猴痘病毒分型试剂、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种猴痘病毒分型试剂、试剂盒及其应用。

背景技术：

2.猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)属于痘病毒科，正痘病毒属，具有正痘病毒的典型形态。形态与正痘病毒一致，外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200nm～400nm，是结构较为复杂的dna病毒。猴痘病毒的基因组为双链dna长约197kb基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列，该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中。猴痘病毒与天花病毒、疫苗病毒和牛痘病毒是正痘病毒中对正痘病毒中对人类致病的4种病毒、它们都含有可溶性抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原形制基本相同，彼此之间有交叉免疫性。猴痘病毒主要存在两个分支：西非分支和刚果盆地(中非)分支。两者具有明确的流行病学和临床转归差异，其中西非分支的致死率较低，大约1％～3.6％的感染会导致死亡；刚果盆地(中非)分支则可以导致10％的死亡率，因此很有必要在检测鉴定猴痘病毒的同时实现西非分支型与刚果盆地(中非)分支型快速的基因分型。
3.猴痘是一种以皮肤出疹为特征的、类似于天花的人畜共患的病毒性疾病，通过密切接触，由动物传染给人，并可以在人与人之间传播，属于人畜共患传染病。除人和猴子外其他灵长类动物和啮齿类动物都可感染猴痘病毒。猴痘病毒主要是通过与受感染的人或动物密切接触传播，或与被病毒污染的物品接触而传染给别人。猴痘病毒通过与病灶、体液、呼吸道飞沫和被污染的物品(如床上用品)的密切接触产生人际传播。猴痘的潜伏期通常为6至13天。这种疾病最明显的特征就是出现严重的皮疹，但皮疹的严重程度可以说是介于天花(smallpox)和水痘(chickenpox)之间，而其他症状则包括发热、头痛、肌痛、背痛、淋巴结肿大等。
4.病毒分离鉴定是诊断猴痘病毒的经典方法，但是猴痘病毒微生物安全级别较高生物因子，对实验室安全级别要求极高，并且检测周期长；同时猴痘病毒与痘病毒质检存在抗原交叉，所以血清学方法的特异性不够；目前猴痘病毒的最常见的检测方法为基于taqman探针法实时荧光定量pcr技术，比如朱娜等在2009年发表的《猴痘病毒荧光定量pcr检测方法的建立》中根据猴痘病毒f3l基因保守区设计了两套引物探针，该文献中提供的引物探针可以实现猴痘病毒的检测，该方法具有灵敏度高、特异性强等特点，仅需要几个小时即可得到结果。yu li等2010年在《j virol methods》发表的《real-time pcr assays for the specific detection of monkeypox virus west african and congo basin strain dna》文章中针对于三个不同的靶基因位点(g2r基因、c3l基因等)设计了三套引物探针组合实现猴痘病毒通用型、西非分支型、刚果盆地(中非)分支型的分型检测，检测试剂体系相对复杂，成本较高，同时扩增时长需要在1个小时以上，很慢满足超快速检测需求。
5.鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对猴痘病毒特殊基因j1l和j3r的保守区涉及检测试剂，采用该试剂或者相应的试剂盒能够快速高效地实现西非分支型猴痘病毒和刚果盆地分支型猴痘病毒的分型。
7.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂，所述试剂检测猴痘病毒的j1l基因保守区靶序列和/或j3r基因保守区靶序列：
9.所述猴痘病毒包括西非分支型猴痘病毒和/或刚果盆地分支型猴痘病毒；
10.所述西非分支型猴痘病毒的j1l基因保守区的靶序列为西非分支型猴痘病毒全基因组第1335～1403位，j3r基因保守区的靶序列为西非分支型猴痘病毒全基因组195722～195790；
11.所述刚果盆地分支型猴痘病毒的j1l基因保守区的靶序列为刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组第1135～1221位，j3r基因保守区的靶序列为刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组195222～195308。
12.在可选的实施方式中，所述试剂用于检测以下(a)～(d)中至少一个碱基区域：
13.(a)西非分支型猴痘病毒全基因组的第(1335～1340)～(1398～1403)位碱基区域；
14.(b)西非分支型猴痘病毒全基因组的第(195722～195727)～(195785～195790)位碱基区域；
15.(c)刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组的第(1135～1140)～(1216～1221)位碱基区域；
16.(d)刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组的第(195222～195227)～(195303～195308)位碱基区域。
