利用靶向TGF-β抑制的三阴性乳腺癌的

本公开一般涉及用于被诊断为三阴性乳腺癌(TNBC)的对象的方法，其涉及识别可能响应经由使用抗TGFβ剂的靶向TGFβ抑制的的对象，并且利用该抗TGFβ剂该对象。

TNBC是乳腺癌肿瘤的异质性组，通常通过肿瘤的免疫组织化学诊断为根本不表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)，并且不过度表达激素表皮生长因子受体2(HER-2)。TNBC是一种侵略型的癌症，与不良预后相关联。由于肿瘤细胞缺乏必需的受体，因此像激素疗法和针对雌激素、孕激素和HER-2的药物的常规无效。多柔比星(doxorubicin)是用于许多恶性肿瘤(包括局部晚期和复发性或转移性TNBC)的护理标准的DNA损伤剂；与其他类型的乳腺癌相比，对多柔比星的响应令人沮丧。

改善TNBC疗法的最新努力集中在基于基因表达谱根据4(Lehmann,J.Clin.Invest.(2011)121:2750–2767)或6((Burstein,Clin.Canc.Res.(2014)21:1688–1698)种亚型对TNBC肿瘤类型进行分类：BL1(基底细胞样1型)，BL2(基底细胞样2型)，LAR(管腔雄激素受体型)，M(间质型)，IM(免疫调节型)和MSL(间质干细胞样型)。一种有希望的途径是在具有BRCA1/2突变的患者中使用PARP抑制剂，该组患者占TNBC患者的10-20％。该患者亚组属于BL1亚型，针对其也已提出了其他疗法，例如CDK抑制剂和紫杉烷类。BL2亚型(占TNBC的22％)包括富集生长因子信号传导的基因，这表明生长因子抑制剂(包括激酶抑制剂)是该组的潜在疗法。顾名思义，LAR亚型包含雄激素受体基因，因此，抗雄激素是该组中的潜在疗法。已经提出了靶向间质通路的药物，例如c-Met抑制剂、TGFβ抑制剂和Wnt抑制剂，作为M亚型的潜在疗法。最后，检查点抑制剂(CPI)对于IM组可能是好的选择，因为该组富含免疫过程中涉及的基因。许多靶向剂正在接受临床试验，大多数情况下是针对未选定的TNBC患者。

然而，由于迄今为止缺乏配对的生物标志物和相关的靶向疗法，精确医学对于TNBC的应用受到了限制。尽管在文献中已经描述了TNBC亚型，但是在这种疾病中由前瞻性生物标志物驱动的临床试验仍然不常见。对特定敏感的患者亚组的识别可以导致对生物标志物阳性患者的更有效，同时避免对生物标志物阴性患者进行不必要的(及其潜在的副作用)。这样的靶向可以改善TNBC患者的选择。本公开识别与对TGFβ阻断剂和/或CPI的响应相关联的生物标志物。预计生物标志物阳性患者比生物标志物阴性患者更有可能对疗法产生响应。

美国专利申请公开号US 20150225483 A1，其通过引用纳入本文，描述了一个双官能性融合蛋白，其结合抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体及作为TGFβ中和“阱”的肿瘤生长因子贝塔受体II型(TGFβRII)的胞外可溶性域成为一个单分子。具体地，该蛋白是一个异四聚体，由抗PD-L1的两条免疫球蛋白轻链和两条重链构成，所述两条重链包含抗PD-L1重链和通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头与之基因融合的人TGFβRII胞外域(参见图1)。此抗PD-L1/TGFβ阱分子被设计为靶向肿瘤微环境中的两个主要免疫抑制机制。美国专利申请公开号US20150225483 A1记载了按照基于患者体重的剂量进行该阱分子的给药。

本公开提供了用于诊断为TNBC的对象的方法，其中首先确定该对象的高迁移率组蛋白AT-钩2(high mobility group AT-hook 2)(HMGA2)和/或MDS1和EVI1复合基因座(complex locus)蛋白EVI1(MECOM)相对于已知的对照表达水平具有增加的表达水平，然后将抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质施用于该对象。

为了对诊断为TNBC的患者进行有效，本发明提供了为确定为HMGA2或MECOM相对于已知表达水平具有增加的表达水平的患者TNBC的方案，并且改善了TNBC患者的疾病预后和总体生存期。

一方面，本发明提供了一种或管理对象的TNBC的方法，该方法通过向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而对象的TNBC。

另一方面，本发明提供了一种实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，该方法通过向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应。

另一方面，本发明提供了识别适合于利用抗TGFβ剂或管理对象的TNBC的对象的方法，该方法包含确定对象的高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)的水平，其中在该对象中HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平的增加的表达水平将该对象识别为适合于利用抗TGFβ剂TNBC。

在某些实施方式中，本公开提供了或管理对象的TNBC的两步方法，其中第一步涉及识别HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象，并且第二步涉及将抗TGFβ剂施用于已被确定为具有增加的HMGA2或MECOM水平的对象，从而对象的TNBC。

在某些实施方式中，本公开提供了实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的两步方法，其中第一步涉及识别HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象，并且第二步涉及将抗TGFβ剂施用于已被确定为具有增加的HMGA2或MECOM水平的对象，从而实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应。

在某些实施方式中，本公开提供了识别对于利用抗TGFβ剂对象的TNBC有响应的对象的方法，其中确定对象的HMGA2或MECOM的水平，并且其中在该对象中HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平的增加的表达水平将该对象识别为适合于利用抗TGFβ剂TNBC。

在本发明的各个方法中，通过分析源自患者的组织样本确定对象的HMGA2或MECOM水平。在某些实施方式中，组织样本是活检样本、血液、血清或血浆样本。

在本发明的各个方法中，通过免疫化学或通过RNA表达分析确定HMGA2或MECOM水平。

在一些实施方式中，抗TGFβ剂是在TNBC患者的中使用的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区；其中第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。在一些实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用至少1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用至少1800mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1800mg至3000mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg至2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每两周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1800mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2100mg或3000mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值的至少2.0倍，例如2.27倍。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达是已知人平均HMGA2表达水平的至少2-5倍。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达比HMGA2正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。在某些实施方式中，在本发明的方法中，在对象中增加的HMGA2表达是对利用抗TGFβ剂的无响应的对象中的HMGA2表达的至少19-35倍。在一些实施方式中，HMGA2基因的表达水平是通过依据一个或多个持家基因归一化来定量HMGA2 mRNA转录物而测量的。HMGA2 mRNA转录物以及一个或多个持家基因是通过诸如定量逆转录PCR的RNA定量方法定量的。一个或多个持家基因是在目标人中具有相对恒定表达的那些基因。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均值的至少1.5倍。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均值的至少1.5-4倍。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的MECOM表达比MECOM正常表达水平更高至少100％、更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

mRNA的确定可以来自肿瘤组织或循环肿瘤细胞，或循环肿瘤mRNA。mRNA将被用于检测HMGA2或MECOM基因的高表达。高表达可以被认为是通过PCR或定量mRNA表达的其他技术表达高于某个参考水平的水平的肿瘤细胞。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2或MECOM表达是通过分别定量HMGA2和MECOM mRNA而确定的。在某些实施方式中，在本发明的方法中，HMGA2 mRNA或MECOM mRNA水平是通过逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测确定的。在某些实施方式中，HMGA2 mRNA或MECOM mRNA水平是通过数字液滴PCR(ddPCR)确定的。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2或MECOM表达是通过分别定量HMGA2和MECOM蛋白而确定的。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2蛋白或MECOM蛋白水平是通过免疫组织化学确定的。在某些实施方式中，在本发明的方法中，来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞(例如多于5％、多于10％、多于15％或多于20％)表达HMGA2蛋白确定了增加的HMGA2蛋白表达水平。在某些实施方式中，在本发明的方法中，来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞(例如多于5％、多于10％、多于15％或多于20％)表达MECOM蛋白确定了增加的MECOM蛋白表达水平。

