一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行细胞质特异性标记的方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用人工蛋白类荧光探针对活 细胞进行细胞质特异性标记的方法的应用，在紫外光的激发下，这种探针可以 在活细胞体内产生蓝荧光。

在近些年的生物医学研究领域里，研究者常利用自发光的荧光分子来对生 物体进行标记，使原本透明的细胞或细胞器在黑暗的显微镜视场中显露出来。

2008年，下村修、马丁·沙尔菲、钱永健三位科学家以绿荧光蛋白的发 现及应用获得了诺贝尔奖。下村修在提取水母素时发现了绿荧光蛋白，马 丁·沙尔菲通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物产生绿荧光蛋白， 证实了绿荧光蛋白与活体生物的相容性，建立了利用绿荧光蛋白研究基因 表达的基本方法。钱永健研究了绿荧光蛋白的工作原理以及发光机制，并通 过改变基因序列等化学改造手段，将其研究的红、蓝、黄荧光蛋白应用 在生物学、遗传学、生命科学等领域。钱永健将红、黄、青3种荧光素嵌入 老鼠基因组，随后用来自细菌的重组基因激活这些素基因。通过在老鼠不同 部位或不同发育阶段使用不同素基因，成功为老鼠的不同细胞涂上不同颜， 这就是2007年轰动科学界的“脑虹”现象。2010年，钱永健课题组研制出一种 荧光液体，这种注射型液体可使患者体内通常不可见的神经发光现形。荧光蛋 白对神经的特异性标记使其与周围组织区别开来，这种差异比利用其他方式产 生的差异要大10倍，为外科手术提供了重要的辅助工具。这些研究的成功，使 得荧光蛋白在显微医学和临床医学等应用上有了重大突破。

尽管利用蛋白质自发荧光实现标记的研究已取得了很大进展，但仍存在着 许多亟待解决的问题，如对于细胞内存在的各种复杂情形而言的小分子标记物， 其标记的特异性目前仍具有挑战性，尚未在真正意义上实现生物活体内各类蛋 白质的实时观测、动态研究。另外，蛋白类荧光探针也有其固有缺点：(1)需 要从蛋白质中提取氨基酸片段，实施过程复杂；(2)绿荧光蛋白由238个氨 基酸组成，它较大的体积在作为荧光探针时容易干扰其他蛋白的正常生理活动 甚至阻碍其达到研究目的；(3)荧光稳定性差，且蛋白容易失活；(4)以特异 性的标记表达与检测为主，缺乏普遍适用性。

巯基化合物是生物体内重要的生物活性物质，可作为细胞内的抗氧化 剂，参与蛋白质和DNA的合成以及物质的运输和新陈代谢等生理活动。半胱氨 酸是生物体内非常重要的巯基类化合物，具有抑菌和解毒等独特的功能，生物 体内半胱氨酸的含量变化或代谢失调均会导致一些疾病的发生。正因如此，科 研人员一直不懈努力，试图开发出各种特异性的荧光探针来检测生物体内巯基 化合物。然而对巯基的自发荧光特性几乎无人问津。因此，巯基类自发荧光探 针对细胞的标记特性目前尚属缺乏。

本发明中通过将自然界唯一的碱性多糖‑壳聚糖与丰富、价廉的L‑半胱氨 酸进行人工接枝聚合，制备出氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物，研究其自发荧 光特性及共聚物对细胞特异性标记。由于该共聚物合成原料来源丰富，共聚物 与细胞生物相容性好使得该共聚物有望成为目前昂贵染料的替代品，为临床医 学、生物分析等提供新的方法，同时为新型自发荧光探针的研究开创新的研究 思路和研究体系。

根据本发明的一个方面，提供了一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行 细胞质特异性标记的方法，其特征在于包括：

配制氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；

将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM培养液中；

用乙二胺四乙酸(EDTA)‑胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细 胞消化为单细胞悬液；

孵育所述CHL细胞；

弃掉原液；

加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；

继续培养预定的时间。

图1显示了紫外照射下在灭菌水中接枝聚合物的荧光现象。

图2‑5显示了在本发明的各实施例中，在紫外光的激发下，用荧光显微镜观 察接枝共聚物与高糖培养液组成的悬液在与中国仓鼠肺成纤维细胞共培养后的 细胞内荧光情况。

图6是在本发明的一个实施例中，在紫外光激发作用下CLSM光切单个标 记CHL细胞的图像。

本发明的目的是提供一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行细胞质特异 性标记的方法，弥补目前细胞标记领域里费时、成本高、细胞损伤大的缺点， 提供一种简便、细胞损伤小、生物相容性好的蛋白类荧光探针，利用其中能自 发荧光的巯基作为生团，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记与检测， 为临床医学、生物分析等提供新的方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行 细胞质特异性标记的方法，其特征在于包括：

