将上述反应液滴加流入侧向流试纸条后观察结果。
[0106]
结果如图9所示，图9为本实施例中cas12a/crrna-侧向流试纸体系在临床样本检测中的应用结果。其中，a为基于cas12a/crrna体系和侧向流试纸的临床样本bcr-abl融合基因可视化检测结果；b为对a图结果中侧向流试纸的控制线(c)和检测线(t)灰度值定量统计的结果；c为对临床样本bcr-abl融合基因可视化检测结果的roc分析。
[0107]
上述结果说明，针对实施例1所述的1-8号样本，本实施例的扩增引物对可成功扩增出bcr-abl融合基因片段，且所选择crrna-a2可快速准确检测获得准确结果，可通过肉眼直接观察侧向流试纸的检测线条带显判断是否出现bcr-abl融合基因(图9a)，对侧向流试纸的显条带进行灰度统计分析也进一步确认了检测结果(图9b)，通过进一步对灰度统计结果与临床检测结果比较并进行roc曲线分析(图9c)，得到了该方法的检测准确度为93.75％，根据roc曲线分析得到的cut-off值计算得到本方法的检测灵敏度为88.9％(真阳性/(真阳性+假阴性))，特异度为100％(真阴性/(真阴性+假阳性))。
[0108]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0109]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：

1.一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，其特征在于，包括扩增引物对，所述扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物选自与bcr-abl融合基因的bcr基因e1至b3外显子区域互补的序列，所述下游引物选自与bcr-abl融合基因的abl基因a2至a3外显子区域互补的序列。2.根据权利要求1所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，其特征在于，所述扩增引物对包括pcr引物对和/或rpa引物对，所述pcr引物对的上游引物选自：seq id no.1-seq id no.2所示序列，所述pcr引物对的下游引物选自：seq id no.3所示序列；所述rpa引物对的上游引物选自：seq id no.4-seq id no.7所示序列，所述rpa引物对的下游引物选自：seq id no.8-seq id no.10所示序列。3.根据权利要求1所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，其特征在于，还包括crrna，所述crrna包括骨架序列和靶向序列，所述骨架序列与cas蛋白结合，所述靶向序列与所述bcr-abl融合基因片段互补。4.根据权利要求3所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的引物组，其特征在于，所述crrna选自：seq id no:11-seq id no.14所示序列。5.权利要求1-4任一项所述的引物组在制备用于检测白血病bcr-abl融合基因试剂中的应用。6.一种用于检测白血病bcr-abl融合基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。7.根据权利要求6所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的试剂盒，其特征在于，还包括crrna，cas蛋白和信号报告探针，所述crrna包括骨架序列和靶向序列，所述骨架序列与cas蛋白结合，所述靶向序列与所述bcr-abl融合基因片段互补。8.根据权利要求7所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的试剂盒，其特征在于，所述cas蛋白为cas12a，所述crrna选自：seq id no:11-seq id no.14所示序列。9.根据权利要求7所述的用于检测白血病bcr-abl融合基因的试剂盒，其特征在于，还包括侧向流试纸，所述侧向流试纸由底板，以及依次层叠附着在所述底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述结合垫包埋偶联有抗fam抗体的金纳米粒子，所述硝酸纤维素膜上设有对照线和检测线，且所述对照线包埋有链霉亲和素，所述检测线包埋有二抗。10.一种非诊断目的检测白血病bcr-abl融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：样本提取：取待测样本，提取其中rna；rpa扩增：以权利要求1-4任一项中的扩增引物对，扩增上述提取得到的待测样本的bcr-abl融合基因片段，得扩增产物；crispr反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告探针、cas蛋白和权利要求3或4中的crrna，进行crispr反应，将反应液滴加到权利要求9所述的侧向流试纸的样品垫区域，通过该试纸检测线的显情况获得检测结果。

技术总结

本发明涉及一种用于检测白血病BCR-ABL融合基因的引物组及其应用，属于医学检测技术领域。该引物组包括扩增引物对，所述扩增引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物选自与BCR-ABL融合基因的BCR基因e1至b3外显子区域互补的序列，所述下游引物选自与BCR-ABL融合基因的ABL基因a2至a3外显子区域互补的序列。本发明的用于检测白血病BCR-ABL融合基因的引物组，可用于CRISPR/Cas检测系统中，能够实现BCR-ABL融合基因的检测，且具有检测过程简单、快速，检测灵敏度高，不依赖复杂仪器设备及专业操作人员等优势。业操作人员等优势。业操作人员等优势。