一种禾本科植物过敏原的DNA序列和重组生产的方法

一种禾本科植物过敏原的 DNA序列和重组生产的方法

本发明涉及鉴别和确定一种草类花粉过敏原的特点，以及编码该 过敏原的重组DNA分子。梯牧草(Phleum pratense)的花粉被用作天 然的原材料。本发明也包括片段、部分序列和突变体。该重组DNA分 子和衍生的多肽、片段和变体可用于花粉变态反应疾病。而且， 通过重组方法产生的蛋白和片段可用于诊断花粉过敏原。

1型变态反应具有世界范围的重要性。在工业化国家，高达20％的 人遭受诸如过敏性鼻炎，结膜炎或支气管哮喘的困扰。这些变态反 应通过空气中存在的过敏原(空气过敏原)引起，这些过敏原由例如 植物花粉、螨、猫或狗等各种来源释放。在草类花粉的病例中，高达40％ 的1型变态反应表现为特异性IgE反应性(Friedhoff et al.，1986， 临床变态反应免疫学杂志78，1190-201)。

激发1型变态反应的物质是蛋白、糖蛋白或多肽。经粘膜吸收后， 这些过敏原与致敏人的结合在肥大细胞表面的IgE分子反应。如果2 个IgE分子经过1个过敏原彼此连接，就导致效应细胞的介导分子(例 如组胺、前列腺素)和细胞因子的释放，然后引起相应的临床症状。

根据具有抗一些过敏原的IgE抗体的变态反应患者的相对发生率， 可以看出主要过敏原和次要过敏原的差别。在梯牧草的病例中，迄今 为止，Phl p1(Petersen et al.，1993，临床变态反应免疫学杂志92， 789-796)，Phl p5(Matthiesen and Lwenstein，1991，临床实验 变态反应21，297-307；Petersen et al.，1992)，Phl p6(Petersen et al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)和Phl p2/3 (Dolecek et al.，1993，FEBS 335(3)，299-304)被描述为主要过 敏原，而Phl p4(Lwenstein et al.，1978，变态反应进展25， 1-62)以及来自黑麦草(Lolium perenne)的10和11组(Ansari et al.， 临床变态反应免疫学杂志，80，229-235)为次要过敏原。

关于本发明，Phl p4过敏原尤为重要，这是因为它具有与新抗原 相似的分子量，大约55 kDa(Fischer et al.，1996，临床变态反应 免疫学杂志98(1)，189-98)，因而最可与按照本发明产生地抗原相 比较，但在免疫学和生物化学方面明显不同。与上述提到的其他过敏 原相反，唯独Phl p4的基因或转录(cDNA)序列至今未被鉴定。对Phl p1(Laffer et al.，1994，临床变态反应免疫学杂志94，1190-98； Petersen et al.，1995，临床变态反应免疫学杂志95(5)，987-994)， Phl p5(Vrtala et al.，1993，免疫学杂志151(9)，4773-4781)， Phl p6(Petersen et al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108 (1)，55-59)和Phl p2(Dolecek et al.，1993，FEBS 335(3)， 299-304)来说，其序列资料已经得到。求助于cDNA序列，有可能产 生用于诊断和的重组过敏原(Scheiner and Kraft，1995，变态 反应50，384-391)。

对变态反应有效的经典方法是特异免疫和脱敏 (Fiebig，1995，变态反应杂志4(6)，336-339，Bousquet et al.， 1998，临床变态反应免疫学杂志102(4)，558-562)。在这些方法中， 把天然过敏原提取物以逐步增加剂量的方式给病人皮下注射。不过， 该方法必须承受变态反应甚至过敏性休克的风险。为了把这些风险降 低到最小程度，现在采用以类变应原形式的新颖制备物。与未处理过 的提取物相比，这些化学修饰的过敏原提取物，明显地降低IgE反应 性，而具有一致的T细胞反应性(Fiebig，1995，变态反应杂志4(7)， 377-382)。

通过重组方法产生的过敏原，有可能更大程度地优化方法。 通过重组方法产生高纯度的过敏原的特定合剂，如果需要与各个病人 相匹配，可以代替来源于天然过敏原的提取物，因为除了各种过敏原 外，后者还含有相对大量的免疫原性但不伴有过敏原性的蛋白。用表 达产物获得安全脱敏疗法的真实前景，可通过特异突变重组过敏原实 现，在这些过敏原中，IgE表位被特异缺失，而不损坏所须的T细 胞表位(Schramm et al.，1999，免疫学杂志162，2406-2414)。

