戴尔福特菌LW26及其在降解氯苯中的应用

本发明涉及一株新型氯苯高效降解菌——戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)LW26 及其应用。

氯苯是苯环上只有氢原子和氯原子的单环芳香族化合物，具有溶解度低、疏水性强 等特点。近年来，作为一种重要的有机溶剂和化工生产的中间体，氯苯被广泛应用于塑 料、染料、医药、农药、有机合成等行业。由于其水溶性低且生物毒性大，对环境造成 严重污染。氯苯进入人体后可以抑制神经中枢，易与酶系统结合，有致畸致癌作用。由 于使用广泛，氯苯在多种环境介质中均具有较高的检出率，对人体健康和生态系统安全 构成了一定的威胁，氯苯已被美国环保署(EPA)列入优先控制污染物名单中。

目前，针对这类污染物的排放控制，国内外科研工作者进行了大量研究，各种处理 方法应运而生，主要有吸附法、超声波法、膜分离法、催化氧化法、光化学氧化法、电 化学法等。近年来，生物法被证明在氯苯类化合物的净化中具有良好的应用前景。生物 净化技术是利用微生物代谢活动，将污染物转化为细胞代谢的能源、细胞组成物质及无 害化的小分子物质(如H2O、CO2等)，相较于其它方法具有高效、低耗，反应条件温 和、二次污染小等优点。

利用生物技术降解氯苯的关键之一便是获得氯苯高效降解菌。目前，国内外学者已 在这方面做了大量研究，但是由于氯苯易挥发且难生物降解的特性，已分离得到的氯苯 降解菌种类还比较有限，此外，已分离得到的菌株降解效率还有待提高。如牛仙等在对 一株氯苯优势降解菌LysinibacillusfusiformisLW13进行降解条件优化的实验中发现，当 氯苯初始浓度为100mg/L时，氯苯的降解率达到最大，而当氯苯浓度达到180mg/L时， 氯苯的降解受到明显抑制(牛仙等.环境工程,2013,31(1):43-46.)；2010年，张丽丽等 发现一株具有氯苯降解能力的RalstoniapickettiiH2，在氯苯浓度低于250mg/L时，H2 可快速地降解氯苯，细菌生长良好，而在250mg/L时，菌株生长和降解受到明显抑制(ZL 101880642)；李明堂等筛选出的氯苯降解菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，以初始浓度为50mg/L的氯苯为唯一碳源和能源时，需经过120h才能 将氯苯降解完全(李明堂等.微生物学报,2010,50(5):586-592.)。

经检索有关文献，尚未见用戴尔福特菌降解氯苯的报道。

本发明针对氯苯生物降解效率较低、微生物世代时间长的不足，提供了能高效降解 氯苯的戴尔福特菌LW26及其应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株——戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)LW26，保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏日期为2015年3月15日，保藏编号CCTCCNo：M2015113， 地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所提供的氯苯高效降解菌——戴尔福特菌LW26是通过采集浙江工业大学生 物转化与生物净化实验室用于净化氯苯废气的生物滴滤塔中的生物膜，经分离、纯化后 获得。所述的戴尔福特菌LW26菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为 (0.6～0.8)μm×(1.0～1.5)μm，无芽孢；在固体R2A培养基上菌落呈圆形，乳白，凸起，边 缘平整，形态饱满，光滑湿润，菌苔沿划线生长；接触酶反应为阳性，V-P反应、甲基红 反应、硝酸盐还原反应、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，革兰氏染阴性。

本发明涉及所述的戴尔福特菌LW26在微生物降解氯苯中的应用。具体的，所述的 应用为：将戴尔福特菌LW26接种至含氯苯的无机盐培养基中，在温度23～40℃，pH 4.0～10.0的条件下(优选23～30℃，pH6.0～9.0)进行培养，实现对氯苯的降解。