配制氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；

将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM高糖培养液中；

用EDTA‑胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬 液；

孵育所述CHL细胞；

弃掉原液；

加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；

继续培养预定的时间。

根据本发明的更具体的方面，为了实现上述目的，本发明采用以下措施：

这类蛋白类自发荧光探针主要通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内 酸酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应制备氨基 酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物粉末‑荧光探针，紫外照射约10min后将其分散于 灭菌水中，利用其特性制备此探针的悬液，并与DMEM高糖培养液混合，与 中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)在37℃、5％体积分数的CO2培养箱中共同孵育， 荧光探针通过微粒扩散、细胞内吞等方式进入细胞质，实现对细胞的标记。

一种氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物荧光探针标记细胞的方法，其具体实 施步骤如下：

1、配制0.126mol/mL和1.031mol/mL的氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物 悬液。将氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物固体粉末紫外照射约10min后加入适 量灭菌水，并用超声器超声分散，时间为7h，保持超声器每工作20min停歇 10min。将分散好的接枝共聚物水溶液分散于DMEM高糖培养液中，保存于4 ℃冰箱中备用；

2、CHL细胞在DMEM高糖培养液中培养至铺满培养瓶80％以上时，用体 积比为0.05％的乙二胺四乙酸(EDTA)‑胰蛋白酶消化为单细胞悬液，并用血球 计数板计数后，将其配为1.0×104个/mL、2.5×104个/mL、4.5×104个/mL的 细胞悬液，分装至底部铺有盖玻片的六孔板，在37℃、5％体积分数的CO2培养 箱中孵育，使细胞正常贴壁生长，得到实验所需的细胞生长状态；

3、待上一步的CHL细胞孵育24h后，弃掉原液，加入第一步配好的溶有 荧光探针(氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物)的DMEM高糖培养液，继续培养 6‑48h。

4、选择预设时间点，每隔6h、12h、24h取出六孔板，弃掉原液，用PBS (磷酸缓冲液)冲洗3次，约5min/次。然后，放置于荧光显微镜下观察荧光探 针对CHL细胞标记的情况，所采用的激发光是紫外光。

所述的荧光探针通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合成、半胱 氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应制备而成。

所述的细胞为中国仓鼠肺成纤维细胞。

本发明与现有荧光探针标记技术相比有以下优点和作用：

本发明所用的荧光探针对细胞标记效果良好，操作简单易行，与细胞的生物相 容性好，光稳定性好；无需引入其他有机染料，对细胞损伤度低，且在48h内 几乎无毒。细胞被标记后稳定性好，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记 与检测，在医学诊断里，可以通过信号传导和细胞的迁移来诊断疾病。

1、提供自发荧光探针的应用途径。

本发明的技术方案为：

1、自发荧光探针的结构

本发明的自发荧光探针的结构式为：

这一蛋白类自发荧光探针主要通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸 酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应来完成的。

2、自发荧光探针的应用

将本发明的自发荧光探针用于生物体系中活体细胞的检测标记和荧光成像 检测。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

(1)利用紫外激发，实现自发荧光团的荧光效果，可免去代价高、对细胞损伤 大的染过程。在氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物中，侧链上的自发荧光团较 多，可增强细胞体内荧光强度。

(2)生物相容性好，毒性低，可进行活细胞标记。

(4)有很好的光稳定性，受细胞内源荧光干扰小。

(5)进入细胞后荧光效果好，而且荧光稳定，适合活体细胞标记。

本发明的自发荧光探针在活细胞标记与检测上有很好的应用价值，可以通 过标记过的细胞检测信号传导和细胞的迁移来诊断疾病。

本发明的氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物是一种很好的荧光成像物质，在 生物工程领域中有很好的实用效果。

图1是紫外光激发下，氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝聚合物(以下实验均采用 接枝度为30的共聚物为探针进行研究)分散于灭菌水中的荧光图像。从图像中 可以看到接枝共聚物颗粒发出蓝荧光，同时可以看到，分散颗粒的粒径范围 为50‑1500nm，为其顺利透过细胞膜，进入细胞体内作了较好的准备；