通过方法影响过敏患者中扰乱的Th细胞平衡的另一个可能 是，用编码相关过敏原的可表达DNA。给啮齿类注射编码过敏原 的DNA，已经得到了对过敏原特异的免疫应答的初步实验证据(Hsu et al.，1996，自然医学2(5)，540-544)。

本发明优先地用于体内和体外诊断变态反应疾病，特别是花粉病。 为实现本目的，克隆的核酸被连接到一种表达载体中，然后该构建体 在一种合适的细胞类型中表达。经过生化纯化后，制备了该重组过敏 原，用于已经建立的方法检测IgE抗体。另一方面，本发明也用作特 异免疫中，含重组过敏原或含核酸的制备物的基本组分。在此方 面的应用中，存在多种可能性。首先，拥有未修饰一级结构的蛋白可 以是该制备物的一种成分。其次，通过特异缺失整个分子的IgE表位 或者产生编码T细胞表位的各个片段，可按照本发明把低变应原性(类 变应原)形式用于，以避免非所需的副作用。最后，通过核酸本 身，如果它与真核表达载体连接，可以产生一种制备物，当直接使用 时，从意义上说该制备物能修饰过敏原性免疫状态。

本发明描述一种重组的DNA分子，该DNA分子由(图1)的核酸序 列组成，编码一种过敏原。禾本科的花粉粒，例如特别是梯牧草、黑 麦草、鸭茅(Dactylis glomerata)、草地早熟禾(Poa pratensis)、 狗牙草(Cynodon dactylon)、绒毛草(Holcus lanatus)的花粉粒用 作天然的原材料。

分离和纯化所述的天然过敏原后，进行N末端的蛋白测序。依据 从蛋白推导的核酸序列，产生引物。用该引物，通过PCR、克隆并确定 特性，从花粉的cDNA库中获得相应的cDNA。根据本发明，从编码过 敏原的该DNA分子中产生片段和部分序列。

通过合适的表达载体，在细胞体系中表达该重组DNA分子或其片 段和部分序列后，纯化该过敏原或其低变应原性的变体或片段。

用二步方法，从梯牧草花粉中纯化天然过敏原。将花粉经水相提 取后，通过疏水相互作用层析法，把得到的提取物分为2个级分，过 层析柱的级分和洗脱液。过层析柱的级分含有3个过敏原，Phl p1(30-35 kDa)，Phl p2/3(11-14 kDa)和一种未知的过敏原(55-60 kDa)。这 些蛋白可从另一种用Superdex 75的凝胶过滤法中分离出来。

至此，该未知过敏原(工作名为p55)通过SDS-PAGE法分离出来， 接着印迹到PVDF膜上，分离得到精制的级分。经Edman降解法测定该 p55分子的N末端的氨基酸序列。

为了产生和克隆p55相对应的cDNA，按照本发明构建了一条基于 该N末端序列(图3)的特异DNA引物(21mer)。第2条所用的引物 是一种锚定序列，该序列定位在用于反转录寡-dT引物中。用来自梯牧 草花粉的代表性mRNA体产生的cDNA和按照本发明的引物以及所述 的锚定引物，在严格条件下进行PCR反应。在PCR反应物的分析性凝 胶电泳中，鉴别出了一条大小为1.65kb的扩增DNA。把该扩增的DNA 连接到pCR2.1载体中，并成功地转化。对2个不同克隆插入片段的测 序得到一致的序列。

在这种初始扩增的DNA中，鉴别出了1个1492bp的可读框(ORF) (见图1)。

为了从所述的核酸中产生相应的重组蛋白(图4)，首先用限制性 内切酶把pCR2.1载体重新克隆到表达载体pProEx Htb中。该表达产 物表达并经生化纯化后，对该产生的具有过敏原性质的蛋白进行了多 种分析。在所有的分析中，例如蛋白印迹法和点印迹法，重组蛋白与 来自被诊断为草类花粉变态反应临床症状的病人的IgE特异地反应。 所用的对照蛋白是天然的p55。因此，该重组蛋白显然是一种过敏原。 这样，本表达产物被用于对草类花粉变态反应患者的高度特异改进的 诊断方法中。

为了产生低变应原性变体以改进用途，按照本发明从克隆到 表达载体中的核酸开发了确定片段和部分序列的组合。此外，导入了 特异定点突变，优选地在编码半胱氨酸的三联体中导入。因此，本发 明的这部分内容与开发用于诊断目的的本发明内容不同点，在于降低 或缺乏IgE反应性。这样，由于减低(lacuna)而明显低或没有副作 用的制备物，可用于脱敏。如果编码低变应原性蛋白变体的核酸 或编码p55的未修饰核酸与一种人表达载体相连接，这些构建体同样 能用作特异免疫的制备物。