进一步，所述氯苯在无机盐培养基中初始浓度为100～500mg/L；所述戴尔福特菌 LW26以种子培养或发酵培养后的湿菌体经无机盐培养基稀释获得的OD600＝0.1-0.5的菌 悬液形式加入，菌悬液体积接种量为1-5％，优选OD600＝0.15的菌悬液体积接种量为2％。 进一步，所述无机盐培养基组成为：CaCl2，0.023g/L；MgSO4，0.2g/L；(NH4)2SO4，2.5g/L； KH2PO4，1.0g/L；Na2HPO4，4.5g/L；微量元素母液1mL/L；溶剂为水，pH7.0～7.5。所 述的微量元素母液组成为：FeSO4·7H2O，1.0g/L；CuSO4·5H2O，0.02g/L；H3BO3，0.014 g/L；MnSO4·4H2O，0.10g/L；ZnSO4·7H2O，0.10g/L；Na2MoO4·2H2O，0.02g/L；CoCl2·6H2O， 0.02g/L；溶剂为水。

进一步，当菌液用量较小时，所述的戴尔福特菌LW26菌悬液可通过斜面培养、种 子培养和菌悬液制备三个步骤获得；当用量较大时，可通过斜面培养、种子培养、发酵 液培养和菌悬液制备四个步骤获得，具体过程如下：

(1)斜面培养：将戴尔福特菌LW26接种于R2A固体培养基，28～32℃培养48h， 获得斜面菌体；所述R2A固体培养基组成为：酵母粉，0.50g/L；胰蛋白胨，0.50g/L；干 酪素，0.50g/L；葡萄糖，0.50g/L；可溶性淀粉，0.50g/L；丙酮酸钠，0.30g/L；KH2PO4， 0.45g/L；MgSO4，0.05g/L；琼脂，15～18g/L；溶剂为水，pH7.2。

(2)种子培养：从步骤(1)斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中，28～32℃ 培养24～36h，获得种子液。所述的种子培养基为R2A液体培养基，除无琼脂外，其余组 分与R2A固体培养基相同。

(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵 培养基，于28～32℃，pH6.0～8.0条件下培养24～36h，获得发酵液。所述发酵培养基组 成为：酵母粉，0.5g/L；CaCl2，0.023g/L；MgSO4，0.2g/L；(NH4)2SO4，2.5g/L；KH2PO4， 1.0g/L；Na2HPO4，4.5g/L；微量元素母液，1mL/L；溶剂为水，pH7.0～7.5，微量元素母 液组成同无机盐培养基中微量元素母液。

(4)菌悬液制备：将种子液(或发酵液)在6000rpm离心10min，弃上清液，用已 灭菌的无机盐培养基清洗菌体，然后在6000rpm离心10min，弃上清液，重复洗涤2次。 将获得的湿菌体用无菌无机盐培养基稀释获得所需浓度的菌悬液。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在23～30℃，pH6.0～9.0条件下， 戴尔福特菌LW26在16h内可将无机盐培养基中100mg/L的氯苯完全降解，对氯苯的最 高降解浓度可达500mg/L。而专利申请CN101880642A提供的菌株H2氯苯耐受浓度仅 为250mg/L。李明堂等筛选出的氯苯降解菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) (李明堂等.微生物学报,2010,50(5):586-592.)，以初始浓度为50mg/L的氯苯为唯一 碳源和能源时，需经过120h才能将氯苯降解完全。相较于现有技术，本发明提供的戴 尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)LW26具有降解速度快、耐受浓度高的特点，将在氯苯废 气和废水治理实践中发挥重要作用。

图1为戴尔福特菌LW26透射电镜照片。

图2为戴尔福特菌LW26的系统发育树图。

图3为温度对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响。

图4为pH对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响。

图5为不同氯苯初始浓度下戴尔福特菌LW26对氯苯的降解(a)和生长曲线(b)。

图6为生物滴滤塔工艺流程图，1.空气泵，2.质量流量计，3.转子流量计，4.吹脱瓶， 5.混合瓶，6.储液瓶，7.碱液瓶，8.尾气排放口，9.气体采样口，10.填料取样口，11.蠕动 泵。

