一种油茶籽饼粕ACE抑制肽及其应用

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技术实现要素：

17.本发明的目的是提供一种油茶籽饼粕ace抑制肽及其应用，以解决现有技术的不足。
18.本发明采用以下技术方案：
19.本发明第一方面提供了一种油茶籽饼粕ace抑制肽，其氨基酸序列为val-val-val-pro-gln-asn，缩写为vvvpqn。
20.本发明第二方面提供了上述油茶籽饼粕ace抑制肽在制备降血压食品、保健品、药
品中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.本发明从油茶蛋白中筛选得到了序列为val-val-val-pro-gln-asn(vvvpqn)的ace抑制肽，体外实验表明该肽段具有良好的ace抑制活性，其ic
50
值为0.13mg/ml，并明确了该ace抑制肽的抑制机制以及作用位点，是一种非竞争性抑制剂。本发明所得到的ace抑制肽具有结构简单、安全、活性强等特点，可用于制备具有降血压功能的食品、保健品、药品。
附图说明
23.图1为活性最高的组分(cph3)经sephadex g-25凝胶分离的谱图。
24.图2为vvvpqn的ace抑制活性图。
25.图3为vvvpqn的hplc图。
26.图4为vvvpqn的一级质谱图。
27.图5为vvvpqn的二级质谱图。
28.图6为vvvpqn的分子对接图。
29.图7为vvvpqn对ace的lineweaver－burk图。
具体实施方式
30.下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
31.实施例1油茶籽饼粕ace抑制肽的制备
32.(1)油茶蛋白的提取
33.首先将油茶籽去壳后通过液压榨油机冷榨脱脂，条件为室温，50mpa，40min，得到油茶籽饼粕。之后将得到的油茶籽饼粕粉碎过60目筛，得到油茶籽饼粕粉。将油茶籽饼粕粉以1:5(w/v，g/ml)与石油醚混合，室温、500r/min条件下搅拌提取2h，后室温下沉降1h得沉降物；重复混合、搅拌提取、沉降3次，45℃干燥后得到脱脂油茶籽饼粕粉。将脱脂油茶籽饼粕粉以1:10(w/v，g/ml)与80v/v％乙醇混合，40℃、500r/min条件下搅拌提取2h，后室温下抽滤得滤渣；重复混合、搅拌提取、抽滤2次，45℃干燥至含水量低于4wt％后得到脱脂脱皂素油茶籽饼粕粉。
34.采用碱提酸沉法制备油茶蛋白：将脱脂脱皂素油茶籽饼粕粉过60目筛，以1:20(w/v，g/ml)与去离子水混合，在50℃、ph10.0(用6mol/lnaoh调节ph)、500r/min条件下搅拌提取2h，冷却至室温后于室温、4000r/min下离心15min，收集上清液，用6mol/的hcl调ph至4.0，静置1h后于室温、4000r/min下离心15min，收集沉淀，用80v/v％乙醇醇洗三次后加适量去离子水用6mol/lnaoh调ph至7.0溶解，-80℃冷冻干燥48h，得到油茶蛋白。
35.(2)油茶蛋白酶解液制备
36.将油茶蛋白加去离子水配制成底物浓度为2wt％的蛋白溶液，置于95℃水浴锅静置变性15min，冷却至室温后用1mol/l naoh和1mol/l hcl调ph至7，加入5000u/g(以溶液中油茶蛋白的质量为基准)中性蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，酶活50000u/g)，置于45℃水浴锅300r/min搅拌酶解4h，置于95℃水浴锅静置灭酶10min，冷却至室温后于4℃、8500r/min下离心30min，取上清液，得到油茶蛋白酶解液(cph)。
37.(3)分离纯化与鉴定
38.将油茶蛋白酶解液经0.45μm水系微孔过滤膜抽滤，后依次采用截留分子量为10kda和3kda的超滤膜进行分离，分别得到＞10kda(cph1)，3-10kda(cph2)，＜3kda(cph3)三个组分，分别测定ace抑制活性，将活性最高的组分(cph3)利用sephadex g-25凝胶进行分离：将样品配制成10mg/ml，取3ml过0.45μm的水系针式过滤器滤膜去除杂质，以去离子水为洗脱液，在0.8ml/min的流速下进行洗脱，于280nm波长下测定吸光值，收集得到两个组分(f1和f2，图1)，测定ace抑制活性，其中f2组分ace抑制活性较好，利用lc-ms/ms技术测定f2组分的氨基酸序列信息。