17.在可选的实施方式中，所述试剂包括探针，所述探针包括探针1和/或探针2；
18.所述探针1的核苷酸序列如seq id no:1所示；
19.所述探针2的核苷酸序列如seq id no:2所示。
20.在可选的实施方式中，所述试剂还包括核苷酸序列如seq id no:3～4所示的引物对。
21.在可选的实施方式中，所述探针1和探针2均为taqman探针，所述探针1和探针2的5’端连接有不同的报告荧光基团，所述探针1和探针2的3’端均连接有淬灭荧光基团和/或mgb。
22.优选地，所述报告荧光基团选自fam、nex、rox、tet、tamra、joe、vic、cy3、cy5或texas red。
23.优选地，所述淬灭荧光基团选自bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq或lowa blacktm fq。
24.优选地，所述探针1的5’端连接有fam，所述探针2的5’端连接有vic或nex。
25.第二方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述的试剂在制备用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒中的应用。
26.第三方面，本发明提供了用于诊断猴痘病毒感染相关疾病的试剂盒，所述试剂盒
包括前述实施方式任一项所述的试剂。
27.在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种或多种的组合：rt-pcr缓冲液或酶混合液。
28.优选地，所述酶混合液包括热启动dna聚合酶和逆转录酶。
29.优选地，所述酶混合液还包括rna酶抑制剂和/或udg酶。
30.优选地，所述rt-pcr缓冲液包括pcr缓冲液、dntps和mg
2+
，所述dntps为datp、dttp、dctp和dgtp的组合。
31.第四方面，本发明提供了非诊断目的地检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法，所述方法为采用前述实施方式任一项所述的试剂或前述实施方式任一项所述试剂盒对待测样品进行pcr扩增的方法，所述pcr扩增的反应条件包括条件1或条件2：
32.条件1：50℃预热60s；95℃变性后，55～62℃下退火15s；变性至退火重复40～45个循环；
33.条件2：94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。
34.第五方面，本发明提供了前述实施方式所述检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法在猴痘病毒分型中的应用，所述猴痘病毒分型包括将刚果盆地分支型猴痘病毒与西非分支型猴痘病毒区分开。
35.本发明针对于猴痘病毒j1l基因和j3r基因保守区域设计了一套猴痘病毒的引物对、猴痘病毒的西非分支型和刚果盆地分支型共用探针、刚果盆地(中非)分支型探针。本发明选择的靶基因保守区域在基因组中具有双拷贝特征，同时西非分支型猴痘病毒与刚果盆地分支型猴痘病毒在探针结合区域为单拷贝与双拷贝的差异，根据该结构特点可以设计两条探针实现通用检测与核酸分型的双重目的，大大降低了成本以及优化难度。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为探针在猴痘病毒基因组的结合位置示意图，其中“.”表示一样的碱基，
“‑”
表示缺失的碱基；
38.图2为提供的试剂盒在p810上检测西非分支型的最低检出限扩增曲线数据；
39.图3为实施例3特异性实验扩增曲线；
40.图4为含有西非分支型和刚果盆地分支型共用探针的检测通道检测西非分支型猴痘病毒质粒线性分析数据；
41.图5为含有西非分支型和刚果盆地分支型共用探针检测通道检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒线性分析数据；
42.图6为含有刚果分支型特异性探针检测通道检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒线性分析数据。
具体实施方式
43.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
44.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.本说明书所使用的术语“扩增”应从广义上来理解，其包括从rna或dna获得dna的过程，并且包括但不限于pcr反应，逆转录反应，以及其各种变型(例如实时pcr反应)。
46.本说明书中使用的“待测样品”可以由任何合适的形式提供，例如作为来自患者的生物组织或流体的样本，样本可以来自口腔拭子、鼻咽拭子、唾液、痰液、肺腔灌洗液，还可以来自血液样本、全血、血浆、血清或可以是从以上样本提取的核酸的样本。样本可以是包含核酸的任何样本，包含在样本中的核酸可以是dna和/或rna。
47.样本可来自任何真核或原核或病毒来源，例如可以是微生物(例如细菌或真菌)、植物或动物。优选地，样本为人来源。所述样本可以是来自动物的组织或血液样本。