本公开的其他实施方式和详细内容可见后文。

图1是抗PD-L1/TGFβ阱分子的示意图，包括一个抗PD-L1抗体与两个TGFβ受体II胞外域(ECD)通过(Gly4Ser)4Gly(SEQ ID NO:11)接头融合。

图2A是示出实施例1所述研究的HMGA2结果的箱形图。相对于对抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制HMGA2表达水平。TPM＝每百万转录物数；PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解。高HMGA2表达被认为是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低HMGA2表达一样高的表达水平。

图2B是TCGA数据库中乳腺癌中HMGA2表达的分布的直方图。TPM＝每百万转录物数；NE＝不可评估。NE数据从假设检验中排除。

图3A是TCGA数据库中乳腺癌中MECOM表达的分布的直方图。TPM＝每百万转录物数；NE＝不可评估。高MECOM表达被认为是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低MECOM表达一样高的表达水平。

图3B是示出实施例1所述研究的MECOM结果的箱形图。相对于对抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制MECOM表达水平。TPM＝每百万转录物数；PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解。高MECOM表达被认为是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低MECOM表达一样高的表达水平。

图4A-D示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的若干潜在预测性生物标志物的log-TPM的箱形图。图4A示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的HMGA2的log-TPM的箱形图。图4B示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的MECOM的log-TPM的箱形图。图4C示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的CLEC3A的log-TPM的箱形图。图4D示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的CCNDBP1的log-TPM的箱形图。(图中使用的缩写：NE(不可评估)；PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解)。

图5A-F是示出HMGA2与选择的TGF-β信号转导核心基因之间的关联的散点图。图5A是示出HMGA2表达与Tgfbr1表达之间的关联的散点图。图5B是示出HMGA2与Tgfbr2表达之间的关联的散点图。图5C是示出HMGA2表达与Smad3表达之间的关联的散点图。图5D是示出HMGA2表达与Tgfb1表达之间的关联的散点图。图5E是示出HMGA2表达与Tgfb2表达之间的关联的散点图。图5F是示出HMGA2表达与Tgfb3表达之间的关联的散点图。

图6A-F是示出HMGA2与选择的TGF-β信号转导靶基因之间的关联的散点图。图6A是示出HMGA2表达与Col1a1表达之间的关联的散点图。图6B是示出HMGA2表达与Col1a2表达之间的关联的散点图。图6C是示出HMGA2表达与Fn1表达之间的关联的散点图。图6D是示出HMGA2表达与Vim表达之间的关联的散点图。图6E是示出HMGA2表达与Vegfa表达之间的关联的散点图。图6F是示出HMGA2表达与Zeb1表达之间的关联的散点图。

图7A是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfbr1表达的图表。图7B是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfbr2表达的图表。图7C是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Smad3表达的图表。图7D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb1表达的图表。图7E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb2表达的图表。图7F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb3表达的图表。

图8A是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中HMGA2表达的图表。图8B是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Col1a1表达的图表。图8C是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Col1a2表达的图表。图8D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Fn1表达的图表。图8E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Vim表达的图表。图8F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Vegfa表达的图表。图8G是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Zeb1表达的图表。

图9A是示出HMGA2表达与Ifng表达之间的关联的散点图。图9B是示出HMGA2表达与Gzmb表达之间的关联的散点图。图9C是示出HMGA2表达与Gzmk表达之间的关联的散点图。图9D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Ifng表达的图表。图9E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Gzmb表达的图表。图9F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Gzmk表达的图表。

图10是示出HMGA2表达(以log-TPM(每百万转录物数)表示)和对象的TNBC状态的箱形图。

图11在单独的面板中示出HMGA2表达(以TPM表示)与非TNBC(左)和TNBC(右)患者中响应的关系。[图中使用的缩写：NE：不可评估；PD：进展性疾病；SD：病情稳定；PR：部分缓解；CR：完全缓解；METBRC：转移性乳腺癌；TPM：HMGA2基因的每百万转录物数]。

“TGFβRII”或“TGFβ受体II”指具有野生型人TGFβ受体2型同种型A序列(例如NCBI参考序列(RefSeq)登录号NP_001020018(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列)的多肽，或具有野生型人TGFβ受体2型同种型B序列(例如NCBI参考序列(RefSeq)登录号NP_003233(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列)的多肽，或具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列基本相同的序列的多肽。TGFβRII可保留野生型序列TGFβ结合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％。表达的TGFβRII多肽没有信号序列。

“能结合TGFβ的TGFβRII片段”指NCBI RefSeq登录号NP_001020018(SEQ ID NO:8)或NCBI RefSeq登录号NP_003233(SEQ ID NO:9)的任何部分，或与SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列基本相同的序列，其长度为至少20(例如至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175或200)个氨基酸，并维持至少一些野生型受体或对应的野生型片段的TGFβ结合活性(例如至少0.1％、0.5％、1％、5％、0％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％)。通常，此类片段是可溶性片段。示例性片段之一是具有SEQ IDNO:10序列的TGFβRII胞外域。

“PD-L1高”或“高PD-L1”指PD-L1 IHC 73-10检测(Dako)测定≥80％PD-L1阳性肿瘤细胞，或Dako IHC 22C3 PharmDx检测测定肿瘤比例评分(TPS)≥50％(TPS是IHC 22C3PharmDx检测相关术语，描述具有部分或完全膜染(例如PD-L1染)的活肿瘤细胞百分数)。IHC 73-10和Dako IHC 22C3检测在各自截止值选取相似的患者。在一些实施方式中，也可使用与22C3 PharmDx检测高度相关的VENTANA PD-L1(SP263)检测测定PD-L1高表达水平(参见Sughayer等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.,(2018))。

“PD-L1阳性”或“PD-L1+”表示例如通过Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx检测测定TPS≥1％PD-L1阳性肿瘤细胞。

“基本相同”表示多肽与参照氨基酸序列显示至少50％，优选60％、70％、75％或80％，更优选85％、90％或95％，最优选99％的氨基酸序列相同性。比较序列的长度一般为至少10个氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，更优选至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续氨基酸，最优选是全长氨基酸序列。

“患者”表示人或非人动物(例如哺乳动物)。“患者”、“对象”、“有需要的患者”和“有需要的对象”在本公开中可互换使用，指患有或易患可通过使用本公开中提供的方法和组合物给药来的疾病或病症的活生物体。

本公开中使用的术语“”、“疗法”或其他语法上的等同形式包括减轻、缓解、改善或预防疾病、病况或症状，预防其他症状，改善或预防症状潜在的代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，缓解疾病或状况，引起疾病或状况消退，缓解由疾病或病况引起的状况或停止疾病或病况的症状，并旨在包括预防。该术语还包括实现获益和/或预防获益。获益是指根除或改善所的潜在疾病。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现益处，由此在患者中观察到改善，尽管患者仍然可能患有潜在病症。

如本领域中通常理解的那样，在本公开的方案的上下文中使用术语“巩固”。例如，根据美国国家癌症研究所的说法，术语“巩固疗法”是“在初始疗法后癌症消失后给予的“”。巩固疗法用于杀死可能留在体内的任何癌细胞。它可能包括放疗，干细胞移植或用杀死癌细胞的药物。也称为强化疗法和缓解后疗法。”https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/consolidation-therapy，最后访问于2018年6月9日。

术语“无进展生存期”或PFS定义为从随机分组(可以发生在开始后6周或更长周数)到第一个有记载的肿瘤进展或没有疾病进展而死亡的时间。术语“总体生存期”定义为从随机分组到任何原因致死的时间。研究人员根据RECIST 1.1版评估无进展生存期，作为预定义的敏感性分析。

“癌症”是指三阴性乳腺癌(TNBC)，对此免疫组织化学已证实该乳腺癌根本不表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)，也不会过度表达HER2。

“晚期三阴性乳腺癌(TNBC)”是指转移性疾病、难治性疾病或以前局部晚期且现在已经发展的癌症。

“有响应的”受试者或“响应者”是指接受抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC对象将经历根据RECIST 1.1确定的至少部分缓解(PR)或完全缓解(CR)的最佳总体响应。

“无响应的”受试者或“无响应者”是指接受抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC对象将经历根据RECIST 1.1确定的进展性疾病*(PD)的最佳总体响应。

