一种优化的临床用TCM分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用

一种优化的临床用TCM分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒 及应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞靶向技术领域，特别涉及一种优化的从人体外周血或外周血单个核细胞中分离纯化记忆性免疫细胞（TCM）或CD8T+细胞试剂盒，TCM诱导扩增试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用。

背景技术

过继性细胞技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法。然而目前还存在不少问题亟待解决，包括：1)如何获得充分数量的肿瘤反应性T细胞是决定过继性细胞效果的最关键因素；2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8+T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞的临床疗效。

记忆性T细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力，能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞提供更为合适的免疫效应细胞。有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离记忆性T细胞并通过TCR基因转染有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。

本发明人2017年发明了《外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用》（专利号：201710712565.6），在临床应用中，TCM细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，许多技术人员很难在短时间内培养出质量均一的TCM细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，同时本发明通过进一步优化诱导因子组合物TCM-III，节省了原材料，降低了生产成本；诱导培养前用TCM-II包被培养板TCM细胞增殖倍数提高了2-3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%-20%，有效细胞的绝对数量提高了2-3倍；TCR基因转染前，用TCM-II包被培养板可提高转染效率。本发明改进了工艺，这对临床上提高肿瘤疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。

发明内容

为了解决过继性细胞技术中免疫细胞在体内难以长期存活，缺少靶向性的问题；本申请提供了一种从人体外周血或低温冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化记忆性T细胞（TCM）或CD8T+细胞，TCM诱导活化率高的试剂盒及应用，然后将肿瘤特异或病毒特异性TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞具有长效性和靶向性。

本发明是通过以下步骤得到的：

1.TCM或CD8T+细胞的分选、刺激与基因转染

（1）本发明提供一种人体外周血TCM或CD8T+细胞分选试剂盒以及产品鉴定试剂盒。

(2) 所述人体TCM或CD8T+细胞分选试剂盒包括，CD8重力柱，Reagent1：CD8纯化试剂，由CD8Fab-Strep和Buffer CI构成。Reagent2：CD62L+纯化试剂，由CD62L+Fab-Strep和Buffer IS构成。Reagent3：CD45RA-纯化试剂，由CD45RA-Fab-Strep和Buffer IS构成。Reagent4：Strep-Tactin Magnetic Microbeads.Reagent5：洗脱液，由D-biotin和BufferIS构成。

（3）所述TCM或CD8T+细胞分选试剂盒的使用方法

1）用8ml Buffer CI冲洗CD8重力柱。

2）加1mlReagent1到步骤1中的重力柱中。

3）加2mlBuffer CI冲洗步骤2 上样后的重力柱。

4）PBMC按照密度1x106-1x107/ml上柱或者外周血按照体积66ml上柱。

5）用40ml Buffer CI冲洗柱子四次，每次10ml。

6）用Reagent5洗脱细胞，400g离心6-10min收集细胞，得到CD8+T细胞。

7）去掉上清，用合适的Buffer IS重悬，进行下一步的分选。

8）取50-100ul Reagent2和150-300ulReagent4混合后，摇床摇30min。

9）取1-2x108 PBMC用900-1500ul Buffer IS重选，加到上述步骤8中。摇床中摇20min。

10）加5mlBuffer IS到步骤9中，放磁极上，水平放置，静止3min后，去掉上清液，再用5mlBuffer IS重选。

11）重复步骤10。

12）Reagent5重悬阳性标记的细胞。室温静止10min，放置磁极上静止3min，将含有阳性细胞的上清液转移到新的反应管中。

13）用5ml Reagent5再洗一次，重复步骤12。

14）混合两次的上清液，400g离心6-10min。

15）去上清，用5mlBuffer IS重悬细胞，摇床上摇10min。

16）放置在磁极上静止3min。

17）将上清转移到一个新的离心管中，400g离心6-10min。

18）重复步骤8和9，400g离心6-10min收集细胞。

19）去掉上清，用合适的Buffer IS重悬，进行下一步的分选。通过连续两次阳性选择和CD45RA-阴选的方法，获得CD8+CD62L+CD45RO+细胞，对其进行内毒素检测和表型鉴定。

（4）本发明提供一种CD8+T细胞分选试剂盒或TCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TCM细胞无血清扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液TCM-II和诱导因子组合物TCM-III：

