抗原偶联物及其用途

技术领域

本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领 域。本发明提供包含与至少一种本发明的抗原连接的病毒样颗粒 (VLP)的组合物，其中所述本发明的抗原是本发明的CCR5、本发 明的胃泌素、本发明的CXCR4、本发明的CETP或本发明的C5a。

本发明还提供一种制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以 用于制备疫苗，该疫苗特别用于其中本发明的抗原介导或贡献于 其病症的疾病，特别是用于AIDS、胃肠癌、冠心病或炎性疾 病。而且，本发明的组合物诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。 而且，本发明的组合物特别可用于在特定环境内有效诱导自身特异性 免疫应答。

相关技术

背景技术

HIV R5株利用细胞表面分子CD4和CCR5附着并进入巨噬细胞 和CD4+T细胞。CCR5是一种7-跨膜受体，具有N末端序列和三个 暴露于胞外间隙的环，它们后来分别被称为PNt、ECL-1、ECL-2和 ECL-3。天然CCR5配体RANTES、MIP-1α、MIP-1β及其类似物能够 阻断病毒-共同受体的相互作用，并进一步引起CCR5的内化 (Lederman等人，2004，Science 306，p485)。CCR5特异性自身抗体已 经在12.5％的重复暴露于HIV但是仍未感染的女性中发现(Lopalco等 人，2000，J.Immunology 164，3426)。这些抗体表现为结合CCR5的第 一胞外环(ECL-1)，并且能够抑制外周血单核细胞(PBMC)的R5-向性 HIV感染。在女性中的同种异体免疫产生能够在体外抑制R5-HIV感 染的CCR5特异性抗体(Wang等人，2002，Clin.Exp.Immunol.129， 493)。

单克隆抗-CCR5抗体能够在体外预防HIV感染(Olson等人，1999， J.Virol.73，4145；Wu和LaRosa等人，1997，J.Exp.Med.186， 1373)。与对应于小胞外环ECL-2A(Arg168-Thr177)的环肽结合的抗 体抑制HIV-1 R5地感染(Misumi等人，2001，J.Virol.75，11614)。用 线性CCR5肽(来自N-末端，ECL-1或ECL-2序列)免疫猴子产生的抗 体在外体具有病毒抑制作用(Lehner等人，2001，J.Immunology 166， 7446)。CCR5的N-末端结构域展示在乳头瘤病毒样颗粒上，并免疫 猴子(Chackerian等人，2004，J.Virol.78，4037)。

趋化因子受体CXCR4，也被称为LESTR或融合素，属于七跨膜 域G-蛋白偶联受体家族(Federsppiel等人(1993)，Genomics 16：707)。 CXCR4在大多数白细胞体的细胞表面上表达，该白细胞体包括 所有B细胞和单核细胞、大多数T淋巴细胞亚类、内皮细胞和上皮细 胞(Murdoch，(2000)Immunol.Rev.177：175)。CXCR4的唯一已知的配 体是SDF-1(Pelchen-Mattews，等人(1999)Immunol.Rev.168：33)。

CXCR4后来被确定为HIV的共同受体(Feng等人(1996)Science 272：872)。因此，进入细胞需要CXCR4的HIV株被归类为X4株，并 且这种进入可以被已经显示阻止HIV-1进入的SDF-1所阻断(Oberlin 等人(1996)，Nature 382：833；Bleul，等人(1996)Nature 382：829)。

已经鉴定了几种CXCR4肽拮抗剂，它们显示抑制X4 HIV-1株的 进入和感染(Murakami等人(1997)J Exp Med 186：1389；Arakaki等人 (1999).J Virol 73：1719；Doranz等人(2001)AIDS Res Hum Retroviruses 17：475；Doranz，等人(1997)J Exp Med 186：1395；Schols，D.(2004)， Curr Top Med Chem4：883)。另外，小化学化合物AMD3100，它是 HIV-1和HIV-2复制的强选择性抑制剂，显示为CXCR4特异性的(De Clercq(2003)Nat Rev Drug Discov 2：581)。而且，针对CXCR4的不 同胞外域的抗-CXCR4单克隆抗体显示抑制HIV-1感染(Endres等人 (1996)Cell 87：745；Brelot等人(1997)，J Virol 71：4744；Misumi等人 (2003)，J Biol Chem 278：32335；Xiao等人(2000)，Exp Mol Pathol 68：139)。

胃泌素(G17)是一组经典的肠肽激素，它们在结肠和胰脏中含量 非常低(Koh，Regulatory Peptides.93，37-44(2000))。胃泌素是从它的 前体前胃泌素(G34)加工而来的。胃泌素和前胃泌素都以C末端甘氨 酸延伸的形式和C末端苯丙氨酸酰胺化的形式存在(Steel.IDrugs.5， 689-695(2002))。

众所周知胃泌素具有刺激胃酸分泌的能力(Pharmacol Ther.98， 109-127(2003))。相关的激素胆囊收缩素(CCK)，其具有作为胃泌素 的C-末端四肽酰胺，在十二指肠中合成，并负责胰酶分泌。酰胺化的 G17与CCK-2受体结合，CCK既结合CCK-1受体又结合CCK-2受体 (Steel.IDrugs.5，689-695(2002))。甘氨酸延长的胃泌素的受体仍然不 清楚。最近的数据提示胃泌素可能促进胃肠道癌症的发展(Watson. Aliment Pharmacol Ther.14，1231-1247(2000))。

补体系统的激活诱导大量的强有力的生物学效应，其中许多由过 敏毒素C5a介导。补体第5成分(C5)由C5转化酶切割为两个片段， C5a和C5b。

C5a是一种74个氨基酸的四螺旋束糖蛋白(Fernandez和Hugli，J. Biol.Chem.253，6955-6964，1978)，负责产生针对细胞系统、特别是 嗜中性粒细胞、内皮细胞和巨噬细胞的大量多样化的效应，以诱导局 部炎症来对抗感染性微生物(Ward P，Nat.Rev.Immunol.4：133， 2004)。但是，通过相同的方式，脓毒症中C5a的过量产生导致嗜中 性粒细胞的严重的功能缺陷(Czermak等人，Nat.Med.5：788，1999； Huber-Lang等人，J.Immunol.166：1193，2001)。

C5a活化增强也与许多原发和/或慢性炎性疾病有关，如类风湿性 关节炎(Jose P.Ann Rheum.Dis.49：747，1990)、牛皮癣 (Takematsu H，Arch.Dermatol.129：74，1993)、成人型呼吸窘迫综合 征(Langlois P，Heart Lung 18：71，1989)、再灌注损伤(Homeister，J. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.34：17，1994)、狼疮肾炎和大疱性类 天疱疮。

与C5结合并且阻断其切割、由此减少C5a和C5b产生的抗体， 已经提出用于诸如肾小球肾炎(WO9529697)、哮喘 (WO04022096)、胶原诱导的关节炎(Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.， 92：8955，1995)和血清转移关节炎(Ji等人，Immunity，16：157，2002)等疾 病。特异性结合C5a的抗体已经提出用于成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)(WO8605692)和有害的血管内补体激活(EP245993)。对C5aR 胞外环具有反应性、由此可能降低或抑制C5a与C5aR结合的单克隆 抗体已经提出用于免疫病理疾病(WO2003062278)。

胆固醇-酯转移蛋白(CETP)是一种血浆糖蛋白，其介导胆固醇酯 (CE)和甘油三酯(TG)在高密度脂蛋白(HDL)颗粒和富含apo B的颗粒 如极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒或低密度脂蛋白(LDL)颗粒之间的交 换。CETP也转移磷酯(PL)。人CETP cDNA编码一种476个氨基 酸的蛋白质。

HDL被认为抗动脉粥样硬化，因为在HDL-胆固醇水平和冠心病 (CHD)之间已经观察到负相关(Barter P.J.和Rye K.-A.(1996) Atherosclerosis 121：1-12)。

WO 96/39168公开了一种通过刺激抑制CETP活性的免疫应答增 加HDL-c的方法。针对CETP抗原的免疫也已经在US2003/0026808 中描述。CETP多肽与“MAP”融合，并且在完全弗氏佐剂(CFA)中乳 化，用于免疫兔子。CETP肽与乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的融合也 已经在US2003/0026808中公开，但是该构建体的免疫原性尚未报 道。

发明内容

现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含至少一种CCR5胞外域 或至少一种CCR5胞外域片段的组合物和疫苗能够诱导免疫应答，特 别是抗体应答，导致抗CCR5的高抗体效价。而且，我们惊奇地发 现，本发明的分别包含至少一种CCR5胞外域或至少一种CCR5胞外 域片段的组合物和疫苗能够诱导免疫应答，特别是抗体应答，具有针 对HIV感染的保护和/或效果。这表明本发明的组合物和疫苗分 别产生的免疫应答，特别是抗体，能够在体内特异性地识别CCR5， 并且作为HIV共同受体干扰其功能。

因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有 至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二 附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是CCR5胞外域或 CCR5胞外域片段或其任意组合，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个 第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有序且 重复的抗原阵列。在本发明的一个优选实施方案中，适合在本发明中 使用的病毒样颗粒包括病毒、优选RNA噬菌体的重组蛋白、优选重 组外壳蛋白、其突变体或片段。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含：(a) 具有至少两个第一附着位点的RNA噬菌体的病毒样颗粒(VLP)；和(b) 具有至少两个第二附着位点的至少一种CCR5胞外域PNt，其中所述 CCR5胞外域PNt包含、基本由、或者由以下物质组成：(i)Nta结构 域或Nta结构域片段，和(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27(SEQ ID NO：56)的Ntb结构域或包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的Ntb 结构域片段，其中所述Nta结构域或所述Nta结构域片段的C末端与 所述Ntb结构域或所述Ntb结构域片段的N末端融合，优选直接融 合，并且其中所述至少两个第二附着位点的第一个或第二个位点包含 或者是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基，并且其中所述至少两个第二 附着位点的第一个位点位于所述SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的N 末端的上游；并且其中所述至少两个第二附着位点的第二个位点位于 所述SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的C末端的下游，优选地位于所 述CCR5胞外域PNt的C末端的下游；并且其中所述RNA噬菌体的 所述VLP和所述CCR5胞外域PNt通过至少一个非肽共价键连接。

另一方面，本发明提供一种预防和/或HIV感染的方法，其 中该方法包括给人分别施用本发明的组合物或本发明的疫苗组合物， 其中本发明的抗原是本发明的CCR5。

现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含至少一种CXCR4胞外 域或至少一种CXCR4胞外域片段的组合物和疫苗能够诱导强免疫应 答，特别是强抗体应答，导致抗CXCR4的高抗体效价。

因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有 至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二 附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是CXCR4胞外域 或CXCR4胞外域片段或其任意组合，并且其中(a)和(b)通过所述至少 一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有 序且重复的抗原阵列。在本发明的一个优选实施方案中，适合在本发 明中使用的病毒样颗粒包括病毒、优选RNA噬菌体的重组蛋白、优 选重组外壳蛋白、其突变体或片段。

现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含至少一种CETP蛋白或 至少一种CETP片段的组合物和疫苗能够诱导强免疫应答，特别是强 抗体应答，导致抗CETP的高抗体效价。

因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有 至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二 附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是CETP蛋白或 CETP片段或其任意组合，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附 着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有序且重复的 抗原阵列。在本发明的一个优选实施方案中，适合在本发明中使用的 病毒样颗粒包括病毒、优选RNA噬菌体的重组蛋白、优选重组外壳 蛋白、其突变体或片段。

现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含至少一种C5a蛋白或至 少一种C5a片段的组合物和疫苗能够诱导强免疫应答，特别是强抗体 应答，导致抗C5a的高抗体效价。而且，我们惊奇地发现，本发明的 分别包含至少一种C5a蛋白或至少一种C5a片段的组合物和疫苗能够 诱导强免疫应答，特别是强抗体应答，对其中C5a起重要作用的原发 和/或慢性炎性疾病如关节炎具有保护和/或效果。这表明本发明 的组合物和疫苗分别产生的免疫应答，特别是抗体，能够在体内特异 性地识别C5a，并且干扰其功能。

因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有 至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二 附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是C5a蛋白或C5a 片段或其任意组合，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点 和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵 列。在本发明的一个优选实施方案中，适合在本发明中使用的病毒样 颗粒包括病毒、优选RNA噬菌体的重组蛋白、优选重组外壳蛋白、 其突变体或片段。

本发明相对于使用抗C5a单克隆抗体疾病的现有技术是有利 的。单克隆抗体的缺点包括需要反复注射大量抗体(Kaplan，Curr Opin Invest.Drugs.2002；3：1017-23)。高剂量的抗体可以导致副作 用，例如输液病。在异型应答的患者中也可能产生抗-抗体，即使使用 人抗体或人源化抗体也是如此，导致疗效降低或者潜在地也导致副作 用。而且，与人源化单克隆抗体的高生产成本和需要经常前往医院有 关的费用使许多需要的患者无法采用这种抗体。

在一方面，本发明提供一种预防和/或原发和/或慢性炎性疾 病的方法，其中该方法包括给动物或人分别施用本发明的组合物或本 发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的C5a。其中C5a介 导或贡献于其病症的原发和/或慢性炎性疾病包括但不限于类风湿性关 节炎、系统性红斑狼疮、哮喘和大疱性类天疱疮。

在一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个 第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点 的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是本发明的缓激肽，并且其 中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位 点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的一个优选实 施方案中，适合在本发明中使用的病毒样颗粒包括病毒、优选RNA 噬菌体的重组蛋白、优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。

在一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个 第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点 的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是本发明的脱-Arg缓激肽， 并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二 附着位点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的一个 优选实施方案中，适合在本发明中使用的病毒样颗粒包括病毒、优选 RNA噬菌体的重组蛋白、优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。

现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含至少一种胃泌素G17、 至少一种胃泌素G17片段、胃泌素G34或至少一种胃泌素G34片段 的组合物和疫苗能够诱导强免疫应答，特别是强抗体应答，导致抗胃 泌素或前胃泌素的高抗体效价。

因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有 至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二 附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是胃泌素G17、胃 泌素G17片段、胃泌素G34或胃泌素G34片段，并且其中(a)和(b)通 过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优 选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的一个优选实施方案中， 适合在本发明中使用的病毒样颗粒包括病毒、优选RNA噬菌体的重 组蛋白、优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。

在另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物 包含至少一种本发明的抗原。而且，本发明提供一种给人或动物、优 选给哺乳动物施用该疫苗组合物的方法。本发明的疫苗组合物在不存 在至少一种佐剂的情况下能够诱导强免疫应答，特别是抗体应答。因 此，在一个优选实施方案中，该疫苗组合物不含佐剂。避免使用佐剂 可以减少不希望的炎性T细胞应答的可能的发生。

