有放射活性的性脂质体

本发明涉及偶联物系统，其包含带有离子载体的脂质体，该脂质体内部 有螯合剂，其中所述脂质体用发射α-粒子的放射性重(heavy)核素稳定标记。 本发明进一步涉及制备所述偶联物系统的方法和该系统的用途，以及制备该 偶联物系统的试剂盒。

在抗癌中放射性核素的生物医学应用迄今为止集中在阳离子或阴 离子核素的使用，例如，[131I]碘化物抗甲状腺癌和89Sr用于减轻骨癌转移瘤 的疼痛，并及大多数附着于单克隆抗体上的发射β射线的放射性核素的应用 (DeVita et al.，1996)。

针对癌症的放射性核素靶向的应用依赖于到将放射性核素附着 于肿瘤特异性载体化合物上的方法的能力(Gaze，1996)。今天，因为在放射性 核素和载体化合物之间提供化学稳定性连接的问题，一些具有有用放射性特 征的放射性核素不能用于肿瘤靶向。然而，新的载体系统既可以拓宽放射性 同位素的使用，也可以拓宽认为对有用的放射性核素的储备 (Gaze，1996)。

表面附着有或没附着受体亲和基团的脂质体，已经被评价用于药物给 药，并且目前临床用于一些癌症类型中化疗药物的给药。最近，脂质体研究 的发展已经走向新的药代动力学领域，其使这些化合物作为有用的放射性核 素载体用于抗癌地内部放疗(Gabizon，1995)。在脂质体配制和生产上的这些 最近发展导致延长了循环时间的小于100nm的小泡囊，因为途经膜的挤压 可以较好限制脂质体至小直径。而且，聚乙二醇移植型脂质体的导入降低了 血浆蛋白质的干扰，并因此降低了受网状内皮系统中巨噬细胞影响的识别和 清除作用(Maruyama，et al.，1997)。因此持久的血液浓度可使肿瘤摄取水平升 高。通过将具有受体亲和力的分子，例如单克隆抗体或叶酸，偶联到脂质体 的表面可进一步摄取肿瘤。此外，几项研究已显示了使用PEG作为脂质体 和靶配体之间连接物的优点，因为这也能改善受体的易接近性(例如 Maruyama et al.，1997；  Gabison et al.，1999；Lee et al.，1994)。

以前将脂质体作为放射性同位素的载体研究(Goins et al.，1998；Turner et al，1988)。Pikul.et al(1987)报道了一项以被动掺入的212Pb-葡聚糖为基础的研 究(即在脂质体形成过程中加入212Pb-葡聚糖，以及将一个212Pb-葡聚糖级分 与代表脂质体内部的水相混合)。作者认为这些脂质体不适合用于癌症， 而主要用其研究放射性同位素在体外细胞内的细胞杀伤作用。没有资料表明 212Pb衰变产生的212Bi的命运，而且与目前认为最佳的体内肿瘤体积(近 100nm)相比，脂质体达350-500nm的体积是非常大的(Forssen，1997)。而且 脂质体在膜内不含有PEG。

Ogihar-Umeda et al.(1996)使用脂质体作为发射γ射线的放射性核素 67Ga，111In和99mTc的载体，并建议使用放射性标记的脂质体来成像。

在理论性研究中，Kostarelos et al.(1999)提出了用有潜力的放射性核 素131I，67Cu，188Re和211At标记的脂质体的用途，但未指出制备放射性标记 的脂质体的化学过程。

EP 386 146 B1描述了一种包裹有用于中子俘获肿瘤之化合物的脂质 体的组合物和使用方法。但是，这些脂质体是用稳定元素(例如硼)装载，这 些元素只有被激活后才有放射性活性，而且这些脂质体既不包含离子载体也 不包含螯合剂。

Utkhede et al.，(1994)描述装载了90Y和与本发明中描述的螯合剂不同的 螯合剂DTPA的脂质体。而且，没有描述母/子核素的滞留时间，此外，90Y 不是如本申请描述的重核元素。

用发射α射线的放射性核素对载体进行足够稳定的放射标记通常需要适 合每种元素化学性质的特殊化学方法，但这些方法是未知的。用于放射标记 例如Ga，In，Tc，Cu或Re的方法无法预计是否适用于放射性重核素(原子 重量超过150)阳离子α射线发射者如212/213Bi，212Pb，223/224Ra，227Th或225Ac。

