鸡血抗菌肽的制备方法

鸡血抗菌肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及鸡血抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。

抗菌肽是生物体内诱导表达具有广谱抗菌活性的小分子多肽。这些多肽是生物体

非专一性的免疫应答产物，是生物体内免疫系统的重要成分。国内外关于鸡源抗菌肽的研究，主要针对鸡小肠中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在国内外却很少有报道。目前，我国鸡的饲养量很大，屠宰鸡的下脚料鸡血很多，对其进行抗菌肽的提取和研究，是对资源的利用和再开发，是很有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供鸡血抗菌肽的制备方法，其制备方法条件温和、无污染、效率高。为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

鸡血抗菌肽的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取鸡血，进行血细胞破碎(目的是释放血红蛋白)后加入菠萝蛋白酶进行酶解；

(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5(如6.0)，获得鸡血抗菌肽粗提物；

(3)将所述鸡血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；

(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得鸡血抗菌肽溶液；

(5)将步骤(4)收集的鸡血抗菌溶液冷冻干燥。

在所述方法的步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶与所述鸡血的配比可为750-35000U：100ml(如1750-3500U：100ml，具体如3500U:100mL)；所述酶解的温度可为70～90℃(如70℃)，时间可为4～6h(如4h)。另外，在本发明中，所述进行血细胞破碎具体通过采用组织捣碎机搅拌所述鸡血实现的。

在本发明中，所述菠萝蛋白酶的酶活为3500U/mg。相应的，所述菠萝蛋白酶与所述鸡血的配比可为0.5-10mg：100ml(如0.5-1mg：100ml，具体如1mg:100mL)。

在所述方法的步骤(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具体可为：向所述酶解液中加入等体积的5％(体积百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具体可为：4～37℃(如4℃～10℃，再如4℃)震荡16-20h(如16h)；所述离心为：6600g-10000g(如10000g)4～10℃(如4℃)离心20min～30min(如20min)。

在所述方法的步骤(3)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm²·h。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)的洗脱过程中共产生两个洗脱峰，所述具有抗菌活性的洗脱峰实际为第二个洗脱峰。所述抗菌活性具体体现为抗如下细菌中的至少一种：大肠杆菌(如ACTT25922)、绿脓杆菌(如ACTT27853)、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。

在所述方法的步骤(4)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm²·h。

在本发明的一个实施例中，步骤(4)的洗脱过程中只产生一个洗脱峰，该洗脱峰即为纯化后的鸡血抗菌肽样品。

在所述方法的步骤(3)中，SephadexG-100凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。

在所述方法的步骤(4)中，SephadexG-25凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。

在上述方法中，所述鸡血即可为新鲜的鸡血，也可以为经冷冻后融化的鸡血。

利用如上所述方法提取得到的鸡血抗菌肽也属于本发明的保护范围。

具体而言，本发明具有以下优点：

1、本发明方法实现了从鸡血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。

2、采用本发明方法提取的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌、抗病毒、促生长和调节免疫等广泛而稳定的功能特点。

3、与同类方法相比，本发明方法操作方便，设备简单，提取周期短，而且分离提取率高。

4、本发明所开发产品的原料来源丰富，生产成本低，可以使鸡血得到高值化利用。因此本发明的应用不仅可以带来良好的经济效益，而且还具有良好的生态效益，进而还具有重要的公共卫生学意义，符合构建节约环保型社会的理念。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、从鸡屠宰场收集新鲜鸡血，组织捣碎机搅拌均匀(同样可以将采集的鸡血冷冻待用时融化后再按上步骤进行)，此步骤的目的是破碎血细胞，释放血红蛋白，冻融之后效果更佳。

2、向步骤1处理过的鸡血中加入菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶与鸡血的配比为1mg木瓜蛋白酶/100ml鸡血原液，混匀，在70℃条件下酶解4h，以得到酶解液。

3、向步骤2的酶解液加入等体积的5％乙酸(体积百分含量，溶剂为水)，4℃震荡浸提16h，8000r/min(相当于10000g)4℃离心20min，留取上清，调其pH值至6.0，即为鸡血抗菌肽的粗提物。

4、4℃下将鸡血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱(柱长与内径比为

8:1，SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)进行层析，上样量为10ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2·h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。

鸡血粗提物经SephadexG-100凝胶柱层析后出现2个洗脱峰。将洗脱峰各收集管的组分取20μL进行抑菌试验。采用琼脂糖弥散方法(检测菌在琼脂平板上

的终浓度为106CFU/ml)对收集的洗脱液进行检测，检测收集液对大肠杆菌ACTT25922株的抗菌作用，以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽作为阳性对照，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽作为阴性对照。收集具有抑菌作用的洗脱液。

5、将步骤4获得的有效的抗菌肽(合并的具有抑菌作用的洗脱液，即经SephadexG-100凝胶柱层析后收集的第9-16管)浓缩之后进一步用SephadexG-25凝胶柱(柱长与内径比为8:1，本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1)进行层析，上样量为10ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2·h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。收集具有抑菌作用的洗脱液，将其置于-20℃条件下保存。

6、将步骤5获得的有效的抗菌肽溶液冷冻干燥。

实施例1获得的鸡血抗菌肽的抗菌试验

采用琼脂糖弥散法，对实施例1从鸡血中提取的鸡血抗菌肽进行抗菌活性检测，测定抑菌圈直径大小，具体操作同实施例1步骤4中相关描述。供试细菌有：大肠杆菌ACTT25922、绿脓杆菌ACTT27853株、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。针对每个供试细菌均同时以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽的阴性对照。

实验重复三次，结果取平均值。

结果表明，实施例1从鸡血中提取的鸡血抗菌肽对各供试菌株均有明显的抑制作用，而阴性对照均无抗菌活性。