术语“风险”、“处于风险中”和“风险因素”在此如本领域常规理解的那样使用。例如，风险因素是个体增加患病或受伤可能性的任何属性，特征或暴露。在某些实施方式中，处于患疾病、病症或病状的风险中的人是指该人暴露于有助于或增加该疾病、病症或病状的发生概率的风险因素。

在本公开的整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和该词的其他形式，例如“含有”和“包括”，意味着包括但不限于，并且不旨在排除例如其他组分。

“共同施用(共同给药)”是指本文所述的组合物在施用另外疗法的同时、临近其前或紧接其后施用。本公开的蛋白质和组合物可以单独施用，或者可以与第二、第三或第四剂共同施用于患者。共同施用意在包括以单独或组合(多于一种剂)的形式同时或依次施用蛋白质或组合物。

术语“一个(种)”并不意味着限制为单数。在某些实施方式中，术语“一个(种)”可以指复数形式。如本文全文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，提及“组合物”包括多种这样的组合物，以及单一组合物。

“重建的”制剂是通过将冻干制剂溶解在水性载体中制备的制剂，使得双功能分子溶解在重建的制剂中。重建的制剂适合于对有需要的患者静脉内给药(IV)。

术语“约”是指在制剂的制备以及在疾病或病症的中不改变药物效力的药物浓度或量的任何最小改变。在实施方式中，术语“约”可包括指定数值或数据点的±15％。

本公开中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相关以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。还应理解，本公开公开了多个数值，并且每个数值在本公开中除了作为该数值本身公开之外，还作为“约”该具体数值来公开。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据代表了各种终点和起点以及数据点任意组合而成的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为视为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及10至15之间。还应理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

“等张(isotonic)”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等张制剂通常具有约250至350mOsmol/KgH2O的渗透压。术语“高张(hypertonic)”用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如，可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等张性(isotonicity)。

术语“缓冲剂”是指一种或多种组分，当加入到水溶液中，能够保护溶液当加入酸或碱时或在用溶剂稀释时免于pH变化。除磷酸盐缓冲液外，还可以使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液等，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可用作反离子。

“酸”是在水溶液中产生氢离子的物质。“药学上可接受的酸”包括在其配制浓度和方式上无毒的无机和有机酸。

“碱”是在水溶液中产生氢氧根离子的物质。“药学上可接受的碱”包括在其配制浓度和方式上无毒的无机和有机碱。

“冻干保护剂”是当与感兴趣的蛋白质结合时，防止或减少冻干和随后储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。

“防腐剂”是降低细菌作用的物质，并且可以任选地添加至本文的制剂中。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。可用防腐剂的示例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵，六甲基氯化铵，苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇如苯酚，丁醇和苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚。

“表面活性剂”是含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羧酸酯/盐基团)的表面活性分子。可以将表面活性剂添加到本发明的制剂中。适用于本发明制剂的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；曲通(Triton)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-、肉豆蔻酰基-、亚油基-或硬脂基-磺基丁二烯(sulfobetadine)；十二烷基-、肉豆蔻酰基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰氨丙基-、棕榈胺酰丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠或甲基油酰基-牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.，Paterson，N.J.)，聚乙二醇，聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。

为了对诊断为三阴性乳腺癌(TNBC)的患者进行有效，本发明提供了为确定为具有HMGA2或MECOM相对于已知表达水平的增加的表达水平的患者TNBC的方案，并且改善了TNBC患者的疾病预后和总体生存期。已知表达水平是在对照人或组织样本中的HMGA2表达水平。在某些实施方式中，患者被诊断为晚期TNBC。在某些实施方式中，患者被诊断为对先前的难治的转移性TNBC。

本公开的抗TGFβ剂包括靶向TGFβ表达的TGFβ阱、抗体、小分子抑制剂和寡肽。例如，抗TGFβ剂包括TGFβ中和抗体ID11、2G7、Fresolimumab(GC1008；Sanofi，Genzyme)、Metelimumab(CAT-192；Astra Zeneca，Cambridge Antibody Technology)、TGFβ受体阻断抗体例如LY3022859(Eli Lilly&Co)和小分子TGFβ受体激酶抑制剂Galunisertib(LY2157299；Eli Lilly&Co)、SD-208(Scios Inc)和LY2109761(Eli Lilly&Co.)。

本公开的双功能蛋白(抗PD-L1/TGFβ阱分子)包括第一和第二多肽。所述第一多肽包括：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段(例如可溶性片段)。第二多肽包括：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，其中，第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。由于本公开的双功能蛋白能与两个靶标结合：(1)PD-L1，其大多与膜结合，和(2)TGFβ，其在血液和间质中为可溶形式，非BW依赖性给药方案需要不仅能在肿瘤位点抑制PD-L1且能足以抑制TGFβ的剂量。

癌症或抑制肿瘤生长的方法

一方面，本发明提供了一种或管理对象的TNBC的方法，该方法通过向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而对象的TNBC。

另一方面，本发明提供了一种实现TNBC患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，该方法通过向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应。

在某些实施方式中，本公开提供了或管理对象的TNBC的两步方法，其中第一步涉及识别HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有的表达水平的对象，并且第二步涉及将抗TGFβ剂施用于已被确定为具有增加的HMGA2或MECOM水平的对象，从而对象的TNBC。

在某些实施方式中，本公开提供了实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的两步方法，其中第一步涉及识别HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象，并且第二步涉及将抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质施用于已被确定为具有增加的HMGA2或MECOM水平的对象，从而实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应。

在本发明的各个方法中，通过分析源自患者的组织样本确定对象的HMGA2或MECOM水平。在某些实施方式中，组织样本是血液、血清或血浆样本。在特定实施方式中，来自对象的组织样本是通过活检(例如，开始前从患者收集的针刺活检样本)获得的乳腺组织。在本发明的各个方法中，通过在开始前从患者收集的活检样本的免疫化学，或活检样本或血液、血清或血浆样本的RNA表达分析确定HMGA2或MECOM水平。

在特定实施方式中，来自对象的组织样本是通过活检(例如，开始前从患者收集的针刺活检样本)获得的乳腺癌组织。在本发明的各个方法中，通过在开始前从患者收集的活检样本的免疫化学，或活检样本或血液、血清或血浆样本的RNA表达分析确定HMGA2或MECOM水平。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2 mRNA和MECOMmRNA水平是通过众所周知的mRNA定量方法确定的。在示例性实施方式中，在本发明的方法中，HMGA2 mRNA和MECOM mRNA水平是通过逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测确定的。在示例性实施方式中，HMGA2 mRNA和MECOM mRNA水平是通过数字液滴PCR(ddPCR)确定的。

在某些实施方式中，本公开提供了用于预测被诊断为三阴性乳腺癌的患者对于抗TGFβ剂的响应以及通过施用抗TGFβ剂该患者的响应的方法。在示例性实施方式中，HMGA2水平是通过从新鲜石蜡包埋的肿瘤样本中提取RNA来确定的。在示例性实施方式中，HMGA2水平是通过从冷冻石蜡包埋的肿瘤样本中提取RNA来确定的。在另一个示例性实施方式中，HMGA2水平是通过从固定石蜡包埋的肿瘤样本中提取RNA来确定的。在某些实施方式中，逆转录提取的RNA以产生cDNA。在某些实施方式中，使用基于PCR的方法(例如，RT-qPCR、数字液滴PCR)扩增逆转录的cDNA。在示例性实施方式中，采用基于PCR的方法(例如，RT-qPCR、数字液滴PCR)定量检测HMGA2表达的RNA转录物水平。在某些实施方式中，HMGA2 RNA转录物水平相对于至少一个持家基因的RNA转录物水平归一化，以提供归一化的HMGA2转录物水平。使用众所周知的持家基因(例如，GAPDH、actin、ubiquitin)归一化基因表达数据的方法是众所周知的(参见Dheda K.等，用于实时PCR中归一化RNA表达的持家基因的验证(Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-timePCR)，Biotechniques 2004；37:112–119)。