图7为生物滴滤塔处理模拟氯苯废气的进出口浓度及去除效率。

图8为SBR反应器工艺流程图，1.搅拌器，2.pH计，3.进水管，4.溶解氧仪，5.排水 口，6.pH探头，7.溶解氧仪传感器，8.温度控仪，9.温度传感器，10.排泥管，11.曝气器， 12.流量计，13.空气泵。

图9为SBR反应器处理模拟氯苯废水的氯苯降解曲线。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中所用无机盐培养基组成为：CaCl2，0.023g/L；MgSO4，0.2g/L；(NH4)2SO4， 2.5g/L；KH2PO4，1.0g/L；Na2HPO4，4.5g/L；微量元素母液，1mL/L；溶剂为水，pH7.0～7.5。 所述的微量元素母液组成为：FeSO4·7H2O，1.0g/L；CuSO4·5H2O，0.02g/L；H3BO3，0.014 g/L；MnSO4·4H2O，0.10g/L；ZnSO4·7H2O，0.10g/L；Na2MoO4·2H2O，0.02g/L；CoCl2·6H2O， 0.02g/L；溶剂为水。

所用R2A固体培养基组成为：酵母粉，0.50g/L；胰蛋白胨，0.50g/L；干酪素，0.50g/L； 葡萄糖，0.50g/L；可溶性淀粉，0.50g/L；丙酮酸钠，0.30g/L；KH2PO4，0.45g/L；MgSO4， 0.05g/L；琼脂，15～18g/L；溶剂为水，pH7.2。

所用R2A液体培养基组成为：酵母粉，0.50g/L；胰蛋白胨，0.50g/L；干酪素，0.50g/L； 葡萄糖，0.50g/L；可溶性淀粉，0.50g/L；丙酮酸钠，0.30g/L；KH2PO4，0.45g/L；MgSO4， 0.05g/L；溶剂为水，pH7.2。

所用发酵培养基组成为：酵母粉，0.5g/L；CaCl2，0.023g/L；MgSO4，0.2g/L；(NH4)2SO4， 2.5g/L；KH2PO4，1.0g/L；Na2HPO4，4.5g/L；微量元素母液，1mL/L；溶剂为水，pH7.0～7.5。

实施例1：戴尔福特菌LW26的分离、纯化及其鉴定

(1)戴尔福特菌LW26的分离及纯化

采集生物滴滤塔填料表面的生物膜，该滤塔为浙江工业大学生物转化与生物净化实 验室处理氯苯废气的生物滴滤塔，接种活性污泥来自浙江某药厂的污水处理池，已稳定 运行5个月。生物膜经分离纯化后得到一株能高效降解氯苯的菌株。具体步骤如下：

从生物滴滤塔中取5g填料，用30mL无菌水将生物膜洗于摇瓶中，置于摇床160rpm， 30℃振荡1小时。然后利用含氯苯的无机盐培养基(氯苯初始浓度100mg/L)进行菌株 富集筛选。

摇瓶中的混合菌液经过5次传代富集后，在R2A固体培养基上稀释涂布，于30℃恒 温培养箱中培养2～3天，依据菌体落的差异性，挑取平板上长出的单菌落进行划线分 离，得到4株纯菌落。将筛选到的4株氯苯降解菌接种至以氯苯为唯一碳源和能源的无 机盐培养基中，考察各菌株对氯苯的处理效果，最终获得一株具有高效氯苯降解活性的 菌株LW26。

(2)菌株LW26的鉴定

菌株LW26细胞呈短杆状，大小为(0.6～0.8)μm×(1.0～1.5)μm，无芽孢；菌落呈圆形， 乳白，凸起，边缘平整，形态饱满，光滑湿润，菌苔沿划线生长，电镜照片见图1。

菌株LW26的生理生化特征为：接触酶反应为阳性，V-P反应、甲基红反应、硝酸盐 还原反应、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，革兰氏染阴性。

菌株LW26斜面菌种委托生工生物工程(上海)有限公司进行PCR扩增以及测序， 获得16SrDNA序列如下(SEQIDNO.1，GenBank登录号为KP966097)：