48.本说明书中所述的西非分支型猴痘病毒monkeypox virus可以是accession no.on563414.2的序列，所述的刚果盆地(中非)分支型猴痘病毒monkeypox virus可以是accession no.kj642613.1的序列。
49.本发明所述的ct值(cycle threshold，ct)的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。
50.本公司(广东润鹏生物技术有限公司)的超快速实时荧光定量pcr分析仪(型号：p810)，通过该设备可以实现pcr扩增试剂的快速升降温，可在15min内完成40个扩增循环，同时通过实时荧光定量pcr分析仪完成荧光pcr步骤，实现靶标的荧光pcr检测。
51.在某次具体实施方式中，本发明提供了一种基于快速荧光pcr技术的检测毛霉菌核酸的试剂盒，该试剂盒主要包含pcr反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照等四个组分。
52.其中pcr反应液主要包括datps、dgtps、dctps、dttp四种核苷酸、用于检测猴痘病毒病基因分型的荧光pcr引物和探针以及含有镁离子的缓冲液组成。
53.所述引物对中的正向引物、反向引物和荧光探针序列分别是：
54.正向引物：5
’‑
gggatctccttttacaacttcttcg-3’(seq id no:3)；
55.反向引物：5
’‑
caatccgtaacggaagttacagaga-3’(seq id no:4)；
56.西非分支型和刚果盆地分支型共用寡核苷酸探针1：5
’‑
atacctcatcatcttcgg-3’(seq id no:1)；
57.刚果盆地分支型寡核苷酸探针2：5
’‑
catcttcggatacctcat-3’(seq id no:2)；
58.上述所有探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团和/或mgb。
59.所述mgb是小沟结合物(minor groovebinder)修饰基团。探针3’端连接有mgb修饰
基团，可以将探针的tm值提高10℃左右，从而可以加强定量pcr反应过程中的特异性。
60.作为本发明的进一步改进，以上所述荧光报告基团选自fam、nex、rox、tet、tamra、joe、vic、cy3、cy5或texas red；其中猴痘病毒西非分支型和刚果盆地分支型共用寡核苷酸探针1优选fam，刚果盆地分支型寡核苷酸探针2优选vic或nex等，所述荧光淬灭基团选自bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq、lowa blacktm fq等。
61.所述试剂盒中的酶混合液为包含有热启动的taq dna聚合酶、udg酶和酶保存液。
62.其中所述的阳性质控品包含插入刚果盆地分支型猴痘病毒特异性保守序列的质粒载体和细胞骨架蛋白beta-actin基因的质粒载体的混合物，以上重组质粒转化到大肠杆菌dh5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌te缓冲液稀释。其中两种质粒载体的浓度均为1.0
×
106copies/ml。
63.其中所述的阳性质控品含有的猴痘病毒刚果盆地分支型特异性保守序列为：
64.aataagtggtgggatctccttttacaacttcttcggatacctcatcatcttcggatacctcatcatcttcggtctctgtaacttccgttacggattgacaaatcttatcattggtcgg(seq id no:5)。
65.其中所述的阳性质控品含有的细胞骨架蛋白beta-actin基因特异性保守序列为：
66.gcgagaagatgacccagatcatgtttgagaccttcaacaccccagccatgtacgttgctatccaggctgtgctatcc(seq id no:6)。
67.其中所述的阴性质控品为无菌te缓冲液，该缓冲液采用分子级水配制。
68.进一步的，本发明还提供了试样上述试剂盒进行快速检测猴痘病毒以及核酸基因分型荧光pcr方法，包括如下操作步骤：
69.(1)样本处理和核酸提取(阴性对照、阳性对照与待测样本同步处理)：
70.提前30分钟将试剂取出，室温融化，并将各组分涡旋振荡15秒，将试剂盒各组分低速离心15秒待用。将质控品(包括阴性质控品、阳性质控品)全部转移至样本提取室。根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按200μl/人份样本取相应量的待测样本、阴性对照、阳性对照，充分混匀成待提取样本，瞬时离心后备用。采用本公司生产的病毒dna/rna提取试剂盒(磁珠法)(货号：rk1002)提取样本dna，提取操作步骤参照提取试剂盒说明书。
71.(2)首先将pcr反应液和酶混合液试剂取出，室温融化，涡旋振荡15秒，低速离心15秒待用。确定反应数n，n＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1。按pcr反应液8.0μl/反应，酶混合液2.0μl/反应，根据反应数n计算需要取出的反应液，将pcr反应液和酶混合液涡旋振荡15秒，低速离心15秒。然后将混好的反应液按10μl/管分装至pcr反应管中：