在另一方面，本发明提供包含本发明的组合物和可接受的药物载 体的药物组合物。

再另一方面，本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包 括：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一 个第二附着位点的至少一种本发明的抗原；和(c)将所述VLP与所述 至少一种本发明的抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种 抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二 附着位点连接。

发明详述

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领 域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

抗原：本文所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，则能够 被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”也包 括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液 免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然 而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或者连接 于Th细胞表位上，并且包含于佐剂中。一个抗原可能包含一个或多 个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应表示抗原优选地一般以 高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原 诱导的其它许多抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不 同抗原的混合物。

抗原性位点：术语“抗原性位点”和术语“抗原性表位”在本文中可 以互换使用，是指多肽的连续或不连续的部分，它可以被抗体或在 MHC分子环境内被T细胞受体免疫特异性地结合。免疫特异性结合 不包括非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。抗原性位点在对 于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。

本发明的抗原：本文使用的术语“本发明的抗原”是指选自下组的 抗原：a)本发明的CCR5；b)本发明的CXCR4；c)本发明的CETP； d)本发明的C5a；e)本发明的胃泌素；f)本发明的缓激肽；和g)本 发明的脱-Arg-缓激肽。

本发明的CCR5：本文使用的术语“本发明的CCR5”是指如本文 定义的至少一种CCR5胞外域、至少一种CCR5胞外域片段或其任意 组合。

CCR5胞外域：本文使用的术语“CCR5胞外域”应当包括任何包 含、基本由、或可替代地或优选地由SEQ ID NO：24的人CCR5的4 个胞外域任一或来自任何其他动物、优选哺乳动物的相应直向同源物 (ortholog)组成的多肽。而且，本文使用的术语“CCR5胞外域”也应 当包括任何包含、基本由、或可替代地或优选地由任何天然或遗传工 程变体组成的多肽，该变体与以上定义的CCR5胞外域具有70％以 上、优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、最优选 97％以上的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“CCR5胞外域”也应 当包括以上定义的CCR5胞外域的翻译后修饰，包括但不限于糖基 化、乙酰化、磷酸化。优选地，本文定义的CCR5胞外域由长度为最 多200个、更优选最多100个的氨基酸组成。典型且优选地，CCR5 胞外域能够在体内诱导特异性结合CCR5的抗体的产生。

CCR5胞外域片段：本文使用的术语“CCR5胞外域片段”应当包括 任何包含、基本由、或可替代地或优选地由本文定义的CCR5胞外域 的至少4、5个、优选地至少6、7、8、9、10、11、12、17、18、 19、20、25或30个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有65％ 以上、优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序 列同一性的多肽。优选地，本文使用的术语“CCR5胞外域片段”应 当任何包含、基本由、或可替代地或优选地由本文定义的CCR5胞外 域的至少6个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有65％以上、 优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列同一 性的多肽。优选地，本文定义的CCR5胞外域由长度为最多50个、 更优选最多30个的氨基酸组成。典型且优选地，CCR5胞外域片段能 够在体内诱导特异性结合CCR5的抗体的产生。

CCR5胞外域和/或CCR5胞外域片段的组合：术语“CCR5胞外域 和/或CCR5胞外域片段的组合”应当包括任何包含或由以上定义的 CCR5胞外域和/或CCR5胞外域片段的任意组合组成的实体。优选 地，CCR5胞外域和/或CCR5胞外域片段通过融合到一条多肽中而组 合。因此，术语“CCR5胞外域和/或CCR5胞外域片段的组合”还包括 作为间隔区的额外的氨基酸，其中所述间隔区通常不长于10个、优 选不长于6个氨基酸，并且其中所述间隔区位于两个CCR5胞外域和/ 或CCR5胞外域片段之间。

本发明的CXCR4：本文使用的术语“本发明的CXCR4”是指本文 定义的至少一种CXCR4胞外域、至少一种CXCR4胞外域片段或其 任意组合。

CXCR4胞外域：本文使用的术语“CXCR4胞外域”应当包括任何 包含、基本由、或可替代地或优选地由SEQ ID NO：28的人CXCR4 的4个胞外域任一或来自任何其他动物、优选哺乳动物的相应直向同 源物组成的多肽。而且，本文使用的术语“CXCR4胞外域”也应当包括 任何包含、基本由、或可替代地或优选地由任何天然或遗传工程变体 组成的多肽，该变体与以上定义的CXCR4胞外域具有70％以上、优 选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、最优选97％以上 的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“CXCR4胞外域”也应当包括如 上定义的CXCR4胞外域的翻译后修饰，包括但不限于糖基化、乙酰 化、磷酸化。优选地，本文定义的CXCR4胞外域由长度为最多200 个、更优选最多100个的氨基酸组成。典型且优选地，CXCR4胞外 域能够在体内诱导特异性结合CXCR4的抗体的产生。

CXCR4胞外域片段：本文使用的术语“CXCR4胞外域片段”应当 包括任何包含、基本由、或可替代地或优选地由本文定义的CXCR4 胞外域的至少4、5个、优选地至少6、7、8、9、10、11、12、17、 18、19、20、25或30个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有 65％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的氨基 酸序列同一性的多肽。本文使用的术语“CXCR4胞外域片段”应当包括 任何包含、基本由、或可替代地或优选地由本文定义的CXCR4胞外 域的至少6个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有65％以上、 优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列同一 性的多肽。优选地，本文使用的CXCR4胞外域片段由长度为最多50 个、更优选最多30个的氨基酸组成。典型且优选地，CXCR4胞外域 片段能够在体内诱导特异性结合CXCR4的抗体的产生。

CXCR4胞外域和/或CXCR4胞外域片段的组合：术语“CXCR4胞 外域和/或CXCR4胞外域片段的组合”应当包括任何包含或由以上定 义的CXCR4胞外域和/或CXCR4胞外域片段的任意组合组成的实 体。优选地，CXCR4胞外域和/或CXCR4胞外域片段通过融合到一 条多肽中组合。因此，术语“CXCR4胞外域和/或CXCR4胞外域片段 的组合”还包括作为间隔区的额外的氨基酸，其中所述间隔区通常不 长于10个、优选不长于6个氨基酸，并且其中所述间隔区位于两个 CXCR4胞外域和/或CXCR4胞外域片段之间。

本发明的C5a：本文使用的术语“本发明的C5a”是指本文定义的 至少一种C5a胞外域或至少一种C5a胞外域片段或其任意组合。

C5a蛋白：本文使用的术语“C5a蛋白”应当包括任何包含、基本 由、或可替代地或优选地由SEQ ID NO：45的人C5a或来自任何其他 动物、优选哺乳动物的相应直向同源物组成的多肽。而且，本文使用 的术语“C5a蛋白”也应当包括任何包含、基本由、或可替代地或优选 地由任何天然或遗传工程变体或来自任何其他动物的相应直向同源物 组成的多肽，所述变体与SEQ ID NO：45的人C5a具有70％以上、优 选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、最优选97％以上 的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“C5a蛋白”也应当包括如上定 义的C5a蛋白的翻译后修饰，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸 化。优选地，本文定义的C5a蛋白由长度为最多200个、更优选最多 100个的氨基酸组成。典型且优选地，C5a蛋白能够在体内诱导特异 性结合C5a的抗体的产生。

C5a片段：本文使用的术语“C5a片段”应当包括任何包含、基本 由、或可替代地或优选地由本文定义的C5a蛋白的至少4、5个、优 选地至少6、7、8、9、10、11、12、17、18、19、20、25或30个连 续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有65％以上、优选80％以上、 更优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列同一性的多肽。优选 地，本文使用的术语“C5a片段”应当包括任何包含、基本由、或可替 代地或优选地由本文定义的C5a蛋白的至少6个连续氨基酸组成的多 肽，以及任何与其具有65％以上、优选80％以上、更优选90％以上、 更优选95％以上的氨基酸序列同一性的多肽。优选地，本文使用的 C5a片段由长度为最多50个、更优选最多30个的氨基酸组成。典型 且优选地，C5a片段能够在体内诱导特异性结合C5a的抗体的产生。

本发明的CETP：本文使用的术语“本发明的CETP”是指本文定义 的至少一种CETP蛋白或至少一种CETP片段或其任意组合。

CETP蛋白：本文使用的术语“CETP蛋白”应当包括任何包含、 基本由、或可替代地或优选地由SEQ ID NO：31的人CETP或来自任 何其他动物、优选哺乳动物的相应直向同源物组成的多肽。而且，本 文使用的术语“CETP蛋白”也应当包括任何包含、基本由、或可替代 地或优选地由任何天然或遗传工程变体或来自任何其他动物的相应直 向同源物组成的多肽，所述变体与SEQ ID NO：31的人CETP具有 70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、最优 选97％以上的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“CETP蛋白”也应 当包括如上定义的CETP蛋白的翻译后修饰，包括但不限于糖基化、 乙酰化、磷酸化。优选地，本文定义的CETP蛋白由长度为最多500 个的氨基酸组成。典型且优选地，CETP蛋白能够在体内诱导特异性 结合CETP的抗体的产生。

CETP片段：本文使用的术语“CETP片段”应当包括任何包含、基 本由、或可替代地或优选地由本文定义的CETP蛋白的至少4、5 个、优选地至少6、7、8、9、10、11、12、17、18、19、20、25或 30个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与其具有65％以上、优选 80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的氨基酸序列同一性的 多肽。优选地，本文使用的术语“CETP片段”应当包括任何包含、基 本由、或可替代地或优选地由本文定义的CETP蛋白的至少6个连续 氨基酸组成的多肽，以及与其具有80％以上、优选90％以上、更优选 95％以上的氨基酸序列同一性的多肽。优选地，本文定义的CETP片 段由长度为最多50个、更优选最多30个的氨基酸组成。典型且优选 地，CETP片段能够在体内诱导特异性结合CETP的抗体的产生。

本发明的胃泌素：本文使用的术语“本发明的胃泌素”是指如本文 定义的至少一种胃泌素G17、至少一种胃泌素G17片段、至少一种前 胃泌素G34或至少一种前胃泌素G34片段，或其任意组合。

胃泌素G17：术语“胃泌素G17”应当包括任何包含、基本由、或 由SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36的人胃泌素1-17、C末端苯丙氨酸 被酰胺化的SEQ ID NO：34的胃泌素1-17或来自任何其他动物、优选 哺乳动物的相应直向同源物组成的多肽。术语“胃泌素G17”还应当包 括任何包含、基本由、或由SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36的人胃泌 素1-17、C末端苯丙氨酸被酰胺化的SEQ ID NO：34的胃泌素1-17或 来自任何其他动物的相应直向同源物组成的多肽，其中最多三个、优 选最多两个、更优选一个氨基酸被缺失、添加或置换。优选地，所述 置换是保守氨基酸置换。胃泌素G17的长度优选地不长于50个，更 优选不长于30个氨基酸。典型且优选地，胃泌素G17能够在体内诱 导产生特异性结合胃泌素的抗体。

胃泌素G17片段：本文使用的术语“胃泌素G17片段”应当包括 任何包含、基本由或由胃泌素G17的至少4、5个、优选地至少6、 7、8、9或10个连续氨基酸组成的多肽。术语“胃泌素G17片段”应 当还包括任何包含、基本由或由如上定义的胃泌素G17的片段组成的 多肽，其中至少一个氨基酸、优选地最多三个、更优选地最多两个、 更优选一个氨基酸被缺失、添加或置换。优选地，所述置换是保守氨 基酸置换。胃泌素G17片段的长度优选地不长于30个，更优选不长 于20个氨基酸。典型且优选地，胃泌素G17片段能够在体内诱导产 生特异性结合胃泌素的抗体。

前胃泌素G34：术语“前胃泌素G34”包括任何包含、基本由、或 由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37的人胃泌素1-34、C末端苯丙氨酸 被酰胺化的胃泌素1-34或来自任何其他动物、优选哺乳动物的相应直 向同源物组成的多肽。术语“前胃泌素G34”还应当包括任何包含、基 本由、或由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37的人胃泌素1-34、C末端 苯丙氨酸被酰胺化的胃泌素1-34或来自任何其他动物的相应直向同源 物组成的多肽，其中最多5个、优选最多4个、更优选最多3个、优 选最多2个、更优选一个氨基酸被缺失、添加或置换。优选地，所述 置换是保守氨基酸置换。前胃泌素G34的长度优选地不长于60个， 更优选不长于40个氨基酸。典型且优选地，前胃泌素G34能够在体 内诱导产生特异性结合前胃泌素的抗体。

前胃泌素G34片段：本文使用的术语“前胃泌素G34片段”应当包 括任何包含、基本由或由前胃泌素G34的至少6、7、8、9、10、 11、12、13或14个氨基酸组成的多肽。术语“前胃泌素G34片段”应 当还包括任何包含、基本由或由如上定义的前胃泌素G34的片段组成 的多肽，其中至少一个氨基酸、优选地最多三个、更优选最多两个、 更优选一个氨基酸被缺失、添加或置换为另一个氨基酸。优选地，所 述置换是保守氨基酸置换。前胃泌素G34片段的长度优选地不长于 40个，更优选不长于20个氨基酸。典型且优选地，前胃泌素G34片 段能够在体内诱导产生特异性结合前胃泌素的抗体。

本发明的缓激肽：本文使用的术语“本发明的缓激肽”包括任何包 含、基本由、或由SEQ ID NO：22的人缓激肽或来自任何其他动物、 优选哺乳动物的相应直向同源物组成的多肽。本文使用的术语“本发 明的缓激肽”还应当包括任何包含、基本由、或由SEQ ID NO：22的人 缓激肽或来自任何其他动物的相应直向同源物组成的多肽，其中最多 2个、优选1个氨基酸被缺失、添加或置换为另一个氨基酸。优选 地，所述置换是保守氨基酸置换。本发明的缓激肽的长度优选地不长 于30个，更优选不长于20个氨基酸。典型且优选地，本发明的缓激 肽能够在体内诱导产生特异性结合缓激肽的抗体。

