景天根际镉抗性菌株芽孢杆菌，筛选方法及其应用

本发明涉及一株从景天根际分离的具有镉抗性的芽孢杆菌(Bacillus sp.)BCd5及其在植物-微生物联合修复镉重金属污染土壤中的应用。

重金属镉是造成环境污染的重要金属元素之一，它不仅会对植物造成伤害，而且经过食物链的传输，富集，对人体也会造成一定程度的伤害，日本的“痛痛病”就是由于镉中毒引起的。镉主要来源于电镀、合金、塑料、印刷、陶瓷等工业，因此对于含镉污染处理的研究在环保领域有着非常重要的意义。

人类活动可使镉以各种途径进入土壤，而镉迁移转化的最大特点是不能或不易被生物体分解转化后排出体外，不易随水移动，只能沿食物链逐级往上传递，在生物体内浓缩放大，当累积到较高含量时就会对生物体产生毒性效应，从而危害健康，影响其正常发育和代谢平衡。

土壤镉污染的主要来源是采矿、冶炼、电镀及基础化工行业的废水、废气和废渣；施用含镉的化肥、农药以及农用污泥也是土壤镉污染的重要来源。另外，人类对环境的破坏导致的一系列相关问题，如山体滑坡引起天然水的镉污染等。研究发现，若源水镉的含量达0.57～3.88mg/L，下游水体、鱼类、土壤、农作物就易受到严重污染，从而危害人类健康。

植物和微生物共存体系对重金属超积累有重要的作用，植物根系-微生物系统的相互促进作用将大大提高对污染土壤的生物修复能力。通过添加微生物来强化植物修复技术是提高植物-微生物联合修复体系重金属修复能力的有效措施之一。微生物是土壤的重要组成部分，参与土壤生态系统的物质循环与能量转换过程，对提高土壤肥力和维持 土壤生态平衡具有重要意义。在污染土壤中接种微生物能够促进植物对营养元素与重金属的吸收，同时微生物能够分泌一些生长调节剂和保护植物的抗生素、抑菌剂和螯合剂等，这些物质都能增强植物对环境的适应能力。

因此，分离具有较强镉耐受性和促进植物修复镉污染土壤的细菌对植物-微生物联合修复镉重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。

本发明的技术目的在于筛选景天根际具有较强镉耐受性的细菌。

因此，本发明的第一方面涉及一株从景天根际分离的镉抗性菌株——芽孢杆菌(Bacillus sp.)BCd5，其于2014年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10077。

优选地，所述景天根际镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO：3所示，GenBank数据库中没有与其一致的序列，且本菌株16S rDNA基因序列并未提交GenBank数据库。

本发明的第二方面涉及上述的景天根际镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5的筛选方法，其包括步骤：

(1)选择生长状况良好的景天植株进行处理：取镉(Cd)溶液母液2.5mL，稀释定容至40mL，均匀浇灌在供试植物的土壤中，使土壤的镉含量达到100mg·kg-1；在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔4d浇水40mL；

(2)菌种的分离、纯化与筛选：在经过处理的植物根际取10g土样，置于90mL装有玻璃珠的细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g振荡20-30min后取下，静止5min，使土壤沉淀；在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37℃培养24h；取富集后的菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃恒温培养箱中，培养48h；肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离；反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种；

(3)对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种接种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度为10％(v/v)，置于-80℃进行保存。

其中所述细菌培养基为:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.0。

所述筛选培养基的配制方法如下：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元素液和维生素液各10ml，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右，加入镉溶液母液，使培养基中镉含量为100mg·L-1。其中微量元素液为：MnSO4 0.01g，ZnSO4 0.05g，H3BO3 0.01g，CaCl20.01g，定容至1L，4℃避光保存。维生素液为：肌酸0.025g，抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避光保存。镉溶液母液为：CdSO4配制成Cd2+浓度为200mg·ml-1的母液，过滤除菌后，室温保存。

本发明的第三方面涉及含有上述的景天根际镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5的组合物。

优选地，所述组合物具有较强的镉耐受性。

本发明的第四方面涉及上述的景天根际镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5及所述组合物在植物-微生物联合修复镉重金属污染土壤中的用途。

本发明的第五方面涉及上述的景天根际镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5及所述组合物在处理含重金属镉的污染物中的用途。优选地，所述污染物为被污染的土壤。

利用本发明的筛选方法从镉胁迫的景天植物根际土壤中分离筛选出的镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5，其于2014年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.10077；其建议的分类命名为芽孢杆菌属Bacillus sp.；其为革兰氏阴性菌，需氧杆菌，有鞭毛和荚膜。该菌株对重金属镉有较强的耐性，对植物-微生物联合修复镉重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。

本领域技术人员公知，在本发明所获得的上述景天根际镉抗性菌 株Bacillus sp.BCd5新种的基础上，本领域技术人员可以对所述细菌进行适当的诱变而继续提高其耐受重金属镉的能力，这样的诱变后的基于本发明所述菌种的突变株也落入本发明保护的范围。所述诱变包括辐射、化学诱变等。同时，本领域技术人员也可能将本发明获得的上述菌株与其他植物共同使用，以达到最佳植物-微生物联合修复重金属镉污染土壤的目的。

图1：菌株Bacillus sp.BCd5的16S rDNA序列。

图2：菌株Bacillus sp.BCd5的透射电镜照片。

图3：菌株Bacillus sp.BCd5生长曲线图。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1镉抗性菌株Bacillus sp.BCd5的分离

材料与方法 

1、培养基

细菌培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

配制筛选培养基：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元素液和维生素液各10mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右，加入镉溶液母液，使培养基中镉含量为10mg·L-1。37℃培养。

