一株抑菌枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺

一株抑菌枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺

技术领域

本发明属于微生态饲料添加剂技术领域，具体涉及一株抑菌枯草芽孢杆菌及微生态制剂制备工艺。

背景技术

由于滥用各种抗生素、激素和违禁药品饲喂畜禽，而导致食品安全事件频发，抗药性菌株出现，随之带来巨大的食品安全潜在风险，可见开发高效优质的生物饲料产品替代抗生素、激素，生产绿无公害、有机肉、蛋、奶是国家和全民食品安全需要的民生问题。

近几年来人们研究开发出了饲用酶制剂、饲用微生物制剂、酸化剂、抗菌肽、寡聚糖、大蒜素、中草药以及有机金属微量元素等抗生素替代品，这些绿饲料添加剂得到了人们的青睐，都是基于抑制有害菌增殖、促进有益菌增殖、改善肠道微环境的基础上进行研究的，但总体来说，这些抗生素替代产品相对于抗生素而言，其作用效果仍有一定的差距。

各种动物及家禽自幼小个体发育开始，体内就建立起平衡的微生物菌，并有其维持自身菌稳态的机制，例如抗氧化因子、激素、蛋白、小肽等是维持机体微环境稳定的重要因子。

因此，开发无毒副作用、安全高效的具有抗感染性能的益生菌菌株，可以减少、替代甚至取代抗生素的使用，有效降低抗生素带来的一系列的副作用。枯草芽孢杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗真菌和细菌的代谢物，不会产生耐药性，将其作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大，市场前景广阔。

发明内容

基于市场发展需求以及发展趋势，本发明提供了一株抑菌枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺。

本发明所述菌株的主要生物学特征为：好氧菌，细胞大小(0.7μm～0.9μm)×(1.7μm～2.6μm)，菌体呈杆状，菌体单个存在，无荚膜，周生硬毛、能运动的革兰氏阳性菌；芽孢位于菌体中央，呈椭圆形或柱状，大小为0.8μm×(1.2μm～1.5μm)；脱落的芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面暗，变厚和不透明，有褶皱，菌落呈现奶油或微黄，发酵培养能够利用能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、淀粉、植物蛋白、动物源蛋白，能水解淀粉、氨酸；生长温度范围40℃～50℃，最适温度为43℃。

本发明所属枯草芽孢杆菌菌株具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶酶促活性，此项生物活性功能可以将本发明菌株应用到饲料添加剂中。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌微生态制剂，其主要活性成分为编号QR-KC-008的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明所述的枯草芽孢杆菌生产工艺流程：斜面母种→三角瓶母种→50L液体种子罐母种→500L液体种子罐→10T液体发酵罐接种→产品（液体菌剂或粉剂）。

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂制备工艺包括以下具体步骤：

（1）菌株选用编号QR-KC-008的枯草芽孢杆菌菌株；

（2）斜面母种培养：将采用甘油冻干管保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于固体斜面培养基上，40℃培养2d；

（3）三角瓶母种培养：将制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150mL三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；

（4）扩大培养：将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接接种到5L种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；

（5）50L液体种子罐种子液制备：将二级三角瓶种子液已2.5%（体积百分比）的接种量接种到50L液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量2.5m3/h条件下培养24-26h；

（6）500L液体种子罐发酵种子液制备：将50L液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500L液体种子罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量30m3/h条件下培养24-26h；

（7）10T发酵培养：将500L液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到10T发酵罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量50m3/h条件下培养24-26h；

（8）上述步骤（3）和（4）中，所述三角瓶种子液体培养基的配方为：按质量百分比计，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠1%，pH7.0；

（9）步骤（5）和（6）中，所述种子罐培养基配方为：按照质量百分比计：葡萄糖2%、牛肉膏0.8%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.1%， K2HPO4 0.5%，pH7.0；

（10）步骤（2）中所述斜面培养基为上述（8）中所述液体培养基中添加2%的琼脂粉；

（11）本发明提供了枯草芽孢杆菌微生态制剂制备方法，具体步骤为：以2%海藻酸钠、卡波胶0.5%为壁材，用菌株QR-KC-008发酵离心菌泥浆溶解，边加边搅拌，加入0.15%的吐温80，250r/min搅拌15min，再加入中药提取浓缩液、壳聚糖，4%氯化钙作为固化剂继续固化，直至细腻均匀无颗粒，即得本发明微生态制剂；