图2‑图5是荧光显微镜下，氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物与DMEM高 糖培养液组成的悬液在与CHL细胞(根据对照实验结果，细胞悬液浓度采用2.5 ×104个/mL)共培养6h，12h，24h，48h后的细胞内荧光图像(左图均为自然光下 的细胞图像，右图均为紫外光激发下的细胞内荧光图像。采用激发波长范围为 EX＝330‑380nm，曝光时间为15.505ms。放大倍数为1000倍。经过比较发现， 48h时细胞的荧光强度最大，标记效果最好。

下面通过具体实施例说明本发明的应用，但本发明不受这些实施例的限制；

实施例1：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物探针悬液的荧光性

取0.096g接枝度为30的氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物分散于装有5mL 灭菌水的离心管中，并用超声波清洗器分散聚合物，超声分散时超声清洗器每 工作20min停下10min，总共超声时间约7h。然后在荧光显微镜下观察共聚物 悬液的荧光情况。如图1所示，聚合物粒径可分散至50‑1500nm。在紫外光激 发下，聚合物颗粒发出蓝的荧光，荧光强度比较强，这为配成培养液悬液与 细胞共孵育打下基础。

实施例2：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物探针与CHL细胞共培养6h时 细胞内的荧光性CHL细胞与DMEM高糖培养液共培养。在细胞传代时，将一 定浓度的细胞悬液转移至铺有盖玻片的六孔板。在CO2培养箱中培养24h后换 液，新的培养液是溶有共聚物的悬液。细胞与培养液悬液继续共同孵育6h后， 弃掉培养液，用PBS在摇床上振荡冲洗3次，约5min/次。取出后放置于载玻 片上，盖上盖玻片置于荧光显微镜下观察细胞的荧光图像，紫外光激发，激发 波长范围为EX＝330‑380nm，曝光时间为15.505ms。如图2所示，接枝共聚物 在细胞周围富集，其原因主要有两种：一是共聚物本身特性，如共聚物富含丰 富的羟基、分散的小颗粒之间有分子间吸附作用力等使其容易团聚成球，且不 易分散；二是细胞对共聚物的吸附作用，细胞在内吞异物或者细胞壁内外有浓 度差时，在细胞周围均会富集异物，6h培养结果表明此阶段细胞与共聚物主要 的相互作用是细胞外的富集。

实施例3：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物与CHL细胞共培养12h时细胞 内的荧光性

接枝共聚物与CHL细胞共培养12h，实验过程及处理方式同实施例3。如 图3所示，小颗粒的接枝共聚物进入了细胞内。从CHL细胞的类型及摄食方式 可知，细胞体内的小颗粒的接枝共聚物主要通过细胞的内吞作用进行，而且接 枝共聚物在细胞内荧光开始出现。

实施例4：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物与CHL细胞共培养24h时细胞 内的荧光性

接枝共聚物与CHL细胞共培养24h，实验过程及处理方式同实施例3。从图 4可以看出，进入细胞的共聚物数量增多，这些共聚物在细胞内转运，富集，在 紫外光激发下，荧光强度增加。

实施例5：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物与CHL细胞共培养48h时细胞 内的荧光性

接枝共聚物与CHL细胞共培养48h，实验过程及处理方式同实施例3。

如图5所示，左图是自然光下细胞，右图则为紫外光下细胞。共培养48h 后的细胞由于已经适应周围环境，呈现自然的梭形。此时，更多的共聚物颗粒 在细胞内富集，细胞的荧光区域增大，荧光强度大大增强。这表明，自发荧光 探针对细胞有较好的生物相容性，对细胞有良好的标记效果。

实施例6：氨基酸‑壳聚糖多肽类接枝共聚物与CHL细胞共培养24h时细胞 荧光光切图像

接枝共聚物与CHL细胞共培养24h，实验过程及处理方式同实施例3。

图6是本实施例中紫外光激发作用下CLSM光切单个标记CHL细胞的图 像，在光切扫描过程中，细胞膜与细胞质的蓝荧光区域被分层切片扫描，荧 光光亮持久稳定。随着光切的进行，共聚物颗粒可以穿过细胞膜进入并固定在 细胞的胞浆区域，而使胞浆区呈现稳定的蓝荧光。被蓝区域包裹的区域是 没有被共聚物标记的细胞核，因为共聚物颗粒粒径相对较大无法穿越核孔进入 细胞核内部。由此可以证实，共聚物不仅可以成功对CHL细胞进行标记，还对 活细胞的细胞质有特异性的标记效果。