72.组分1人份n人份(n+1阳性+1阴性)pcr反应液8.0μl18.0
×
(n+3)酶混合液2.0μl2.0
×
(n+3)待测样本10μl10
×
(n+3)
73.(3)加样：
74.将完成提取的样本dna、阴性对照、阳性对照按10μl加样量加入到pcr反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，随后使用移液器将pcr反应管内反应液转移至毛细管内，使用毛细管专用离心机将装有反应液的毛细管进行低速离心15秒。然后立即进行pcr扩增反应。
75.(4)超快速qpcr仪p810上扩增程序设置。
76.其中，猴痘病毒西非分支型和刚果盆地分支型共用检测选择fam(reporter:fam,quencher:mgb)检测通道、猴痘病毒刚果盆地分支型检测选择vic(reporter:vic,quencher:mgb)检测通道；内标选择rox(reporter:rox,quencher:mgb)检测通道：
[0077][0078]
(5)采用该程序15分钟可以完成全部扩增。
[0079]
(6)常规qpcr仪abi 7500上扩增程序设置其中，猴痘病毒西非分支型和刚果盆地分支型共用检测选择fam检测通道、猴痘病毒刚果盆地分支型检测选择vic/joe/nex检测通道；内标选择rox检测通道：
[0080][0081]
(7)结果分析：
[0082]
7.1实验结束后保存检测数据文件。
[0083]
7.2分析条件设置：反应结束后自动保存结果，对猴痘病毒的曲线和相应内标的曲线进行分析。根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在3～15、end值可设在5～20，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击analyze进行分析，使扩增曲线窗口下的曲线图达到最佳，然后到plate窗口下记录结果。
[0084]
(8)质量控制
[0085]
8.1阴性对照：fam通道、vic通道和rox通道均无扩增曲线,或ct＞38，且无明显s型扩增曲线；
[0086]
8.2阳性对照：fam通道、vic通道和rox通道均有扩增曲线，且ct值均≤30；
[0087]
以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
[0088]
(9)结果判读
[0089]
9.1当fam通道有扩增曲线，且ct值均≤38时可判定猴痘病毒核酸阳性；当vic通道有扩增曲线，且ct值均≤38时可判定刚果盆地分支型猴痘病毒核酸阳性；当vic通道无扩增曲线，且ct值显示为undet或no ct，可判定西非分支型猴痘病毒核酸阳性；
[0090]
9.2当fam通道无扩增曲线，且ct值显示为undet或no ct，rox通道有扩增曲线且ct值均＞38时可判定猴痘病毒核酸阴性；
[0091]
9.3对于阳性样本，内标检测结果不作要求；当fam通道有扩增曲线，38＜ct值≤40，建议重复一次实验，如果结果同上，可判定为猴痘病毒阳性，如果无扩增，可判定为猴痘病毒阴性；
[0092]
9.4当fam通道、vic通道和rox通道均无扩增曲线，且ct值显示为undet或no ct，实
验无效、建议更换一批试剂重新实验。
[0093]
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0094]
实施例1引物探针的设计与筛选
[0095]
本发明针对于猴痘病毒j1l或j3r基因保守区域设计了一套猴痘病毒的引物、猴痘病毒的西非分支型和刚果盆地分支型共用探针、刚果盆地(中非)分支型探针，由于猴痘病毒的基因组特点，j1l基因与j3r基因为位于全基因组两端的回文结构基因序列，意味着该基因相对于其他基因的单拷贝具有两个拷贝的优势。
[0096]
另外，如图1所示，对于西非分支型，只能结合左边位置的mp-t探针；对于刚果盆地分支型，能结合两个位置的mp-t探针，和中间位置的mp-g探针。本发明选择的mp-t探针在刚果盆地分支型存在连续两个重复，因此在检测刚果盆地分支型时性能具有显著优势。但是，其他病毒的同源区域无法和mp-t或mp-g互补配对，因此无法检测出其他病毒。
[0097]
在上述引物和探针的设计过程中，尽可能避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成等。通过ncbi blast在线数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)对上述设计的猴痘病毒特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他致病菌或人类基因发生非特异结合和扩增。
[0098]
具体设计的引物探针序列见下表：
[0099][0100][0101]
为了充分验证本发明设计的引物探针性能优势，本发明合成了朱娜发表的《猴痘病毒荧光定量pcr检测方法的建立》(朱娜,陈国强,张敬友,等.猴痘病毒荧光定量pcr检测方法的建立[j].南京农业大学学报.2009.32(4)：165-168)中的引物探针序列，序列如下表所示：
[0102]
[0103]
为了筛选最佳的靶标引物探针组合，本发明合成了以下代表株的靶基因的目标片段，并将这些序列插入克隆载体，通过单克隆筛选出纯化的含有阳性片段的质粒。