GAACAGGGGGACCGCCTTACAATGCTAGTCGAACGGTAACAGGTCTTCGGAC GCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGG ATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATACGATCTGAGGATGAAAGCGGGGG ACCTTCGGGCCTCGCGCGATTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGA TAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGG ACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGG TTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAAAAGCTCCTTCTAATACAGGGGGCCCATG ACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG TAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATG TAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGCATG GCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAT ATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATG CACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAA CGATGTCAACTGGTTGTTGGGAATTAGTTTTCTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAA GTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG ACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTAC CCACCTTTGACATGGCAGGAAGTTTCCAGAGATGGATTCGTGCTCGAAAGAGAACC TGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTCAGTTGAGCACTCTAAT GAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGC CCTTATAGGTGGGGCTACACACGTCATACAATGGCTGGTACAGAGGGTTGCCAACC CGCGAGGGGGAGCTAATCCCATAAAACCAGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAAC TCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTCTCGCCAG AAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTACCCACGGGCGGGTTTGCCGG。

将测序结果上传到GenBank，获得GenBank登录号为KP966097，并且同GenBank 中的基因序列进行同源性比对。据此建立系统发育树如图2所示，推测菌株LW26可能 是Delftiatsuruhatensis。通过16SrRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，结合菌 株LW26生理生化特征，确定该菌株LW26为Delftiatsuruhatensis。

实施例2：戴尔福特菌LW26菌悬液的制备

当菌液用量较小时，所述的戴尔福特菌LW26菌悬液可通过斜面培养、种子培养和 菌悬液制备三个步骤获得；当用量较大时，可通过斜面培养、种子培养、发酵液培养和 菌悬液制备四个步骤获得，具体过程如下：

(1)斜面培养：将戴尔福特菌LW26接种于R2A固体培养基，28～32℃培养48h， 获得斜面菌体；

(2)种子培养：从步骤(1)斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中，28～32℃ 培养24～36h，获得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵 培养基，于28～32℃，pH6.0～8.0条件下培养24～36h，获得发酵液；

(4)菌悬液制备：将种子液(或发酵液)在6000rpm离心10min，弃上清液，用已 灭菌的无机盐培养基清洗菌体，然后6000rpm离心10min，弃上清液，重复洗涤2次， 将获得的湿菌体用无菌无机盐培养基稀释获得所需浓度的菌悬液。

实施例3：戴尔福特菌LW26对氯苯的降解特性

(1)温度对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响

在不同温度下实施戴尔福特LW26对氯苯的降解实验，发现其在23～30℃具有较高 的降解氯苯的能力，具体实验方案如下：

在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基，pH值7.0，110℃灭菌40分钟后，加 入氯苯作唯一碳源，使氯苯的初始浓度为100mg/L，再加入1mL实施例2方法经斜面和 种子培养至对数生长期的戴尔福特菌LW26菌悬液(OD600＝0.15)。实验过程中，每个 温度设计三个平行样和一个空白对照(不加LW26菌悬液)。将各个样品分别放置在23℃、 25℃、30℃、35℃、40℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm)，分别在0h和24h 取样，检测摇瓶中氯苯浓度和菌株的菌密度。

结果如图3所示，在温度为23～30℃时该菌株生长状况良好，氯苯的去除率均可达 到99％；温度35℃时菌株对氯苯的去除率有所下降，仅为76.2％。随着温度的进一步提 高，菌株的生长受到抑制，氯苯降解能力大幅度下降。

(2)pH对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响

在不同pH下实施戴尔福特LW26对氯苯的降解实验，结果表明LW26在pH6.0～9.0 具有较高的降解氯苯的能力，具体实验方案如下：

在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基，用1mol/LNaOH水溶液或1mol/LHCl 水溶液将无机盐培养基的pH调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，110℃灭菌40 分钟灭菌后，加入氯苯作唯一碳源，使氯苯的初始浓度为100mg/L，再加入1mL实施例 2方法经斜面和种子培养至对数生长期的戴尔福特菌LW26菌悬液(OD600＝0.15)。实验 过程中，每个pH设计三个平行样和一个空白对照(不加LW26菌悬液)。将各个样品 放置在30℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm)。分别在0h和24h取样，检测 摇瓶中的氯苯浓度和菌株的菌密度。