在某些实施方式中，本发明涉及向已被确定为具有与人中全部肿瘤中的HMGA2RNA转录物水平分布相比的增加的HMGA2 RNA转录物水平的对象施用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，从而实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应。

在某些实施方式中，高HMGA2表达截止值是基于用于定量受试者中HMGA2表达的定量方法而设置的。在示例性实施方式中，用以选择将响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者人的HMGA2高表达截止值是通过整合从RNA-seq获得的数据以及从qPCR和/或ddPCR获得的数据而推论的。从RNA-seq获得的TPM值可以转换为能够从绝对定量方法(例如，qPCR或ddPCR)中获得的定量值。生成一个传递函数，该函数将从RNA-seq获得的TPM值映射到Ct值(对于qPCR)或ddPCR比率值(对于ddPCR)。此传递函数用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct或ddPCR比率水平。在示例性实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct值的传递函数是：

Y1＝X1-log2(TPM最低/TPM基线)；

其中Y1＝Ct值截止值；

X1＝归一化的ΔCt值(HMGA2的相对qPCR表达中位数)；

TPM最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在示例性实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct值的传递函数是：

Y1＝X1-log2(TPM第二最低/TPM基线)；

其中Y1＝Ct值截止值；

X1＝归一化的ΔCt值(HMGA2的相对qPCR表达中位数)；

TPM第二最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的ddPCR比率值的传递函数是：

Y1＝X1×(TPM最低/TPM基线)；

其中Y1＝ddPCR比率值截止值；

X1＝归一化的ddPCR比率值(HMGA2的ddPCR比率值中位数)；

TPM最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的ddPCR比率值的传递函数是：

Y1＝X1×(TPM第二最低/TPM基线)；

其中Y1＝ddPCR比率值截止值；

X1＝归一化的ddPCR比率值(HMGA2的ddPCR比率值中位数)；

TPM第二最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的第二最低的HMGA2表达(TPM值)。

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数

在示例性实施方式中，当患者的肿瘤中的HMGA2表达与TNBC人中全部肿瘤中的HMGA2表达分布相比为高时，患者被视为HMGA2高。在示例性实施方式中，HMGA2表达的参考水平通过如下确定：收集对抗PD-L1/TGFβ阱有响应的患者队列(cohort)和无响应的患者队列(分别为响应者和无响应者)的肿瘤样本；测量样本中的HMGA2表达；表征响应者和无响应者之间的表达分布，其特征反映在分离这些分布的截止值上；以及设置阈值作为参考表达水平，该阈值对应于响应者和无响应者之间选择的截止值。

一方面，本发明提供了用于识别可能响应(例如，部分缓解、改善的生存期)利用靶向TGFβ抑制的的TNBC患者的方法。为了识别可能响应利用抗TGFβ剂的的TNBC患者，分别分析HMGA2和/或MECOM相对于对应的已知对照表达水平的表达水平。在某些实施方式中，在利用抗PD-L1/TGFβ阱分子的利用靶向TGFβ抑制的之前，HMGA2或MECOM表达水平的分析进行7-30天(例如，7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天)以上。为了确定HMGA2和/或MECOM的水平，在使用本文中描述的方法的TNBC患者中，可以从该患者获得样本。因此，在本发明的一些实施方式中，TNBC患者中的HMGA2和/或MECOM水平是在从该TNBC患者获得的样本中确定的。在某些实施方式中，为了识别可能响应利用抗TGFβ剂的的TNBC患者，在从该对象收集的组织样本中分析HMGA2和/或MECOM的表达水平。在特定实施方式中，来自对象的组织样本是血液、血清或血浆样本。在特定实施方式中，来自对象的组织样本是通过活检(例如，开始前从患者收集的针刺活检样本)获得的乳腺组织。

在某些实施方式中，本发明提供了利用靶向TGFβ的药剂具有相对于一般TNBC人的已知对照表达水平的高HMGA2表达的TNBC患者的方法。在某些实施方式中，靶向TGFβ的药剂可以是小分子、单克隆抗体、TGFβ受体的融合蛋白和/或反义RNA衍生物。在某些实施方式中，已知这些药剂靶向TGFβ通路。例如，Galunisertib(LY-2157299；Eli Lilly&Co.)、vactosertib(TEW-7197，NOV-1301；MedPacto,Inc.,National OncoVenture)、LY3200882(Eli Lilly&Co.)、NIS-793(XOMA-089；Novartis，XOMA corporation)、SAR-439459(Sanofi)、ABBV-151(AGRX-115，AbbVie，Argenx)、AVID-200(Forbius)、PF-06952229(Pfizer)以及YL-13027(上海璎黎药业有限公司(Shanghai YingLi Pharmaceutical Co.,Ltd.))。

在一些实施方式中，HMGA2和/或MECOM水平是通过分析来自患者的样本确定的。在某些实施方式中，来自对象的组织样本是通过活检(例如，开始前从患者收集的针刺活检样本)获得的乳腺组织。在本发明的各个方法中，通过在开始前从患者收集的活检样本的免疫化学，或活检样本或血液、血清或血浆样本的RNA表达分析确定HMGA2或MECOM水平。例如，在本发明的方法中，HMGA2和/或MECOM水平可以通过免疫化学确定，例如，通过酶联免疫吸附检测(ELISA)或通过核苷酸分析。

在某些实施方式中，本发明的方法涉及比较从TNBC患者获得的样本中测量的HMGA2和/或MECOM的mRNA表达水平与TCGA数据库(癌症基因组图谱(The Cancer GenomeAtlas)-国家卫生研究院(National Institutes of Health))中现有的已知值的mRNA表达水平，该TCGA数据库是大量患者的数据库。

比较RNA-seq数据集是有意义的，原因是技术平台和样本制备方法有所不同，从而导致通常所说的批次效应；为了校正将观测到的HMGA2和/或MECOM表达水平与根据TCGA的水平分开的批次效应，在sva Bioconductor软件包中执行了ComBat算法(sva版本3.28.0，Leek JT、Johnson WE、Parker HS、Fertig EJ、Jaffe AE、Storey JD、Zhang Y、Torres LC(2018)。sva：替代变量分析(Surrogate Variable Analysis)。)。这种方法使TCGA乳腺癌数据集(下文称TCGA-BRCA)中为三阴性(下文称TCGA_BRCA_TNBC)的患者临床数据与HMGA2和/或MECOM的观测水平具有可比性。

在某些实施方式中，为了识别可能响应利用抗PD-L1/TGFβ阱分子的的TNBC患者，通过从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样本中提取的RNA进行测序，分析HMGA2或MECOM的表达水平。例如，通过使用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从一到两个5-10μm FFPE卷(curl)中分离总RNA而从FFPE样本中提取RNA，并在Qubit 2.0荧光计上使用Qubit HS RNA检测(ThermoFisher Scientific，美国)确定RNA浓度。然后使用本领域已知的方法对提取的RNA测序。例如，在某些实施方式中，使用定量实时PCR(qPCR)分析HMGA2或MECOM表达水平。在某些实施方式中，使用TaqMan基因表达预混液，并且使用制造商推荐的循环规程在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统(96孔格式)上运行，一式两份地进行qPCR。如果没有“现成的”基因表达检测方法，靶基因(SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:64)和持家基因的引物/探针组可以使用Primer设计。对于基因表达的相对定量，可以使用比较ΔCt法。

在另一个实施方式中，使用数字液滴PCR(ddPCR)分析HMGA2或MECOM表达水平。在某些实施方式中，使用包含靶向靶基因(SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:64)和持家基因的引物和探针的检测，遵循BioRad ddPCR规程进行ddPCR。使用QuantaSoft软件进行各个实验的样本分析。基于在相应的无模板对照(NTC)中检测到的阴性簇(cluster)，使用手动设置的荧光阈值确定所有样本中的阳性液滴浓度。单个样本中的靶DNA浓度(份数/mL)和绝对液滴计数用作定量结果测量。