（12）本发明提供了枯草芽孢杆菌芽孢菌剂制备方法：具体步骤：步骤（7）发酵培养至产孢率达到95%左右，终止发酵，85℃灭活菌体，添加喷干保护剂，在进风口温度215-230℃、出风口温度92-98℃，发酵液流量500L/h，负压-0.65-0.75KPa条件下喷雾干燥，收料口收集物料。

步骤（11）所述中药提取浓缩液为甘草：黄芩、苦参、薄荷和紫锥菊按质量比为20:9:9:5:4混合的混合药材的水提液，浓缩至中药重量与中药液重量比为1:1。

步骤（12）所述喷干保护剂为脱脂乳5%、糊精15%、氯化钠4.5%、醋酸钠1.2%、谷氨酸钠0.8%。

本发明的有益效果：

（1）本发明提供的枯草芽孢杆菌QR-KC-008对金黄葡萄球菌和大肠杆菌、镰刀菌都具有较强的抑制作用，最低抑菌浓度为3%；

（2）本发明提供的枯草芽孢杆菌QR-KC-008具有较强的耐高温能力，在100℃处理20min还有较强的抑菌性；

（3）本发明提供的枯草芽孢杆菌QR-KC-008具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶酶促活性；

（4）本发明提供的枯草芽孢杆菌QR-KC-008的发酵周期为24-26h，稳定期发酵液的活菌数数量级最高达到1011cfu/g，喷干粉的芽孢活菌数到达9.6×1012cfu/g。

具体实施方式

本发明公开了一株抑菌枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数达到满足自身实际设备条件的工艺配方。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都可视为本发明保护内容。

本发明一株抑菌枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺将通过具体实施例进行了描述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1枯草芽孢杆菌QR-KC-008的分离和纯化：

（1）样品处理：

样品选用公司附近沙土土壤，土样放无菌水90℃煮沸了20分钟。

（2）然后用接种环蘸取处理过的样品溶液于母种斜面盛有已凝固的平板培养基中，划线，40℃培养箱中恒温培养24h，挑取长势良好的菌落、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌，分离出的单菌进行蛋白酶检测试验、抑菌性实验、革兰氏染镜检。

所述平板培养基成为为：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠1%，琼脂2%，pH7.0。

（3）菌株的抑菌性实验比较：

实验筛选得到枯草芽孢杆菌菌株25株。

用接种环取纯化好的25株斜面菌株两环于分别接种于LB液体培养基中，编号1-25，40℃，180r/min震荡培养20h。

用无菌镊子取直径为6mm，并加有50μL经16000rpm离心20min之后的发酵上清液的滤纸片，贴在涂金黄葡萄球菌的胰蛋白胨大豆琼脂培养基、涂大肠杆菌营养琼脂培养基、图镰刀菌营养琼脂中，在37℃培养箱中恒温培养20h，观察并用游标卡尺量取抑菌圈的直径。(纸片琼脂扩散法)。

经过抑菌性复筛得到6抑菌性能较好的菌株，其形态学特征见表1，抑菌效果见表2。

所述LB培养基成分为：每950mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，121℃灭菌20min。

表1.各分离菌株菌体形态

表2.菌株抑菌效果比较单位mm

从表1和表2中可以看出菌株QR-KC-008和QR-KC-0022具有良好的抑菌性能，可以同时对三种有害菌起来抑制作用，但QR-KC-008抑菌性显著高于其它各株菌的抑菌性，因此QR-KC-008作为最佳试验菌株。

（4）菌株产酶性能比较：

将菌株QR-KC-008接种到液体种子培养基中发酵，40℃、150r/min恒温培养24h，终止发酵测定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，结果见表3。

表3.菌株酶活性比较单位：U/mL

菌株 QR-KC-008 中性蛋白酶 115.26±1.54 脂肪酶 46.58±0.63 淀粉酶 25.01±2.14

试验结果表明：菌株QR-KC-008分泌的次级代谢产物中具有中性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶。