本发明的脱-Arg-缓激肽：本文使用的术语“本发明的脱-Arg-缓激 肽”包括任何包含、基本由、或由SEQ ID NO：23的人脱-Arg-缓激肽 或来自任何其他动物、优选哺乳动物的相应直向同源物组成的多肽。 本文使用的术语“本发明的脱-Arg-缓激肽”还应当包括任何包含、基本 由、或由SEQ ID NO：23的人脱-Arg-缓激肽或来自任何其他动物的相 应直向同源物组成的多肽，其中最多2个、优选1个氨基酸被缺失、 添加或置换为另一个氨基酸。优选地，所述置换是保守氨基酸置换。 本发明的脱-Arg-缓激肽的长度优选地不长于30个，更优选不长于20 个氨基酸。典型且优选地，本发明的缓激肽能够在体内诱导产生特异 性结合脱-Arg-缓激肽的抗体。

联接的(associated)：本文所用的术语“联接的”(或其名词：联 接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个 分子连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共 价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共 价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、 碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。

第一附着位点：本文所用的短语“第一附着位点”是指VLP中天然 存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连 接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷 酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视 黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯)、或化学反应基如氨 基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位 点的化学反应基的一个优选的实施方案是氨基酸如赖氨酸的氨基。第 一附着位点一般位于VLP的表面上，优选位于VLP的外表面上。多 个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外 表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一 个共价键、优选通过至少一个肽键联接。在一个进一步优选的实施方 案中，第一附着位点自然存在于VLP中。可替代地，在一个优选的实 施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。

第二附着位点：本文使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于 或者人工添加到本发明的抗原上的一种元件，第一附着位点可以与之 连接。本发明的抗原的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、氨基 酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生 物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯)、 或化学反应基例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其 组合。作为第二附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是巯 基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基。本文使用的术语“具有至少一个第 二附着位点的本发明的抗原”是指包含本发明的抗原和至少一个第二 附着位点的构建体。在一个实施方案中，第二附着位点自然存在于本 发明的抗原内。在另外一个优选的实施方案中，第二附着位点被人工 添加到本发明的抗原上。在一个优选实施方案中，第二附着位点与本 发明的抗原通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键联接。在一 个优选的实施方案中，具有至少一个第二附着位点的本发明的抗原还 含有连接体，优选地所述连接体包含至少一个第二附着位点，优选 地，所述连接体与本发明的抗原通过肽键融合。

外壳蛋白：本申请中的术语“外壳蛋白”和可交换使用的术语“衣壳 蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质。典型且优选 地，术语“外壳蛋白”是指由病毒、优选RNA噬菌体的基因组或由病 毒、优选RNA噬菌体的变体的基因组编码的外壳蛋白。更优选地， 例如，术语“AP205的外壳蛋白”是指SEQ ID NO：14或其中从SEQ ID NO：14上切下第一个甲硫氨酸的氨基酸序列。更优选地，例如，术语 “Qβ的外壳蛋白”是指SEQ ID NO：1(″Qβ CP″)和SEQ ID NO：2 (A1)，其在N末端含有或不含甲硫氨酸。噬菌体Qβ的衣壳主要由Qβ CP组成，含有少量A1蛋白。

连接的：本文所用的术语“连接的”(或其名词：连接)是指所有 可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着 位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和 非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏 水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷 酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实 施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接， 优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，本 文所用的术语“连接”应当不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个 第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个 第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典 型且优选地通过使用至少一个、优选一个异双功能交联剂连接。

连接体：本文所用的“连接体”将第二附着位点与本发明的抗原联 接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或者由第二附着位点组 成。优选地，本文所用的“连接体”已经包含第二附着位点，典型且优 选地-但不是必需地-为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。本文 所用的“连接体”也被称为“氨基酸连接体”，特别是当本发明的连接体 含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语“连接体”和“氨基酸连接体” 在本文中可以交换使用。然而，这并不意味着这种连接体仅由氨基酸 残基组成，即使由氨基酸残基组成的连接体是本发明的优选的实施方 案。连接体的氨基酸残基优选地由本领域已知的天然氨基酸或非天然 氨基酸、其全L型或全D型或混合物组成。本发明的连接体的进一步 优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也 包括在本发明中。可用于本发明的其他连接体有包含C1-C6烷基-、 环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而 且，优选地包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基-或杂芳基-部分 和另外的氨基酸的连接体也可以用作本发明的连接体，并且包括在本 发明的范围内。连接体与本发明的抗原优选地通过至少一个共价键、 更优选地通过至少一个肽键联接。在本发明的抗原内不天然存在第二 附着位点的情况中，连接体与至少一个第二附着位点例如半胱氨酸优 选地通过至少一个共价键、更优选地通过至少一个肽键联接。

有序且重复的抗原阵列：本文所用的术语“有序且重复的抗原阵 列”通常是指抗原的重复模式，或者其特征在于抗原相对于病毒样颗 粒的空间排列具有典型且优选地高度的均一性。在本发明的一个实施 方案中，这种重复模式可以是几何模式。本发明的某些实施方案，例 如RNA噬菌体的VLP，是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优 选的实例，其优选地具有严格重复的类晶体抗原排列，优选间隔1-30 纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步 更优选1.6-7纳米。

包装的：本文所用的术语“包装的”是指聚阴离子大分子相对于 VLP的状态。本文所用的术语“包装”包括结合，该结合可以是共价 的，例如化学偶联，也可以是非共价的，例如离子相互作用、疏水相 互作用、氢键等。该术语也包括聚阴离子大分子的包封或部分包封。 因此，聚阴离子大分子可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合， 特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子被 包装在VLP内，最优选地以非共价的方式包装。

多肽：如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键 (也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指 特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和 蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如：糖基化、乙酰化、 磷酸化等。

重组VLP：本文使用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个 重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。本文使用的术语“重组产生的 VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的 VLP。因此，术语“重组VLP”和“重组产生的VLP”在本文中可以互 换使用，具有相同的含义。

病毒颗粒：本文使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。 在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具 有额外的结构(例如被膜、尾等)。

本文使用的病毒样颗粒(VLP)是指非复制性或非传染性的、优选 非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者是指非复制性或非传染性的、 优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒、优选病毒衣壳的结构。 本文使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所含的基因组。本文使 用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒 样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基 因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因 组已经被物理或化学灭活的病毒颗粒。典型且更优选地，病毒样颗粒 缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。本发明的病毒样 颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的一个典 型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体、优选RNA 噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单 位组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360 个和360个以上的病毒蛋白亚单位。典型且优选地，这些亚单位的相 互作用导致形成具有固有的重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构， 其中所述结构一般是球形或管状。

病毒颗粒和病毒样颗粒的一个共同特征是其高度有序且重复的亚 单位排列。

RNA噬菌体的病毒样颗粒：本文使用的术语“RNA噬菌体的病毒 样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段或者优选 地基本由其组成或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病 毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性 的，并且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的基因，一般也缺少 编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义应当也 包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，这 样也可产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。在 本申请的公开内容中，术语“亚单位”和“单体”在上下文中可互换并且 等同地使用。

一种或一个：术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外 说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。

在本申请中，如果抗体与抗原结合的结合亲和力(Ka)为106 M-1或 更高，优选107 M-1或更高，更优选108 M-1或更高，最优选109 M-1或 更高，则该抗体被定义为特异性结合。本领域技术人员可以容易地测 定抗体的亲和力(例如通过Scatchard分析)。

多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序等已知计算机 程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序、优选使用 Bestfit来确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时， 将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并 且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述 测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多 肽或其片段。

保守氨基酸置换，如本领域技术人员理解的，包括等构置换 (isosteric substitution)，该置换中氨基酸的电荷、极性、芳族、脂 族或疏水性性质得到保持。典型的保守氨基酸置换是下组之一内的氨 基酸之间的置换：Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser， Thr，Cys；Lys，Arg；Phe和Tyr。

本发明提供增强动物或人体中对本发明的抗原的免疫应答的组合 物和方法。本发明的组合物包含：(a)具有至少一个第一附着位点的病 毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原， 其中所述至少一种抗原是本发明的抗原，并且其中(a)和(b)通过所述至 少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，本 发明的抗原与VLP连接，从而形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在 本发明的优选实施方案中，至少20个，优选至少30个，更优选至少 60个，更优选至少120个，进一步更优选至少180个本发明的抗原与 VLP连接。

可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本 发明的VLP。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA 或RNA病毒已经在WO 2004/009124的第25页第10-21行，第26 页第11-28行，和第28页第4行到第31页第4行公开。这些公开的 内容在此引入作为参考。

病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中产生和纯化。 获得的用于疫苗目的的病毒或病毒样颗粒需要没有毒力。除了遗传工 程以外，还可以利用物理或化学方法灭活病毒基因组功能，如紫外线 照射、甲醛处理。

在一个优选实施方案中，VLP是重组VLP。几乎所有公知的病毒 都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员能够容 易地确定编码外壳蛋白的基因。通过在宿主中重组表达外壳蛋白制备 VLP是本领域技术人员公知的常识。

在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者由选自下组的病毒 的重组蛋白、其突变体或片段组成：a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙 型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182 (1998))或其表面蛋白(WO 92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人， Gene 160：173-178(1995))；e)辛德毕斯病毒；f)轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13： 1603-1610，(1995))；h)诺沃克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580- 1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461 (1991))；i)甲病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO 96/30523)；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白p1；l)人乳头瘤病毒(WO 98/15631)；m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和o)禽兽棚病毒。

在一个优选实施方案中，VLP包含或者由重组蛋白、其突变体或 片段的一种以上的氨基酸序列、优选两种氨基酸序列组成。包含或者 由一种以上的氨基酸序列组成的VLP在本申请中被称为嵌合VLP。

如此处使用的术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”被 定义为一种多肽，其长度分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至 少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，并且 优选地保留形成VLP的能力。优选地，该片段通过至少一个内部缺 失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。术语“重组蛋白的片段” 或术语“外壳蛋白的片段”还包括与以上定义的“重组蛋白的片段”或“外 壳蛋白的片段”分别具有至少80％，优选90％，更优选95％的氨基酸 序列同一性并且优选能够装配为病毒样颗粒的多肽。

在本发明中可以交换使用的术语“突变重组蛋白”或术语“重组蛋白 突变体”，或者在本发明中可以交换使用的术语“突变外壳蛋白”或术语  “外壳蛋白突变体”，分别是指具有野生型重组蛋白或外壳蛋白衍生的 氨基酸序列的多肽，其中该衍生的氨基酸序列与野生型序列至少 80％、优选至少85％、90％、95％、97％或99％相同，并且优选地保 留装配为VLP的能力。

在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的 病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备已经在WO 00/32227、 WO0 1/85208和WO 02/056905中公开，所有三篇文献在这里都引用 以作参考。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在WO 01/056905的第34-39页已经公开。

在本发明的一个进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入 HBcAg多肽中，来介导本发明的抗原与HBcAg的VLP的连接。在优 选的实施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO：20的氨基酸1-144、 或1-149、1-185组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其 中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly- Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。这个修饰将SEQ ID NO：20改变为 SEQ ID NO：21。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO：21的第 48和110位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1- 149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸 改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步包括分别包 含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含、或由与SEQ ID NO：21至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸 序列组成。

在一个优选实施方案中，病毒样颗粒是豇豆褪绿斑驳病毒、豇豆 花叶病毒或苜蓿花叶病毒的病毒样颗粒。产生这些病毒的VLP的方法 在US 2005/0260758和WO05067478中描述。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是RNA 噬菌体的病毒样颗粒。优选地，该RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ； b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体 MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体 f2；1)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。

在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体 的外壳蛋白、其突变体或片段，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的 氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：1；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2的混合物(涉及QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：3；(d) SEQ ID NO：4；(e)SEQ ID NO：5；(f)SEQ ID NO：6；(g)SEQ ID NO：6 和SEQ ID NO：7的混合物；(h)SEQ ID NO：8；(i)SEQ ID NO：9；(j) SEQ ID NO：10；(k)SEQ ID NO：11；(1)SEQ ID NO：12；(m)SEQ ID NO：13；和(n)SEQ ID NO：14。通常，上述外壳蛋白能够装配为 VLP，需要或不需要存在N-末端甲硫氨酸。

在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含或者由 RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列， 优选两种氨基酸序列组成。

在一个非常优选的实施方案中，VLP包含或者由RNA噬菌体的 两种不同的外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含或者 基本由或者由RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的重组外壳蛋白、 其突变体或片段组成。

在一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体Qβ的 VLP。根据本发明进一步优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒、特别是 Qβ和fr的病毒样颗粒，已经在WO02/056905中公开，其公开内容在 此引用作为参考。特别地，WO 02/056905的实施例18给出了由Qβ 制备VLP颗粒的详细描述。

在另一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体AP205 的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205 VLP的能够装配的突 变形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置换为苏氨酸、氨基酸1 4位的 天冬酰胺被置换为天冬氨酸的AP205外壳蛋白，这产生本发明的其他 优选的实施方案。WO 2004/007538，特别是在实施例1和实施例2 中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表 达和纯化。WO 2004/007538在此引入作为参考。

在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的VLP包含或者由病 毒、优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过 删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另 一个优选实施方案中，本发明的VLP包含或者由病毒、优选RNA噬 菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一 个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在一个非常优选的实施 方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体Qβ的突变外壳蛋白，其中已经 通过置换或通过删除除去了至少一个或至少两个赖氨酸残基。在一个 可替代的非常优选的实施方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体Qβ的 突变外壳蛋白，其中已经通过置换或通过插入添加了至少一个或至少 两个赖氨酸残基。在一个进一步优选的实施方案中，RNA噬菌体Qβ 的突变外壳蛋白具有选自SEQ ID NO：15-19中任一个的氨基酸序列。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物和疫苗的抗原密度为从 0.5，优选从1.0，优选从1.2，优选从1.6，优选从1.9，优选从2.2至 4.0。如本文使用的术语“抗原密度”是指VLP、优选RNA噬菌体的 VLP的每个亚单位上、优选每个外壳蛋白上连接的本发明的抗原的平 均数。因此，该值计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP、优选 RNA噬菌体的VLP的所有亚单位或单体上的平均数。

