一株粪产碱菌酚亚种及其应用

本发明涉及环境微生物技术领域，更具体地讲，涉及一株粪产碱菌酚亚种及其应用。

天然气(常规气和页岩气)是国民经济发展的重要能源，但天然气勘探开采过程中必须使用钻井基液以润滑冷却钻具、保护井壁、平衡地层压力。为满足钻井的各种需要，水基钻井基液通常会添加一些高分子有机物以提高钻井液热稳定性、耐高温和降滤失等性能，目前使用的高分子添加剂主要为磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM，添加量在1％-5％。这些聚合物均由多种有机物聚合而成，是水基钻井固废COD的重要来源；同时还具有难降解的特点。因此若高分子添加剂进入水环境或土壤，严重影响动物、值物生长，甚至危害人体健康，开展水基钻井固废无害化处理研究意义重大。

目前，水基钻井固废无害处理技术有制备烧结砖和生产水泥等。但这些处理技术存在能耗高、消化量低、易受地域制约等问题。微生物能将复杂有机物转化为简单有机物，达到无害化效果，且投资运行费用低、耗能少、消化量大，不受地域限制，因此近几年水基钻井固废微生物处理越来越受到关注。微生物处理的关键在于筛选出高效降解菌株，目前已报道了100多个属，200多个种的细菌、放线菌、酵母、霉菌以及藻类等微生物类能够降解有机污染物，部分菌株已得到应用。但在石油和天然气勘探领域，钻井固废/泥浆微生物处理技术涉及的大多是石油烃类降解微生物，对高分子有机物添加剂降解微生物资源研究较少。因此需进一步丰富高效水基钻井固废降解菌株资源。

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的之一在于解决上述现有技术中存在的一个或多个问题。例如，本发明的目的之一在于提供一种高效降解水基钻井液添加剂的菌株，抗逆性较强的粪产碱菌酚亚种。

为了实现上述目的，本发明的一方面提供了一株粪产碱菌酚亚种，所述粪产碱菌酚亚种分类命名为Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14，所述粪产碱菌酚亚种已于2019年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2019646。

在本发明一株粪产碱菌酚亚种的一个示例性实施例中，所述粪产碱菌酚亚种为革兰氏阳性菌，有芽孢，菌体为杆状，有运动性，专性需氧。

在本发明一株粪产碱菌酚亚种的一个示例性实施例中，所述粪产碱菌酚亚种的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明一株粪产碱菌酚亚种的一个示例性实施例中，所述粪产碱菌酚亚种在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则形状，48h后菌落为圆形，白，直径为0.5～1mm，边缘整齐，扁平湿润。

本发明的另一方面提供了一种降解生物制剂，所述降解生物制剂可以包含上述的粪产碱菌酚亚种或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或其发酵上清液。

本发明的再一方面提供了所述的粪产碱菌酚亚种和所述的降解生物制剂在降解水基钻井固废和有机添加剂中的应用。

本发明的再一方面提供了所述的粪产碱菌酚亚种和所述的降解生物制剂在降解水基钻井液添加剂磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素和聚丙烯酰胺的应用。

本发明的再一方面提供了所述的粪产碱菌酚亚种和所述的降解生物制剂在降解水基钻井固废的总有机碳的应用。

本发明的再一方面提供了粪产碱菌酚亚种和所述的降解生物制剂在修复水基钻井固废污染环境中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明的粪产碱菌酚亚种Alcaligenesfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14能够有效的降解水基钻井固废及主要的有机添加剂；在接菌培养7天后，粪产碱菌酚亚种对水基钻井固废的COD(化学需氧量)的降解率达64.34％，磺化褐煤降解率达26.12％，磺化酚醛树脂降解率达5.65％，羧甲基纤维素钠(CMC)降解率达32.0％，聚丙烯酸甲酯(PAM)降解率达45.61％，处理效果显著；粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14具有较强抗逆能力，可作为优良降解菌用于水基钻井固废及其污染环境的生物处理，应用前景良好。

通过下面结合附图进行的描述，本发明的上述和其他目的和特点将会变得更加清楚，其中：

图1示出了本发明一个示例性实施例的粪产碱菌酚亚种在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌体和菌落形态；

图2示出了本发明一个示例性实施例的粪产碱菌酚亚种的16S rDNA序列的系统发育图。

在下文中，将结合附图和示例性实施例详细地描述根据本发明的一株粪产碱菌酚亚种及其应用。

本发明的一方面提供了一株粪产碱菌酚亚种，该菌株分类命名为Alcaligenesfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14。该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年8月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019646。

在本实施例中，粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14为革兰氏阳性菌，有芽孢，菌体为杆状，有运动性，专性需氧。

在本实施例中，提取粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalissubsp.Phenolicus)GFB-14的总DNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，GFB-14与GenBank中的模式菌株粪产碱菌酚亚种(Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus)J T的相似度最高(99.4％)，从而确定GFB-14在分类上属于粪产碱菌酚亚种(Alcaligenesfaecalis subsp.Phenolicus GFB-14)。

在本实施例中，将所述粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalissubsp.Phenolicus)GFB-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，48h后菌落为圆形，乳白(白)，直径为2mm～3mm，边缘不整齐，呈现扁平润湿。