因此本发明的一个目的是提供一种放射性核素一脂质体偶联物系统，具 有或不具有受体亲和基团，其(1)包裹有螯合剂和发射α粒子射线的放射性重 核素，(2)当母核素引入脂质体时能够保留子核素和(3)能够通过对一组放射 性核素有用的主动掺入方法制备，本发明也提供该系统的用途和制备该系统 的试剂盒。这些目的已经通过本发明实现了，其特征由所附的权利要求限定。

本发明涉及包含脂质体的偶联物系统，该脂质体带有离子载体即用于脂 质体的金属提取试剂，以及位于该脂质体内部的螯合剂和放射性重核素(原 子重量超过150)。用主动掺入放射性核素，即经由离子载体的方式制备脂质 体，且按照生产体积一般为100nm的脂质体的方法制备。得到的产品数天 后仍显示良好的化学稳定性，而且在脂质体内仍保留子核素，例如从212Pb 转化而成的212Bi。可以将脂质体制备为膜上附着有或不带有修饰基团如聚环 氧烷，例如，PEG。这里我们也描述了将这种放射标记的脂质体连接于肿瘤 搜索蛋白，例如偶联叶酸的单克隆抗体。

现在参考附图和实施例更详细描述本发明。

为了开发适合癌症的放射标记的脂质体，本发明者们已研究了一些 脂质体的制备和用途，以放射性核素212Bi，213Bi，213Ra，224Ra，225Ac，212Pb， 和227Th为基础，其装载发射α粒子的放射性重核素(即原子重量超过150)。 使用带有离子载体的脂质体(泡囊)，用放射性核素的主动掺入制备带有优选 螯合剂的放射标记脂质体(即脂质体包裹放射性核素和螯合剂)，并且按照生 产体积一般为100nm的脂质体的方法制备。

单层泡囊用薄的脂质膜按下列方式水化和挤压(Olson et al.1979，Mac Donald et al.1991)制备：将DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)和胆固醇以2∶1摩 尔比，一般分别10和5μmol溶解于圆底烧瓶内的氯仿中。利用减压经旋转 蒸发去除溶剂。然后将干燥的脂质膜在0.5-1ml的150mM柠檬酸，30mM DOTA(1，4，7，10四氮杂环十二烷1，4，7，10 N，N’，N”，N”’四乙酸)，PH4中水化。 将得到的悬浮物进行5轮冻融，随后用手动挤压装置(Avestin，Ottawa，Canada) 反复挤压通过100nm孔径的聚碳酸酯过滤器5次和50nm孔径者5次。产品 的脂质浓度为～30mM。在放射性核素装载脂质体前，将外部溶液在PD-10 柱上用250mM蔗糖，20mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2乙磺酸)，pH7.4 洗脱而交换。

脂质体组分：a)内部水相介质：pH1-14，优选2-9，更优选4-5。组分： 水；能在所需时间间隔内，即直到由离子载体介导的放射性金属掺入开始， 维持水相介质所需pH值的试剂。优选地，内部水相介质的组分也引起放射 性金属的复杂功能。这种影响的产生通过i)例如用于调节pH的试剂，例如 在醋酸盐，柠檬酸盐和相关化合物中的氧原子的静电供体功能；ii)此外，在 内部水相介质中有复合试剂，例如EDTA，DTPA，DOTA，DOTMP和相关 化合物。

b)离子载体：例如能基本上不可逆地，从脂质体外部相向脂质体内部穿 过脂质双层转运放射性金属的试剂。例如：以所需方式展示功能的离子载体： 钙离子载体A23187，二环己基18-C6，二苯并-18-C6，2，3-二巯基-1-丙醇， Pb-离子载体。