结果如图4所示，在pH为6.0、7.0、8.0、9.0时，戴尔福特菌LW26生长状况良好， 在24h内对氯苯的去除率均达90％以上，对氯苯去除效率较高。而在pH为4、10的培 养基中，经24h的培养，菌密度仍然很低，氯苯的去除率均在30％以下，表明在过酸或 过碱的条件下，戴尔福特菌LW26都难以生存。

(3)戴尔福特菌LW26对不同初始浓度的氯苯的降解情况

在不同氯苯初始浓度下，实施戴尔福特菌LW26对氯苯的降解，结果发现LW26最 高可降解500mg/L氯苯，具体实验方案如下：

在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基，pH值7.0，110℃灭菌40分钟后，中 加入氯苯作唯一碳源，使氯苯的初始浓度分别为100、200、300、400、500mg/L。再分 别加入1mL实施例2方法经斜面和种子培养至对数生长期的戴尔福特菌LW26菌悬液 (OD600＝0.15)。实验过程中，每个初始浓度设计三个平行样和一个空白对照(不加LW26 菌悬液)。将各个样品放置在30℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm)，每隔 2h取样，检测氯苯浓度和菌株的菌密度，绘制戴尔福特菌LW26对氯苯的降解曲线图以 及其生长曲线图。

结果如图5所示，当氯苯初始浓度在400mg/L及以下时，戴尔福特菌LW26可快速 降解氯苯，细菌生长状况良好。当氯苯初始浓度在400mg/L以上时，由于底物的抑制作 用，降解能力略有下降，该菌株对氯苯的最高降解浓度可达500mg/L。

实施例4：戴尔福特菌LW26净化模拟氯苯废气

利用生物滴滤塔处理模拟氯苯废气，工艺流程如图6所示。

由空气泵1鼓出的空气分为两路，一路经质量流量计2进入装有氯苯废液的吹脱瓶 4中，用于吹脱氯苯，吹脱出的氯苯气体与另一路经过转子流量计3进入混合瓶5的空 气混合均匀后，通过控制质量流量计和转子流量计模拟得到不同浓度的氯苯废气。气体 自下而上流经填料塔，填料塔中填料为鲍尔环，循环营养液则由蠕动泵11提升至塔顶后 向下喷淋，为填料上附着的微生物提供其所需营养元素，在填料取样口10取样测定生物 量，在塔顶的气体采样口测定出气浓度，处理后的废气经尾气排放口8流出，营养液喷 淋后流入储液瓶6，通过碱液瓶7调节储液瓶6内液体pH值。装置的操作温度由缠绕于 塔体的电热丝及控温器控制在30℃左右。营养液的喷淋量为5～6L/h，每隔4d更换一次 营养液，其pH采用0.5mol/L的NaOH水溶液调节以维持在6.8～7.2之间。将按照实施例 2方法经斜面、种子和发酵培养制备的戴尔福特菌LW26菌悬液(OD600＝0.5)接种至生 物滴滤塔中，接种量为2L。挂膜启动过程中停留时间为90s，初始氯苯进气浓度为 200mg/m3。

如图7所示，滤塔运行22d后，挂膜启动成功，当氯苯进口浓度为750～850mg/m3 时，氯苯的去除率仍大于90％。

实施例5：戴尔福特菌LW26处理模拟氯苯废水

利用SBR反应器处理模拟氯苯废水工艺流程如图8所示。

在反应器中按照1∶1的比例接种活性污泥和LW26菌液(按照实施例2方法经斜面、 种子和发酵培养制备)。反应器总容积为4L，有效容积为3L，每个周期运行时间为8h， 具体运行参数如下：采用瞬时进水和瞬时出水，每个周期内曝气时间和沉淀时间分别为 7h和1h。运行期间，反应器内DO为2～4mg/L，MLSS为1.5～3g/L，pH6.5～7.5，温度 通过温控仪控制在25±1℃。

如图9所示，SBR运行稳定后，当进水氯苯浓度为110mg/L时氯苯去除效率可达到 92％以上。