其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也显示自装 配(Kastelein，RA.等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等 人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1 986)，Adhin，MR.等人， Virology 170：238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297 (1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.5：2485- 2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271：759-773(1997))和fr (Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol. 244：279-290，(1994))的生物学和生化性质。几种RNA噬菌体的晶体 结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554 (1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰 RNA噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个反 应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在 细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原是CCR5胞外域、CCR5 胞外域片段或其任意组合。在一个优选实施方案中，至少一种抗原是 CCR5胞外域片段。在一个优选实施方案中，CCR5胞外域片段包 含、基本由或由CCR5胞外域ECL2片段、优选ECL2A组成。本领 域技术人员通常理解，ECL2A优选地从ECL2的N末端的第一个氨 基酸开始，并且优选地终止于恰在人ECL2序列中半胱氨酸之前的苏 氨酸。在一个优选实施方案中，CCR5胞外域片段包含、基本由、或 由SEQ ID NO：25组成。在一个优选实施方案中，CCR5胞外域片段 包含、基本由、或由环化的ECL2A组成。在一个进一步优选的实施 方案中，CCR5胞外域片段包含、基本由、或由环化的SEQ ID NO：25 组成。在一个进一步优选的实施方案中，CCR5胞外域片段包含、基 本由、或由环化的SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：52组成，其中该肽 通过两端的C和G残基环化。本文使用的环化的SEQ ID NO：25是指 包含、基本由、或由SEQ ID NO.25组成的氨基酸序列，其中所述氨 基酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个氨基酸残基通过至少一个化 学键，优选地通过至少一个共价键彼此相互作用。优选地，所述氨基 酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个氨基酸残基均通过共价键彼此 相互作用。优选地，所述氨基酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个 氨基酸残基通过一个肽键彼此相互作用，产生环肽。

在本发明的一个优选实施方案中，至少一种抗原是CCR5胞外域 PNt。在一个进一步优选的实施方案中，CCR5胞外域PNt包含、基本 由、或由SEQ ID NO：27组成。在一个进一步优选的实施方案中， CCR5胞外域PNt包含、基本由、或由具有另外的连接体的SEQ ID NO：27组成，该连接体优选地是半胱氨酸，与SEQ ID NO：27的C或 N末端融合，优选地与SEQ ID NO：27的C末端融合。在另一个进一 步优选的实施方案中，CCR5胞外域PNt包含、基本由、或由具有另 外的连接体的SEQ ID NO：27组成，该连接体优选地是半胱氨酸，与 SEQ ID NO：27的C或N末端融合，优选地与SEQ ID NO：27的C末 端融合，其中SEQ ID NO：27内天然存在的半胱氨酸被置换为另一个 氨基酸，优选丝氨酸。这确保了均一且确定的抗原呈递。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含：(a) 具有至少两个第一附着位点的RNA噬菌体的病毒样颗粒(VLP)；和(b) 具有至少两个第二附着位点的至少一种CCR5胞外域PNt；其中所述 CCR5胞外域PNt包含、基本由、或者由以下物质组成：(i)Nta结构 域或Nta结构域片段，和(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27(SEQ ID NO：56)的Ntb结构域或包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的Ntb 结构域片段，其中所述Nta结构域或所述Nta结构域片段的C末端与 所述Ntb结构域或所述Ntb结构域片段的N末端融合，优选直接融 合，并且其中所述至少两个第二附着位点的第一个或第二个位点包含 或者是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基，并且其中所述至少两个第二 附着位点的第一个位点位于所述SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的N 末端的上游；并且其中所述至少两个第二附着位点的第二个位点位于 所述SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的C末端的下游，优选位于所述 CCR5胞外域PNt的C末端的下游；并且其中所述RNA噬菌体的所 述VLP和所述CCR5胞外域PNt通过至少一个非肽共价键连接。

Nta结构域：本文使用的术语“Nta结构域”是指具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列或来自任何其他动物、优选灵长类动物(包括类 人猿和原猴)、更优选来自类人猿的CCR5直向同源物的相应序列的 天然Nta结构域。此外，本文使用的术语“Nta结构域”还指修饰的Nta 结构域，其中本文定义的天然Nta结构域的3个、优选2个、更优选 1个氨基酸已经通过缺失、插入和/或置换、优选地通过保守置换而修 饰，条件是由包含所述修饰的Nta结构域的本发明组合物产生的抗体 特异性结合人CCR5。

Nta结构域片段：本文使用的术语“Nta结构域片段”是指任何包 含、基本由、或由本文定义的Nta结构域的至少8个、优选地至少 9、10、11、12、13、14、15或16个连续氨基酸序列组成的多肽，条 件是由包含所述修饰的Nta结构域片段的本发明组合物产生的抗体特 异性结合人CCR5。

Ntb结构域：本文使用的术语“Ntb结构域”是指具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列或来自任何其他动物、优选灵长类动物(包括类 人猿和原猴)、更优选来自类人猿的CCR5直向同源物的相应序列的 天然Ntb结构域。此外，本文使用的术语“Ntb结构域”还指修饰的 Ntb结构域，其中本文定义的天然Ntb结构域的2个、优选1个氨基 酸已经通过缺失、插入和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条件 是由包含所述修饰的Ntb结构域的本发明组合物产生的抗体特异性结 合人CCR5。

Ntb结构域片段：本文使用的术语“Ntb结构域片段”是指任何包 含、基本由、或由本文定义的Ntb结构域的至少6个、优选地至少 7、8、9、10个连续氨基酸序列组成的多肽，条件是由包含所述修饰 的Ntb结构域片段的本发明组合物产生的抗体特异性结合人CCR5。 优选地，所述Ntb结构域片段包含、基本由、或由氨基酸序列 CQKINVK(SEQ ID NO：59)、更优选地CQKINVKQ(SEQ ID NO：60) 组成。此外，所述Ntb结构域片段包含、基本由、或由氨基酸序列 CQKINVK、更优选地CQKINVKQ组成，其中CQKINVK或 CQKINVKQ的一个氨基酸已经通过缺失、插入和/或置换、优选地通 过保守置换而修饰，条件是由包含所述Ntb结构域片段的本发明组合 物产生的抗体特异性结合人CCR5。

在一个优选实施方案中，具有至少两个第二附着位点的CCR5胞 外域PNt除了所述至少两个第二附着位点的所述第一个和第二个位点 所包含的或是所述第一个和第二个位点的两个巯基、优选地所述半胱 氨酸残基的两个巯基以外，不包含另外的半胱氨酸的巯基，优选地不 包含另外的巯基。

在一个优选实施方案中，所述至少两个第二附着位点的第一个位 点不位于Nta结构域或Nta结构域片段的N末端的上游。这确保了 Nta结构域或Nta结构域片段的N末端能够被宿主免疫系统自由接 近，因为CCR5的天然构型具有自由移动的N末端。优选地，所述至 少两个第二附着位点的第一个位点位于Nta结构域或Nta结构域片段 的C末端的下游。

在一个优选实施方案中，所述至少两个第二附着位点的第一个位 点是在所述CCR5胞外域PNt内天然存在的半胱氨酸残基。在一个优 选实施方案中，所述至少两个第二附着位点的第一个位点对应于SEQ ID NO：27的半胱氨酸残基的巯基。

在一个替代实施方案中，所述至少两个第二附着位点的第一个位 点位于所述天然存在的半胱氨酸上游1、2或3个氨基酸位置处、或 下游1或2个氨基酸位置处，其中优选地，所述至少两个第二附着位 点的所述第一个位点通过插入或将该位置处天然存在的氨基酸残基置 换为半胱氨酸而产生；并且其中优选地，PNt结构域内所述天然存在 的半胱氨酸已经缺失或置换，优选地被丝氨酸或丙氨酸置换。

在一个优选实施方案中，CCR5胞外域PNt包含、基本由、或优 选地由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中， CCR5胞外域PNt包含、基本由、或优选地由SEQ ID NO：27衍生的 氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：27的3个、优选2个、优选1个 氨基酸通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条件 是由包含所述SEQ ID NO：27衍生的氨基酸序列的本发明组合物产生 的抗体特异性结合人CCR5。

在一个优选实施方案中，所述组合物进一步包含连接体，其中所 述连接体与所述CCR5胞外域PNt的C末端融合，并且其中所述连接 体包含或者是所述至少两个第二附着位点的第二个位点。连接体可以 是不同长度的，使得Ntb结构域或Ntb结构域片段的柔性可以调节， 以便更有效地与不同的VLP偶联，或者更好地模拟天然Ntb结构域的 天然构型。

在一个优选实施方案中，连接体选自：(a)GGC；(b)GGC- CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。在一个进一 步优选的实施方案中，连接体是半胱氨酸或酰胺化的半胱氨酸。在一 个优选实施方案中，具有至少两个第二附着位点的CCR5胞外域PNt 包含、基本由、或优选地由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成。

在一个优选实施方案中，所述至少两个第二附着位点的第一个和 第二个位点与至少两个第一附着位点通过至少两个非肽共价键连接。 在一个进一步优选的实施方案中，只有所述至少两个第二附着位点的 第一个和第二个位点与至少两个第一附着位点通过至少两个非肽共价 键连接，典型且优选地形成Ntb结构域或Ntb结构域片段的“桥样”结 构。不受提出的理论的束缚，据认为这种桥样结构模拟了天然Ntb结 构域的天然构型，天然Ntb结构域的N末端与ECL3环中的另一个半 胱氨酸配合成二硫键，其C末端锚定到细胞膜上。

在一个优选实施方案中，至少两个第一附着位点包含相同的反应 性官能团。优选地，所述至少两个第一附着位点的每一个包含氨基。 更优选地，所述至少两个第一附着位点的每一个包含赖氨酸残基的氨 基。

在一个优选实施方案中，组合物还包含至少两个异双功能分子， 其中所述至少两个异双功能分子连接所述至少两个第一附着位点和所 述至少两个第二附着位点，其中优选地，所述至少两个异双功能分子 的每一个是SMPH。

在一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的病毒样颗粒是Qβ、 AP205、fr或GA。在一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的病毒样颗 粒是Qβ。至少4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP的表面 上。这种赖氨酸密度确保了在至少两个第二附着位点的另一个通过至 少一个非肽共价键连接一个第一附着位点之后，至少两个第二附着位 点之一快速发现并且连接第一附着位点。类似地，其他RNA-噬菌体 的VLP也适合本发明。

在一方面，本发明提供一种制备组合物的方法，包括：(a)提供 具有至少两个第一附着位点的RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中所述 RNA噬菌体的病毒样颗粒(VLP)包含或者由所述RNA噬菌体的外壳 蛋白、其突变体或片段组成；其中优选地所述至少两个第一附着位点 的每一个包含或者是氨基，优选赖氨酸的氨基；(b)提供具有至少两个 第二附着位点的至少一种CCR5胞外域PNt；其中所述CCR5胞外域 PNt包含、基本由、或者由以下物质组成：(i)Nta结构域或Nta结构 域片段，和(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27(SEQ ID NO：56)的 Ntb结构域或包含SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的Ntb结构域片段， 其中所述Nta结构域或所述Nta结构域片段的C末端与所述Ntb结构 域或所述Ntb结构域片段的N末端融合，优选直接融合，并且其中所 述至少两个第二附着位点的第一个或第二个位点包含或者是巯基，优 选半胱氨酸的巯基，并且其中所述至少两个第二附着位点的第一个位 点位于所述SEQ ID NO：27的氨基酸23-27的N末端的上游；并且其 中所述至少两个第二附着位点的第二个位点位于所述SEQ ID NO：27 的氨基酸23-27的C末端的下游，优选地位于所述CCR5胞外域PNt 的C末端的下游；(c)将所述RNA噬菌体的VLP和所述CCR5胞外 域PNt通过至少一个非肽共价键连接。

在一个优选实施方案中，CCR5胞外域PNt与RNA噬菌体的 VLP的外壳蛋白的分子比为8∶1至0.5∶1，优选为4∶1至1∶1，更优选 地为4∶1至2∶1，更优选地为2∶1。

在一个优选实施方案中，步骤(a)进一步包括向所述RNA噬菌体 的病毒样颗粒(VLP)中添加异双功能连接体，其中优选地所述异双功 能连接体是SMPH。优选地，SMPH与RNA噬菌体的VLP的外壳蛋 白的分子比为40∶1至2∶1，优选地为20∶1至4∶1，更优选地为10∶1。

在一个优选实施方案中，所述RNA噬菌体的VLP和所述CCR5 胞外域PNt位点的连接在离子强度不大于150mM、优选地不大于 100mM、优选地不大于75、更优选地不大于50mM的溶液中进行。

在一个优选实施方案中，RNA-噬菌体的病毒样颗粒是Qβ、 AP205、fr或GA，优选地是Qβ。

在一个优选实施方案中，CCR5胞外域PNt包含、基本由、或优 选地由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中， CCR5胞外域PNt包含、基本由、或优选地由SEQ ID NO：27衍生的 氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：27的3个、优选地2个、优选地 1个氨基酸已经通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修 饰，条件是包含所述SEQ ID NO：27衍生的氨基酸序列的本发明组合 物产生的抗体特异性结合人CCR5。

在一个优选实施方案中，具有至少两个第二附着位点的CCR5胞 外域PNt包含、基本由、或优选地由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组 成。

一方面，本发明提供一种根据本发明的方法可以获得或者优选地 已经获得的组合物。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原是CXCR4胞外域、 CXCR4胞外域片段或其任意组合。在一个优选实施方案中，CXCR4 胞外域是CXCR4的N末端胞外域。在一个优选实施方案中，CXCR4 N-末端胞外域通过其C末端与病毒样颗粒偶联。

在一个优选实施方案中，CXCR4 N-末端胞外域包含、基本由或 由SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：30衍生的氨基酸序列组成，其中 SEQ ID NO：30的3个、优选地2个、优选地1个氨基酸已经通过插 入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条件是包含所述 SEQ ID NO：30衍生的氨基酸序列的本发明组合物产生的抗体特异性 结合人CXCR4。在一个进一步优选的实施方案中，包含、基本由或 由SEQ ID NO：30组成的CXCR4 N-末端胞外域通过其C-末端与病毒 样颗粒偶联。

在一个优选实施方案中，CXCR4胞外域片段是CXCR4胞外域 ECL2片段。在一个进一步优选的实施方案中，CXCR4胞外域ECL2 片段包含、基本由、或由SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：29衍生的氨 基酸序列组成，其中SEQ ID NO：29的2个、优选地1个氨基酸已经 通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条件是包含 所述SEQ ID NO：29衍生的氨基酸序列的本发明组合物产生的抗体特 异性结合人CXCR4。在一个优选实施方案中，CXCR4胞外域ECL2 片段包含、基本由或由线性即非环化的SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：29衍生的氨基酸序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，所 述线性SEQ ID NO：29通过其N末端或C末端、优选地通过其C末端 与病毒样颗粒偶联。