在另一个实施方式中，使用HTG EdgeSeq系统分析HMGA2或MECOM表达水平。将FFPE标本刮入试管中并在HTG的裂解缓冲液中裂解，随后引入基因特异性DNA核酸酶保护探针(NPP)。在使NPP与可在生物基质中溶解或交联的它们的靶RNA杂交后，添加S1核酸酶以去除过量的未杂交的NPP和RNA，仅留下与它们的靶RNA杂交的NPP。

由此，实现了靶RNA向NPP的化学计量转化，产生了NPP与RNA的实质上的(virtual)1:1比例。qNPA步骤在HTG EdgeSeq处理器上是自动执行的，随后进行PCR以添加测序接头(adaptor)和标签(tag)。使用标准规程，在新一代测序(NGS)平台上对标记的样本进行汇总、清洁和测序。来自NGS仪器的数据由HTG EdgeSeq解析器软件处理和报告。

如图2A(HMGA2)和图3B(MECOM)所示，与无响应者相比，HMGA2和MECOM两者在响应者中的过表达均高出20倍以上。在图2A中，相对于对抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制HMGA2表达水平(每百万转录物数(TPM)的对数)(PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解)。TPM作为一个广泛使用的转录物丰度度量标准，是通过RSEM计算的。参见Li&Dewey,(2011),BMC Bioinformatics,12:323。在图2B中记录了HMGA2的高和低表达水平，并且在图3A中记录了MECOM的高和低表达水平。高-低表达水平的比率提供了一个独立的值(一个因子)，通过该值可以识别可能响应抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC患者。

高HMGA2表达是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低HMGA2表达一样高的表达水平。如图2A所示，与无响应者中的表达水平相比，HMGA2表达显著更高(至少35倍)。

在图3B中，相对于对利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制MECOM表达水平(每百万转录物数(TPM)的对数)(PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解)。高MECOM表达是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低MECOM表达一样高的表达水平。如图3B所示，与无响应者中的表达水平相比，MECOM表达显著更高(至少20倍)。

在某些实施方式中，HMGA2或MECOM表达水平是通过免疫组织化学(IHC)分析的。例如，在某些实施方式中，可以开发出自动化的IHC方法来检测FFPE组织标本中肿瘤细胞核中HMGA2或MECOM的表达。本公开提供了用于检测测试组织样本中人HMGA2或MECOM抗原的存在、或定量人HMGA2或MECOM抗原的水平或样本中表达抗原的细胞比例的方法，该方法包含在允许Ab或其部分与人HMGA2或MECOM之间形成复合物的条件下，用特异性结合人HMGA2或MECOM的mAb接触测试样本和阴性对照样本。优选地，测试和对照组织样本是FFPE样本。然后检测复合物的形成，其中在测试样本和阴性对照样本之间的复合物形成的差异表明样本中人HMGA2或MECOM抗原的存在。使用各种方法定量HMGA2或MECOM表达。

在特定实施方式中，自动化的IHC方法包含：(a)在自动染器中对已安装的组织切片进行脱蜡和补水；(b)使用预处理模块，在适当的pH值下在标靶恢复液(TargetRetrieval Solution)中修复(retrieve)抗原。(c)运行自动染器以包括以下步骤：中和组织标本中的内源性过氧化物酶；在载玻片上阻断非特异性蛋白质结合位点；用一级Ab或阴性对照试剂孵育载玻片；用一级后(post-primary)阻断剂孵育；添加原底物并显影；以及用苏木精复染。(d)在梯度乙醇系列中脱水，并在用永久性介质封固之前进行清除。

为了评估肿瘤组织样本中HMGA2或MECOM的表达，病理学家在显微镜下检查每个视野中HMGA2+或MECOM+肿瘤细胞的数量，并且心理估计阳性细胞的百分比，然后取平均值以得出最终百分比。不同的染强度被指定为0/阴性、1+/弱、2+/中、以及3+/强。通常，首先将百分比值分配给0和3+组，然后考虑中间的1+和2+强度。对于高度异质性的组织，将标本分为多个区域，单独对每个区域评分，然后合并为一组百分比值。从每个区域确定不同染强度的阴性和阳性细胞的百分比，并为每个区域指定一个中值。对于每个染强度类别(阴性、1+、2+和3+)，为组织指定最终百分比值。所有染强度的总和必须为100％。

在这些评分方法的某些实施方式中，由两名独立操作的病理学家对样本进行评分，随后对评分进行合并。在某些其他实施方式中，使用恰当的软件对阴性和阳性细胞的识别进行评分。

使用组织分数(histoscore)被作为IHC数据的更加定量的测量。组织分数如下计算：组织分数＝[(肿瘤％×1(低强度))+(肿瘤％×2(中强度))+(肿瘤％×3(高强度))]为了确定组织分数，估计标本中各个强度类别中染细胞的百分比。最终的组织分数范围可以是0(无表达)至300(最大表达)。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值的至少2.0倍，例如2.27倍。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达是已知的人平均HMGA2表达水平的至少2-7倍(例如，2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5.0倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6.0倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍或7.0倍)。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均值的至少1.5倍。在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均值的至少1.5-4倍(例如，2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍或4.0倍)。

在某些实施方式中，HMGA2或MECOM表达水平与一般TNBC人的已知表达水平相比较。在某些实施方式中，如果HMGA2 RNA表达水平被确定为大于一般TNBC人的HMGA2 RNA表达水平的2.60倍，则确定HMGA2表达水平为高。在某些实施方式中，在本发明的方法中，来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞(例如多于5％、多于10％、多于15％或多于20％)表达HMGA2蛋白确定了增加的HMGA2蛋白表达水平。在某些实施方式中，如果MECOMRNA表达水平大于一般TNBC人的MECOM RNA表达水平的1.7倍，则确定MECOM表达水平为高。在某些实施方式中，在本发明的方法中，来自TNBC患者的组织样本中多于肿瘤1％细胞(例如多于5％、多于10％、多于15％或多于20％)表达MECOM蛋白确定了增加的MECOM蛋白表达水平。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，对象中增加的HMGA2表达是对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的不响应的对象中的HMGA2表达的至少19-40倍(例如，19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍或40倍)。

在某些实施方式中，HMGA2或MECOM表达水平在TNBC人中的响应者和无响应者之间相比较。在某些实施方式中，如果HMGA2 RNA表达水平被确定为大于无响应TNBC人的HMGA2 RNA表达水平的19-35倍，则确定HMGA2表达水平为高。在某些实施方式中，如果MECOMRNA表达水平大于无响应TNBC人的MECOM RNA表达水平的18-35倍，则确定MECOM表达水平为高。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2表达比HMGA2正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

在某些实施方式中，在本发明的方法中，增加的HMGA2和/或MECOM表达是转录物表达比HMGA2和/或MECOM的正常人表达水平更高100％-1000％(更高200％-1000％、更高300％-1000％、更高400％-1000％、更高500％-1000％、更高至少600％-1000％、更高700％-1000％、更高800％-1000％、更高900％-1000％、更高100％-900％、更高100％-800％、更高100％-700％、更高100％-600％、更高100％-500％、更高100％-400％、更高100％-300％或更高100％-200％)。在某些实施方式中，被识别为响应利用靶向TGFβ抑制的的对象已被确定为具有增加的HMGA2转录物表达，其中增加的HMGA2转录物表达比HMGA2转录物正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。在某些实施方式中，被识别为响应利用靶向TGFβ抑制的的对象已被确定为具有增加的MECOM表达，其中增加的MECOM转录物表达比MECOM转录物正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

在本发明的实施方式中，在施用抗PD-L1/TGFβ阱分子之前约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1周至约2周、约2周至约3周、3周至4周、4周至5周、5周至6周、6周至7周、7周至8周、8周至9周、9周至10周、10周至11周、11周至12周、12周至16周、16周至20周、20周至24周、24周至28周、28周至32周、32周至36周、36周至40周、40周至44周、44周至48周、48周至52周、和/或52周以上确定HMGA2和/或MECOM的增加的水平。