因此，本发明的内容是：

a)一种重组DNA分子，该DNA分子含有一种编码作为过敏原的多

肽的核苷酸序列，优选地由禾本科(Gramineae)(禾本科

(Poaceae))和单子叶植物表达；

b)一种所示的具有来源于梯牧草核苷酸序列的DNA分子；

c)一种如图1所示的DNA分子的核苷酸序列；

d)一种含有如下核苷酸序列的DNA分子，所述的核苷酸序列能与

上面提到的图1中描述的核苷酸序列杂交；

e)按照c)或d)项所述的核苷酸序列的部分序列和部分序列的组 合； f)一种含有如a)-d)所述的核苷酸序列的DNA分子，该DNA分 子可通过单个密码子的特异突变和消除或添加而修饰； g)一种按照c)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫 调节T细胞反应片段； h)一种按照d)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫 调节T细胞反应片段； i)一种按照e)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫 调节T细胞反应片段； j)一种按照f)所述的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种免疫 调节T细胞反应片段； k)一种重组DNA表达载体或克隆体系，该载体或体系包括在a)- d)中描述重组DNA分子，它与一种表达控制序列有功能地相连接； 1)一种由按照c)所述的核酸编码的多肽； m)一种由按照d)所述的核酸编码的多肽； n)一种由按照e)所述的核酸编码的多肽； o)一种由按照f)所述的核酸编码的多肽； p)一种由按照g)所述的核酸编码的多肽； q)一种由按照h)所述的核酸编码的多肽； r)一种由按照i)所述的核酸编码的多肽； s)一种由按照j)所述的核酸编码的多肽； t)一种生产多肽、片段或其衍生物的方法，该方法培养已被权利 要求11的表达载体转化的单核或真核细胞，然后从培养物中分离 相应的蛋白或多肽； u)一种应用按照1)-n)所述的多肽，体内或体外诊断花粉变态 反应的方法； v)一种药学制备物，该制备物包括按照1)-n)所述的多肽、片 段或衍生物，用于患花粉变态反应的人类或动物； w)一种使用v)中描述的药学制备物，患花粉变态反应的人 类或动物的方法； x)一种通过使用k)中描述的构建体DNA免疫接种，花粉变 态反应的方法； y)一种通过使用k)中描述的含有免疫刺激DNA片段的构建体DNA 免疫接种，花粉变态反应的方法。 因此，本发明作为病人特异的分辨过敏原组分敏感谱的鉴别部分， 用于改进体外诊断方法。同样地，本发明也用于生产免疫草类 花粉过敏原患者而明显改进的的制备物。

                           序列表 <110>Merck Patent GmbH <120>DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung eines

 Graminaen-Allergens <130>DNA-Sequenz <140> <l41> <160>4 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>1187 <212>DNA <213>禾本科 <214> <400>1 gggaagaagg aggagaagaa ggaggagaag aaggagagtg gagatgctgc gtccggggcc 60 gacggaacct acgacatcac caagctcggc gccaaacccg acggcaagac ggactgcacc 120 aaggaggtgg aggaggcatg ggcttcggct tgcggtggta ccgggaagaa tacgatcgtc 180 atccccaagg gtgatttcct gaccgggcct ctgaatttca ccgggccatg caagggcgac 240 agcgtcacca tcaagctgga cggcaacctg ctgagctcca acgacctggc caagtacaag 300 gctaactgga tcgagatcat gcggatcaag aaactcacta tcaccggcaa aggcacgctc 360 gacggccaag gcaaggccgt gtggggcaag aacagctgcg ccaagaacta caactgcaag 420 atcttgccaa acacattggt gctggacttc tgtgacgacg ctctcatcga aggcatcacc 480 ctcctaaacg ccaagttctt ccatatgaac atctacgagt gcaagggcgt gaccgtcaag 540 gacgtgacca tcaccgcgcc cggggacagc cccaacaccg acggcatcca catcggcgac 600 tcgtccaagg tcaccatcac cgacaccacc atcggcaccg gcgacgactg catctccatc 660 ggccccggaa gcaccggcct caacatcacc ggcgtgacct gcggtccagg ccacggcatc 720 agcgttggca gcctgggacg gtacaaggac gagaaggacg tgaccgacat caccgtaaag 780 aactgcgtgc tcaagaagtc caccaacggc ctccggatca agtcgtacga ggacgccaag 840 tcgccgctga cggcgtcgaa gctgacctac gagaacgtga agatggagga cgtgggctac 900 cccatcatca tcgaccagaa gtactgcccc aacaagatct gcacctccaa gggagactcc 960 gccagggtca ccgtcaagga cgtcaccttc cgcaacatca ccggcacctc ctccaccccc 1020 gaggccgtca gcctgctctg ctccgacaag cagccctgca atggtgtcac catgaacgac 1080 gtcaagatcg agtacagcgg caccaacaac aagaccatgg ctgtctgcac caacgccaag 1140 gtcaccgcca agggtgtcag cgaggctaac acctgcgccg cctgatg               1187 <210>2 <211>20 <212>PRT <2l3>Künstliche Sequenz <214>人工序列 <220> <223>人工序列描述：p55特异性引物 <400>2 Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Glu Ser Gly Asp Ala   1               5                  10                  15 Ala Ser Xaa Ala

