一种生物催化合成β-丙氨酸的方法

一种生物催化合成β ‑ 丙氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生物催化合成β‑丙氨酸的方法，属酶工程领域。

背景技术

β‑丙氨酸（英文名beta‑Alanine）又名β‑氨基丙酸，它是一种非蛋白质氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸，1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解产物中发现。β‑丙氨酸是一种重要的生化原料，在医药、饲料和食品领域有着广泛的应用领域和市场前景。目前，β‑丙氨酸的主要应用于合成泛酸和泛酸钙，泛酸又被称作维生素B₅，是多种代谢所必需的辅酶A的组成部分。

根据目前文献报道β‑丙氨酸的合成方法主要有以下几种：

1、化学合成法

（1）丙烯酸法（US  2376334 A，1945.05.22；US  3105092 A，1963.09.24；US  3846489 A，1974.11.05）：丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水，在较高的温度和压力下发生氨化反应，得到β‑丙氨酸。丙烯酸法副产物多，需要高温高压，丙烯酸本身的腐蚀性很强，所以反应对设备的要求较高。

(2)丙烯腈法（US 2335997 A，1943.12.07；US 2377401 A，1947.06.14）：丙烯腈与氨在高温高压下反应生成β‑氨基，然后在酸性或碱性条件下水解反应生成β‑丙氨酸。丙烯腈法使用剧毒的丙烯腈，对安全防护要求较高，反应需要高温高压，对设备要求也较高，反应收率低，由于水解过程中生成大量无机盐，产品提纯较为困难，产品纯度不高。

（3）β‑氨基法（US 2336067 A，1943.12.07；J.Am.Chem.Soc.1945,67,876～877）: β‑氨基在酸性或碱性条件下水解生成β‑丙氨酸。β‑氨基法的特点是反应产率高，缺点是β‑氨基的价格较高，造成生产成本过高，另外中和过程中会产生大量的盐，造成提取困难。

2、生物合成法

（1）丙烯酸加氨酶法（CN  1285730 C，2006.11.22）:先培养微生物产生氨基化酶，然后将氨基化酶加入烯酸和氨的水溶液的反应液中，在酶的作用下合成β‑丙氨酸，经脱氨、纯化后得β‑丙氨酸产品。该方法反应效率高，成本低，但原料丙烯酸为强腐蚀性和刺激性液体，对人员安全和设备的要求较高，目前未见有产业化应用的报道。

(2)L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶法(CN 1242054 A，2006.01.19）:以DL‑天冬氨酸为原料，在L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶法的作用下生成D‑天冬氨酸和β‑丙氨酸，然后调节pH值使D‑天冬氨酸结晶析出，从而获得β‑丙氨酸。该方法β‑丙氨酸含有少量的D‑天冬氨酸，产品的纯度不高； L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶活力低，酶促反应的效率低，原料DL‑天冬氨酸价格较高，造成β‑丙氨酸成本较高。

（3）腈水解酶法（JP 特开平10‑42886 A，2006.02.17）:利用产有机腈水解酶的微生物催化β‑氨基合成β‑丙氨酸。该法底物β‑氨基价格高，且反应浓度低，生产成本相对较高，经济效益差。

发明内容

本发明提供了一种安全、环保、高效、成本低、产品品质高的生物催化合成β‑丙氨酸的方法，彻底杜绝了传统生产工艺中剧毒、强腐蚀性、强酸强碱和高价原料的使用。

本发明达到发明目的所采用的技术方案是：

本发明所采用的微生物为大肠杆菌属菌株，在培养基上纯培养，获得两种酶：天冬氨酸酶和L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶，富马酸溶解于氨水中配制成反应的底物—富马酸铵溶液，将含酶的大肠杆菌细胞加入底物中进行酶促反应，从而生成β‑丙氨酸。

本发明所用的种子培养基为：富马酸1～10g/L，玉米浆干粉10～20g/L，多肽朊5～15g/L，味精5～10g/L，MgSO₄·7H₂O  0.2～0.5g/L，K₂HPO₄  0.15～0.25g/L，NaCl  0.1～0.5g/L，用氨水调pH6.8～7.5；发酵培养基为：富马酸5～15g/L，玉米浆干粉10～20g/L，多肽朊5～15g/L，L‑天冬氨酸5～15g/L，甜菜碱盐酸盐0.1～0.5g/L，MgSO₄·7H₂O  0.2～0.5g/L，K₂HPO₄  0.15～0.25g/L，NaCl  0.1～0.5g/L，用氨水调pH6.8～7.5。

本发明所述大肠杆菌的培养温度为28～45℃，转速150～300r/min，培养时间16～32h。

本发明所述底物的pH为6.0～7.5，底物中富马酸的浓度为50～150g/L。

本发明所述酶促反应中大肠杆菌细胞的添加量为20～50g/L。

本发明所述酶促反应的温度为32～50℃，pH为6.0～7.5。

本发明采用流加富马酸来控制反应过程中的pH。

本发明所述的一种生物催化合成β‑丙氨酸的方法，其有益效果主要体现在：

（1）反应过程中没有使用剧毒、强腐蚀性、强酸强碱原料，生产工艺安全环保；

（2）反应直接生成β‑丙氨酸，工艺简单易行；

（3）反应过程中温度为32～50℃，pH为6.0～7.5，反应条件温和；

（4）反应中无副产物和大量的盐产生，提取工艺简单，产品纯度高；

（5）原材料富马酸廉价易得，底物浓度高，产率高，生产成本低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例 1 ：含量的测定