在一个优选实施方案中，CXCR4胞外域片段包含或由环化的 CXCR4胞外域ECL2片段组成。在一个进一步优选的实施方案中， CXCR4胞外域片段包含、基本由、或由环化SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：29衍生的环化氨基酸序列组成。本文使用的环化SEQ ID NO：29是指包含或由SEQ ID NO.29组成的氨基酸序列，其中所述氨 基酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个氨基酸残基通过至少一个化 学键、优选地通过至少一个共价键彼此相互作用。优选地，所述氨基 酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个氨基酸残基均通过共价键彼此 相互作用。优选地，所述氨基酸序列的第一个氨基酸残基和最后一个 氨基酸残基通过一个肽键彼此相互作用，形成环肽。在一个进一步优 选的实施方案中，CXCR4胞外域ECL2片段包含或由环化SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：53组成，其中该肽通过两端的C和G残基环 化。

在一个优选实施方案中，至少一种抗原是本发明的胃泌素。在一 个实施方案中，至少一种抗原是胃泌素G17。在一个优选实施方案 中，胃泌素G17包含、基本由、或由SEQ ID NO：34组成。在一个进 一步优选的实施方案中，胃泌素G17包含、基本由、或由SEQ ID NO：36组成。在一个替代的进一步优选的实施方案中，胃泌素G17包 含、基本由、或优选地由最后一个氨基酸F被酰胺化的SEQ ID NO：34组成。

在一个优选实施方案中，至少一种抗原是本发明的前胃泌素 G34。在一个优选实施方案中，前胃泌素G34包含、基本由、或由 SEQ ID NO：35组成。在一个进一步优选的实施方案中，前胃泌素 G34包含或由SEQ ID NO：37组成。在一个替代的进一步优选的实施 方案中，前胃泌素G34包含、基本由、或优选地由最后一个氨基酸F 被酰胺化的SEQ ID NO：35组成。

在一个优选实施方案中，至少一种抗原包含、基本由、或由胃泌 素G17 1-9片段(SEQ ID NO：33)组成，优选地具有与其C末端融合 的连接序列，更优选地具有与C末端融合的连接序列SSPPPPC(SEQ ID NO：39)。

一个非常优选的实施方案中，与连接体融合的本发明的胃泌素包 含、基本由、或由SEQ ID NO：38组成。

在一个优选实施方案中，具有至少一个第二附着位点的本发明的 胃泌素包含、基本由、或由选自SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的氨基酸 序列组成。

应当指出，作为胃泌素序列一部分的序列EGPWLEEEE的第一 位置处的E可以是E、pyro E或Q。当另外的氨基酸与EGPWLEEEE 的N末端融合时，序列EGPWLEEEE的第一位置处的E可以是E或 优选地Q。

在一个优选实施方案中，本发明的至少一种抗原是CETP片段。 在一个进一步优选的实施方案中，CETP片段包含、基本由、或由具 有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的多肽或SEQ ID NO：32衍生的多肽 组成，在该衍生的多肽中SEQ ID NO：32的2个、优选地1个氨基酸 已经通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条件是 包含所述SEQ ID NO：32衍生的多肽的本发明组合物产生的抗体特异 性结合CETP，优选人CETP。

在一个优选实施方案中，至少一种抗原是C5a蛋白。在一个优选 实施方案中，C5a蛋白包含、基本由、或由具有SEQ ID NO：45的氨 基酸序列的多肽或SEQ ID NO：45衍生的多肽组成，在该衍生的多肽 中SEQ ID NO：45的5个、4个、优选3个、优选2个、优选地1个氨 基酸已经通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修饰，条 件是包含所述SEQ ID NO：45衍生的多肽的本发明组合物产生的抗体 特异性结合C5a，优选人C5a。在一个优选实施方案中，至少一种抗 原是C5a片段。在一个进一步优选的实施方案中，C5a片段包含、基 本由、或由具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的多肽或SEQ ID NO：46 衍生的多肽组成，在该衍生的多肽中SEQ ID NO：46的2个、优选地 1个氨基酸已经通过插入、缺失和/或置换、优选地通过保守置换而修 饰，条件是包含所述SEQ ID NO：46衍生的多肽的本发明组合物产生 的抗体特异性结合C5a，优选人C5a。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原是本发明的缓激肽。缓激 肽(BK，KRPPGFSPFR，SEQ ID NO：50)是一种重要的血管扩张肽，在 血压、血流和血管通透性的局部调节中起重要作用(Margolius H.S，等 人.，Hypertension，1995)。缓激通过B2-受体发挥其作用。

脱-Arg9-BK(KRPPGFSPF，SEQ ID NO：51)具有与缓激肽重叠的 和不同的功能。证据表明脱-Arg9-BK在组织损伤后快速产生，并且 调节在炎症过程中观察到的大多数事件，包括血管扩张、血管通透性 提高、血浆外渗、细胞迁移、疼痛和痛觉过敏(Calixto J.B.等人.，Pain 2000)。脱-Arg9-BK通过B1受体发挥其作用。

已经报道BK和脱-Arg9-BK在几种炎性疾病中起作用(Cruwys S.C.等人.，Br J Pharmacol，1994；Cassim B.等人.， Immunopharmacology 1997)。实验证据表明BK和脱-Arg9-BK都在哮 喘发展过程中起作用(Christiansen S.C.等人.，Am.Rev.Dis. 1992；Barnes P.J.等人.，Thorax，1992；Fuller R.W.等人，Am.Rev.Respir. Dis.，1987)。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明的缓激肽还包含与本发 明的缓激肽的N末端融合的连接体，优选地该连接序列是半胱氨酸。 在一个进一步优选的实施方案中，本发明的缓激肽还包含与本发明的 缓激肽的C末端融合的连接体，优选地该连接序列是半胱氨酸。在一 个进一步优选的实施方案中，本发明的缓激肽包含或者由SEQ ID NO：50组成。

在一个优选实施方案中，本发明的抗原是本发明的脱-Arg-缓激 肽。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的组合物还包含与本发 明的脱-Arg-缓激肽的N末端融合的连接体，优选地该连接序列是半 胱氨酸。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的组合物还包含与 本发明的脱-Arg-缓激肽的C末端融合的连接体，优选地该连接序列 是半胱氨酸。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的脱-Arg-缓激 肽包含或者由SEQ ID NO：51组成。

在另一个优选的实施方案中，至少一种抗原包含或者由本发明的 抗原的至少一个抗原性位点组成。

众所周知，具有免疫原性通常不需要全长蛋白质，一个蛋白质通 常含有一个以上的抗原性表位，即抗原性位点。一个片段或短肽可能 足以含有至少一个可被抗体或MHC分子环境内的T细胞受体免疫特 异性结合的抗原性位点。抗原性位点可以通过本领域技术人员公知的 大量技术来确定。确定蛋白质的抗原性位点的方法是本领域技术人员 公知的。WO2005/108425在第[0099]到[0103]段已经详细说明了这样 一些方法，其具体公开内容在此引入作为参考。应当指出，这些方法 通常适用于其他多肽抗原，因此不限于WO2005/108425中公开的IL- 23p19。

在本发明的一个优选实施方案中，具有至少一个第一附着位点的 VLP与具有至少一个第二附着位点的本发明的抗原通过至少一个肽键 连接。编码本发明的抗原的基因、优选编码不长于75个氨基酸、优 选不长于50个氨基酸、更优选不到30个氨基酸的本发明的抗原的基 因，符合读框地连接到编码VLP外壳蛋白的基因的内部或优选N末 端或C末端。也可以通过将本发明的抗原的序列插入部分外壳蛋白序 列已经缺失的外壳蛋白突变体(其进一步称为截短突变体)中实现融 合。截短突变体可以具有外壳蛋白的部分序列的N末端或C末端或者 内部缺失。例如，对于特异性VLP HBcAg，氨基酸79-80被替换为外 源表位。该融合蛋白优选保留了在表达后装配为VLP的能力，这可以 通过电镜检查。

可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。 甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼 序列提供额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP亚单位序列时可 能的去稳定效应，并且可减少外源表位的存在对装配的干扰。

在一个优选的实施方案中，修饰的VLP是嵌合VLP，其中优选 地，所述嵌合VLP包含或由至少一个融合蛋白和至少一个病毒外壳蛋 白组成。

在另外一些实施方案中，至少一种本发明的抗原，优选由少于50 个氨基酸组成的本发明的抗原，能够与大量其它病毒外壳蛋白融合， 例如，与Qβ的A1蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska，T.M.，等 人，Intervirology 39：9-15(1996))，或者插入CP延伸的位点72和73 之间。例如，Kozlovska等人(Intervirology，39：9-15(1996))描述了其 中的表位融合到在第19位截短的QβCP延伸区的C-末端的QβA1蛋 白融合体。作为另一个例子，本发明的抗原可以插入frCP的第2和3 位氨基酸之间(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。而且， 本发明的抗原能够与RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N末端突出β-发 夹融合(WO92/13081)。此外，本发明的抗原也可以与乳头瘤病毒的衣 壳蛋白融合，优选地与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1 融合(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378 (1999)，WO 00/23955)。将BPV-1 L1的氨基酸130-136置换为本发明 的抗原也是本发明的实施方案。将本发明的抗原与病毒的外壳蛋白、 其突变体或片段融合的实施方案已经在WO 2004/009124的第62页第 20行至第68页第17行公开，在此引入作为参考。

在另一个优选实施方案中，至少一种本发明的抗原，优选由不长 于70个氨基酸、优选不长于50个氨基酸组成的本发明的抗原，与 RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端 融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述融合蛋白还包括间隔 区，其中所述间隔区与AP205的外壳蛋白、其突变体或片段和本发明 的抗原融合。优选地，所述间隔区由不到30个、优选不到20个、更 优选不到10个、再更优选不到5个氨基酸组成。

在本发明一个优选的实施方案中，组合物含有或者基本由具有至 少一个第一附着位点的病毒样颗粒组成，该病毒样颗粒与具有至少一 个第二附着位点的至少一种本发明的抗原通过至少一个共价键连接， 优选地该共价键是非肽键。优选地，第一附着位点不包含或者不是半 胱氨酸残基的巯基。进一步优选地，第一附着位点不包含或者不是巯 基。在本发明的一个优选的实施方案中，第一附着位点包含或优选地 是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案 中，第二附着位点包含，或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。

在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点 包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附 着位点包含，或者优选地是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。

在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，一般且优选地 通过使用异双功能交联剂，将本发明的抗原与VLP连接。在优选的实 施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位 点(优选氨基，更优选赖氨酸残基的氨基)反应的官能团，和能够与 本发明的抗原固有的或人工添加的优选的第二附着位点(即巯基，优 选半胱氨酸残基的巯基)反应的另一个官能团，任选地该另一个官能 团也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包 括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo- GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其 它例如可从Pierce Chemical Company获得的、具有一个氨基反应性 官能团和一个巯基反应性官能团的交联剂。上述交联剂均导致在与氨 基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明 的另一类交联剂的特征在于偶联时在本发明的抗原与VLP之间引入二 硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP (Pierce)。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含连接体。根据本 发明的公开内容，通过连接优选包含适合作为第二附着位点的至少一 个氨基酸的连接体，实现向本发明的抗原上构建第二附着位点。因 此，在本发明的一个优选实施方案中，连接体通过至少一个共价键、 优选通过至少一个、通常一个肽键与本发明的抗原连接。优选地，连 接体包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案 中，连接体包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实 施方案中，氨基酸连接体是半胱氨酸残基。

连接体的选择在WO2005/108425A1，第32-33页公开，在此引入 作为参考。

根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接本发明的抗原与 VLP，使得本发明的抗原以定向方式与VLP偶联。连接本发明的抗原 和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联本发明的抗原 和VLP的方法。本发明的抗原也可以首先通过例如与SATA、SATP 或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在脱保护之 后，本发明的抗原可以和VLP如下所述偶联。在分离过量的硫醇化试 剂之后，本发明的抗原与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能 交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱 氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的本发明的抗原能 够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另 外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、 BS3(Pierce)或含有对VLP的胺基或羧基有反应性的官能团的其它已 知同型双功能交联剂，将本发明的抗原与VLP连接。

在本发明的其他实施方案中，组合物包含或者基本由通过化学相 互作用与本发明的抗原连接的病毒样颗粒组成，其中这些相互作用的 至少一种不是共价键。这些相互作用包括但不限于抗原-抗体相互作 用、受体-配体相互作用。VLP与本发明的抗原的连接可以通过将 VLP生物素化并且将本发明的抗原表达为链霉亲和素-融合蛋白而实 现。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的VLP由宿主重组产 生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个 进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合、 优选包装或包封于VLP内部的聚阴离子大分子。在一个进一步优选的 实施方案中，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。

基本不含宿主RNA、优选宿主核酸：本文所用的术语“基本不含 宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、优选宿主核 酸的量，该量典型且优选地为每mg VLP不到30μg，优选不到 20μg，更优选不到10μg，甚至更优选不到8μg，甚至更优选不到 6μg，甚至更优选不到4μg，最优选不到2μg。在上述内容中使用的宿 主是指在其中重组产生VLP的宿主。测定RNA、优选核酸的量的常 规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA、优选核酸的 量的典型且优选的方法在同一申请人于2005年10月5日提交的 WO2006/037787A2的实施例17中描述。对于含有Qβ以外的VLP的 本发明的组合物，测定RNA、优选核酸的量典型且优选地使用相同、 相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常 识。确定的量的数值应当典型且优选地被理解为包括指定数值± 10％、优选±5％偏差的数值。

聚阴离子大分子：本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重 复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念 上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。聚阴离子大分子的分 子量应当为至少2000道尔顿，更优选至少3000道尔顿，甚至更优选 至少5000道尔顿。本文所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地 指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优 选地不包括Toll-样受体配体，甚至更优选地不包括免疫刺激物，如 Toll-样受体配体、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更优选地，本文 所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。甚 至更优选地，术语“聚阴离子大分子”不包括免疫刺激物。本文所用的 术语“免疫刺激物”是指能够诱导和/或增强特别针对本发明中包括的抗 原的免疫应答的分子。

宿主RNA、优选宿主核酸：本文使用的术语“宿主RNA、优选宿 主核酸”或术语“具有二级结构的宿主RNA、优选宿主核酸”是指最初 由宿主合成的RNA或优选核酸。然而，RNA、优选核酸在典型且优 选地通过本发明的方法减少或去除RNA、优选核酸的量的过程中可能 经受化学和/或物理学改变，例如，RNA、优选核酸的大小可能被缩 短，或者其二级结构可能改变。但是，甚至这种得到的RNA或核酸 仍然被认为是宿主RNA，或宿主核酸。

2005年10月5日同一申请人提交的WO2006/037787A2公开了 确定VLP包含的RNA的量以及减少VLP包含的RNA的量的方法， 因此整个申请，特别是实施例4、5、17，引入本文作为参考。减少或 消除宿主RNA、优选宿主核酸的量，最小化或者减少了不希望的T 细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答，和其他不希望 的副作用，如发热，而同时保持特异性针对抗原的强抗体应答。