其中微量元素液为：MnSO4 0.01g，ZnSO4 0.05g，H3BO3 0.01g， CaCl2 0.01g，定容至1L，4℃避光保存。

维生素液为：肌酸0.025g，抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避光保存。

镉溶液母液：CdSO4配制成Cd2+浓度为200mg·ml-1的母液，过滤除菌后，室温保存。

2、样品采集和菌株分离

选择生长状况良好的景天植株进行处理。取重金属Cd溶液母液2.5ml,稀释定容至40ml，均匀浇灌在供试植物的土壤中，使土壤的镉含量达到100mg·kg-1。在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔4d浇水40ml。在经过处理的植物根际取10g土样，置于90ml装有玻璃珠的细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g振荡20-30min后取下，静止5min，使土壤沉淀。在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37℃富集培养24h。取富集培养后的菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃恒温培养箱中，培养48h。肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离。反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种，至此完成菌种的分离、纯化与筛选工作。对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种接种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度为10％(v/v)，置于-80℃进行保存。分离获得一株对重金属镉有较强的耐性的细菌，命名为BCd5。

实施例2菌株BCd5的菌种鉴定 

1、基因组DNA提取

按照常规技术手段大量培养上述菌株BCd5，然后获取其基因组DNA。

2、菌株BCd5的16S rDNA的鉴定方法 

2.1菌株BCd5的16S rDNA的PCR扩增、测序及系统发育树的构建

2.1.1 16S rDNA基因序列的PCR扩增

扩增16S rDNA基因序列的两端引物选用通用引物：正向引物BSF8/20：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)和反向引物BSR1541/20：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(SEQ ID NO：2)。PCR反应体系为50μl，反应条件为94℃变性5min；接下来进行35个循环反应：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s；然后72℃再延伸10min，最后于4℃保存。

2.1.2扩增产物的克隆及序列测定

PCR产物用TAKARA公司生产的18-T Vector克隆试剂盒进行克隆，先将16S rDNA基因片段纯化，连接到18-T Vector载体上，5μL连接反应液转化感受态细胞DH5α，并用菌落PCR进行鉴定。重组子的基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。

2.2菌株BCd5的16S rDNA的鉴定结果 

2.2.1菌株BCd5的16S rDNA基因序列

扩增菌株BCd5的16S rDNA基因序列，得到了长度约1.5kb的扩增片段。扩增片段经胶回收、连接、克隆后测序，测得菌株BCd5的16S rDNA为1486bp(SEQ ID NO：3，同时请见图1)，该序列未提交NCBI数据库。

2.2.2 BCd516S rDNA基因序列的相似性比较

将BCd516S rDNA的序列输入到NCBI数据库中，运用Blast程序将这株细菌的16S rDNA和数据库中的16S rDNA基因序列进行比对，从数据库中挑选与BCd5的16S rDNA基因序列具有较高相似性的菌株，见表1。

从表1中可以得出，菌株BCd5的16S rDNA与Bacillus cereus、Bacillus cereus strain EIF59、Bacillus sp.00763、Bacillus cereus strain RR8和Bacillus sp.B31(2008)菌株的相似性都比较高，均可以达到95％以上，且都为Bacillus属的成员。这说明菌株BCd5为Bacillus属的一 个新种。

表1 菌株BCd5 16S rDNA序列NCBI同源性检索结果

3.菌株Bacillus sp.BCd5生理生化分析

3.1形态特征

采用日本日立公司H-7650型号透射电子显微镜对菌株BCd5进行了电镜观察。该透射电镜分辨率为0.2nm，加速电压为40kV～120kV，放大倍率(连续放大模式为×200～×600000；低倍模式为×50～×1000)。

菌株BCd5的透射电镜观察照片见图2。菌株BCd5呈革兰氏染阴性，杆状，有鞭毛和荚膜，能够运动，直径1μm－1.5μm，长度4μm－5μm。

3.2生理生化分析 

对菌株BCd5进行了生理生化分析，其分析结果见表2。糖酵解试验分析结果见表3。

表2 Bacillus sp.BCd5的生理生化试验分析

生理生化 Bacillus sp.BCd5 生理生化 Bacillus sp.BCd5

淀粉水解实验 + 油脂水解实验 +

吲哚实验 + 甲基红实验 -

柠檬酸盐实验 + 明胶实验 +

硫化氢实验 + V.P.实验 -

纤维素实验 + 尿素实验 -

接触酶实验 + 菌膜形成实验 -

产氨实验 - 卵磷脂实验 -

七叶苷实验 - 苯丙氨酸脱氢酶实验 +

注：“+”阳性“-”阴性

表3 Bacillus sp.BCd5的糖酵解分析

糖酵解分析 Bacillus sp.BCd5 糖酵解分析 Bacillus sp.BCd5

葡萄糖 + 蔗糖 +

乳糖 - 麦芽糖 +

半乳糖 - 果糖 +

木糖 -    

注：“+”表示产酸，“—”表示不产酸。

3.3 Bacillus sp.BCd5生长曲线

将Bacillus sp.BCd5菌株接种于LB液体培养基中活化24h，取500μl接种于100ml LB液体培养基中，将三角瓶置于37℃恒温振荡器150×g进行培养。每隔2h取样一次，以未接菌的LB液体培养基为空白对照，用分光光度计比法测定600nm波长下细菌悬浮液的吸光值，连续测定36h。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制细菌生长曲线，见图3。

从图3可知，菌株BCd5从接种后4小时内处于迟缓期，4-10小时为对数生长期，10小时后进入平台期。

含有景天根际镉抗性菌株(Bacillus sp.)的组合物，在处理含重金属镉的污染物或植物-微生物联合修复镉重金属污染土壤中的应用。