在本发明的方法中，向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的TNBC患者施用至少1200mg包含第一多肽和第二多肽的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。所述第一多肽包括：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段。所述第二多肽至少包括结合PD-L1的抗体轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，本公开的TNBC或抑制肿瘤生长的方法涉及向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用包括两个肽的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，其中第一多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且第二多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本公开的TNBC或抑制肿瘤生长的方法涉及向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱分子(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列；或者第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ IDNO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))，其剂量为约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg、约1200mg至约2900mg、约1200mg至约2800mg、约1200mg至约2700mg、约1200mg至约2600mg、约1200mg至约2500mg、约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约3000mg、约1400mg至约3000mg、约1500mg至约3000mg、约1600mg至约3000mg、约1700mg至约3000mg、约1800mg至约3000mg、约1900mg至约3000mg、约2000mg至约3000mg、约2100mg至约3000mg、约2200mg至约3000mg、约2300mg至约3000mg、约2400mg至约3000mg、约2500mg至约3000mg、约2600mg至约3000mg、约2700mg至约3000mg、约2800mg至约3000mg、约2900mg至约3000mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg)。在某些实施方式中，每两周一次向TNBC患者施用约1200mg抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向TNBC患者施用约1800mg抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向TNBC患者施用约2400mg抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每两周一次向对象施用约1200mg第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用施用约1800mg第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包括SEQ IDNO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，每三周一次向TNBC患者施用约1800mg第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有的表达水平的对象施用施用约2400mg第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，每三周一次向TNBC患者施用约2400mg第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在某些实施方式中，向TNBC患者施用的剂量可以是约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg或约2400mg。

在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用至少1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用至少1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg至3000mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg至2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1800mg至2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，每两周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用1800mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2400mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2100mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2100mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。在某些实施方式中，每三周一次向已被确定为HMGA2或MECOM相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用2400mg或3000mg抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

在某些实施方式中，向TNBC患者施用的剂量可以每两周施用一次。在某些实施方式中，向TNBC患者施用的剂量可以每三周施用一次。在某些实施方式中，蛋白质可以通过静脉内给药，例如用预填充袋、预填充笔或预填充注射器给药。在某些实施方式中，蛋白质从250ml盐水袋静脉内给予，并且静脉内输注可以持续约1小时(例如，50至80分钟)。在某些实施方式中，袋连接包含管和/或针的通道。

在某些实施方式中，通过静脉内施用至少1200mg(例如，约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或更多)抗PD-L1/TGFβ阱已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内施用至少1200mg(例如，约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或更多)抗PD-L1/TGFβ阱患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内施用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。在某些实施方式中，通过静脉内施用2400mg抗PD-L1/TGFβ阱患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在某些实施方式中，通过静脉内施用约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约2400mg、约1400mg至约2400mg、约1500mg至约2400mg、约1600mg至约2400mg、约1700mg至约2400mg、约1800mg至约2400mg、约1900mg至约2400mg、约2000mg至约2400mg、约2100mg至约2400mg、约2200mg至约2400mg或约2300mg至约2400mg)抗PD-L1/TGFβ阱已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在某些实施方式中，通过静脉内施用约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约2400mg、约1400mg至约2400mg、约1500mg至约2400mg、约1600mg至约2400mg、约1700mg至约2400mg、约1800mg至约2400mg、约1900mg至约2400mg、约2000mg至约2400mg、约2100mg至约2400mg、约2200mg至约2400mg或约2300mg至约2400mg)抗PD-L1/TGFβ阱已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的患有TNBC的对象或患者，其中该抗PD-L1/TGFβ阱包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在一些实施方式中，每2周一次以约1200mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)或MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)相对于相应的已知对照水平具有增加的表达水平的患有TNBC的对象或患者。在一些实施方式中，每2周一次以1200mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱患有晚期TNBC的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以约1800mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱患有晚期TNBC的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以约2400mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱患有晚期TNBC的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以2400mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱患有晚期TNBC的对象或患者。

在某些实施方式中，待的TNBC为PD-L1阳性。例如，在某些实施方式中，待的TNBC表现出PD-L1+表达(例如，高PD-L1表达)。在一些实施方式中，例如，PD-L1高可以定义为通过73-10检测确定为≥80％PD-L1阳性肿瘤细胞(肿瘤比例得分[TPS])。在一些实施方式中，PD-L1高可以定义为通过PD-L1 IHC 22C3 pharmDx检测确定为肿瘤比例得分(TPS)≥50％。在一些实施方式中，PD-L1高可以定义为通过PD-L1IHC SP263检测确定为肿瘤比例得分(TPS)≥25％。检测例如癌症或肿瘤上的诸如PD-L1的生物标志物的方法是本领域常规的并且是本文中所考虑的。非限定性实例包括免疫组织化学、免疫荧光和荧光活化细胞分选(FACS)。在一些实施方式中，每2周一次以约1200mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱具有PD-L1高的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以约1800mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱具有PD-L1高的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以约2100mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱具有PD-L1高的对象或患者。在一些实施方式中，每3周一次以约2400mg的剂量通过静脉内施用抗PD-L1/TGFβ阱具有PD-L1高的对象或患者。

在一些实施方式中，本文中公开的方法导致对象或患者的疾病缓解或改善的生存期。例如，在一些实施方式中，疾病缓解可以是完全缓解、部分缓解或病情稳定。例如，在一些实施方式中，改善的生存期可以是无进展生存期(PFS)或总体生存期。在一些实施方式中，改善(例如，在PFS中)是相对于开始用本发明的抗PD-L1/TGFβ阱之前的时期来确定的。确定癌症或肿瘤疗法的疾病缓解(例如，完全缓解、部分缓解或病情稳定)和患者生存期(例如，PFS、总体生存期)是本领域常规的并且是本文中所考虑的。在一些实施方式中，接受的患者在患病区域接受相差增强计算机断层摄影(CT)或磁共振显影(MRI)之后，根据RECIST 1.1评估疾病缓解。

TGFβ为癌症靶标

本公开允许通过使用与抗体部分系连的可溶性细胞因子受体(TGFβRII)捕获TGFβ从而在肿瘤微环境中局部降低TGFβ，所述抗体部分靶向某些肿瘤细胞或免疫细胞外表面上的细胞免疫检查点受体。本公开的针对免疫检查点蛋白的抗体部分的一个例子是抗PD-L1。本发明的双功能分子，有时在本文中亦称为“抗体-细胞因子阱”，是确实有效的，因为抗受体抗体与细胞因子阱是物理连接的。由此产生的优势(例如，相对于所述抗体和所述受体作为单独的分子施用)部分归因于细胞因子通过自泌和旁泌功能主要在局部环境中起作用。抗体部分将细胞因子阱引向肿瘤微环境，细胞因子阱在此通过中和局部免疫抑制性自泌或旁泌作用而表现得最为有效。此外，当抗体的靶标通过抗体结合而被内化的情形中，则提供了清除细胞因子/细胞因子受体复合物的有效机制。对于PD-L1显示了的抗体介导的靶标内化作用，并且抗PD-L1/TGFβ阱显示出具有与抗PD-L1相似的内化率。与使用抗TGFβ抗体相比，这是一个明显的优势，因为首先抗TGFβ抗体可能不具有完全中和性；其次，抗体可以作为载体来延长细胞因子的半衰期。

事实上，如下所述，由于在阻断肿瘤细胞上的PD-L1和免疫细胞上的PD-1之间相互作用的同时中和肿瘤微环境中的TGFβ，利用抗PD-L1/TGFβ阱的引发了协同抗肿瘤作用。不受理论的束缚，这大概是由于通过同时阻断两种主要的免疫逃逸机制而获得的协同作用，以及由于肿瘤微环境中的TGFβ被单分子实体耗竭。所述耗竭是通过以下实现的：(1)抗PD-L1靶向肿瘤细胞；(2)肿瘤微环境中的TGFβ自泌/旁泌被TGFβ阱所结合；和(3)被结合的TGFβ通过PD-L1受体介导的内吞作用所破坏。此外，I融合于Fc(IgG的结晶片段)的C末端的TGFβRI比将TGFβRII置于Fc的N末端的TGFβRII-Fc效力强数倍。

