异天冬氨酸甲基转移酶NTPIMT1L3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用的制作方法

异天冬氨酸甲基转移酶ntpimt1l3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用
技术领域
1.本技术涉及烟草种子检测技术领域，特别是一种异天冬氨酸甲基转移酶ntpimt1l3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用。

背景技术：

2.种子引发是指通过控制种子吸水，使种子处于第ⅱ阶段即让种子内的大分子、细胞膜和细胞器等结构修复和活化，经引发-回干后使其处于准备发芽的代谢状态，但防止胚根伸出的操作。种子引发能促进种子萌发，提高种子出苗整齐度，缩短出苗时间，提高幼苗素质和抗逆性。种子引发操作简单、有效、易行，越来越受到农业生产的重视。
3.引发时间是影响引发效果的关键因素。目前，主要利用种子发芽试验确定最佳引发时间，然而该试验因操作环境和品种的不同导致最佳引发时间难以确定，而且确定时间相对较长，不能及时调整技术方案。如何监测烟草种子引发进程，进而通过控制烟草种子引发时间提高种子引发效果仍然是亟待解决的问题。因此，有必要开发能监测烟草种子引发进程的分子标记，从而准确的、不受环境影响的掌握种子引发进程，确定最佳引发时间。
4.根据现有文献中公开的研究结果表明蛋白修复l-异天冬氨酸-甲基转移酶i在延长种子寿命上具有重要的作用，蛋白质异天冬氨酸甲基转移酶能直接修复蛋白中存在的异构天冬氨酸，从而使损伤蛋白的结构和功能重新恢复。但相关研究主要集中于在水稻、鹰嘴豆等相关作物，例如水稻中存在2个l-异天冬氨酸甲基转移酶基因，2个基因通过协同作用提高水稻抗逆性，增强水稻种子的耐贮性(闫蕴韬,何兮,张海清,贺记外.水稻种子耐贮性研究进展[j].中国农学通报,2022,38(05):1-8.)。现有技术并未公开该基因表达在确定烟草种子引发最佳时间的相关应用。