实施例2枯草芽孢杆菌QR-KC-008发酵生产工艺。

将实施例1筛选得到的优选菌株QR-KC-008，经扩大培养，制备得到菌粉，具体生产工艺流程如下：

本发明所述枯草芽孢杆菌菌剂制备工艺包括以下具体步骤：

（1）菌株选用编号QR-KC-008的枯草芽孢杆菌菌株；

（2）斜面母种培养：将采用甘油冻干管保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于固体斜面培养基上，40℃培养2d；

（3）三角瓶母种培养：将制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150mL三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；

（4）扩大培养：将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接接种到5L种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；

（5）50L液体种子罐种子液制备：将二级三角瓶种子液已2.5%（体积百分比）的接种量接种到50L液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量2.5m3/h条件下培养24-26h；

（6）500L液体种子罐发酵种子液制备：将50L液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500L液体种子罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量30m3/h条件下培养24-26h；

（7）10T发酵培养：将500L液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到10T发酵罐中，于42℃，罐压0.05MPa，通气量50m3/h条件下培养24-26h；

（8）上述步骤（3）和（4）中，所述三角瓶种子液体培养基的配方为：按质量百分比计，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠1%，pH7.0；

（9）步骤（5）和（6）中，所述种子罐培养基配方为：按照质量百分比计：葡萄糖2%、牛肉膏0.8%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.1%，K2HPO4 0.5%，pH7.0；

（10）步骤（2）中所述斜面培养基为上述（8）中所述液体培养基中添加2%的琼脂粉。

实施例3枯草芽孢杆菌QR-KC-008微生态制剂制备工艺。

利用实施例2发酵培养的QR-KC-008发酵，利用GQ-105离心机设定转速16000r/min，进料流速2.68L/min，离心，离心结束后，收集菌泥，放置于4℃冰柜保藏备用。离心菌泥浆溶解。

枯草芽孢杆菌QR-KC-008微生态制剂制备工艺主要包含以下步骤：

（1）枯草芽孢杆菌QR-KC-008悬浊液制备，利用无菌生理盐水250r/min搅拌15min将离心菌泥制备成30%（w/v）菌悬液；

（2）芯材混合物混合物的制备：将海藻酸钠2%（w/v），甘油4.5%（w/v）、卡波胶0.5%（w/v）、吐温80 0.2%（w/v）和枯草芽孢杆菌QR-KC-008 30%（w/v）加入一定量的蒸馏水中混匀即得；

（3）将以上步骤（2）制备的芯材混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.88kgf/cm2，液体压力为0.56kgf/cm2；

（4）雾化后的液体微滴用装有适量5%氯化钙溶液的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器不轻轻搅拌氯化钙溶液；

（5）液体微滴在5%氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入包材中药提取浓缩液、壳聚糖0.8%（w/v）中，轻轻搅拌15min直至细腻均匀无颗粒，使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被，即得本发明微生态制剂；

（6）再将④处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于-72℃冷冻干燥5h，然后于-75℃再干燥20h，干燥时压力设定为6.14Pa；

（7）所述中药提取浓缩液为甘草：黄芩、苦参、薄荷和紫锥菊按质量比为20:9:9:5:4混合的混合药材的水提液，浓缩至中药重量与中药液重量比为1:1。

实施例4枯草芽孢杆菌QR-KC-008芽孢菌剂喷雾干燥制备工艺。

枯草芽孢杆菌QR-KC-008芽孢菌剂喷雾干燥制备工艺步骤如下：

（1）在本实施例中，利用实施例2发酵枯草芽孢杆菌QR-KC-008，当发酵培养至产孢率达到95%左右，终止发酵，85℃灭活菌体；

（2）经过灭活菌体的发酵液，温度降至40-45℃时，添加喷干保护剂，设定搅拌转速500r/min，搅拌至喷干保护剂混合均匀；

（3）在喷干转移物料前，首先利用0.4MPa蒸汽对物料管道、储液罐进行杀菌处理，杀菌时间30min；

（4）将步骤（2）处理好的发酵液倒入喷干储罐中，开启喷雾干燥设备，设定进风口温度215-230℃、出风口温度92-98℃，发酵液流量500L/h,，负压-0.65-0.75KPa，开始对枯草芽孢杆菌QR-KC-008芽孢发酵液进行喷雾干燥，收料口收集物料；

（5）所述步骤（2）中喷干保护剂为脱脂乳5%、糊精15%、氯化钠4.5%、醋酸钠1.2%、谷氨酸钠0.8%。