[0104]
其中西非分支型猴痘病毒monkeypox virus(on563414.2)序列，命名为mpxv-1：
[0105]
gggatctccttttacaacttcttcggatacctcatcatcttcggtctctgtaacttccgttacggattgtcgcgggatacatcatctattatagcatcagcatcagaatctgtaggccgtgtatcagcatccattgtcgtagacc(seq id no:10)。
[0106]
其中刚果盆地(中非)分支型猴痘病毒monkeypox virus(kj642613.1)序列，命名为mpxv-2：
[0107]
gggatctccttttacaacttcttcggatacctcatcatcttcggatacctcatcatcttcggtctctgtaacttccgttacggattgtcgcgggatacatcatctattatagcatcagcatcagaatctgtaggccgtgtatcagcatccattgtcgtagacc(seq id no:11)。
[0108]
其中天花病毒variola virus(lr800244.1)序列，命名为vav：
[0109]
aggaggatctacatcctcgactgatgtggaatcatcttctgattccacctcgggatctggatctgactcggactctgtaatttccgttacggattgtcgcgggatacatcatctattatgacgtcagccatagcatcagcatccggcttatccgcctccgttgtcataaacc(seq id no:12)。
[0110]
其中痘苗病毒vaccinia virus(mt227314.1)序列，命名为vacv：
[0111]
gggatctctttttacgacttcttcggatacctcatcgtctttggtctctgtaacttccgttacggattggcgggatacatcatctattatggcgtcagccataacatcagcatccggcttatccgcctccgttgtcataaacc(seq id no:13)。
[0112]
其中牛痘病毒cowpox virus(lt896732.2)序列，命名为copv：
[0113]
taggcataattatatctgctcctagttctataaatgtatctatgattgtttcattgtaatctagaaaattgcttcttgtaaaaccatgtaagtaataatgtaacggtgttctcgcgggatacatcatctattatgatgtcagtcatagcatcagcatccggcttatccgcctccgttgtcataaacc(seq id no:14)。
[0114]
其中骆驼痘病毒camelpox virus(af438165.1)序列，命名为capv：
[0115]
gggatctccttttacgactgatgtggaaccatcttcggatacctcatcgtcttcagactctgtaacttccgttacggattgtcgcgggatacatcatctattatggcgtcagccatagcatcagcatccggtttatccgcctccgttgtcataaacc(seq id no:15)。
[0116]
其中鼠痘病毒ectromelia_virus(jq410350.1)序列，命名为ecv：
[0117]
gggatctccttttacgacttcttcggataccccatcgtcttcagactctgtaacttcggttactgattgtcgcgggatacatcatctattatggcatccgccatagtattagtatccggcttatccgcctccgttgttataaacc(seq id no:16)。
[0118]
其中马痘病毒horsepox virus(ky349117.1)序列，命名为hopv：
[0119]
gggatctctttttacaacttcttcggatacctcatcgtctttggtctctgtaacttccgttacggattgtcgcgggatacatcatctattatgacgtcagccatagcatcagcatccggcttatccgcctccgttgtcataaacc(seq id no:17)。
[0120]
扩增体系所用快速dna聚合酶(货号：rk1101)为润鹏生物自研扩增酶，热敏udg酶(货号：md029)为菲鹏生物、所用引物探针皆是生工生物进行合成。
[0121]
模板分别采用上述构建的8种猴痘病毒以及亲缘关系较近的痘病毒科的质粒，将提取后的核酸产物用分子级纯化水分别稀释到1.0
×
105copies/ml。阴性对照模板采用te
缓冲液。
[0122]
组分本发明/μl对照/μl5
×
pcr buffer(货号：rk1101)44dntps(10mm)0.50.5mgcl2(25mm)22上游引物(mpxv-f/mpxv-f2)(10mm)11下游引物(mpxv-r/mpxv-r2)(10mm)11探针1(mpxv-p1-1/mpxv-p2)(10mm)0.50.5探针2(mpxv-p1-2)(10mm)0.5/快速dna聚合酶(货号：rk1101)0.20.2udg酶(货号：md029)0.10.1h2o0.30.3模板1010
[0123]
