蜡状芽孢杆菌ZJB-11071及其应用

本发明涉及一株产脱卤酶的菌株——蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071， 及其在生物催化合成环氧化物和手物中间体中的应用。

1948年Heppel等首先描述了由微生物产生的能使二氯甲烷水解成甲醛的脱卤 酶，此后不同类型的脱卤酶被相继发现。1960年Janssen把能从卤族有机化合物上使 卤族离子释放出来的酶统称作脱卤酶(Dehalogenase)。从1968年Castro等首次发现 以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobaterium sp.)菌株至今，人们相 继筛选到多种可以降解卤代醇的微生物。其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤 杆菌(Agrobacterium radiobacter)AD1和节杆菌(Arthrobacter sp.)AD2以及从土壤 中获得的棒状杆菌(Corynebacterium sp.)N-1074等。虽然它们降解有机卤化物的途 径虽然存在明显差异，但是卤代醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于 所有的代谢途径中。

本发明的目的是提供一种能够产生卤醇脱卤酶的菌株——蜡状芽孢杆菌(Bacillus  cereus)ZJB-11071，及其在生物催化合成环氧化物和手物中间体中的应用。

本发明采用的技术方案是：

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中国典型培养物保藏中心，地 址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M2013314，保藏日期2013 年7月5日。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有 催化合成环氧化物和手物中间体(R(-)4-氰基-3-乙酯)的性能。

本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在微生物催化卤代醇制备环氧化物 中的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化 剂，以卤代醇为底物，于pH值为7.0～7.5的缓冲液中，在35℃、150rpm条件下进 行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相 即为含有环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得所述环氧化物。

所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为30～80g/L，优选50g/L，所述底物 的初始浓度为20～50mmol/L。

所述卤代醇为1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-2-丙醇或1,3-二溴-2-丙醇。

本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在生物催化合成手物中间体中 的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化剂， 以S(-)-4-氯-3-乙酯为底物，于pH值为7.0～7.5的缓冲液中，在35℃下进行 转化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相， 将混合液分离纯化，获得R(-)-4-氰基-3-乙酯；所述催化剂的用量以湿菌体质 量计，终浓度为50g/L，所述底物的初始浓度为20～50mmol/L。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：

(1)斜面培养

将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30℃培养12h，获得斜面菌 体；

所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L， 琼脂20.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0；

(2)种子培养

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子 液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L， 溶剂为水，pH值为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养 60h后，在12000g下离心5min，收集湿菌体；

所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HPO43.2g/L， K2HPO41.5g/L，Na2EDTA0.06g/L，MnSO40.002g/L，MgSO40.001g/L，ZnSO40.002 g/L，FeSO40.01g/L，溶剂为水，pH值为6.8。

通常的，保存的菌株从冰箱中取出后进行下一步操作前，需要进行活化培养，按 照常规方法即可，通常选择LB培养基进行斜面培养，培养温度30℃，培养时间2天。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株新菌株--蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)ZJB-11071，及其在生物催化环氧化物和手物中间体中的应用， 蜡状芽孢杆菌ZJB-11071对1,3-二氯-2-丙醇转化率达到42.3％，对2,3-二氯-2-丙醇转 化率达到21.1％，对1,3-二溴-2-丙醇转化率达到95％，对S(-)-4-氯-3-乙酯 转化率达到24.6％，具有重要应用前景。

图1为1,3-DCP和ECH的气相谱图。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：

实施例1：蜡状芽孢杆菌ZJB-11071的筛选

本发明从全国各地取土样，共取土样80份。筛选的具体方法：称取1g土样置于 50mL富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天。取1mL富集液加入50mL 新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化。

选用溴百里香酚蓝作为指示剂检测能够降解底物的菌落。其原理为：含氯有机物 降解的同时会释放质子，从而使培养基局部的pH值发生改变。指示剂溴百里香酚蓝 变范围为5.8-7.6(黄-蓝)，因此能利用含氯有机物的菌落周围呈现黄，而不能利 用的则菌落周围平板颜仍为青绿。

将富集液用无菌水逐级稀释10个梯度，选取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10五个梯 度的稀释液各取0.1mL均匀涂布在平板筛选培养基上，30℃恒温培养48h。挑取指 示平板上黄单菌落接种到斜面培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养，长至菌落 直径大小为3-4mm左右时，于4℃保藏。