在一个方面，本发明提供一种含有、基本由或由本发明的组合物 组成的疫苗组合物。在一个优选实施方案中，该疫苗组合物中与VLP 连接的本发明的抗原可能来源于动物，优选哺乳动物或人。在优选的 实施方案中，本发明的抗原来源于人、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、猪 或马。

在一个优选实施方案中，该疫苗组合物进一步包含至少一种佐 剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时 或之后进行。本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激 物，或允许在宿主中产生储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗 和药物组合物结合时能够产生更强的免疫应答。

在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。本发明的 一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如 此。而且，不含佐剂使得不希望的炎性T细胞应答的发生减至最少， 炎性T细胞应答是针对自身抗原接种中的一个安全性问题。因此，优 选地给患者施用本发明的疫苗而不需在施用该疫苗之前、同时或之后 给同一患者施用至少一种佐剂。VLP通常被描述为佐剂。然而，术语 “佐剂”在本申请中使用时是指不是用于本发明组合物的VLP、而是除 所述VLP以外的佐剂。

本发明进一步公开了一种免疫方法，包括给动物或人施用本发明 的疫苗。所述动物优选的是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、 狗、大鼠、小鼠，特别是人。疫苗可以用本领域所知的各种方法给动 物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物 理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、 鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液 (例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚 乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载 体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。

如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为该疫苗是 “药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“有效量”(即产生希 望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开 内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发 明的疫苗可以诱导可与CCR5、CXCR4、胃泌素、前胃泌素、 CETP、C5a、缓激肽或脱-Arg-缓激肽结合的抗体，从而降低了它的 浓度和/或干扰它的生理学或病理学功能。

在一个方面，本发明提供一种包含、基本由、或由本发明所述组 合物和可接受的药物载体组成的药物组合物。当给个体施用本发明的 疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物效果所需 的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资 料中提供，包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol，A，ed，Mack Publishing Co，(1990))。

本发明教导了一种制备本发明的组合物的方法，该方法包括以下 步骤：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少 一个第二附着位点的本发明的抗原；和(c)将所述VLP和所述本发明 的抗原组合，产生组合物，其中所述本发明的抗原和所述VLP通过所 述第一附着位点和第二附着位点连接。在一个优选的实施方案中，提 供具有至少一个第二附着位点的至少一种本发明的抗原是通过表达， 优选地通过在细菌系统中，优选地在大肠杆菌中表达而实现的。为了 有利于纯化过程，通常添加标签，如His标签、Myc标签。在另一方 法中，特别可以化学合成具有不长于50个氨基酸的至少一种本发明 的抗原。

在一个进一步优选的实施方案中，提供具有至少一个第一附着位 点的VLP的步骤包括以下另外的步骤：(a)将所述病毒样颗粒解装配 为所述RNA噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述 外壳蛋白、其突变体或片段；(c)将所述纯化的所述RNA噬菌体的外 壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒 基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案 中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在 下实现。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或HIV感 染的方法，其中所述方法包括给人分别施用本发明的组合物或本发明 的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的CCR5。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或HIV感 染的方法，其中所述方法包括给人分别施用本发明的组合物或本发明 的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的CXCR4。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或动脉粥样 硬化的方法，其中所述方法包括给动物或人分别施用本发明的组合物 或本发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的CETP。动脉 粥样硬化是一种动脉疾病，包括但不限于冠心病、冠状动脉疾病、颈 动脉疾病和脑血管病。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或原发和/ 或慢性炎性疾病的方法，其中所述方法包括给动物或人分别施用本发 明的组合物或本发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的 C5a。其中C5a介导或贡献于其病症的原发和/或慢性炎性疾病包括但 不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘和大疱性类天疱疮。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或原发和/ 或慢性炎性疾病的方法，其中所述方法包括给动物或人分别施用本发 明的组合物或本发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的缓 激肽。其中缓激肽介导或贡献于其病症的原发和/或慢性炎性疾病包括 但不限于关节炎和哮喘。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或原发和/ 或慢性炎性疾病的方法，其中所述方法包括给动物或人分别施用本发 明的组合物或本发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的脱- Arg-缓激肽。其中脱-Arg-缓激肽介导或贡献于其病症的原发和/或慢 性炎性疾病包括但不限于关节炎和哮喘。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种预防和/或癌症、特 别是胃肠道癌症的方法，其中所述方法包括给动物或人分别施用本发 明的组合物或本发明的疫苗组合物，其中本发明的抗原是本发明的胃 泌素。胃肠道癌症包括但不限于胃癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌。

在另一方面，本发明提供用作药物的本发明的组合物，其中本发 明的抗原分别是本发明的CCR5、本发明的CXCR4、本发明的胃泌 素、本发明的CETP、本发明的C5a、本发明的缓激肽、或本发明的 脱-Arg-缓激肽。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 人类HIV感染的药物中的用途，其中所述组合物包含至少一种本 发明的CCR5。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 人类HIV感染的药物中的用途，其中所述组合物包含至少一种本 发明的CXCR4。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 动脉粥样硬化的药物中的用途，其中所述组合物包含至少一种本 发明的CETP。动脉粥样硬化是一种动脉病，包括但不限于冠心病、 冠状动脉疾病、颈动脉疾病和脑血管病。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 原发和/或慢性炎性疾病的药物中的用途，其中所述组合物包含至 少一种本发明的C5a。其中C5a介导或贡献于其病症的原发和/或慢性 炎性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘和大 疱性类天疱疮。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 原发和/或慢性炎性疾病的药物中的用途，其中所述组合物包含至 少一种本发明的缓激肽。其中缓激肽介导或贡献于其病症的原发和/或 慢性炎性疾病包括但不限于关节炎和哮喘。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 原发和/或慢性炎性疾病的药物中的用途，其中所述组合物包含至 少一种本发明的脱-Arg-缓激肽。其中脱-Arg-缓激肽介导或贡献于其 病症的原发和/或慢性炎性疾病包括但不限于关节炎和哮喘。

在一个优选实施方案中，本发明提供所述组合物在制备预防和/或 癌症、特别是胃肠道癌症的药物中的用途，其中所述组合物包含 至少一种本发明的胃泌素。胃肠道癌症包括但不限于胃癌、结肠癌、 直肠癌和胰腺癌。

附图说明

图1A显示用nG17amide或CCK8包被板并与连续稀释的小鼠血 清(免疫后14天)孵育的ELISA结果。图1B显示抑制ELISA的结 果，其中在加到包被后的板上之前，血清与连续稀释的nG17amide或 CCK8预孵育。

图2示出了在Qβ-mC5acys或QβVLP免疫的小鼠最后一次注射 胶原/CFA之后(图2A)或最后一次注射抗-胶原单克隆抗体混合物之 后(图2B)，所有肢的平均临床得分总和。x-轴表示胶原注射后的天 数，y-轴表示所有腿的临床得分的平均和。

图3示出了蛋白尿读数大于300μg/ml的用Qβ-mC5acys或Qβ VLP免疫的小鼠的百分数。

实施例

实施例1

CCR5 PNt肽或ECL2A与QβVLP的偶联

2g/l QβVLP(143μM Qβ外壳蛋白)用1.43mM SMPH(Pierce)在 25℃下衍生化30分钟，然后相对于20mM Hepes pH8，150mM NaCl 透析。0.286mM的C末端半胱氨酸被酰胺化的肽PNt-CC(SEQ ID NO：44，来自3mM在DMSO中的贮存液)和1g/l衍生化的Qβ颗粒在 25℃下孵育2小时。

作为第二种方法，2g/lQβVLP用1.43mM SMPH在25℃下衍 生化30分钟，然后相对于20mM磷酸盐pH 7.4透析。0.143mM的 C末端半胱氨酸被酰胺化的肽PNt-CC(SEQ ID NO：44，来自50mM在 DMSO中的贮存液)和1g/l衍生化的Qβ颗粒在25℃下孵育2小时。 偶联产物相对于20mM磷酸盐pH 7.4透析。

2g/l Qβ用1.43mM SMPH(Pierce)在25℃下衍生化30分钟， 然后相对于20mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl透析。0.286mM的C 末端半胱氨酸被酰胺化的肽PNt-SC(SEQ ID NO：54，来自5mM在 DMSO中的贮存液)和1g/l衍生化的Qβ颗粒在25℃下孵育2小时。 偶联产物相对于20mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl透析。

2g/l Qβ用1.43mM SMPH(Pierce)在25℃下衍生化30分钟， 然后相对于20mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl透析。0.143mM的C 末端半胱氨酸被酰胺化的肽PNt-CN(SEQ ID NO：55，来自5mM在 DMSO中的贮存液)和1g/l衍生化的Qβ颗粒在25℃下孵育2小时。 偶联产物相对于20mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl透析。

2g/l Qβ用1.43mM SMPH在25℃下衍生化30分钟，然后相对 于20mM磷酸盐pH 7.5透析。将1g/l衍生化的Qβ颗粒溶解在20％ 乙腈中，加入0.286mM环ECL2A(SEQ ID NO：26，来自5mM在 DMSO中的贮存液)，并在20mM磷酸盐pH 7.5，150mM NaCl中在 25℃下孵育2小时。偶联产物相对于20mM磷酸盐pH 7.5透析。

实施例2

免疫

C57BL/6小鼠在第0天用50μg Qβ-PNtCC、Qβ-PNtCN、Qβ- PNtSC或Qβ-ECL2A(从实施例1获得)免疫(皮下，在0.2ml 20mM 磷酸盐pH 7.5中)，并且与仅用50μg Qβ免疫的Balb/C小鼠进行比 较。在于第14天用相同疫苗加强免疫后，在第14天和第21天通过 ELISA检测抗-Qβ和抗-CCR5肽抗体滴度(表1)。

表1

此外，新西兰白兔在第0天用100μg Qβ-PNtCC(从实施例1第 二种方法获得)和相等份数(v/v)的弗氏完全佐剂免疫(真皮内，在兔 背上10个点处)。随后三次加强免疫(100μgQβ-PNtCC，在第14、 28、56天)用相等份数(v/v)的不完全弗氏佐剂进行。在第37天和第 56天通过ELISA检测抗-Qβ和抗-CCR5肽抗体滴度，发现总是高于 12000。

实施例3

多克隆小鼠或兔IgG的纯化

来自分别用Qβ-PNtCC、Qβ-PNtCN、Qβ-PNtSC或Qβ-ECL2A免 疫的5只小鼠(或两只兔)的合并的血清(从实施例4获得)以 14000rpm离心5分钟。将上清液加到3.3ml预洗的蛋白G sepharose 柱(Amersham)上。然后用PBS洗柱，用100mM甘氨酸pH 2.8洗 脱。将1ml级分收集到预先装有112μl 1M Tris pH8的试管中。合并 在280nm处具有光吸收的峰级分。

实施例4

多克隆兔IgG的亲和纯化

按照生产商的说明(GE Healthcare Europe)将1mg Qβ或Qβ- PNtCC固定在N-羟基琥珀酰亚胺活化的Sepharose柱上。以0.5 ml/min的流速将5mg兔IgG(来自实施例3)在PBS中加于Qβ亲和柱 上。收集流过级分进一步进行PNtCC特异性纯化。使用100mM甘氨 酸pH 2.6从Qβ柱上洗脱Qβ特异性IgG，并用120mM Tris pH 8中 和。流过级分中的PNtCC特异性IgG在Qβ-PNtCC柱上进一步纯 化。洗脱并中和的IgG用离心过滤装置(Amicon Ultra-4，10000 MWCO)用PBS洗4次。

实施例5

使用小鼠多克隆IgG对细胞CCR5的FACS染

CEM.NKR-CCR5是CEM.NKR细胞系的表达CCR5的变体， CEM.NKR细胞系是天然表达CD4的细胞系(Trkola等人.，J.Virol.， 1999，8966)。CEM.NKR-CCR5细胞在RPMI 1640培养基(含10％ FCS、谷氨酰胺和抗生素)中生长。将细胞沉淀，并重悬浮在含有 1％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，以得到2.3×106细胞/ml。 加入人IgG(Miltenyi Biotec)的[1∶250]稀释液作为封闭剂，并孵育20 分钟。细胞在1％FCS/PBS中洗涤一次，平板接种0.1ml(2.3×105细 胞/孔)，并与实施例3纯化的CCR5多克隆抗体(60mg/l；从蛋白G柱 上洗脱；用1％FCS/PBS稀释)孵育。在4℃下30分钟后，细胞用 1％FCS/PBS洗涤一次，在4℃下用15mg/l在1％FCS/PBS中的 FITC-山羊-抗-小鼠-IgG(Jackson)染20分钟。在1％FCS/PBS中洗 涤两次后，通过流式细胞术分析5000-10000个染的细胞。用“cell quest”流式细胞分析软件确定每次染的几何平均值。

表2显示了PNtCC或ECL2A特异性抗体特异性结合在 CEM.NKR细胞表面上表达的CCR5分子，而PNtSC和PNtCN特异 性抗体以及Qβ特异性抗体不结合在细胞表面上表达的CCR5分子。

表2

实施例6

HIV-中和试验

简要地说，用Rosette Sep混合物(StemCell Technologies Inc)将从 3个健康供血者获得的血沉棕黄层排除CD8+T细胞，并通过Ficoll- Hypaque离心(Amersham-Pharmacia Biotech)分离。用培养基(RPMI 1640，10％FCS，100U/ml IL-2，谷氨酰胺和抗生素)将细胞调节为 4×106/ml，分为三份，并用5μg/ml植物凝集素(PHA)、0.5μg/ml PHA或1mg/l抗-CD3MAb OKT3刺激。72小时后，将来自所有三个 刺激的细胞混合，并作为刺激的CD4+T细胞的来源用于感染和病毒 中和实验。

HIV中和试验基本如前所述进行(Trkola等人.，J.Virol.，1999， 8966)。R5病毒(CCR5共同受体特异株)、JR-FL和SF162在以前已经 描述(O′Brien等人.，Nature 1990，348，69；和Shioda等人.，Nature 1991， 349，167)。简言之，细胞与系列稀释的纯化的多克隆兔IgG(25μg/ml- 25ng/ml；从实施例5或实施例6获得)或阳性对照HIV抑制剂Rantes 在96-孔培养板中37℃孵育1小时。

4,000TCID50/ml(100TCID50：50％组织培养感染剂量；Trkola等人，J. Virol.，1999，8966)。加入病毒接种物(100TCID50：50％组织培养感染 剂量)，将培养板培养7天。总感染体积为200μL。然后，如以前所 述(Moore等人，1990.Science 250，1139)，利用免疫测定法测定上清液 基质中HIV-1 p24抗原的产生。