（5）本发明提供一种临床用无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素2和人白介素15。本发明不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养。

（6）本发明提供一种TCM细胞扩增包被液TCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml。

（7）本发明提供一种TCM细胞诱导因子组合物TCM-III，无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I中添加300-1000u/mL 人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mL IL-2。

优选步骤（7）中TCM按照细胞密度1×10/mL用TCM-III重悬，其中添加500u/mLIFN-γ、120u/mL IL-1α、1000u/mL IL-2、30IU/mL IL-7、30IU/mL人白介素15、80ng/mL CD3单抗、80ng/mL CD28。第二天以后用 TCM-I培养液对TCM或CD8T+细胞进行诱导扩增培养，经过12-14天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE细胞；

（8）质量检测合格的TCM细胞装入50-100ml生理盐水中，制成免疫细胞制剂，配合肿瘤临床需要静脉回输。

（9）本发明提及的无血清培养基和诱导因子或者TCM细胞分离液的原料可以从市场上购买，并且长期冷冻保存细胞和小分子蛋白的技术已经非常成熟，本领域技术人员完全可以利用上述技术保存组成本发明试剂盒的培养基和组合物。

（10）本发明还包括将上述TCM或CD8T+细胞分选试剂盒、无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液体TCM-II和TCM-III装入专用洁净容器制备成试剂盒。

本发明通过包被TCM-II工作液，TCM细胞增殖倍数提高了2-3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%-20%，这对临床上提高肿瘤疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。

（11）重组TCR逆转录病毒转染（培养后第3天）TCM细胞。

根据目的基因序列，设计引物，通过PCR技术克隆目的基因，构建重组人逆转录病毒PLXPXSN-TCRa12-2-IRES-Vβ7.1，用HEK293细胞包装完整病毒颗粒后以MOI=100的比例转染TCM。转染前TCM-II 配成50ug/ml工作液，包被到六孔板中。

（12）培养后5天用DC负载肝癌肿瘤抗原AFP进行肿瘤抗原再刺激。

（13）台盼蓝染法获取CD8+T细胞及TCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至26天）。

（14） 本发明另一方面还提供一种TCM分选和诱导后鉴定试剂盒，所述临床用TCM细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双抗体组合物，分别是IgG-FITC/IgG-PE/IgG-ECD、CD3-FITC/CD8-PE、CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗体每两种按照体积1:1混合装于1支棕EP管中，每3-8ul可检测一次，共计10-50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛。

（15）所述试剂盒制备中的质量控制鉴定方法，按照GMP要求，将相关物料密封装入试剂盒，按照《中国药典》进行无菌和内毒素检测；

（16）所述制备的细胞制剂的质量控制鉴定方法，包括按照国家食品药品监督管理总局公布的《药品注册管理办法（修订稿）》意见中“生物制品注册分类和申报资料要求（试行）”进行质量控制，保证临床应用时的安全性。

（17）上述方法中，在获得本发明TCM之前，用生理盐水洗涤并重悬所述TCM细胞3-4次，直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素的检测指标，保证本发明的TCM细胞在回输给患者是残留的本发明所述的培养基组分和诱导因子组合物不会引起患者不适反应。所述TCM细胞组合物包括1x10-3x10/ml本发明的TCM，优选为1x10-2x10/ml。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基础，所述人血白蛋白的质量体积含量为1-5%，优选为5%。

（18）本发明还提供了一种本发明TCM细胞组合物的临床应用和疗效评估方法。

本发明提供了一种TCM在临床肿瘤综合中的应用方法，其中包括让患者知晓本发明TCM的作用并签署知情同意书后，自由选择本发明TCM细胞作为辅助手段在肿瘤综合中的联合应用。

（19）优选所述TCM组合物使用的方式为滴注。具体地，使用所述TCM细胞组合物的方式为采用6号针头或7号针头、输液器，静脉注射或静脉滴注。优选使用所述TCM细胞组合物的方式为在手臂或者下肢采用7号针头输液器进行静脉滴注。