将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h。将种子液以体 积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h。在12000g 下离心5min，收集湿菌体，加入一定体积的磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)制成0.5g/mL 菌悬液用于转化。转化条件如下：磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)10ml中加入0.5g/mL 菌悬液(菌悬液的用量以湿菌体质量计为50g/L反应体系)10ml，1,3-DCP0.03mol (终浓度30mM)，置于30℃水浴摇床转化24h，取1mL转化液，乙酸乙酯萃取后气 相检测分析。最终得到一株催化活力较高的野生菌株，并将此菌株命名为菌株 ZJB-11071。

气相分析条件为：采用的气相谱仪为美国安捷伦Agilent-7890型，配备FID检 测器。谱分析条件：谱柱为HP-5毛细管柱；柱温为80℃保持4min10℃/min 升温至100℃；前进样口温度为230℃；检测器FID温度为250℃；载气(N2)流速 为54.0mL/min。在该条件下，标样出峰情况如图1所示，1,3-DCP和ECH的出峰时 间分别为5.1min和3.7min。

所述富集培养基终浓度组成为(g/L)：Na2HPO45.37，KH2PO41.36，(NH4)2SO4 1.25，Na2EDTA0.06，MnSO40.002，MgSO40.001，ZnSO40.002，FeSO40.01，溶剂 为水，pH值为6.8。

所述平板筛选培养基为(g/L)：K2HPO45.37，(NH4)2SO41.25，KH2PO41.36，酵 母抽提物0.2，琼脂20，溶剂为水，pH值为6.8。121℃20min灭菌。冷却至50-60 ℃时加入溴百里香酚蓝0.06g，1,3-DCP2mL，利用NaOH调至青绿后倒平板。

所述斜面培养基终浓度组成为(g/L)：NaCl10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，琼 脂20.0，溶剂为水，pH值为7.0。

所述发酵培养基终浓度组成为(g/L)：乳糖8，蛋白胨6，Na2HPO43.2，K2HPO4 1.5，Na2EDTA0.06，MnSO40.002，MgSO40.001，ZnSO40.002，FeSO40.01，溶剂 为水，pH值为6.8。

实施例2：菌株ZJB-11071的鉴定

本发明实施例1筛选得到的菌株ZJB-11071在斜面培养基上，37℃培养24小时 后形成圆形或近圆形，质地软，表面较粗糙，扁平，边缘不规则，有光泽的乳白菌 落，直径5-7mm。革兰氏染观察：紫短杆状。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生 或近中生，孢囊无明显膨大。

通过Biolog(GENIII)自动微生物检定系统对菌株ZJB-11071进行了94种表型测 试，包括71种碳源利用情况以及23种化学敏感性检测。经Biolog读数仪分析菌株的 代谢指纹，结果表明菌株ZJB-11071能与22种化学物质发生灵敏反应，对40种碳源 的利用率较大，而对其他31种的碳源的利用较低或者完全不能利用。Biolog系统给 出36h鉴定结果，如表1和表2所示，确定菌株ZJB-11071为蜡样芽孢杆菌(Bacillus  cereus)。同时以菌株ZJB-11071的总DNA为模板，利用引物:P1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩 增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托上海生工对该菌16S  rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索 GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对。基于形态、生理生 化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，最终确定该菌为蜡状芽孢 杆菌，命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071。

表1菌株对Biolog GENⅢ板上71种碳源的利用能力

Table1Utilization of71carbon-substrates by the strain using Biolog GENⅢ microplate

Notes:+,positive；-,negative；B,borderline

表2菌株对Biolog GENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性

Table2Sensitivity of23chemical-substrates by the strain using Biolog GENⅢ microplate

Notes:+,positive；-,negative；B,borderline

利用引物P1和P2进行PCR扩增后，经测序确认该片段实际长度为1544bp。菌 株ZJB-110711的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示。

所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为：

任何对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插 入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发 明的保护范围。

实施例3：湿菌体的制备

(1)斜面培养

将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30℃培养12h，获得斜面菌 体。

所述斜面培养基终浓度组成为(g/L)：NaCl10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，琼 脂20.0，溶剂为水，pH值为7.0。

(2)种子培养

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子 液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L， 溶剂为水，pH值为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养 60h后，在12000g下离心5min，收集湿菌体。

所述发酵培养基终浓度组成为(g/L)：乳糖8，蛋白胨6，Na2HPO43.2，K2HPO41.5， Na2EDTA0.06，MnSO40.002，MgSO40.001，ZnSO40.002，FeSO40.01，溶剂为水， pH值为6.8。