表3显示纯化的抗体在低抗体浓度(例如0.56μg/ml)时有效地 中和HIV可达70％。

表3：

抑制HIV的抗体浓度

使用CEM 5.25细胞的HIV中和试验

使用(Montefiori，D.C.(2004))所述的JR-FL包膜假型萤光素酶报 道病毒在CEM 5.25.EGFP.luc.M7细胞(Nathaniel Landau)上评价纯化 的小鼠血清免疫球蛋白样品对病毒分离株JR-FL的中和活性。在萤光 素酶报道基因试验中针对HIV、SIV和SHIV评价中和抗体(Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，12.11.1-12.11.15和Wei， X.，等人，Nature 422：307-12)。CEM 5.25.EGFP.1uc.M7细胞与连续稀释 的小鼠抗体(从实施例3获得)在37℃下孵育1小时。然后加入病 毒接种物(150 TCID50)和polybrene(终浓度为10μg/ml)。总感染 体积为200μl。通过回归分析确定72小时后萤光素酶报道基因产量 降低50％的Ig浓度(NT50)。

表4显示PNtCC特异性总IgG在低浓度时抑制HIV感染，而 PNtCN特异性IgG在测定的任何浓度下都不抑制HIV感染。

表4：

抑制HIV的抗体浓度

实施例7

Qβ-PNtCC的凝胶内消化和LC/MS分析

将Qβ-PNtCC、Qβ-PNtSC和衍生化Qβ的样品(从实施例1获 得)加样到还原SDS-PAGE凝胶上。将对应于每种肽的Qβ单体和每 种肽的Qβ二聚体(或者在衍生化的Qβ的情况下，Qβ单体和Qβ二聚 体)的凝胶带切成小片，用100μl 100mM NH4HCO3，50％乙腈洗两 次，并且用50μl乙腈洗一次。弃去所有三种上清液。然后，加入10 μl蛋白酶Glu-C(0.01ng/μl，在10mM Tris，pH 8.2中)和10μl缓冲液 (10mM Tris，pH 8.2)，在37℃下孵育过夜。贮存上清液，并将凝胶 片用100μl 0.1％三氟乙酸，50％乙腈抽提两次。混合并干燥所有三种 上清液。将样品溶解在15μl 0.1％甲酸中。将6μl注入HPLC柱上， 通过LC/MS确定肽的质量。

实施例8

CXCR4片段(aa1-39)和(aa176-185)的化学合成以及与QβVLP的 偶联

按照标准方法(Peter Henklein，Charité)化学合成具有与CXCR4片 段1-39的N末端或C末端融合的CGG或GGC连接序列的CXCR4 片段1-39(SEQ ID NO：30)，具有在CXCR4片段176-185(SEQ ID NO：29)的N末端或C末端融合的CGG或GGC连接体的CXCR4片段 176-185(SEQ ID NO：29)，其通过连接在N末端添加的C和在C末端 添加的G而环化。

3ml(1.0mg/ml)QβVLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与85 μl SMPH(50mM，在DMSO中，Pierce)在25℃下反应30分钟。然后 用透析的衍生化的QβVLP偶联肽CXCR4-CGG-1-39、CXCR4-1-39- GGC、CXCR4-CGG-176-185、CXCR4-176-185-GGC或CXCR4-C- 176-185-G。简要地说，浓度为1mg/ml的1ml衍生化的QβVLP与 70μl 5mM肽溶液在25℃下在20mM Hepes，pH 7.2中反应2小时。

估计偶联效率为每个Qβ单体0.24-0.5个CXCR4片段。

实施例9

用CXCR4片段免疫小鼠

成年雌性C57BL/6小鼠(每组3只)接种Qβ-CXCR4-片段(在实施 例8中获得)，使用QβVLP作为对照。来自每个样品的100μg透析 后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，在第0天和第1 4天皮下注射 (100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不使用或使用佐剂(Allhydrogel，1mg/ 注射)。小鼠在第14、21、28天眼眶后采血，并通过ELISA测定肽特 异性抗体应答，方法如下：以10μg/ml的浓度在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中包被与RNase偶联的CXCR4-肽，4℃过夜。简要 地说，CXCR4与RNase如下偶联：5mg/ml RNase在0.2mM SPDP (SIGMA)中室温衍生化1小时。然后用PD10柱(Amersham)纯化衍生 化的RNase溶液。向衍生化的RNase溶液中加入10mM EDTA和 1mM肽，反应液孵育1小时。

表5

显示了每组三只小鼠血清中的平均肽特异性ELISA滴度。

实施例10

通过人T-细胞系Jurkat和CEM.NKR-CCR5的表面染检测 CXCR4-特异性抗体

Jurkat细胞或CEM.NKR-CCR5细胞在添加了10％FCS、谷氨酰 胺和抗生素的RPMI 1640培养基中生长。收获细胞，洗涤，并重悬浮 在含有1％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中。为了阻止Fc-受体 介导的结合，细胞首先与大鼠-抗-小鼠-CD16/CD32(BD Pharmingen) 在PBS/1％FCS中4℃孵育30分钟。洗涤后，细胞(1×105)与连续稀 释的小鼠血清(从实施例10获得)在4℃下孵育30分钟。细胞用 PBS/1％FCS洗涤，与FITC-抗-小鼠-IgG(BD Pharmingen)在4℃下 孵育30分钟，然后用FACS Calibur分析细胞，并使用CellQuest软件 (BD Biosciences)定量抗体的特异性结合。结果总结在下表中。

表6：

*使用1∶200稀释的第一次免疫后第21天的血清进行细胞的染 。

实施例11

R4 HIV-1株中和试验

简要地说，首先用Rosette Sep混合物(StemCell Technologies Inc.， BIOCOBA AG)将从3个健康供血者获得的血沉棕黄层排除CD8+T 细胞，并通过Ficoll-Hypaque离心(Amersham-Pharmacia Biotech)收集 外周血单核细胞。然后用培养基(RPMI 1640，10％FCS，100U/ml IL-2， 谷氨酰胺和抗生素)将纯化的细胞调节为4×106/ml，分为三份样品，并 用5μg/ml植物凝集素(PHA)、0.5μg/ml PHA或1mg/l抗-CD3 MAb OKT3刺激。72小时后，将细胞混合，并作为刺激的CD4+T细胞用 于感染和病毒中和实验。

为了检测中和潜力，细胞首先与连续稀释的纯化的多克隆小鼠 IgG(如上所述)或对照抗体12G5(25μg/ml-25ng/ml；Pharmingen)在 96-孔培养板中37℃孵育1小时。

X4株NL4-3和2044如前所述(Trkola等人(1998)，J.Virol.72：396； Trkoly等人(1998)，J.Virol 72-1876)。然后加入病毒接种物(100 TCID50；50％组织培养感染剂量；Trkola等人.，J.Virol.，1999，8966)， 细胞再培养4-14天。总感染体积为200μl。在感染后的第6天，如前 所述(Moore等人.，1990.Science 250，1139)通过免疫测定法测定上清 液的HIV-1 p24抗原产量。

实施例12

CETP片段与QβVLP的偶联

具有人CETP的氨基酸461-476(SEQ ID NO：32)羧基端序列并且 在其N末端融合有用于偶联VLP的三肽CGG的CETP肽CETP1通 过固相化学法在EMC microcollections GmbH化学合成。肽在其C-末 端酰胺化。

750μl(4.0mg/ml)Qβ VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4 中的溶液与10倍过量的SMPH(21.4μl100mM在DMSO中的贮存液， Pierce)在25℃下反应30分钟。1.5ml浓度为2mg/ml的衍生化的Qβ VLP与21μl 50mM CETP肽溶液在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4中15℃反应2小时。

实施例13

用Qβ-CETP1免疫小鼠和ELISA

给雌性Balb/c小鼠(n＝3)接种与QβVLP偶联的CETP1。50μg透 析后的疫苗用PBS稀释至体积为200μl，在第0、14、50、73天皮下 注射(100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不使用佐剂。测定在第0、70、 80天眼眶后采血的小鼠血清中的抗体滴度。

CETP1与AP205 VLP偶联(20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.4)，用于包被ELISA板。简要地说，1ml 1mg/ml AP205 VLP用 7.1μl 50mM SMPH(Pierce)贮存液(在DMSO中)室温衍生化30分 钟。衍生化的AP205溶液(1ml)与7.1μl 50mM CETP1贮存液(在 DMSO中)反应，并且在15℃下孵育2小时。CETP1也与BSA偶联 以包被ELISA板。

ELISA板用浓度为5μg/ml的与AP205VLP或BSA偶联的CETP 肽在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中4℃包被过夜。

表7.在第0、14、50、73天用Qβ-CETP1免疫的小鼠的平均抗- CETP1特异性IgG抗体滴度(表示为在ELISA测定中产生半数最大 结合的血清稀释度的倒数)

表7

实施例14

与AP205VLP的C末端融合的CETP1的克隆、表达和纯化

克隆

通过退火编码CETP1肽序列并且分别含有Kpn2I和Mph1103I限 制位点的两条互补寡核苷酸产生编码CETP1肽(SEQ ID NO：32)的 DNA片段。获得的片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并且克隆到载体 pAP405-61(如WO2006/032674实施例1所述)中的相同的限制位点 内，位于大肠杆菌氨酸操纵子启动子的控制下。

所得到的质粒编码的蛋白质AP205-11-CETP1为：AP205外壳蛋 白-GTAGGGSG-FGFPEHLLVDFLQSLS。

AP205-11-CETP1基本如WO04/007538所述表达并纯化。

实施例15

在胆固醇饲养的兔动脉粥样硬化模型中检测CETP疫苗

新西兰白兔(每组n＝12)在第0天皮下接种200μg VLP-CETP疫苗 或VLP，并且在第3、6、9、12、15、19、23、27周加强免疫。在第 16周将兔置于高胆固醇饮食(0.25％)下，保持该饮食16周。以固定间 隔从禁食兔中采集血浆样品，测定抗体滴度、脂蛋白、胆固醇和 CETP活性。在第32周杀死动物，取出主动脉进行动脉粥样硬化损害 分析。在主动脉″en face″制备后，将主动脉用油红O染，并计算每 只动物中被病变覆盖的主动脉的百分比。

实施例16

缓激肽和脱-Arg9-缓激肽与QβVLP的偶联和小鼠的免疫

按照标准程序化学合成两条序列的N末端均融合有Cys的缓激肽 (BK)(SEQ ID NO：22)和脱-Arg9-缓激肽(SEQ ID NO：23)或在C末端融 合有Cys的缓激肽(BK)。这些肽与QβVLP偶联。

成年雌性C57BL/6小鼠(每组10只)在第0、14、28天皮下接 种50μg与Qβ偶联的Qβ-BK或Qβ-脱-Arg9-BK(100μl，在两腹侧)。 施用疫苗时不使用佐剂。小鼠在第0、14、21、30天眼眶后采血，并 且按照标准方法通过ELISA测定BK或脱-BK特异性抗体。

首先，BK或脱-Arg9-BK与RNase(SIGMA)偶联。用浓度为 10μg/ml的与RNase偶联的缓激肽在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中包被ELISA板，4℃过夜。

表8.在第0、14天分别用QβBK或Qβ-脱-Arg9-BK免疫的小鼠 的平均抗-BK和抗-脱-Arg9-BK特异性IgG抗体滴度(表示为稀释倍 数)

实施例17

针对Qβ-BK、Qβ-脱-Arg9-BK接种对于胶原诱导的关节炎的 效力

每组10只雄性DBA/1小鼠用50μg Qβ-BK、Qβ-脱-Arg9-BK或 单独的Qβ真皮内免疫三次(第0、14、28天)。然后给小鼠真皮内 注射两次(第34、55天)与完全弗氏佐剂混合的200μg II型牛胶 原。

在第二次胶原/CFA注射后，定期检查小鼠，按照观察到的变红 和肿胀的程度将范围为0-3的临床得分分配给每肢。第二次胶原/CFA 注射三周后，在三个实验组中确定每肢的平均临床得分。

实施例18

针对Qβ-BK和Qβ-脱-Arg9-BK接种对于变应性气管炎症 (AAI)的效力

利用变应性气管炎症的实验哮喘模型评价针对缓激肽(BK)和脱- Arg9-缓激肽(脱-Arg9-BK)接种对具有以下特征的Th2-介导的免疫应 答的效果：嗜酸性粒细胞向肺内流入，细胞因子(IL-4，IL-5，IL-13)产 生，IgE抗体和粘膜产生，支气管高反应性(BHR)。Balb/c小鼠(每组 5只)如实施例16所述用Qβ-BK或Qβ-脱-Arg9-BK免疫，或者注射 单独的Qβ。第一次免疫35天后，在存在或不存在佐剂(Alhydrogel)的 情况下给小鼠腹膜内注射50μg卵白蛋白(OVA)。10天后(即第45 天)，每日用PBS中的50μg OVA鼻内攻击所有小鼠，连续4天。最 后一次攻击24小时后，用全身体积描记器检测BHR。然后在特定时 间点处死小鼠，分析肺部炎症和Th2介导的免疫应答。用 PBS/1％BSA进行肺灌洗。支气管-肺泡灌洗液(BAL)中所含的细胞用 Coulter计数器(Instrumenten Gesellschaft AG)计数，并且如前所述利 用Maigrünwald-Giemsa染进行区分(Trifilieff A，等人.Clin Exp Allergy.2001 Jun；31(6)：934-42)。

实施例19

胃泌素或胃泌素片段与QβVLP的偶联

下列胃泌素肽按照标准程序合成。

G17(1-9)C2：pEGPWLEEEESSPPPPC(SEQ ID NO：39)

c1G17：pEGPWLEEEEEAYGWMDFGGC(SEQ ID NO：40)

nG17amide：CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO：41)

nG17-G：CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO：40)

nG34amide：

CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2 (SEQ ID NO：38)

nG34-G：

CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO：43)

随后利用透析的、衍生化的QβVLP偶联c1G17。简要地说，1 ml衍生化的QβVLP(浓度为2mg/ml)与167μl 10mM肽DMSO溶液 和100μl乙腈在15℃下反应2小时。偶联产物被命名为Qβ-c1G17。 通过密度分析考马斯蓝染的SDS-PAGE，估计偶联效率[即mol Qβ-胃泌素/mol Qβ单体(总)]为每个Qβ单体2.4个c1G17片段。