39.(4)肽段筛选
40.筛选出峰面积大于108且肽段打分大于95的肽段，利用biopep网站预测肽段活性，利用autodock vina程序进行分子对接筛选出具有潜在ace抑制活性的7条肽段。
41.实施例2肽段合成与活性验证
42.以下涉及的溶液配制方法如下：
43.硼酸盐缓冲液：取6.185g硼酸粉末用超纯水溶解后定容到500ml，取4.7675g硼砂粉末用超纯水溶解后定容至250ml，量取325ml硼酸溶液和175ml硼砂溶液混合均匀，用盐酸或氢氧化钠调节混合液ph至8.3，加入17.532g氯化钠溶解，定容至1000ml。
44.hhl试剂：取11.64ml硼酸盐缓冲液将25mg的马脲酰组氨酰亮氨酸(hhl)粉末溶解，配成浓度为5mmol/l(用时稀释)，用离心管分装后-20℃保藏。
45.ace试剂：取1ml硼酸盐缓冲液将0.1u的ace溶解，配成0.1u/ml(用时稀释)。
46.(1)肽段合成：7条肽段由固相合成所得，纯度均高于95％(南京金斯瑞生物科技有限公司)。
47.(2)ace体外活性测定：取60μl hhl(2.5mmol/l)与20μl样品(用硼酸盐缓冲液稀释)于1ml离心管中混匀，在37℃条件下静置孵育5min，加入40μlace溶液(0.05u/ml)混匀，在37℃条件下静置反应1h，最后加入120μlhcl(1mol/l)停止反应，过0.45μm的水系针式过滤器滤膜后利用高效液相谱测定马尿酸的含量。
48.高效液相谱条件如下：
49.流动相：乙腈/超纯水(体积比为1:3，各含0.1v/v％三氟乙酸)
50.流速：1ml/min；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：10μl
51.采用以下公式计算ace抑制活性：
[0052][0053]
式中，a
空白
为空白样(即用缓冲液替代样品)的马尿酸峰面积，a
样品
为样品的马尿酸峰面积。
[0054]
测定7条肽段的ace抑制活性(表1)，结果表明，在浓度为0.5mg/ml时，vvvpqn的ace抑制活性最强，达到80.46％，测得其ic
50
为0.13mg/ml(图2)。vvvpqn的分子量为654.3da，无毒，具有较好的水溶性，其hplc图如图3所示，质谱图如图4和图5所示。
[0055]
表1不同肽段在0.5mg/ml下的ace抑制活性
[0056][0057]
实施例3 vvvpqn的抑制机制
[0058]
(1)分子对接：从pdb数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载ace晶体结构(1o8a)，将vvvpqn通过autodock vina程序进行分子对接，分析vvvpqn与ace的分子水平的相互作用机制。结果表明，vvvpqn与ace对接的结合能为-8.8kcal/mol；肽段vvvpqn与ace残基his353、asn374、glu376、gln281、thr282、glu162以及asn277形成8个氢键(其中与glu376形成2个氢键，图6)。
[0059]
(2)抑制动力学研究：将vvvpqn(0，0.05，0.2mg/ml)和不同浓度的hhl(2，3，4，5mmol/l)与ace(0.05u/ml)按实施例2方法混合测定马尿酸的含量，使用双倒数(lineweaver－burk)作图分析抑制动力学，结果显示(图7)，km不变(km为米氏常数，酶促反应达到最大速度(v
max
)一半时的hhl底物[s]的浓度)，v
max
(v
max
为最大反应速度)减小，因此认为vvvpqn是非竞争性抑制剂。

技术特征：

1.一种油茶籽饼粕ace抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列为val-val-val-pro-gln-asn。2.权利要求1所述的油茶籽饼粕ace抑制肽在制备降血压食品、保健品、药品中的应用。

技术总结

本发明公开了一种油茶籽饼粕ACE抑制肽，其氨基酸序列为Val-Val-Val-Pro-Gln-Asn。本发明还公开了其在制备降血压食品、保健品、药品中的应用。本发明体外实验表明该肽段具有良好的ACE抑制活性，其IC

技术研发人员：

吴峰华 何志平 朱巧楠 刘兴泉 张娇娇 吴长玲

受保护的技术使用者：

浙江农林大学

技术研发日：

2022.08.19

技术公布日：

2023/3/24