技术实现要素：

[0005]
本技术提供了一种异天冬氨酸甲基转移酶ntpimt1l3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用，用于解决现有技术中存在的烟草种子发芽试验难以定量确定烟草种子引发效果、确定烟草种子最佳引发时间的技术问题。
[0006]
本技术提供了一种异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3表达在烟草种子引发时间确定中的应用，所述异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3为seq id no.1所示。
[0007]
本技术首次提出通过测定进行引发操作后烟草种子中seq id no.1的相对表达量，确定烟草引发的最佳引发时间，并通过具体实验验证该基因在引发烟草种子中的表达量降至最低时，种子的5天发芽率达到最优。
[0008]
优选地，当seq id no.1在烟草引发种子中的相对表达量降到最低水平时，烟草引发种子的引发时间为最佳引发时间。采用该最佳引发时间能使得引发操作后种子的5天发芽率达到96.7％。
[0009]
优选地，采用荧光定量pcr检测烟草引发种子中基因ntpimt1l3的相对表达量，所
用上游引物如序列表seq id no.2所示，所用下游引物如序列表seq id no.3所示。采用该引物对能监测ntpimt1l3基因在烟草种子引发过程中转录水平。
[0010]
优选地，荧光定量pcr检测中采用烟草基因ntef-1α作为内参基因，所述内参基因上游引物如序列表seq id no.4所示，所述内参基因的下游引物如序列表seq id no.5所示。采用该内参基因能相对定量ntpimt1l3基因在烟草种子引发过程中表达量。
[0011]
优选地，所述烟草引发种子所用引发剂为赤霉素溶液。
[0012]
当确定最佳引发时间后，根据该引发时间进行引发操作，具体为在25℃条件下赤霉素溶液引发处理烟草种子27h后终止引发，进行回干处理，完成对烟草种子的处理。
[0013]
本技术的另一方面还公开了一种基于异天冬氨酸甲基转移酶ntpimt1l3基因表达的烟草种子引发时间确定方法，包括以下步骤：
[0014]
步骤s1：对烟草种子进行引发操作，获取多个不同引发时间的引发种子；
[0015]
步骤s2：测定各引发种子中异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量，以异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量最低的引发时间作为该烟草种子的最佳引发时间。
[0016]
该确定方法操作简单，效率高，可准确获取烟草种子最佳引发时间，检测结果不受环境温度的影响。
[0017]
优选地，步骤s1中包括以下步骤：
[0018]
步骤s11：在环境温度下采用赤霉素溶液对烟草裸种进行引发处理。
[0019]
优选地，所述步骤s2中包括以下步骤：
[0020]
步骤s21：采用液氮冷冻各待检测种子后，磨成粉末，并贮存于-80℃，得到检测样品；
[0021]
步骤s22：提取各检测样品的rna后，反转录所得rna得到cdna，，以所得cdna为模板，用荧光定量pcr分析得到各检测样品的异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量。
[0022]
优选地，荧光定量pcr检测中所用引物序列对中，上游引物序列为序列表seq id no.2所示；下游引物序列为序列表seq id no.3所示。
[0023]
优选地，荧光定量pcr检测中所用烟草内参基因为ntef-1α引物，所述ntef-1α引物的上游引物的序列为序列表seq id no.4所示，所述ntef-1α引物的下游引物的序列为序列表seq id no.5所示。
[0024]
采用本技术提供方法确定的ms云烟87裸种的最佳引发时间为27h，引发所用试剂为赤霉素，按该时间引发后，种子5天发芽率增加96.7％。
[0025]
本技术能产生的有益效果包括：
[0026]
1)本技术所提供的异天冬氨酸甲基转移酶ntpimt1l3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用，通过获取异天冬氨酸甲基转移酶基因的ntpimt1l3表达情况，建立烟草种子引发效果与基因表达的定量关系，准确监测种子引发过程，基于该定量关系，可获得确定烟草种子引发效果的检测方法，该方法不受环境的影响，能准确确定种子最佳引发时间，获得良好引发处理效果，具有十分重要的意义。
[0027]
2)该方法试验周期短，采用该方法能快速确定不同种子的最佳引发时间，及时对生产技术方案进行调整，有效提高种子引发效果。
附图说明
[0028]
图1为本技术实施例1中各试验组、对照组5天发芽率与引发时间的关系图；
[0029]
图2为本技术实施例1中各试验组、对照组引发时间与异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3表达水平关系图；
具体实施方式
[0030]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
[0031]
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0032]
并不用于解决本技术技术问题的技术特征，均按现有技术中常用方法设置或安装，在此不累述。
[0033]
实施例
[0034]
以下实施例中所用物料、仪器如无特殊说明，均为商业渠道获取。
[0035]
实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由天一辉远生物科技有限公司完成；实验中用到的各种酶及反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司，方法均参照具体产品的说明书进行。
[0036]
实施例1：烟草不同引发时间效果比较
[0037]
以ms云烟87裸种为材料，在环境温度25℃下用50mg/lga3溶液引发，取不同引发时间的种子(3h、9h、15h、21h、27h、33h、39h)得到多个烟草种子试验组，以未引发种子为对照，进行发芽试验。
[0038]
发芽试验过程如下，先用75％酒精浸泡各烟草种子试验组、对照组种子30s，再用30％次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗4-5次，再用无菌水浸泡10min，将种子表面擦干净置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入5ml蒸馏水，放置于25℃(光照/黑暗各12h)光照培养箱培养中，发芽期间保持滤纸湿润，试验重复3次。测定并统计各烟草种子试验组、对照组种子3次试验的5天发芽率并取平均值，绘制5天发芽率与引发时间的关系图，具体参见图1。5天发芽率统计标准为2片子叶展开、根系正常生长。
[0039]
结果表明(图1)，与未引发种子比较，经50mg/lga3溶液引发27h以上，种子5d发芽率达到96.7％，与引发33h和39h试验组无显著差异，显著高于其他试验组和对照组。可见，以ms云烟87种子引发最佳时间为27h。