实施例4：以1,3-二氯-2-丙醇为底物的生物转化反应

在10mL磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)中加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g， 底物1,3-DCP(1,3-二氯-2-丙醇)终浓度为20mM，放入水浴摇床35℃，150rpm条 件下转化6h(反应结束后用2M的硫酸终止酶活)。取700μL转化液于EP管中，并 用700μL乙酸乙酯萃取，静置10min后12000r/min离心2min，取上层有机相进行 气相检测。同样条件下，以不加湿菌体作为空白对照。结果表明蜡状芽孢杆菌 ZJB-11071对1,3-二氯-2-丙醇的转化率为42.3％。

1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)和环氧氯丙烷(ECH)的检测条件：采用的气相 谱仪为美国安捷伦Agilent-7890型，配备FID检测器。谱分析条件：谱柱为HP-5 毛细管柱；柱温为80℃保持4min，10℃/min升温至100℃；前进样口温度为230℃； 检测器FID温度为250℃；载气(N2)流速为54.0mL/min。在该条件下1,3-DCP和 ECH的出峰时间分别为5.1min和3.7min。

实施例5：以2,3-二氯-2-丙醇(2,3-DCP)为底物的生物转化反应

在10mL磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)中加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g， 底物2,3-DCP终浓度为20mM，放入水浴摇床35℃，150rpm条件下转化6h(反应结 束后用2M的硫酸终止酶活)。取700μL转化液于EP管中，并用700μL乙酸乙酯萃 取，静置10min后12000r/min离心2min，取上层有机相进行气相检测。同样条件 下，以不加湿菌体作为空白对照。结果表明蜡状芽孢杆菌ZJB-11071对2,3-二氯-2- 丙醇的转化率为21.1％。

2,3-二氯-2-丙醇和环氧氯丙烷的检测条件：气相谱仪为Agilent7890型，配备 FID检测器。谱分析条件：谱柱：HP-5毛细管柱；柱温：150℃保持7min；前进 样口温度：230℃；检测器：FID温度250℃；载气(N2)流速：54.0mL/min；2,3-二氯 -1-丙醇和环氧氯丙烷的出峰时间分别为2.4min和2.6min。

实施例6：以S(-)-4-氯-3-乙酯为底物的生物转化反应

在反应釜中加入10mL磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)，实施例3方法制备的湿 菌体0.5g，S(-)-4-氯-3-乙酯的终浓度为50mM，反应过程中流加NaCN维持 pH7.2～7.5，反应温度为35℃，转速为300r/min，转化2小时后取样，样品经乙酸乙 酯按体积比1:1比例萃取后，利用GC检测分析S(-)-4-氯-3-乙酯和R(-)4-氰 基-3-乙酯的含量，结果表明蜡状芽孢杆菌ZJB-11071对S(-)-4-氯-3- 乙酯的转化率为24.6％。

S(-)-4-氯-3-乙酯和R(-)4-氰基-3-乙酯的检测条件：气相谱仪 为Agilent7890型，配备FID检测器。谱分析条件：HP-5毛细管柱；柱温：165℃保 持4.5min；进样口温度：230℃；检测器：FID温度250℃；载气(N2)流速：54.0mL/min； S(-)-4-氯-3-乙酯和R(-)4-氰基-3-乙酯的出峰时间分别为2.9min和 3.4min。

实施例7：以1,3-二溴-2-丙醇为底物的生物转化反应

在10mL磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)中加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g， 底物1,3-二溴-2-丙醇的终浓度为20mM，放入水浴摇床35℃，150rpm条件下转化6 h(反应结束后用2M的硫酸终止酶活)。取700μL转化液于EP管中，并用700μL 乙酸乙酯萃取，静置10min后12000r/min离心2min，取上层有机相进行气相检测。 同样条件下以不加湿菌体作为空白对照。结果表明蜡状芽孢杆菌ZJB-11071对1,3-二 溴-2-丙醇的转化率为95％。

1,3-二溴-2-丙醇和环氧溴丙烷的检测条件：气相谱仪为Agilent7890型，配备 FID检测器。谱分析条件：谱柱：HP-5毛细管柱；柱温：110℃保持7min；进 样口温度：230℃；检测器：FID温度250℃；载气(N2)流速：54.0mL/min；1,3-二溴 -2丙醇和环氧溴丙烷的出峰时间分别为5.3min和3.0min。

通过以上实施例得出结论:本发明蜡状芽孢杆菌ZJB-11071可以产生卤醇脱卤酶， 进而催化卤代醇生成相应的环氧化物，同时还能催化S(-)-4-氯-3-乙酯制备 R(-)-4-氰基-3-乙酯。