（1）富马酸含量的测定（高效液相谱法）

酶促反应液10000r/min离心沉淀细胞，取上清液并稀释10倍，同时准备富马酸标准样品（2mg/ml），进行高效液相谱分析。

柱型号：Alltech有机酸谱柱No.88645，250mm×4.6mm

流动相：25mmol/L KH₂PO₄，pH2.5

进样量：20μl

柱温：35℃

梯度方式：恒流1.0ml/min

检测器：紫外波长210nm

计算方式：外标法

（2）β‑丙氨酸含量的测定（高效液相谱法）

分别取提取烘干的β‑丙氨酸样品和β‑丙氨酸标准样品（2mg/ml），进行高效液相谱分析。

衍生方法：准确称取0.3430g邻苯二甲醛溶于5ml无水乙醇中，然后加入0.1472g N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，用0.1mol/L的硼砂缓冲液（pH=9.5）定容到25ml，配制衍生剂避光备用。依次加入硼砂缓冲液（pH=9.5）300μl，样品溶液250μl，衍生剂250μl。混匀后等待2min（严格控制时间和试剂添加量），然后进样。

柱型号：XDB‑C8中性柱，150mm×4.6mm

流动相：A：0.05mol/L  醋酸钠缓冲液，B：甲醇

进样量：20μl

柱温：30℃

梯度方式：流动相A：流动相B=65：35，恒流1.0ml/min

检测器：紫外波长334nm

计算方式：外标法

实施例 2 ：生物催化合成β‑丙氨酸

    种子培养基：富马酸5g，玉米浆干粉10g，多肽朊10g，味精10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄  0.15g，NaCl 0.4g，加水配制成1L的溶液并用氨水调pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

 发酵培养基：富马酸20g，玉米浆干粉40g，多肽朊40g，L‑天冬氨酸20g，甜菜碱盐酸盐0.8g，MgSO₄·7H₂O  0.8g，K₂HPO₄ 0.6g，NaCl 0.4g，加水配制成4L的溶液并用氨水调pH7.0，121℃蒸汽灭菌20min。

 底物溶液：富马酸100g，用氨水调节pH7.5，定容至1L。

大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，200r/min，37℃摇床培养24h。以10%的接种量转入发酵培养基，200r/min，37℃摇床培养18h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集126g大肠杆菌湿细胞。取35g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的pH7.5，反应18h后pH保持稳定，流加富马酸64g，再继续反应，每间隔1h取样一次，用HPLC检测富马酸含量，4h后检测反应液中富马酸含量＜0.1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱，过滤，减压浓缩至原体积的1/4，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白固体101.8g，收率为80.9%，用HPLC检测β‑丙氨酸的含量为99.2%。

实施例 3 ：生物催化合成β‑丙氨酸

    种子培养基：富马酸10g，玉米浆干粉15g，多肽朊5g，味精8g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，K₂HPO₄  0.20g，NaCl 0.25g，加水配制成1L的溶液并用氨水调pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

 发酵培养基：富马酸40g，玉米浆干粉60g，多肽朊20g，L‑天冬氨酸40g，甜菜碱盐酸盐1.0g，MgSO₄·7H₂O  1.0g，K₂HPO₄ 0.8g，NaCl 1.0g，加水配制成4L的溶液并用氨水调pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

 底物溶液：富马酸80g，用氨水调节pH7.0，定容至1L。

     大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，250r/min，32℃摇床培养20h。以10%的接种量转入发酵培养基，250r/min，32℃摇床培养24h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集142g大肠杆菌湿细胞。取25g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的pH7.0，反应16h后pH保持稳定，流加富马酸68g，再继续反应，每间隔1h取样一次，用HPLC检测富马酸含量，4h后检测反应液中富马酸含量＜0.1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱，过滤，减压浓缩至原体积的1/4，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白固体85.6g，收率为75.4%，用HPLC检测β‑丙氨酸的含量为98.9%。

实施例 4 ：生物催化合成β‑丙氨酸 

种子培养基：富马酸8g，玉米浆干粉20g，多肽朊15g，味精5g，MgSO₄·7H₂O  0.5g，K₂HPO₄ 0.25g，NaCl 0.5g，加水配制成1L的溶液并用氨水调pH7.5，121℃蒸汽灭菌20min。

 发酵培养基：富马酸60g，玉米浆干粉80g，多肽朊60g，L‑天冬氨酸60g，甜菜碱盐酸盐2.0g，MgSO₄·7H₂O  2.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 2.0g，加水配制成4L的溶液并用氨水调pH7.5，121℃蒸汽灭菌20min。

 底物溶液：富马酸140g，用氨水调节pH6.5，定容至1L。

     大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，300r/min，41℃摇床培养18h。以10%的接种量转入发酵培养基，300r/min，41℃摇床培养27h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集161g大肠杆菌湿细胞。取45g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的pH6.5，反应25h后pH保持稳定，流加富马酸97g，再继续反应，每间隔1h取样一次，用HPLC检测富马酸含量，6h后检测反应液中富马酸含量＜0.1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱，过滤，减压浓缩至原体积的1/3，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白固体155.3g，收率为85.4%，用HPLC检测β‑丙氨酸的含量为99.0%。