c)脂质双层的组分：优选脂双层的组分导致能形成泡囊的混合物，并且 其液-固相变温度高于生理温度；例如，i)磷脂。例如：长链烷基-磷脂酰胆 碱，例如1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，1，2-二肉豆蔻酰 (dinlyristoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)，1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DPPC)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1，2-二油酰-sn-甘油-3- 磷酸胆碱(DOPC)，1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)；ii)固醇或具 有相似的使脂双层坚硬(降低流动性)特性的化合物。例如：固醇类化合物： 胆固醇和胆固醇3-硫酸酯，和iii)(空间排列上)在体内用以增加构建体靶向肿 瘤细胞的特性和增加血液中存留时间的稳定剂，例如聚醚，聚乙二醇。脂质 体制剂中包含PEG和/或PEG衍生物的优点是减少所注射的脂质体从循环系 统中被网状内皮系统的清除。一般地在制剂中包括相当于磷脂的3-10mol％。 但是获得所需稳定效果必需的稳定剂的量依赖于单体(静电特性和极性特性) 和重复单位的数目，即链长度。例子(PEG和/或PEG衍生物)：1，2-二肉豆蔻 酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[聚乙二醇2000](PEG2000DMPE)，1，2-二棕榈酰 -sn-甘油-3-磷酸乙醇胺N-[聚乙二醇2000](PEG2000DPPE)，1，2-二硬脂酰-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[聚乙二醇2000](PEG2000DSPE)。

d)使构建体易于修饰成具有靶向肿瘤细胞的特性的组分：用半抗原的性 质，以及研究的需要决定对合适的活化脂质的选择。通过要去除的基团，亲 水间隔臂，脂质体的材料特性，和反应物的浓度来控制反应的效率。对于要 求其半抗原保持与脂质体相连的体内研究，通过选择在膜间交换更慢的较长 酰基链脂质锚着物会获得明显优势。而且，在半抗原和脂质锚着物间的共价 键应该对化学裂解酶的裂解都很稳定。活化的脂质可用于形成如：胺，酰胺， 硫醚，或脂质和修饰物之间的二硫键。如果制剂中包括空间排列性稳定剂， 例如PEG和/或PEG衍生物，发挥偶联功能的基团优选出现在相同或相似于 该稳定剂的化合物的末端并且具有相同于或长于稳定剂链长度的有效链长 度。例如：来自PEG和/或PEG衍生物的使构建体易于修饰成具有肿瘤细胞 靶向特性的泡囊组份：N-[w-(2-吡啶基二硫代丙酰氨基)聚(乙二醇)2000]1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(PDP-PEG2000-DSPE)，N-{w-[4-(对-马来酰 亚氨基苯基)丁酰]氨基}聚(乙二醇)2000]1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (MpB-PEG2000-DSPE)。

用大小排阻层析法(Mauk和Gamble 1979，Tilcock et al.1991)从未偶联放 射性核素的脂质体中分离已偶联了放射性核素的脂质体。由于分离在脂质体 装载程序之后，故使用PD-10大小排阻层析柱。在PD-10柱上加载1ml或 更小体积的样品，脂质体洗脱在最初的4.5ml中。未与脂质体偶联的放射性 核素洗脱在相当于低分子量组分的级分中。PD-10柱也用于研究所装载脂质 体在PBS中的稳定性(指放射性核素的滞留时间)。

将血清中游离的放射性核素与偶联放射性核素的脂质体分离，通过在 Sepharose CL-4B柱(Hwang和Mauk，1977)上的大小排阻层析进行。因此可 以制备含有放射活性脂质体的溶液，其中的脂质体分散在基本上不含未结合 的放射性核素的液体载体中。

在层析步骤前加入EDTA(乙二胺N，N’四乙酸)以使游离的放射性核素稳 定在容易与脂质体偶联级分分离的状态。

通过对228Ac，223Ra，212Pb，212Bi，205Bi，和207Bi的γ-波谱分析确立偶 联放射性核素的脂质体的放射性核素装载量，和潜伏期。将228Ac和205/207Bi 分别用作有潜在性用途的放射性核素225Ac，212Bi和213Bi的示踪剂。

本发明者们意义重大的且意想不到的发现是，212Bi在掺入此类型脂质体 中的212Pb衰变后没有明显的易位。212Pb作为212Bi分子连接型发生者应用的 现状表明明显的释放(≥30％)通常由螯合剂产生(McClure和Feinendegen， 1998；Mirzadeh et al.，1993)。但是，用高浓度螯合剂，例如在脂质体内部， 俘获212Pb，可以避免子产物的释放，提供可被用来在核转变后俘获子核素 的偶联物系统。这是首次报道几乎能定量地保留212Bi子核素的212Pb偶联物 系统。因此，本发明涉及带有包括位于脂质体内部的放射性核素和螯合剂的 离子载体的脂质体(偶联物系统)，并且其中此偶联物系统能够或不能保留子 核素。