本发明的粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14具有很强的降解能力，能够对水基钻井固废及有机污染物进行降解，尤其适用于水基钻井液添加剂磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素(CMC)和聚丙烯酰胺(PAM)进行降解。并且，所述粪产碱菌酚亚种能够修复水基钻井液固废污染的介质，所述介质为土壤、水和空气。所述粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14能够对水基钻井固废的总有机碳(total organic carbon)TOC进行降解。

以上，本发明的粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14的菌悬液或者其培养液或者其发酵产物或者其发酵上清液同样具有很强的降解能力，能够对水基钻井固废及有机污染物进行降解，能够对磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素(CMC)和聚丙烯酰胺(PAM)，以及水基钻井固废的总有机碳(totalorganic carbon)TOC进行降解，并可以对水基钻井液固废污染的介质进行修复。在对上述物质进行降解中，所述粪产碱菌酚亚种(Alcaligene sfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14的加入比例可以为处理物的质量的0.5％以上。例如，对于土壤的修复，所述粪产碱菌酚亚种的加入量可以是土壤质量的0.7％。处理的温度可以是20℃～28℃。

本发明的另一方面提供了一种降解生物制剂。在本发明的降解生物制剂的一个示例性实施例中，所述降解生物制剂的活性成分包括上述的粪产碱菌酚亚种(Alcaligenesfaecalis subsp.Phenolicus)GFB-14或其菌悬液或者其培养液或者其发酵产物或者其发酵上清液。

同样的，本发明的粪降解生物制剂具有很强的降解能力，能够对水基钻井固废及有机污染物进行降解，能够对磺化褐煤、磺化酚醛树脂、羧甲基纤维素(CMC)和聚丙烯酰胺(PAM)，以及水基钻井固废的总有机碳(total organic carbon)TOC进行降解，并可以对水基钻井液固废污染的介质进行修复。

为了更好地理解本发明的上述示例性实施例，下面结合具体示例对其进行进一步说明。

示例1

(1)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14(简称“菌株GFB-14”)的分离、纯化和保存。

从四川省遂宁市天然气钻井现场采集钾聚磺体系水基钻井固废样品，低温保存带回实验室。

分别制备：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH自然，水1000mL。

取水基钻井固废5kg，按10％(w:w，质量比浓度)向钻井固废中添加秸秆粉，添加碳酸氢铵，调节混合基质的C/N在15:1-20:1，用蒸馏水调节含水量在28％～30％；将混合基质装入白水的塑料盆(规格：长×宽×高＝60cm×35cm×10cm)，用保鲜膜封口，放置在30℃条件下培养。定期搅动充氧，并控制含水量在28％～30％。培养30d后取样，采用梯度稀释法，于牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，30℃恒温培养。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养。待培养16h，挑取一环进行重复划线培养，结合显微观察，直至纯化为止。纯化后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基的试管斜面培养基保存。

如图1所示，本实施例的分离纯化得到的菌株GFB-14在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，培养48h后菌落为圆形，白，直径为0.5mm～1mm，边缘整齐，扁平湿润，其中，图1(a)示出了菌落形态，图1(b)为菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养后的示意图。

(2)菌株GFB-14的16S rDNA的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，以总DNA为模板，用27F和1492R为引物扩增16S片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。

反应体系(50μl)：2×PCRMix25μl，引物27F和1492R(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl；引物27F和1492R的核苷酸序列如SEQID No.2和SEQID No.3所示。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。

PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件DNA man6.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如SEQIDNo.1(序列表所示)。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中进行比对，发现GFB-14的16S rDNA基因序列与数据库中的模式菌株粪产碱菌酚亚种(Alcaligenes faecalissubsp.Phenolicus)J T的相似度最高，为99.4％。根据NCBI比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(如图2所示)，自展值(bootstrap)1000。

基于以上特征，将菌株GFB-14鉴定为粪产碱菌酚亚种(Alcaligenes faecalissubsp.Phenolicus)。该菌株已于2018年8月19日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019646。

(3)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14降解磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM能力实验

将GFB-14接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基上活化培养，待活化培养的菌悬液OD600＝1.0时，取菌液1.5mL，3000rpm离心5min，弃上清，无菌生理盐水洗涤菌体2次，用1.5mL无菌水悬浮，分别接种到已灭菌磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM浓度为1％的MS培养基中，30℃，140rpm振荡培养，以不接菌为对照，重复3次。

菌株降解磺化褐煤能力测定：将滤纸80℃烘干至恒重备用，称重并记录(M1)，将上述试验培养7d后培养液用已称重的滤纸过滤，滤纸和固体残留物于80℃烘至恒重，称重并记录(M2)；同法称量对照残留物重量并记录(M3)。磺化褐煤降解率(％)＝(M2-M1)*100/(M3-M1)。

菌株降解磺化酚醛树脂/CMC/PAM能力测定：收集上述试验培养7d后培养液，1000rpm离心5min，收集上清液，测定其TOC含量并记录(T1)，同法测定处理液初始TOC含量并记录(T2)。磺化酚醛树脂/CMC/PAM降解率(％)＝(T2-T1)*100/T1。