TGFβ由于其作为癌症分子的“双重人格”(Jekyll and Hyde)的自相矛盾作用，在癌症免疫疗法中曾经是有些质疑的靶标(Bierie等，Nat.Rev.Cancer,2006；6:506-20)。就像一些其他细胞因子，TGFβ活性具有发育阶段和背景依赖性。实际上，TGFβ可以充当肿瘤启动子或肿瘤抑制物，影响肿瘤的发生、发展和转移。TGFβ双重作用的潜在机制尚不清楚(Yang等，Trends Immunol.2010；31:220-227)。尽管已经假设Smad依赖性信号传导介导TGFβ信号传导的生长抑制，而Smad非依赖性信号通路可促进其促肿瘤作用，但也有数据表明Smad依赖性信号通路参与了肿瘤的发展(Yang等，Cancer Res.2008；68:9107-11)。

TGFβ配体和受体都作为靶标被深入研究。有三种配体同种型：TGFβ1、2和3，都以均二聚体存在。还有三种TGFβ受体(TGFβR)，称为I、II和III型TGFβR(López-Casillas等，J Cell Biol.1994；124:557-68)。TGFβRI是信号传导链并但不结合配体。TGFβRII高亲合力地结合配体TGFβ1和3，对TGFβ2则不然。TGFβRII/TGFβ复合物募集TGFβRI形成信号传导复合物(Won等，Cancer Res.1999；59:1273-7)。TGFβRIII是TGFβ与其信号传导受体结合的正向调节物，并以高亲和性结合全部3种TGFβ同种型。在细胞表面上，TGFβ/TGFβRIII复合物结合TGFβRII，然后募集TGFβRI取代TGFβRIII形成信号传导复合物。

尽管三种不同的TGFβ同种型均通过同一受体传导信号，但已知它们在体内具有差异表达模式和不重叠的功能。敲除了三种不同TGF-β同种型的小鼠具有不同的表型，表明它们有许多非代偿性的功能(Bujak等，Cardiovasc Res.2007；74:184-95)。TGFβ1缺失的小鼠有造血和血管生成缺陷，TGFβ3缺失的小鼠表现出肺部发育和颚发育缺陷，TGFβ2缺失的小鼠表现出各种发育异常，最突出的是多发性心脏畸形(Bartram等，Circulation 2001；103:2745-52；Yamagishi等，Anat.Rec.2012；295:257-67)。此外，TGFβ还被认为在缺血和再灌注损伤后的心肌损伤修复中起重要作用。在成人心脏中，心肌细胞分泌TGFβ作为自泌物起维持自发搏动速率的作用。重要的是，心肌细胞分泌的TGFβ的70-85％是TGFβ2(Roberts等，JClin Invest.1992；90:2056-62)。尽管利用TGFβRI激酶抑制剂的引起心脏毒性问题，但本申请的申请人发现抗PD-L1/TGFβ阱在猴中没有毒性，包括心脏毒性。

中和TGFβ的方法包括使用TGFβ受体的胞外域作为可溶性受体阱和中和抗体。在受体阱捕获方法中，可溶性TGFβRIII似乎是显然的选择，因为它结合所有三种TGFβ配体。然而，天然形成的TGFβRIII是280-330kD的葡糖胺聚糖(GAG)-糖蛋白，具有762个氨基酸残基的胞外域，对于生物疗法开发来说是非常复杂的蛋白质。可在昆虫细胞中产生去GAG的可溶性TGFβRIII，并已经显示是有效力的TGFβ中和剂(Vilchis-Landeros等，Biochem.J.,(2001),355:215)。TGFβRIII的两个独立的结合域(内皮糖蛋白相关的和尿调节蛋白相关的)可以独立表达，但显示亲和力比可溶性TGFβRIII低20至100倍，并且中和活性大大降低(Mendoza等，Biochemistry.2009；48:11755-65)。另一方面，TGFβRII的胞外域长度仅为136个氨基酸残基，可被生产为25-35kD的糖基化蛋白质。重组可溶性TGFβRII还显示以200pM的KD结合TGFβ1，这与细胞上全长TGFβRII的50pM的KD相当近似(Lin等，J.Biol.Chem.1995；270:2747-54)。对可溶性TGFβRII-Fc进行了作为抗癌剂的测试，在肿瘤模型中表现为能够抑制已建立的鼠恶性间皮瘤生长(Suzuki等，Clin.Cancer Res.2004；10:5907-18)。由于TGFβRII不结合TGFβ2，并且TGFβRIII结合TGFβ1和3的亲和力低于TGFβRII，在细菌中生产了TGFβRIII的内皮糖蛋白结构域与TGFβRII胞外域的融合蛋白，该蛋白在细胞实验中表现为抑制TGFβ1和2的信号传导比TGFβRII或RIII更有效(Verona等，Protein Eng’g.Des.Sel.2008；21:463-73)。

中和TGFβ配体所有三种同种型的另一种方法是筛选泛中和性抗TGFβ抗体，或阻断受体与TGFβ1、2和3结合的抗受体抗体。GC1008是对全部TGFβ同种型特异的人抗体，已进入晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌患者的I/II期研究(Morris等，J.Clin.Oncol.2008；26:9028(会议摘要))。尽管发现该是安全且耐受性良好的，但仅观察到有限的临床疗效，因此在未进一步表征免疫学作用的情况下难以解释抗TGFβ的重要性(Flavell等，Nat RevImmunol.2010；10:554-67)。也有TGFβ同种型特异性抗体进入临床试验。麦特丽珠单抗(Metelimumab)是TGFβ1的特异性抗体，已在预防青光眼手术后瘢痕过多的2期临床试验中测试；在一项3期研究中，发现TGFβ2特异性抗体勒德立木单抗(lerdelimumab)是安全的，但在改善眼部手术后的瘢痕形成方面无效(Khaw等，Ophthalmology 2007；114:1822-1830)。阻断受体与全部三种TGFβ同种型结合的抗TGFβRII抗体，例如抗人TGFβRII抗体TR1和抗小鼠TGFβRII抗体MT1，也显示出对小鼠原发性肿瘤生长和转移的一些功效(Zhong等，Clin.Cancer Res.2010；16:1191-205)。然而，在最近一项抗体TR1(LY3022859)的I期研究中，尽管是预防性，超过25mg的更高剂量(统一剂量)因为细胞因子释放失控而被认为不安全(Tolcher等，Cancer Chemother.Pharmacol.2017；79:673-680)。迄今为止，绝大多数对TGFβ靶向抗癌的研究，包括通常具有相当毒性的TGFβ信号传导小分子抑制剂，大多数处于临床前阶段，并且抗肿瘤效果非常有限(Calone等，Exp Oncol.2012；34:9-16；Connolly等，Int.J.Biol.Sci.2012；8:964-78)。

本公开的抗体-TGFβ阱是双功能蛋白，其包括能够结合TGFβ的人TGFβ受体II(TGFβRII)的至少部分。在一些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型A(SEQ ID NO:8)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包括至少SEQ ID NO:8的氨基酸73-184。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包括SEQ ID NO:8的氨基酸24-184。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型B(SEQ ID NO:9)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包括SEQ ID NO:9的至少氨基酸48-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸24-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸24-105。在某些示例性实施方式中，TGFβ阱多肽包括SEQ ID NO:10、50、51、52、53或54的序列。

在另一个实施方式中，本公开的抗体-TGFβ阱是WO 2018/205985中公开的融合蛋白之一。在一些实施方式中，融合蛋白是该公开中表2列出的构建体之一，例如其中的构建体9或15。在其他实施方式中，具有此公开的SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ ID NO:12的轻链序列[分别对应于本公开的SEQ ID NO:61和62]的抗体是通过连接序列(G4S)xG(其中x为4-5)与该公开的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的TGFβRII胞外域序列[分别对应于本公开的SEQ ID NO:50和51]融合。