备注：对照仅采用朱娜发表的《猴痘病毒荧光定量pcr检测方法的建立》中的引物探针序列信息，体系采用本公司扩增体系。
[0124]
常规平台扩增程序采用下表所示：
[0125][0126]
扩增结果如下表所示：
[0127][0128]
备注：表中noct表示：无扩增。
[0129]
超快速qpcr平台扩增程序采用下表所示：
[0130]
[0131]
扩增结果如下表所示：
[0132][0133]
备注：表中noct表示：无扩增。
[0134]
通过以上数据可以看出，在相同模板数量的情况下本发明设计的引物探针在常规平台上比如abi7500相对于对照体系，在西非分支型猴痘病毒检测上性能几乎一致，在刚果盆地分支型猴痘病毒检测上具有显著性的优势，同时针对于刚果盆地分支型设计的特异性探针在检测性能上也优于对照体系；本发明设计的猴痘病毒特异性引物探针在检测天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒、马痘病毒、骆驼痘病毒、鼠痘病毒等相同位置的序列构建的质粒模板上均无扩增，无交叉反应，特异性良好。
[0135]
实施例2灵敏度检测
[0136]
将含有西非分支型猴痘病毒目的片段的质粒样本mpxv-1、含有刚果盆地分支型猴痘病毒目的片段的质粒样本mpxv-2测定浓度，然后经过计算转换成copies/ml单位，将相关的阳性质粒稀释到合适的浓度后再进行2倍倍比稀释，最终将样本浓度控制在1000copies/ml、500copies/ml、250copies/ml、125copies/ml。采用上述确定的检测体系、产品形式以及循环参数对上述构建的阳性质粒进行检测。
[0137]
在传统荧光定量pcr仪abi 7500上采用优化后的扩增程序进行检测，结果如下：
[0138][0139][0140]
猴痘病毒西非分支型和刚果盆地分支型共用检测刚果盆地分支型质粒在abi7500上的最低检出限实验数据如下：
[0141][0142]
猴痘病刚果盆地分支型探针检测刚果盆地分支型质粒在abi7500上的最低检出限实验数据如下：
[0143][0144]
结果表明，本发明的检测方法以及试剂盒具有较高灵敏度，在常规荧光定量pcr仪平台检测西非分支型猴痘病毒最低检出限可以达到500copies/ml，检测刚果盆地分支型猴痘病毒最低检出限可以达到250copies/ml，考虑到该基因在猴痘病毒基因组中具有双拷贝的特征，临床样本的最低检出限还具有进一步下探空间。
[0145]
在超快速荧光定量pcr仪p810上采用优化后的扩增程序进行复核验证，扩增曲线参考图2，扩增数据如下：
[0146][0147]
猴痘病毒西非分支型和刚果盆地分支型共用引物探针检测刚果盆地分支型质粒在p810平台上的最低检出限实验数据如下：
[0148][0149]
猴痘病刚果盆地分支型引物探针检测刚果盆地分支型质粒在p810平台上的最低检出限实验数据如下：
[0150][0151][0152]
结果表明，本发明的检测方法以及试剂盒具有较高灵敏度，在本公司超快速qpcr平台检测与常规qpcr平台具有一致的性能，并且检测速度更快，可以在15分钟以内完成全部检测过程。
[0153]
实施例3特异性检测-实时荧光定量pcr分析仪平台p810
[0154]
本发明采用将甲型流感病毒株(型别：h1n1)、乙型流感病毒株(y型)、鸡痘病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒(3型)、大肠杆菌流感嗜血杆菌、金黄葡萄球菌、肺炎链球菌、健康人的唾液混合后的样本等作为特异性样本进行检测。检测结果如图3所示，检测特异性参考品的检测结果靶标通道均为阴性，表明本发明的试剂盒对其它常见病原体不会产生非特异性扩增。
[0155]
实施例4线性扩增检测-实时荧光定量pcr分析仪平台p810
[0156]
本发明选取一系列梯度稀释浓度分别为1.0
×
109copies/ml～1.0
×
102copies/ml的西非分支型质粒和刚果盆地分支型质粒进行扩增，采用上述确定的检测体系和扩增程序，进行线性扩增测试。检测结果如下表及图4～图6所示，其中，西非分支型和刚果盆地分支型共用探针检测西非分支型猴痘病毒质粒的线性相关系数为0.9979，扩增效率为91％，西非分支型和刚果盆地分支型共用探针检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒的线性相关系数为0.998，扩增效率为89％，刚果盆地分支型探针检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒的线性相关系数为0.9971，扩增效率为90％，表明本发明的试剂盒在配套实时荧光定量pcr分析
仪p810平台上具有较好的扩增线性。
[0157]
西非分支型和刚果盆地分支型共用探针检测西非分支型猴痘病毒质粒的线性数据如下：
[0158][0159]
西非分支型和刚果盆地分支型共用探针检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒的线性数据如下：
[0160][0161]
刚果盆地分支型探针检测刚果盆地分支型猴痘病毒质粒的线性数据如下：
[0162]
[0163][0164]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：