本发明螯合剂可选自：1，4，7，10四氮杂环十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四 乙酸(DOTA)，1，4，7，10四氮杂环三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸 (TRITA)，1，4，7，10四氮杂环四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TETA)， 1，4，7，10四氮杂环十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亚甲基)膦酸(DOTMP)， 1，4，7，10四氮杂环三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亚甲基)膦酸，1，4，7，10四氮 杂环四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亚甲基)膦酸，二亚乙基三胺N，N’，N” 五乙酸和它们的异构体衍生物，穴状化合物[2，2，2]，穴状化合物[3，2，2]，穴 状化合物[2，2，1]和它们的单-和双-苯并衍生物。包含电子富集(供体)基团(羟 基，羧基，酯，胺，酰胺)的桥联(bridged)杯状(calix)[4]芳烃。1，10-二氮 -4，7，13，16-四氧杂环十八烷-1，10N，N’二乙酸，和1，10-二氮-4，7，13，16-四氧杂 环十八烷-1，10N，N’二丙二酸酯。

另一个重要且惊人的发现是，按照本发明的脂质体可以有效地掺入并保 留212Ra。这是首次描述了带有镭-223的潜在用于靶向肿瘤的偶联物系统。 此外，我们发现铋和锕也可被掺入并很强地保留在目前描述的这类脂质体当 中，说明也可制备以212Bi，213Bi和225Ac为基础的偶联物系统。

按照本发明的偶联物系统可被制成在脂质体膜中带有或不带有表面修饰 基团，例如PEG(PEG植入的/PEG化的脂质体)。在膜中含有PEG的优点是 它提供一些PEG-反应基团，其允许蛋白质例如抗体，抗体片段或构建体或 叶酸，或其他受体亲和性(受体结合性)蛋白质/分子的偶联。

本申请进一步涉及一种在脂质体膜上附着有受体结合蛋白的新型脂质 体。这里我们描述放射性标记的PEG植入性脂质体，其结合于叶酸标记的 抗体。叶酸和叶酸衍生物靶向能表达叶酸结合蛋白(FBP)的肿瘤的用途已经 吸引了研究者们的注意，FBP是一种参与细胞经胞吞作用摄取氧化型叶酸的 糖基-磷脂酰-肌醇-连接的细胞膜蛋白(Kranz et al.，1996；Reddy et al.，1998； Shinoda et al.，1998；Trippet et al.，1999)。由于人类肿瘤细胞的一些类型已 经表现出过表达FBP，所以此受体可能是给予结合叶酸的性放射性同位 素的可能靶点。因此，通过使用结合叶酸的抗体，对癌症有目标的放射性核 素是可以达到的。而且，如果叶酸标记抗体的抗原结合位点是直接抗不 同于FBP的肿瘤相关抗原，则获得二元结合力(即对抗体-抗原和FBP受体都 有亲和力)。据我们所知，这是首次描述叶酸标记的抗体的偶联。

为增强放射性，可以将结合于本发明脂质体的叶酸标记抗体进一步 用放射性核素或不同放射性核素的混合物标记。

本发明表明，叶酸标记的抗体与脂质体偶联的这种新式结合可被用于使 放射性核素靶向表达叶酸受体的细胞。这对α粒子发射者尤其有用，其是高 水平能量线性转移(高-LET)射线发射者，对哺乳类细胞有很强的细胞毒性 (Hall，1994；Larsen et al.，1998；Ritter et al.，1977)。但是，与其他类型射 线相比，α射线源可向特别小的区域发射射线。因此，如果将α射线源直接 指向靶组织，那么会减少对正常组织的照射。

通过将抗体与雌激素或睾酮结合，也可将按照本发明的偶联物系统用于 靶向那些表达例如雌激素受体或睾酮受体的细胞。

按照本发明使用的标记抗体优选是IgG或IgM类，和/或其片段和/或其 构建体(例如小体(minibody))。而且，这些抗体和/或其片段和/或其构建体是 鼠源的，嵌合的或完全人源化的，多克隆的或单克隆的。

本发明也涉及按照本发明的偶联物系统的用途，用来制备适合经静脉内 和/或局部，和/或肿瘤内途径注射或输注至包括人类等哺乳动物的药用溶液。 可以将药用溶液与一种放射性免疫偶联物或几种放射性免疫偶联物和/或其 他类型的放射物，化疗，外部射线或外科联合使用以 恶性肿瘤。