（20）所述TCM细胞组合物优选包含3x10-2x10/ml的本发明TCM细胞，其有效量为50ml-100ml/个体的生理盐水组合物。

（21）以上所述TCM细胞组合物都是一次静脉滴注的剂量，一个疗程三-四次静脉滴注，从第一次开始期间连续或每间隔一天再回输下一次。一个疗程结束后，适疗效情况可以间隔两到三个月后继续给药。如有必要，间隔时间为一年或两年后还可继续再。

（22）所述疗效评价的标准有：

1）起免疫增强作用的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素γ和肿瘤坏死因子a在内的Th1类细胞因子变化水平，一般升高为有效；

2）起免疫抑制作用的细胞因子如白介素6、白介素10、转化生长因子β和表皮细胞生长因子的变化水平，一般降低为有效。

3）T淋巴细胞亚变化：CD3、CD4、CD8、CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE阳性率的升高或改善，CD16/CD56阳性率的升高，以及CD4+FOX3+的降低。

4）其他疗效评价指标还有：患者肿瘤标志物检测，如甲胎蛋白、鳞癌细胞抗原、游离PSA与总PSA比值、癌胚抗原、糖链抗原125、糖链抗原CA242、细胞角蛋白19片段CYFRA21-1、游离绒毛膜促性腺激素β-HCG、神经炎特异性烯醇化酶（NSE）、糖链抗原199、总前列腺特异性抗原TPSA、游离前列腺特异性抗原TPSA、糖链抗原CA724在内的肿瘤特异性抗原的表达降低，主要通过流式荧光发光法检测；影像学检测，如核磁共振、CT和B超检测；以及患者生存期统计。

5）Karnofsky评分法和生活质量评分法。

（23）优选本发明的TCM细胞用于自体，可最大限度的避免免疫排斥反应造成的副作用。

（25）统计学分析

实验数据以均数士标准差来表示。应用SPSS16.0统计软件进行统计分析。各指标先进行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2x2析因设计的方差分析（不同组细胞肿瘤杀伤活性比较，抗体抑制试验，各组细胞的细胞因子分泌。采用重复测量的方差分析完成各组细胞不同时间地点细胞数量分析。采用单因素方差分析对不同组细胞端粒长度进行分析。当P<0.05时，被认为差异具有统计学意义。

本发明所述疾病包括但不限于肾癌、恶性黑素瘤、肺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、淋巴瘤和病毒感染性疾病包括但不限病毒性肝炎、结核病和艾滋病等。

本发明的有益效果：

1）本发明提供了一种临床用TCM细胞高效、快速制备方法，相关组合物和试剂盒及其应用方法。本发明对TCM细胞的诱导、培养及产品质量控制进行了优化和完善，通过一套TCM细胞诱导、培养及产品质量控制鉴定的试剂盒形式，规范TCM细胞临床应用，为TCM细胞高效快速制备和临床应用质量标准统一提供标准模式。

2）本发明中PBMC复苏的细胞存活率93％±3％，复苏后TCM得率为21％±3％，CD8+T细胞得率：58%±2%。

3）诱导培养前用TCM-II包被培养板可提高TCM的增殖能力。

4）TCR基因转染前，用TCM-II包被培养板可提高转染效率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一、外周血采集和稀释：

采集枸橼酸钠抗凝血100ml，平均分成两份，加16mlbuffer CI稀释后，体积大约66ml，准备添加到CD8重力柱中。

二、PBMC冷冻后复苏：取出冻存6个月后的PBMC，迅速投入 37 ℃水浴中，并不断轻轻摇动，保证管内液体在1 min 内80%溶解，将细胞吸到一定量 DMEM 洗涤液中，并洗涤冻存管1 次，移入50 mL 离心管中，233 g 离心5 min。弃上清，加入适量培养基，轻轻混匀，留取500 微升做计数测细胞活性。

三、细胞计数和台盼蓝拒染法测细胞活性

Countstar检测细胞样本，读取屏幕上显示的细胞平均值数值。根据公式细胞数T=细胞数/ml*V计算细胞总数。

四、PBMC回收率

计算PBMC回收率，采用公式：PBMC细胞回收率=(分离后细胞数/分离前细胞数)×100%。

实施例2

在实施例1基础上，用CD8+T细胞或TCM分选试剂盒进行分选：

T细胞亚磁珠分选试剂盒制备及使用

人体TCM分选试剂盒包括，Reagent1：CD8纯化试剂，由CD8Fab-Strep和Buffer IS构成。Reagent2：CD62L+纯化试剂，由CD62L+Fab-Strep和Buffer IS构成。Reagent3：CD45RA-纯化试剂，由CD45RA-Fab-Strep和Buffer IS构成。Reagent4：Strep-Tactin MagneticMicrobeads.Reagent5：洗脱液，由D-biotin和Buffer IS构成。