1.检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂，其特征在于，所述试剂检测猴痘病毒的j1l基因保守区靶序列和/或j3r基因保守区靶序列：所述猴痘病毒包括西非分支型猴痘病毒和/或刚果盆地分支型猴痘病毒；所述西非分支型猴痘病毒的j1l基因保守区的靶序列为西非分支型猴痘病毒全基因组第1335～1403位，j3r基因保守区的靶序列为西非分支型猴痘病毒全基因组195722～195790；所述刚果盆地分支型猴痘病毒的j1l基因保守区的靶序列为刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组第1135～1221位，j3r基因保守区的靶序列为刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组195222～195308。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测以下(a)～(d)中至少一个碱基区域：(a)西非分支型猴痘病毒全基因组的第(1335～1340)～(1398～1403)位碱基区域；(b)西非分支型猴痘病毒全基因组的第(195722～195727)～(195785～195790)位碱基区域；(c)刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组的第(1135～1140)～(1216～1221)位碱基区域；(d)刚果盆地分支型猴痘病毒全基因组的第(195222～195227)～(195303～195308)位碱基区域。3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括探针，所述探针包括探针1和/或探针2；所述探针1的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述探针2的核苷酸序列如seq id no:2所示。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括核苷酸序列如seq id no:3～4所示的引物对。5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述探针1和探针2均为taqman探针，所述探针1和探针2的5’端连接有不同的报告荧光基团，所述探针1和探针2的3’端均连接有淬灭荧光基团和/或mgb；优选地，所述报告荧光基团选自fam、nex、rox、tet、tamra、joe、vic、cy3、cy5或texas red；优选地，所述淬灭荧光基团选自bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq或lowa blacktm fq；优选地，所述探针1的5’端连接有fam，所述探针2的5’端连接有vic或nex。6.权利要求1～5任一项所述的试剂在制备用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒中的应用。7.用于诊断猴痘病毒感染相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种或多种的组合：rt-pcr缓冲液或酶混合液；优选地，所述酶混合液包括热启动dna聚合酶和逆转录酶；
优选地，所述酶混合液还包括rna酶抑制剂和/或udg酶；优选地，所述rt-pcr缓冲液包括pcr缓冲液、dntps和mg
2+
，所述dntps为datp、dttp、dctp和dgtp的组合。9.非诊断目的地检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求1～5任一项所述的试剂或权利要求7或8所述试剂盒对待测样品进行pcr扩增的方法，所述pcr扩增的反应条件包括条件1或条件2：条件1：50℃预热60s；95℃变性后，55～62℃下退火15s；变性至退火重复40～45个循环；条件2：94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。10.权利要求9所述检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法在猴痘病毒分型中的应用，所述猴痘病毒分型包括将刚果盆地分支型猴痘病毒与西非分支型猴痘病毒区分开。

技术总结

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种猴痘病毒分型试剂、试剂盒及其应用本发明针对于猴痘病毒J1L基因或J3R基因保守区域设计了一套猴痘病毒的引物、猴痘病毒的西非型和中非型共用探针、刚果盆地(中非)分支型探针。刚果盆地(中非)分支型探针。刚果盆地(中非)分支型探针。

技术研发人员：

黄超杰 周叙全 罗家威

受保护的技术使用者：

广东润鹏生物技术有限公司

技术研发日：

2022.08.24

技术公布日：

2023/3/24