本发明也涉及使用按照本发明的偶联物系统恶性肿瘤的方法，这些 恶性肿瘤例如脑癌，肺癌，子宫颈癌，卵巢癌，或乳腺癌，或白血病，淋巴 瘤或恶性黑素瘤。

本发明也涉及用于制备按照本发明的偶联物系统的试剂盒，其包括含有 脂质体溶液的第一小瓶和含有放射性核素溶液的第二小瓶，可将它们混合以 易于放射性标记。此外，可与包含具有受体亲和性的蛋白质和/或分子的第 三小瓶混合以获得受体亲和性偶联物系统。

图1 PEG化的脂质体与OVCAR3细胞的结合，所述脂质体含有偶联于其 膜上的Fab’或者叶酸标记的Fab’抗体。

图2叶酸与非叶酸PEG脂质体与OVCAR3细胞的结合。

试剂与设备

γ波谱分析用与多通道分析仪(EG&G ORTEC.Oak Ridge，TN，USA)相连 的锗测试剂(Canberra，Meriden，CT，USA)进行。Beckmann LS 6500(Beckmann， Fullerton，CA，USA)用于液闪计数。DSPC和胆固醇购自Northern Lipids(Vancouver，Canada)。Sephadex G-25 PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)用于放射性标记的脂质体的纯化。大环螯合剂 DOTA用作脂质体内螯合剂且购自Macrocyclics(Richardson，TX，USA)。本 研究中使用了Ultrex grade HNO3(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ，USA)和6M HCl(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)和购自Fluka(经Sigma-Aldrich As， Norway)的双(2-乙基己基)磷酸(HDEHP)。

用精氨酸(游离碱)将所有用于介导脂质体阳离子装载的离子载体调节至 所需pH值。使用的所有水从Milli-Q水纯化系统(Millipore，Bedford.MA. USA)获得。离子交换树脂由Bio-Rad(Hercules，CA，USA)供给。

通过用下列物质依次洗涤将树脂预处理：用水，然后用6M HCl，随后用 丙酮，最后用水洗涤。装柱前将树脂贮存在水中。

使用的DMSO与4滤网一起贮存。

本工作中使用的232Th(NO3)4已经贮存20多年。样品由Nuclear Chemistry Group，Department of Chemistry University of Oslo，Oslo，Norway提供。

3H-叶酸购自Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire，UK)。

所有其它化学试剂购自Sigma-Aldrich，Norway。

表1表示脂质体实验中使用的放射性核素的一些物理特性。

表1

核素                             t1/2                       γ-射线(S)                                   ％概率*

*对每种核素仅列出最丰富的γ-射线。

数据来自Nuclear Data Sheets，Academic Press INC。

最佳方案

将按照描述的步骤制备的脂质体装载镭-223或铅-212。此后，使抗体与 脂质体反应以得到在脂质体表面的抗体分子。约100μm大小的脂质体适合 于全身给药，但进行腔内给药时可使用的一般大小为200-1000μm，例如， 颅内脑肿瘤的，或腹膜内卵巢癌的。(更大的脂质体会减慢从注射 该制剂的体腔中清除的速率，从而在肿瘤区维持高浓度。)

实施例

实施例1：脂质体中212Pb/212Bi的装载

方法：如Hassfjell和Hoff(1994)描述的，通过从228Th源发射220Rn产 生212Pb/212Bi。228Th源如Hassfjell和Hoff(1994)所述。将未加载体的212Pb/212Bi 用0.1M HNO3从收集容器中析出，并将溶液装载至2×20mm的AG 50W-X4 阳离子交换树脂柱。然后将212Pb/212Bi用2M HCl洗脱并将溶液蒸发干燥。 再将212Pb/212Bi溶解于200μl 10mM PH5醋酸溶液中。212Pb通过测定其 238.6keVγ-射线(表1)来定量。212Bi通过在放射平衡时测定其子核208Tl的 583.1keVγ-射线来定量。

结果：保温时间达3天时发现，增加的活性的不到0.2％与脂质体结合。

相当于30-60mM脂质浓度的脂质体与离子载体A23187(10-13nM)的膜 (film)充分混合。然后加入大约1MBq的212Pb/212Bi并将混合物在75℃保温 30分钟，随后从PD-10柱上洗脱。然后使含有所加泡囊的95％以上的级分 从第二个PD-10柱上洗脱。结合212Pb/212Bi的脂质体的潜伏期通过在37℃人 血清或PBS中保温泡囊来研究。随后对活性分布进行24小时的追踪。