1）用8ml Buffer CI冲洗CD8T重力柱。

2）加1mlReagent1到步骤1中的重力柱中。

3）加2mlBuffer CI冲洗步骤2 上样后的重力柱。

4）PBMC按照密度1x10-1x10/ml上柱；外周血按照体积66ml上柱。

5）用40ml Buffer CI冲洗柱子四次，每次10ml。

6）用Reagent5洗脱细胞，400g离心6-10min收集细胞，得到CD8T细胞。

7）去掉上清，用合适的Buffer IS重悬，进行下一步的分选。

8）取50-100ul Reagent2和150-300ulReagent4混合后，摇床摇30min。

9）取1x108 CD8+T用900-1500ul Buffer IS重选，加到上述步骤8中。摇床中摇20min。

10）加5mlBuffer IS到步骤9中，放磁极上水平放置，静止3min后，去掉上清液，再用5mlBuffer IS重选。

11）重复步骤10。

12）Reagent5重悬阳性标记的细胞。室温静止10min，放置磁极上静止3min，将含有阳性细胞的上清液转移到新的反应管中。

13）用5ml Reagent5再洗一次，重复步骤12。

14）混合两次的上清液，400g离心6-10min。

15）去上清，用5mlBuffer IS重悬细胞，摇床上摇10min。

16）放置在磁极上静止3min。

17）将上清转移到一个新的离心管中，400g离心6-10min。

18）重复步骤8和9,400g离心6-10min收集细胞。

19）去掉上清，用合适的Buffer IS重悬，进行下一步的分选。通过连续两次阳性选择和CD45RA-阴选的方法，获得CD8+CD62L+CD45RO+细胞，对其进行内毒素检测和表型鉴定。

计算TCM回收率，采用公式：TCM细胞回收率=(TCM分选后细胞数/分离前PBMC细胞数*TCM%)×100%。见图1和图2

实施例3

TCM的诱导试剂盒制备及使用

本发明提供一种TCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TCM细胞无血清扩增完全培养液TCM-I和TCM细胞扩增包被液TCM-II和诱导因子组合物TCM-III：

1）本发明提供一种临床用无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水和人白介素2和人白介素15。本发明不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养。

2)本发明提供一种TCM细胞扩增包被液TCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml。

3)本发明提供一种TCM细胞诱导因子组合物TCM-III，无血清TCM细胞扩增完全培养液TCM-I中添加300-2000u/mL 人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mL IL-2。

D0天将TCM-II 配成12.5ug/ml工作液，包被到六孔板中，平放于37℃培养箱中大于2小时。TCM按照细胞密度1×10/mL用TCM-III重悬，其中添加500u/mL IFN-γ、120u/mLIL-1α、1000u/mL IL-2、30IU/mL IL-7、30IU/mLIL-15、80ng/mL CD3单抗、80ng/mL CD28。第二天以后用 TCM-I培养液对TCM细胞进行扩增培养，经过12-15天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE细胞；见图2和图3

实施例4

重组TCR逆转录病毒转染（培养后第3天）CIK细胞及TCM细胞。

根据肝癌特异基因TCRa12-2和Vβ7.1序列，设计引物，通过PCR技术克隆目的基因，构建重组人逆转录病毒PLXPXSN-TCRa12-2-IRES-Vβ7.1，用HEK293细胞包装完整病毒颗粒，-80℃冰箱保存病毒颗粒，以MOI=100的比例转染TCM。