随后利用透析的、衍生化的Qβ VLP偶联nG17amide、nG17-G、 nG34amide或nG34-G。简要地说，84μl衍生化的QβVLP(浓度为 2mg/ml)与12μl 10mM肽溶液和4μl H2O在15℃下反应2小时。偶 联产物分别被命名为Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和 Qβ-nG34-G。

实施例20

G17(1-9)C2(SEQ ID NO：39)与白喉类毒素(DT)和Qβ的偶联

用于偶联G17(1-9)C2和DT的方案类似于美国专利5,866,128的 实施例1。简要地说，通过将1mg DT溶解于100μl 0.2M磷酸钠缓 冲液，pH 6.6中活化DT(List Biological Laboratories)。分别地，将2 mg SMPH溶解在80μl DMSO中。将12μl SMPH加入100μl DT 中。室温孵育2小时后，混合物相对于2L 0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0透析两次各2小时。偶联产物被命名为DT-G17(1-9)C2。

随后利用透析的、衍生化的QβVLP偶联G17(1-9)C2。简要地 说，84μl衍生化的QβVLP与6μl 10mM肽DMSO溶液和6μl H2O 在18℃下反应2小时。偶联产物被命名为Qβ-G17(1-9)C2。

实施例21

用Qβ-c1G17、Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide、 Qβ-nG34-G、Qβ-G17(1-9)C2和DT-G17(1-9)C2免疫小鼠

给成年雌性C57BL/6小鼠接种Qβ-c1G17(每组5只小鼠)、Qβ- nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G(每组3只小 鼠)。50μg Qβ-c1G17或25μg Qβ-nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ- nG34amide和Qβ-nG34-G(在实施例24中获得)用PBS稀释至体积为 200μl，并在第0、14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。施用疫苗时不 使用佐剂。作为对照，一组小鼠注射50μg Qβ。用Qβ-C1G17免疫的 小鼠在第0、14、21、28、42、69和101天眼眶后采血，用Qβ- nG17amide、Qβ-nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G免疫的小鼠 在第0、14、21、28、42、56和77天眼眶后采血。

成年雌性C57BL/6小鼠用Qβ-G17(1-9)C2(每只小鼠使用1mg明 矾或不使用明矾)和DT-G17(1-9)C2(每只小鼠使用1mg明矾)免疫 (每组5只小鼠)。50μg Qβ-G17(1-9)C2和DT-G17(1-9)C2用PBS稀 释至体积为200μl，并在第0、14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。小 鼠在第0、14天眼眶后采血。通过用在包被缓冲液(0.1M NaHCO3， pH 9.6)中浓度为10μg/ml的RNase-偶联的c1G17或nG17amide、 nG17-G、nG34smide、nG34-G在4℃下包被过夜，利用ELISA检测 针对这些胃泌素片段的特异性抗体的滴度。

表9.在第0、14天分别用Qβ-c1G17、Qβ-nG17amide、Qβ- nG17-G、Qβ-nG34amide和Qβ-nG34-G免疫的小鼠中的平均抗- c1G17-、nG17amide、nG17-G、nG34amide或nG34-G-特异性IgG抗 体滴度(表示为稀释倍数)。清楚地表明胃泌素-VLP偶联物能够诱 导针对胃泌素片段的高抗体滴度。

表9

表10显示平均G17(1-9)C2-特异性抗体滴度。ELISA滴度表示为 在ELISA测定中导致半数最大OD的血清稀释度。在使用或不使用明 矾的情况下用Qβ-G17(1-9)C2免疫的小鼠或用DT-G17(1-9)C2免疫的 小鼠中，到第14天分别达到大约1∶4242、1∶5838和1∶788的平均 滴度。半数最大OD滴度低于100，这被认为低于该测定的截止值。 这清楚地证明了Qβ-G17(1-9)C2比DT-G17(1-9)C2能够诱导更早和更 高的抗体应答。

表10

实施例22

检查针对c1G17产生的血清与CCK8的交叉反应性

ELISA板用在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中浓度为 0.2mg/ml的c1G17或CCK8(SIGMA)4℃包被过夜。来自c1G17包 被板的ELISA滴度为1250，未观察到明显的与CCK的反应性(图 1A)。

也在抑制ELISA中检查了交叉反应性。ELISA板用在包被缓冲 液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中浓度为0.2mg/ml的c1G17或CCK8 (SIGMA)4℃包被过夜。在加热器上在600rpm振荡下，将针对Qβ- c1G17(从实施例21获得)产生的小鼠血清(免疫后14天)与连续稀 释的nG17amide或CCK8在37℃下孵育2小时。然后将这些血清加 入到ELISA板中，室温孵育2小时。nG17amide预孵育抑制了血清对 包被的nG17amide的识别，未观察到CCK的抑制活性。这两个实验 显示抗Qβ-c1G17抗体不与CCK8交叉反应(图1B)。

实施例23

C5a和C5a片段与Qβ的偶联

含有N末端CGSGG连接体的鼠C5a氨基酸序列(SEQ ID NO：47， 下文称为mC5acys)由Dictagene SA化学合成。化学合成鼠C5a序列 的C末端19个氨基酸(EMC Microcollections)，其在N末端具有额外 的CGG连接体(SEQ ID NO：48，下文称为mC5acys59-77)。

143μM QβVLP在20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.2中的溶 液与2倍摩尔过量(286μM)的(SMPH，Pierce)在25℃振荡下反应30 分钟。透析后，向36μM SMPH-衍生化的QβVLP溶液中加入等摩尔 量的mC5acys。反应体积为100μl，反应液在15℃振荡下孵育2小 时。

200μM QβVLP在20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.2中的溶 液与5倍摩尔过量(1mM)的SMPH(Pierce)在25℃振荡下反应30分 钟。透析后，向107μM SMPH-衍生化的QβVLP溶液中加入5倍摩 尔过量的mC5acys59-77。反应液在15℃振荡下孵育2小时。

实施例24

用Qβ-mC5acys疫苗免疫小鼠和mC5acys-特异性抗体的检测

小鼠在第0、14天并且在需要时用50μg实施例23制备的Qβ- mC5acys疫苗皮下免疫。小鼠在第14、21天并且在随后的时间点眼 眶后或经由尾静脉采血。从这些采血中收集血清，通过C5a-特异性 ELISA进行分析。小鼠接受50μg Qβ-VLP或只接受PBS作为阴性对 照。通过在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中用1μg/ml mC5acys包被过 夜，通过ELISA检测抗-mC5acys IgG抗体滴度。

表11显示该试验的代表性结果，其中使用来自24天前用Qβ- mC5acys、单独的QβVLP免疫的或未处理的小鼠的血清。接受Qβ- mC5acys疫苗的小鼠一致性地显示针对平板包被的mC5acys的IgG抗 体应答。

表11

小鼠基本如上所述用50μg Qβ-mC5acys59-77皮下免疫。

实施例25

Qβ-mC5acys疫苗免疫中和了系统性mC5acys的体内效应

在静脉注射少量mC5acys后通过测定血液粒细胞数的表观降低， 在嗜中性白血球减少试验中检测mC5acys的体内生物活性。

将雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)麻醉并通过侧尾静脉注射100 μl溶液。小鼠接受PBS、PBS中的mC5acys或PBS中的Qβ衣壳。3 分钟后，小鼠通过眼眶后途径采血，将100μl全血转移到含有抗凝剂 肝素(Roche)的2ml PBS中。在室温下于450×g离心10分钟将细胞沉 淀。吸出上清液后，细胞沉淀物重悬浮于2ml Tris氯化铵(TAC)溶液 (17mM Tris，126mM NH4Cl，pH 7.2)中，在室温下5分钟，以裂解红 细胞。其余的细胞通过离心沉淀，重复TAC处理。其余的细胞再次 通过离心沉淀，并重悬浮于50μl流式细胞洗涤缓冲液(Dulbecco PBS，含有2％(v/v)胎牛血清和0.1％NaN3)中。细胞通过流式细胞仪 (FACSCalibur，Becton Dickenson)，通过前向和侧向散射画门(gate) 检测粒细胞的级分。

表6给出了mCa5cys诱导嗜中性白细胞减少的一个代表性实验。 在这种情况中，与PBS处理的小鼠和接受1μg Qβ衣壳蛋白的小鼠相 比，1nmol mC5acys诱导统计学上显著性的嗜中性白细胞减少，显示 合成的mC5acy具有生物活性。

C57BL/6小鼠用在Dulbecco’s PBS中稀释的50μg Qβ-mC5acys 在胁腹皮下免疫。对照小鼠接受单独的Qβ或者不予处理。免疫在实 验的第0、14天进行。第一次免疫后第22天，经侧尾静脉静脉内注 射50pmol mC5acys，以诱导系统性中性白细胞减少。在用单独的Qβ VLP免疫的小鼠中或未处理的小鼠中，在注射50pmol mC5acys后3 分钟血液中的粒细胞百分比下降。在接种Qβ-mC5acys的小鼠中，这 种血液粒细胞百分比的下降得到阻止。因此，通过用Qβ-mC5acys免 疫在小鼠中产生的抗-mC5a抗体能够中和通过静脉注射mC5acys诱导 的系统性中性白细胞减少应答(表12)。

表12

实施例26

用Qβ-mC5acys VLP免疫减轻了胶原诱导的关节炎小鼠模型中的 疾病

雄性6周龄的DBA/1JCrl小鼠(Charles River，Deutschland)在胁腹 皮下免疫50μg Qβ-mC5acys(n＝8)或50μg QβVLP(n＝8)，其均在 Dulbecco’s PBS中稀释。在第一次免疫后第15、24天皮下给予30μg Qβ-mC5a或30μg QβVLP进行另外两次加强免疫。在开始时使用玻 璃注射器将100μg II型牛胶原(MD Biosciences)与完全弗氏佐剂 (CFA)以1∶1比例乳化，用其进行免疫，之后在第35、57天通过尾 真皮内免疫小鼠。CFA由含有5mg/ml热灭活的结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)株H37RA(Difco Laboratories)的不完 全弗氏佐剂(Difco Laboratories)制备。然后通过每天检测前肢和后肢 关节厚度并且每天估计关节临床得分来监测小鼠中胶原诱导的关节炎 的诱导和严重程度。关节厚度使用张力恒定的卡钳(constant-tension caliper)来测量。临床得分基本按照下列标准给出：得分0-没有肿 胀，关节正常；得分1-指/爪轻度变红和/或肿胀；得分2-变红和/ 或肿胀，累及整个爪/关节；得分3-爪/关节严重肿胀，变形，关节 强直。持续实验观察直到最后一次胶原/VFA注射后第15天(第一次 免疫后第72天)。

表13显示最后一次胶原/VFA注射后所有肢的关节厚度的平均增 加。Qβ-mC5acys接种组的关节厚度的平均增加在大多数天里低于Qβ 对照组，在最后一次胶原/VFA注射后第5、7、10天，该差异的p值 ＜0.1(通过2-尾student t-检验)。

表13

图2a显示最后一次胶原/VFA注射后所有肢的平均临床得分总 和。Qβ-mC5acys接种组的平均临床得分总和一致性地低于QβVLP 对照，在最后一次胶原/VFA注射后的第6、8、12、14天，其差异的 p值＜0.1(通过2-尾student t-检验)，在第7、9、10天差异的其p值 ＜0.05(通过2-尾student t-检验)。该结果表明与Qβ载体接种的小鼠 相比，Qβ-mC5acys接种降低了小鼠中胶原诱导的关节炎的严重程 度。

实施例27

用Qβ-mC5acys VLP免疫减轻了抗胶原单克隆抗体混合物诱导的 关节炎小鼠模型中的疾病

雌性6-8周龄的balb/c小鼠(Charles River)在胁腹皮下免疫50μg Qβ-mC5acys(n＝5)或50μg QβVLP(n＝5)，其均在Dulbecco’s PBS 中稀释。在第一次免疫后第21和35天皮下给予50μg Qβ-mC5a或50 μg QβVLP进行另外两次加强免疫。小鼠在第一次免疫后第41天用 200μl抗胶原单克隆抗体混合物(MDBiosciences)静脉内免疫，随后在 1天后腹膜内注射100μl LPS溶液(MDBiosciences)。然后基本如实施 例26所述监测小鼠中抗胶原单克隆抗体诱导的关节炎的诱导和严重 程度。继续实验观察直到抗胶原单克隆抗体混合物注射后第14天 (第一次免疫后第55天)。

图2b示出了单克隆抗体混合物注射后所有肢的平均临床得分总 和。在Qβ-mC5acys接种组中平均临床得分总和一致性地低于Qβ VLP对照，在最后一次胶原/CFA注射后的第3、4、7、8、9、10、 11、13天，其差异的p值＜0.1(通过2-尾student t-检验)，在第12、 14天其p值＜0.05(通过2-尾student t-检验)。该结果表明与Qβ载体 接种的动物相比，Qβ-mC5acys接种降低了小鼠中抗胶原单克隆抗体 诱导的关节炎的严重程度。

实施例28

Qβ-mC5acys VLP免疫和新西兰黑/新西兰白F1杂交系统性红斑 狼疮模型

NZβ/NZW F1小鼠与人类系统性红斑狼疮非常类似地自发发展为 自身免疫病(Andrews等人.J.Exp.Med.，148：1198，1978)。雌性16周 龄的NZB/NZW F1小鼠(Charles River)在胁腹皮下免疫50μg Qβ- mC5acys(n＝20)或50μg QβVLP(n＝20)，其均在Dulbecco’s PBS 中稀释。在第一次免疫后第14和28天皮下给予50μg Qβ-mC5a或50 μg QβVLP进行另外两次加强免疫。在第5 8天给予在明矾中的50μg Qβ-mC5a或50μg QβVLP进行另外一次加强免疫。从第16周(第0 天)到第29周龄(第91天)每周使用浸渍片(Roche)通过比分析测 量尿中排泄的蛋白质的量(蛋白尿)。进一步每周测量蛋白尿，直到 52周龄，需要时通过进一步加强免疫保持高抗体滴度。

图3显示蛋白尿读数达到300mg/dL的小鼠的百分比。这些数据 显示Qβ处理组中30％的小鼠到29周龄时蛋白尿读数大于 300μg/ml。与之相比，在QβC5acys处理组中只有一只小鼠在该年龄 时的读数高于300μg/ml。通过ELISA测定，这只特定小鼠具有低 C5acys抗体滴度。该结果表明，与Qβ载体接种的动物相比，用Qβ- mC5acys接种降低了新西兰黑/新西兰白F1系统性红斑狼疮模型中蛋 白尿的发生率或延迟了其发病。