结果：212Pb的装载效率：34.8％(n＝3)。

用γ波谱分析测定滞留(retention)，保温时间达24小时的情况下，99％ 以上的212Pb与脂质体结合。

实施例2：脂质体结合的212Pb衰变形成的212Bi的滞留

方法：如上述用212Pb装载脂质体。通过将反应混合物在用10mM EDTA的 PBS预平衡的PD-10柱上用10mM EDTA的PBS洗脱，将脂质体结合的放 射活性分离。

3小时后，为了确保212Pb和212Bi之间暂时平衡的建立，将溶液的等份 试样装载于10mM EDTA的PBS预平衡的PD-10柱上，以使脂质体结合的 放射性核素与游离的放射性核素分离。随后对活性分布进行24小时的追踪。

测定未进行分离步骤的另一等份标记性脂质体(与层析步骤获得的有相 同的几何学)以用作标准。进行此步骤以建立在放射平衡时212Bi/212Pb的活 性比率。

结果：通过对比层析分离获得脂质体与平衡混合物的212Bi/212Pbi比率， 估计脂质体结合的212Pb衰变后有95％以上的212Bi滞留在脂质体内。

此外，在两种层析获得的级分中对比212Bi活性的测定值。212Bi总活性 的99％以上洗脱在相应于脂质体的级分中。

实施例3：研究Pb和Bi在脂质体中可能的再装载

方法：脂质体相当于30-60mM脂质，内含150mM柠檬酸，30mM DOTA， 用含有10mM EDTA的PBS作外部溶液，将这种脂质体加入离子载体A23187 膜(film)(玻璃瓶内表面20-26nmol)中。然后加入212Pb和212Bi的PBS，37℃ 保温。溶液的等份试样通过PD-10柱洗脱，经层析获得的相当于脂质体-洗 脱物的级分用内在Ge-测试剂(Ge-detector)测定。

结果：在24小时期间，未检测到212Pb和212Bi的装载(＜1％)。

实施例4：脂质体中223Ra的装载

如所描述的在以227Ac为基础的发生剂(generator)上产生223Ra(Larsen and Henriksen，1999)。简言之，将227Ac和其子核素227Th保留在使用无机酸 洗脱223Ra很容易的一种提取层析树脂柱中。为向脂质体中掺入镭，将发生 剂的洗脱溶液蒸发干燥，然后将223Ra溶解于5mM柠檬酸，pH7.4中。

相当于30-60mM脂质浓度的脂质体被充分地与离子载体A23187(玻璃 瓶内表面10-13nmol)的膜混合。然后加入大约50KBq的223Ra并将混合物在 75℃保温20分钟。然后将反应混合物加入100μl的10mM EDTA中，并在 PD-10柱上洗脱以分离与脂质泡囊结合的放射性活性。

结合223Ra的脂质体的保留通过将泡囊在37℃人血清(Sigma)或含 5mM EDTA的人血清中以0.3mg总脂质/ml血清的脂质体浓度保温来研究。 结果列于表2中，表明223Ra非常稳定地保留在脂质体中。

表2

保温时间(天)     占脂质体级分中总223Ra的％

    1                     94.6±1

    3                     94±2.5

    4                     94.7±0.5

平均标准差，n＝4

实施例5：判断是否再装载在223Ra保留实验中有作用

方法：将用150mM柠檬酸，30mM DOTA水化脂质膜形成的相当于 30-60mM脂质的脂质体，和外部溶液PBS或血清加入离子载体A23187膜(玻 璃瓶内表面10-13nmol)中。然后加入于5mM EDTA pH7.4中的223Ra，于37 ℃保温。将该溶液的等份试样装载至PD-10柱洗脱，层析所得相当于脂质体 的级分用内在Ge-测试剂测定。

实施例6：脂质体中207Bi的装载

方法：通过在(p.xn)天然铅靶上反应产生203-207Bi并用铅选择性提取层析 树脂纯化(Henriksen and Hoff，1998)。

本研究使用同位素Bi-混合物，其主要由205Bi和207Bi组成，此后称作 207Bi。将50μl溶于10-4M HCl中的207Bi溶液加入相当于30-60mM脂质并 已经提前与离子载体A23187膜(玻璃瓶内表面10-13nmol)混合的脂质体中， 并于75℃保温30分钟。然后将反应混合物加入100μl的10mM EDTA中， 并在PD-10柱上洗脱以分离结合于脂质泡囊的放射性活性。