         20 <210>3 <211>26 <212>DNA <213>Künstliche Sequenz <214>人工序列 <220> <223>人工序列描述：p55特异性引物 <220> <221>变体 <222>(3) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(6) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(9) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(12) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(15) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(18) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(21) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <220> <221>变体 <222>(24) <223>n＝次黄嘌呤核苷 <400>3 ggnaanaang anganaanaa nganga                                     26 <210>4 <211>394 <212>PRT <213>禾本科 <400>4 Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Set Gly Asp Ala   1               5                  10                  15 Ala Ser Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Thr Lys Leu Gly Ala Lys

         20                  25                  30 Pro Asp Gly Lys Thr Asp Cys Thr Lys Glu Val Glu Glu Ala Trp Ala

     35                  40                  45 Ser Ala Cys Gly Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ile Val Ile Pro Lys Gly

 50                  55                  60 Asp Phe Leu Thr Gly Pro Leu Asn Phe Thr Gly Pro Cys Lys Gly Asp  65                  70                  75                  80 Ser Val Thr Ile Lys Leu Asp Gly Asn Leu Leu Ser Ser Asn Asp Leu

             85                  90                  95 Ala Lys Tyr Lys Ala Asn Trp Ile Glu Ile Met Arg Ile Lys Lys Leu

        100                 105                 110 Thr Ile Thr Gly Lys Gly Thr Leu Asp Gly Gln Gly Lys Ala Val Trp

    115                 120                 125 Gly Lys Asn Ser Cys Ala Lys Asn Tyr Asn Cys Lys Ile Leu Pro Asn

130                 135                 140 Thr Leu Val Leu Asp Phe Cys Asp Asp Ala Leu Ile Glu Gly Ile Thr 145                 150                 155                 160 Leu Leu Asn Ala Lys Phe Phe His Met Asn Ile Tyr Glu Cys Lys Gly

            165                 170                 175 Val Thr Val Lys Asp Val Thr Ile Thr Ala Pro Gly Asp Ser Pro Asn

        180                 185                 190 Thr Asp Gly Ile His Ile Gly Asp Ser Ser Lys Val Thr Ile Thr Asp

    195                 200                 205 Thr Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Gly Pro Gly Ser

210                 215                 220 Thr Gly Leu Asn Ile Thr Gly Gly Ala Cys Gly Pro Gly His Gly Ile 225                 230                 235                 240 Ser Val Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Lys Asp Glu Lys Asp Val Thr Asp

            245                 250                 255 Ile Thr Val Lys Asn Cys Val Leu Lys Lys Ser Thr Asn Gly Leu Arg

        260                 265                 270 Ile Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Lys Ser Pro Leu Thr Ala Ser Lys Leu

    275                 280                 285 Thr Tyr Glu Asn Val Lys Met Glu Asp Val Gly Tyr Pro Ile Ile Ile

290                 295                 300 Asp Gln Lys Tyr Cys Pro Asn Lys Ile Cys Thr Ser Lys Gly Asp Ser 305                 310                 315                 320 Ala Arg Val Thr Val Lys Asp Val Thr Phe Arg Asn Ile Thr Gly Thr

            325                 330                 335 Ser Ser Thr Pro Glu Ala Val Ser Leu Leu Cys Ser Asp Lys Gln Pro

        340                 345                 350 Cys Asn Gly Val Thr Met Asn Asp Val Lys Ile Glu Tyr Ser Gly Thr

    355                 360                 365 Asn Asn Lys Thr Met Ala Val Cys Thr Asn Ala Lys Val Thr Ala Lys

370                 375                 380 Gly Val Ser Glu Ala Asn Thr Cys Ala Ala 385                 390