[0040]
实施例2：烟草种子引发过程中基因表达分析
[0041]
以ms云烟87裸种为材料，将种子置于环境温度25℃下在50mg/lga3溶液中进行引发，对不同引发时间的种子(3h、9h、15h、21h、27h、33h、39h)得到多个烟草种子试验组，以未引发种子为对照。对各试验组、对照组种子分别取样。所得待检测种子经液氮冷冻处理后，迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。各待测试种子重复3次测试。
[0042]
用(omega,bio-tek,inc)试剂盒提取各个样的rna；用(vazymebiotechco.,ltd)试剂盒反转录形成cdna，以其为模板；用荧光定量pcr进行分析，荧光定量pcr检测引物序列，上游引物序列如序列表seq id no.2所示，所述下游引物序列如序列表seq id no.3所示。
[0043]
采用烟草内参基因ntef-1α引物，上游引物的序列如序列表seq id no.4所示，所述下游引物的序列如序列表seq id no.5所示。
[0044]
结果表明，随着引发时间的增加，种子中ntpimt1l3基因转录水平在在引发时间0～9小时内逐渐上调，9小时后逐渐下降，27小时降到最低水平(参见图2)。
[0045]
结合实例1中发现，当烟草种子中的ntpimt1l3基因的相对表达量降到最低水平后，种子5天发芽率达到96.7％。
[0046]
可见，该基因的表达可准确指示烟草种子适宜引发时间，可开发为烟草引发效果的分子标记，通过检测种子中该基因的相对表达量，确定种子引发过程，即当该基因mrna水平出现显著下降后，终止引发，进行回干处理，可以获得最佳引发效果。
[0047]
实施例3烟草种子最佳引发时间确定方法
[0048]
按以下步骤进行：
[0049]
步骤s1：采用实施例1中公开的ms云烟87裸种进行种子引发操作，获取多个不同引发时间的引发种子；
[0050]
步骤s2：测定各引发种子中异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量，以异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量最低的引发时间作为该烟草种子的最佳引发时间。
[0051]
异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量测定方法：
[0052]
1)分别取样各待测种子。所得待检测种子经液氮冷冻处理后，迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。各待测试种子重复3次测试。
[0053]
2)用(omega,bio-tek,inc)试剂盒提取各个样的rna；用(vazymebiotechco.,ltd)试剂盒反转录形成cdna，以其为模板；用荧光定量pcr进行分析，荧光定量pcr检测引物序列，上游引物序列如序列表seq id no.2所示，所述下游引物序列如序列表seq id no.3所示。
[0054]
3)采用烟草内参基因ntef-1α引物，上游引物的序列如序列表seq id no.4所示，所述下游引物的序列如序列表seq id no.5所示。
[0055]
该方法操作简单，效率高，可定量测定不同品种烟草中的最佳引发时间。且检测结果不受环境温度的影响。有利于快速开展大批量种子引发时间的确定操作。
[0056]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3表达在烟草种子引发时间确定中的应用，其特征在于，所述异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3为seq id no.1所示。2.根据权利要求1应用，其特征在于，当seq id no.1在烟草引发种子中的相对表达量降到最低水平时，烟草引发种子的引发时间为最佳引发时间。3.根据权利要求2的应用，其特征在于，采用荧光定量pcr检测烟草引发种子中基因ntpimt1l3的相对表达量，所用上游引物如序列表seq id no.2所示，所用下游引物如序列表seq id no.3所示。4.根据权利要求3的应用，其特征在于，荧光定量pcr检测中采用烟草基因ntef-1α作为内参基因，所述内参基因上游引物如序列表seq id no.4所示，所述内参基因的下游引物如序列表seq id no.5所示。5.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述烟草引发种子所用引发剂为赤霉素溶液。6.一种基于异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3表达的烟草种子引发时间确定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤s1：对烟草种子进行引发操作，获取多个不同引发时间的引发种子；步骤s2：测定各引发种子中异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量，以异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量最低的引发时间作为该烟草种子的最佳引发时间。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤s1中包括以下步骤：步骤s11：在环境温度下采用赤霉素溶液对烟草裸种进行引发处理。8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中包括以下步骤：步骤s21：采用液氮冷冻各待检测种子后，磨成粉末，并贮存于-80℃，得到检测样品；步骤s22：提取各检测样品的rna后，反转录所得rna得到cdna，以所得cdna为模板，用荧光定量pcr分析得到各检测样品的异天冬氨酸甲基转移酶基因ntpimt1l3相对表达量。9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量pcr检测中所用引物序列对中，上游引物序列为序列表seq id no.2所示；下游引物序列为序列表seq id no.3所示。10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量pcr检测中所用烟草内参基因为ntef-1α引物，所述ntef-1α引物的上游引物的序列为序列表seq id no.4所示，所述ntef-1α引物的下游引物的序列为序列表seq id no.5所示。

技术总结

本申请公开了一种异天冬氨酸甲基转移酶NTPIMT1L3基因表达在烟草种子引发时间确定中的应用，所述异天冬氨酸甲基转移酶基因NtPIMT1L3为SEQIDNO.1所示。烟草种子不同引发时间，会引起异天冬氨酸甲基转移酶NtPIMT1L3基因表达先上升然后显著下降，并在最佳引发时间处达到最低。该基因可作为分子标记监测烟草种子引发过程，确定种子引发最佳时间。确定种子引发最佳时间。