测定结果表明，培养7d后，接种GFB-14菌株的处理的磺化褐煤、磺化酚醛树脂、CMC和PAM降解率分别达到26.12％、5.65％、32.0％和45.61％。

(4)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14的抗性实验

耐酸或碱能力测定：测定培养基的pH值，以10mol/L NaOH溶液和10mol/L HCl溶液调节培养基的pH值为4，5，6，7，8，9，10。121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，设三个重复，置于30℃恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

耐盐能力测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7；在基础牛肉膏蛋白胨培养基中添加NaC1，分别配制盐浓度为0.5％、1％、2％、4％、8％和10％的培养基。121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，设三个重复，置于30℃恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

生长温度范围测定：配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH值为7，121℃灭菌30min后，按1％(v:v)添加菌悬液至新配置的培养基，将接菌的培养基分别放置于4℃、15℃、30℃、45℃和55℃的恒温培养箱中以150r/min转速震荡培养48h，每个温度设3个重复，用紫外分光光度计在波长λ＝600下测定菌的数量。

结果表明，粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14有良好的抗逆特性，其生长初始pH＝5.0～10.0；其耐盐能力较强，能在含4％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长；生长温度范围较广，能在15～45℃温度范围内生长。

(5)粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.Phenolicus GFB-14对水基钻井固废处理实验

按处理水基钻井固废量1％(m/m)接种GFB-14菌剂(OD600nm≈1.6)于处理物(水基钻井固废：玉米秸秆＝9:1)，充分混匀，以不接菌为对照，重复3次。各处理的钻井固废重5.0kg。自然条件下处理45d(2019年6月至2019年7月进行)，期间注意保持处理体系湿度25％左右。分别测定初始处理物和处理45d的接菌和不接菌处理样品的TOC含量和浸出液COD。

结果表明(表1)，经过45d处理，GFB-14对水基钻井固废中的TOC去除率达到了22.09％，浸出液COD降解率达到了80.35％，显著高于对照的1.23％和20.67％，表现出了良好的降解潜力。

表1菌株GFB-14对水基钻井固废的处理效果

注：不同字母表示差异大显著水平(p<0.05)

综上所述，本发明的粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalis subsp.PhenolicusGFB-14能够有效的降解水基钻井固废及主要的有机添加剂；在接菌培养7天后，粪产碱菌酚亚种对水基钻井固废的COD(化学需氧量)的降解率达64.34％，磺化褐煤降解率达26.12％，磺化酚醛树脂降解率达5.65％，羧甲基纤维素钠(CMC)降解率达32.0％，聚丙烯酸甲酯(PAM)降解率达45.61％，处理效果显著；粪产碱菌酚亚种Alcaligenes faecalissubsp.Phenolicus GFB-14具有较强抗逆能力，可作为优良降解菌用于水基钻井固废及其污染环境的生物处理，应用前景良好。

尽管上面已经通过结合示例性实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求所限定的精神和范围的情况下，可对本发明的示例性实施例进行各种修改和改变。

序列表

<110> 中国石油集团川庆钻探工程有限公司 中国石油天然气集团有限公司

<120> 一株粪产碱菌酚亚种及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 粪产碱菌酚亚种(Alcaligenes faecalis subsp. Phenolicus )

<400> 1

gcgtcgccag ctttaccatg cagtcgaacg gcagcgcgag agagcttgct ctcttggcgg 60

cgagtggcgg acgggtgagt aatatatcgg aacgtgccca gtagcggggg ataactactc 120

gaaagagtgg ctaataccgc atacgcccta cgggggaaag ggggggatcg caagacctct 180

cactattgga gcggccgata tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggct caccaaggca 240

acgatccgta gctggtttga gaggacgacc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300

ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg ggaaaccctg atccagccat 360

cccgcgtgta tgatgaaggc cttcgggttg taaagtactt ttggcagaga agaaaaggta 420

tcccctaata cgggatactg ctgacggtat ctgcagaata agcaccggct aactacgtgc 480

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gtgtaggcgg ttcggaaaga aagatgtgaa atcccagggc tcaaccttgg aactgcattt 600

ttaactgccg agctagagta tgtcagaggg gggtagaatt ccacgtgtag cagtgaaatg 660

cgtagatatg tggaggaata ccgatggcga aggcagcccc ctgggataat actgacgctc 720

agacacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccctaaacg 780

atgtcaacta gctgttgggg ccgttaggcc ttagtagcgc agctaacgcg tgaagttgac 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900

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ctggaaagcc gaagagattt ggccgtgctc gcaagagaac cggaacacag gtgctgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

tcattagttg ctacgcaaga gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140

ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagggc ttcacacgtc atacaatggt 1200

cgggacagag ggtcgccaac ccgcgagggg gagccaatct cagaaacccg atcgtagtcc 1260

ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa 1320

tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 1380

tttcaccaga agtaggtagc ctaaccgtaa ggagggcgct accacggtga tcgtg 1435

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(27F)

<400> 2

agagttgatc ctggctcag 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(1492R)

<400> 3

cggttacctt gttacgactt 20