结果：发现总207Bi的32％与脂质体结合。

实施例7：：脂质体中228Ac的装载

方法：通过联合使用溶剂提取和离子交换从232Th(NO3)4制剂分离228Ac。 将232Th(NO3)4(起初带4H2O)溶解于20ml 0.1M HNO3并且加入500ml分离 漏斗上，与5×100ml的2M HDEHP的庚烷溶液接触。然后用庚烷洗涤水相 三次，如所描述(Cabell，1959)随后装载于3×40mm的AG50W-X 12阳离子 交换树脂柱以分离228Ac。212Pb，212Bi，224Ra，和228Ra被洗脱从柱上至 3M HNO3中，将溶液静置＞20h。然后将溶液蒸发干燥，随后用1ml 1M HNO3 从容器中析出放射性核素。将此溶液装载至3×40mm的AG50W-X12柱。 212Pb，212Bi，224Ra，和228Ra再次被洗脱于3M HNO3中，228Ac被洗脱于 6M HNO3中，将洗脱物蒸发干燥。然后用200μl 5mM HNO3将228Ac从容器 中析出。如上所述将大约6kBq的228Ac加入含有离子载体A23187的脂质 体中，并于75℃保温60分钟。然后将反应混合物加入100μl的10mM EDTA 中，并在PD-10柱上洗脱以分离结合于脂质泡囊的放射性活性。将相当于装 载的泡囊的95％以上的级分汇合，然后在第二个PD-10柱上洗脱。228Ac在 脂质体中的滞留时间通过将放射性标记的泡囊在37℃人血清或PBS中保温 来确定。随后对活性分布进行24小时的追踪。

结果：在装载实验中于，装载步骤后，90-95％所加入的228Ac(针对标记 和纯化中的衰变进行了校正)与脂质体结合。在滞留实验中发现保温时间达 24小时的情况下，98％以上的228Ac结合于脂质体。

实施例8：90Y的装载

方法：在本实施例中90Y被用作示踪剂来研究放射性标记的脂质体的行 为。在本研究中用液闪计数测定90Y和90Sr。

如Dietz and Horwitz(1992)所述，用锶选择性提取层析树脂从90Sr分离 90Y。这里，将0.1M HNO3中的90Sr(Amersham，Buckinghamshire，England) 蒸发干燥并向残余物中加入3M HNO3。将溶液装到3×20mm的Sr-树脂柱 上(EiChroM，Darien，IL，USA)并将柱用5ml 3M HNO3洗涤。

此方法选择性洗脱90Y，而Sr充分保留在柱上，使得90Sr/90Y混合物中 90Sr的含量降低约103倍(Dietz and Horwitz1992)。此后，用0.05M HNO3从 柱上将90Sr洗脱并将此溶液放置一周以允许90Y产生。然后，在第二个Sr- 树脂柱上分离放射性核素之前将溶液蒸发干燥并向残余物中加入3M HNO3。将含有90Y的洗脱物蒸发干燥，用200μl 5M HNO3将放射性核素从 容器中析出将此溶液加入含离子载体A23187(如前所述)的脂质体中，75℃保 温60分钟。然后将反应混合物加入50μl 10mM EDTA中，并在PD-10柱上 洗脱以分离结合于脂质泡囊的放射性活性。将相当于泡囊的95％以上的级 分在第二个PD-10柱上洗脱。结合90Y的脂质体的滞留通过将泡囊在37℃人 血清或PBS中保温来观察。随后对活性分布进行4天的追踪。

结果：装载1小时并在凝胶排阻柱上纯化后，加入的90Y95％以上与脂 质体结合。

在脂质体滞留的研究中获得下列结果：5小时和1天后，99％以上是与 脂质体结合的。4天后测得与脂质体结合的部分为98±1％。

如这些实验中所示，脂质体可被发射α-粒子和/或β-粒子的放射性核素 标记并在生理温度下很好地保留了这些核素。

实施例9：钇-90/镭-223 PEG化的脂质体-叶酸-Fab’的制备

用F(ab’)2 Rφ骨髓瘤(IgG1亚类)的14mg/ml PBS溶液(Michalsen， Norwegian Institute of Public Health.Oslo，Norway)进行本实验。