1）将TCM-II 配成50ug/ml工作液，包被到六孔板中，平放于37℃培养箱中大于2小时。

2）吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS终止液0.5 ml。

3）室温放置30分钟。

4)加入适量PBS清洗孔板。

5)吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板。

6)逆转录病毒保存液 (-80℃) 于37℃水浴融解。

7)将病毒液加入包被后的六孔板，每孔1ml。

8）32℃放置4小时。

9）吸出病毒保存液。

10）每孔加入待转染的细胞悬液。

培养后5天用DC负载肝癌肿瘤抗原AFP肿瘤抗原再刺激。

台盼蓝染法获取TCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至26天）。

上述细胞培养过程中及以下实施例中TCM组合物制备都应该在GMP要求的百级洁净室或者操作台进行，严格保证细胞及其制剂的质量安全。

上述实施例包括培养袋培养，本发明的实施例中设计到的添加剂或者因子加入量只明示了其中某个比例，凡是试剂盒涉及的TCM细胞培养鉴定，以及添加相关添加剂或者因子比例能满足在上述权利要求的浓度范围的都应属于本发明要求保护之列。

实施例5

诱导因子组合物TCM-III配方进一步优化。

实验共分4组，

A组：1000IU/ml IFN-γ+120u/mL IL-1α+800 u/mL IL-7+1000IU/ml IL-2+800 u/mLCD3+110ng/mL CD28+800 u/mL IL-15；

B组：500IU/ml IFN-γ+100u/mL IL-1α+1000IU/ml IL-2+80ng/mL CD3+80ng/mL CD28+ 30IU/mL IL-15+ 30IU/mL IL-7；

C组：500IU/ml IFN-γ+100u/mL IL-1α+1000IU/ml IL-2+80ng/mL CD3+80ng/mL CD28+ 30IU/mL IL-15；

D组：500IU/ml IFN-γ+100u/mL IL-1α+1000IU/ml IL-2+80ng/mL CD3+ 30IU/mL IL-15；

Treatment Purity of Percentage of Percentage of

CD8+T cells CD8+TCM CD8+TEM

A组 93.56±0.6 64.2± 2.0 29± 2.8

B组 93.18±0.3 62.65 ± 1.51 23.53± 3.68

C组 92.8 ±0.25 52.17±1.91 44.59±2.5

D组 90.6 ±0.4 50.56±2.11 39.13±2.8

此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加TCM-I培养基，应用Countstar计数仪进行细胞计数。AB组细胞间数量差异无统计学意义（F=154.12,P=0.103)，其他组间差别具有统计学意义。（F=199.02，,P<0.001)

实施例6

TCM组合物制备及临床应用

（1）上述实施例中获得的TCM细胞用0.9%医用生理盐水重悬，计数，在细胞重悬液中添加人血白蛋白5%，调整总体积100ml。

（2）事先准备临床用100ml装有0.9%生理盐水袋或瓶，将上述细胞组合物装入其中，贴上说明标签。

（3）待细胞组合物相应检测合格后，送临床实施自体TCM细胞回输。

（4）临床应用方法说明如下：

1）TCM组合物给药的途径优选：在手臂或者下肢采用7号针头输液器进行静脉滴注。

2）所述TCM细胞组合物临床有效剂量包括：组合物含3x10-2x10/ml细胞，途径80ml-100ml/个体，一个疗程连续回输3-4次。

3）从第一次开始期间连续或每间隔一天再回输下一次。一个疗程结束后，适疗效情况可以间隔两到三个月后继续给药。如有必要，间隔时间为一年或两年后还可继续再。

4）TCM细胞临床回输后进行疗效评价

经过TCM细胞1-2个疗程后，较之前患者生活质量明显改善，KPS评分法评分提高20-30分，QOL评分法提高30-40分，患者免疫功能有不同程度改善，其中细胞因子检测显示能够使Th1类细胞因子水平提高3-6倍。

实施例7

TCM分选和诱导后鉴定试剂盒制备及应用

在培养第15天，用本发明的TCM分选和诱导后鉴定试剂盒鉴定TCM来源TE不同时间点CD45RO+、CD44+和CD62L的表达。细胞培养第15d，TCM细胞比例占99.57%，结果见图4.

（1）单细胞悬液：细胞密度调整至5x10-5x10/ml。

（2）吸取样本100ul，加入IgG-FITC/IgG-PE/IgG-ECD、CD3-FITC/CD8-PE、CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE荧光标记抗体各5ul，室温避光孵育15min。

（3）加入清洗液2ml，1600rpm离心5min。

（4）去上清，500ul PBS缓冲液重悬后上机检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。