叶酸与抗体的偶联

首先将叶酸·2H2O溶解于二甲基亚砜(Fluka，含水量低于0.05％)中。 然后将溶液装套管于活化的4滤网(Fluka)上并在氩气中黑暗贮存6-10小 时。加入氚标记的叶酸(3H-叶酸)，其为3H-叶酸钾水溶液(就柠檬酸而言为1 ％)。用于偶联蛋白质的3H-叶酸的比活性为7-7.5GBq/mol。

为偶联骨髓瘤抗体F(ab’)2，向叶酸溶液加入10mol当量的1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺并于室温保温30分钟将3H-叶酸激活。此后，将 30-40倍摩尔过量的活化的叶酸加入14mg/ml蛋白质的PBS中，允许反应 30-60分钟。通过加入0.2ml 0.3M甘氨酸的pH8.5的PBS/硼酸盐结束反应。 用在PBS中预平衡的PD-10柱将叶酸-F(ab’)2偶联物(叶酸-F(ab’)2)与未反应 物分离。为形成叶酸-Fab’，将叶酸-F(ab’)2在1mM二硫苏糖醇(DTT)中室 温下保温2小时，随后在NAP-5大小排阻柱上洗脱。含有叶酸-Fab’的级分 通过向溶液中吹氩气后立即使溶液与脂质体溶液混合而脱氧。

叶酸偶联的程度通过用液闪计数仪(Beckmann LS6500)测定纯化蛋白质 的3H含量并结合280nm处分光光度计读数判定。

为定量与脂质体结合的叶酸-Fab’，在与DTT反应之前加入痕量碘化 F(ab’)2(蛋白质按照标准步骤由IodoGen碘化)。

标记的抗体与脂质体的偶联

DSPE-PEG2000-MPB(Northern Lipids，VA，Canada)，钠盐包含在5mol％ 总磷脂中。以对非-PEG化的脂质体描述的相同方式，另外构成脂质体并且 也准备进行离子载体介导的阳离子装载步骤。

在允许反应混合物于装载步骤完毕达到室温后，将脂质体悬浮物脱氧 化，加入叶酸-Fab’以获得0.3-0.5mg/ml的蛋白质浓度。经Bartlett磷分析 (Bartlett，1958)判定脂质浓度为1-3mM。允许叶酸-Fab’和脂质体在室温下反 应2小时。然后将反应混合物装载至已用PBS平衡的PD-10柱。将结合于 叶酸-Fab’的PEG-脂质体在用于叶酸-受体结合测定之前于4℃贮存12-15小 时。

脂质体结合的放射活性使用Nal孔(well)型测试剂测定，并校正双标记 样品于不同通道内的溢出值(spillover)。将单一核素和核素混合物的样品用作 参考。

根据对放射活性的测量，将蛋白质浓度转换成每脂质体的Fab’数目，假 定脂质体大小为100nm，有8·104磷脂/泡囊(Kirpotin et al，1997)，并且骨 髓瘤抗体Fab’的分子量等于52000。

细胞结合的放射性活性在加入Insta-Gel plus(Packard)后使用Nal-测试 剂(比Y-90高出3倍浓度)和液闪计数仪测定(表3)。 表3：在有或无叶酸盐时与抗体偶联的90Y-脂质体与OVCAR细胞的结合 加入的脂质体/细胞                               ％结合叶酸阴性                         ％结合叶酸阳性

                                             脂质体的细胞                            脂质体的细胞

脂质体上3H-叶酸的检测

将在20mM HEPES/300mM蔗糖中的PEG脂质体(2.5mM脂质浓度)与 偶联3H-叶酸盐的Fab’(于PBS中0.5mg/ml，叶酸/Fab’比率为2±0.2)反应。 室温下2小时后，将偶联叶酸-Fab’的脂质体在Sepharose CL-4B柱上洗脱分 离。脂质体上3H-叶酸-Fab’的量用层析获得部分的液闪计数定量，经测定叶 酸-Fab’/脂质体比率大约为110。

缩写：

DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱

DOTA：1，4，7，10四氮杂环十二烷1，4，7，10 N，N’，N”，N”’四乙酸

DSPE-PEG2000-MPB：N-(4-(对-马来酰亚氨基苯基)丁酰)-1，2-二硬脂酰 -sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Northern Lipids，VA，Canada)

HEPES：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2乙烷磺酸

PBS：磷酸盐缓冲液

EDTA：乙二胺N，N’四乙酸

HDEHP：二(2-乙基己基)磷酸

PEG：聚乙二醇

DTT：二硫苏糖醇