作用机制

用性抗体靶向T细胞抑制检查点来去抑制(dis-inhibition)的方法是一个具有深入研究的领域(综述可参见Pardoll,Nat.Rev.Cancer 2012,12:253-264)。在方案之一中，抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞上的T细胞抑制哨点受体蛋白，例如：CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-3或LAIR1。在另一方案中，抗体部分靶向抗原呈递细胞和肿瘤细胞上的反受体(counter-receptor)(这些细胞选择这些反受体中的某些用于它们自身的免疫逃逸)，例如：PD-L1(B7-H1)、B7-DC、HVEM、TIM-4、B7-H3或B7-H4。

本公开考虑了通过其抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞抑制检查点的抗体TGFβ阱来去抑制。为此，申请人测试了联合TGFβ阱与靶向多种T细胞抑制检查点受体蛋白的抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3和抗LAG3)的抗肿瘤效果。

程序性死亡1(PD-1)/PD-L1轴是肿瘤免疫逃逸的重要机制。长期感应抗原的效应T细胞呈现由PD-1表达为标志的衰竭表型，在这种状态下肿瘤细胞通过上调PD-L1参与进来。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞、巨噬细胞、实质细胞和T细胞上调PD-L1。阻断该轴可恢复这些T细胞中的效应功能。抗PD-L1/TGFβ阱还结合TGFβ(1、2和3个同种型)，其是在肿瘤微环境中由凋亡性中性粒细胞、髓样抑制细胞、T细胞和肿瘤等细胞产生的抑制性细胞因子。可溶性TGFβRII抑制TGFβ减少了恶性间皮瘤，其方式与CD8+T细胞抗肿瘤作用的增加有关。已经显示，由活化的CD4+T细胞和Treg细胞产生的TGFβ1的缺失可抑制肿瘤生长，并保护小鼠免于自发性癌症。因此，TGFβ对于肿瘤免疫逃逸看来是重要的。

TGFβ对正常上皮细胞具有生长抑制作用，起上皮细胞稳态调节剂的作用，并且在早期癌症发生过程中起肿瘤抑制剂的作用。随着肿瘤向恶性发展，TGFβ对肿瘤的生长抑制作用由于一种或多种TGFβ通道信号传导成分的突变或致癌性重编程而丧失。随着失去对TGFβ抑制的敏感性，肿瘤继续产生高水平的TGFβ，从而起作用促进肿瘤的生长。TGFβ细胞因子在多种癌症类型中过表达，与肿瘤分期相关。肿瘤微环境中许多类型的细胞都会产生TGFβ，包括肿瘤细胞本身、未成熟的髓样细胞、调节性T细胞和基质成纤维细胞；这些细胞在细胞外基质中共同产生大量的TGFβ储库。TGFβ信号传导通过促进转移、刺激血管生成以及抑制先天性和适应性抗肿瘤免疫力促进肿瘤进展。作为一种广泛的免疫抑制因子，TGFβ直接下调活化的细胞毒性T细胞和NK细胞的效应子功能，并有效诱导原初CD4+T细胞分化为免疫抑制调节性T细胞(Treg)表型。另外，TGFβ使巨噬细胞和嗜中性粒细胞极化为伤口愈合表型，该表型与免疫抑制细胞因子的产生有关。作为一种策略，TGFβ活性的中和具有通过恢复有效的抗肿瘤免疫力、阻断转移和抑制血管生成来控制肿瘤生长的潜力。

本公开提供在诊断为TNBC的对象的方法中使用的采用抗PD-L1/TGFβ阱分子的靶向TGF-β抑制的剂量方案。

相伴的PD-1和TGFβ阻断可以重建促炎性细胞因子。抗PD-L1/TGFβ阱包括例如：人TGFβ受体TGFβRII的胞外域，其经由甘氨酸/丝氨酸接头共价连接至完全人IgG1抗PD-L1抗体的每条重链的C末端。鉴于抗PD-1/PD-L1类的新兴蓝图，其中响应明显但具有增加效应大小的空间，据信，共同靶向互补免疫调节步骤将改善肿瘤响应。一种类似的TGF-靶向剂弗瑞索单抗(fresolimumab)是一种针对TGFβ1、2和3的单克隆抗体，其在一项针对黑素瘤患者的I期试验中显示出了肿瘤响应的初步证据。

抗PD-L1抗体

本公开的抗PD-L1/TGFβ阱分子可以包括本领域中描述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。抗PD-L1抗体是可商购的，例如29E2A3抗体(Biolegend，货号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括Fab、F(ab’)2、scFv和Fv片段，详见后文。

示例性抗体可见PCT公开文本WO 2013/079174。这些抗体可以包括含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区多肽，其中：

(a)HVR-H1序列是X1YX2MX3(SEQ ID NO:21)；

(b)HVR-H2序列是SIYPSGGX4TFYADX5VKG(SEQ ID NO:22)；

(c)HVR-H3序列是IKLGTVTTVX6Y(SEQ ID NO:23)；

并且其中：X1是K、R、T、Q、G、A、W、M、I或S；X2是V、R、K、L、M或I；X3是H、T、N、Q、A、V、Y、W、F或M；X4是F或I；X5是S或T；X6是E或D。

在一个实施方式中，X1是M、I或S；X2是R、K、L、M或I；X3是F或M；X4是F或I；X5是S或T；X6是E或D。

在另一个实施方式中，X1是M、I或S；X2是L、M或I；X3是F或M；X4是I；X5是S或T；X6是D。

在再另一个实施方式中，X1是S；X2是I；X3是M；X4是I；X5是T；X6是D。

在另一方面中，所述多肽还包括位于HVR之间的可变区重链框架序列，如下所示：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。

在又另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

在再另一方面中，所述框架序列至少之一如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

在再另一方面中，重链多肽进一步与包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：

(a)HVR-L1序列是TGTX7X8DVGX9YNYVS(SEQ ID NO:28)；

(b)HVR-L2序列是X10VX11X12RPS(SEQ ID NO:29)；

(c)HVR-L3序列是SSX13TX14X15X16X17RV(SEQ ID NO:30)；

并且其中：X7是N或S；X8是T、R或S；X9是A或G；X10是E或D；X11是I、N或S；X12是D、H或N；X13是F或Y；X14是N或S；X15是R、T或S；X16是G或S；X17是I或T。

在另一个实施方式中，X7是N或S；X8是T、R或S；X9是A或G；X10是E或D；X11是N或S；X12是N；X13是F或Y；X14是S；X15是S；X16是G或S；X17是T。

在再另一个实施方式中，X7是S；X8是S；X9是G；X10是D；X11是S；X12是N；X13是Y；X14是S；X15是S；X16是S；X17是T。

在再另一方面中，所述轻链还包括位于HVR之间的可变区轻链框架序列，如下所示：(LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

在再另一方面中，所述轻链框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

在再另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

在再另一方面中，所述框架序列至少其一如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

在另一个实施方式中，本公开提供抗PD-L1抗体或包括重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，并且其中：(i)HVR-H1序列是X1YX2MX3(SEQ ID NO:21)；(ii)HVR-H2序列是SIYPSGGX4TFYADX5VKG(SEQ ID NO:22)；(iii)HVR-H3序列是IKLGTVTTVX6Y(SEQ ID NO:23)，且；

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中：(iv)HVR-L1序列是TGTX7X8DVGX9YNYVS(SEQ ID NO:28)；(v)HVR-L2序列是X10VX11X12RPS(SEQ IDNO:29)；(vi)HVR-L3序列是SSX13TX14X15X16X17RV(SEQ ID NO:30)；其中：X1是K、R、T、Q、G、A、W、M、I或S；X2是V、R、K、L、M或I；X3是H、T、N、Q、A、V、Y、W、F或M；X4是F或I；X5是S或T；X6是E或D；X7是N或S；X8是T、R或S；X9是A或G；X10是E或D；X11是I、N或S；X12是D、H或N；X13是F或Y；X14是N或S；X15是R、T或S；X16是G或S；X17是I或T。

在一个实施方式中，X1是M、I或S；X2是R、K、L、M或I；X3是F或M；X4是F或I；X5是S或T；X6是E或D；X7是N或S；X8是T、R或S；X9是A或G；X10是E或D；X11是N或S；X12是N；X13是F或Y；X14是S；X15是S；X16是G或S；X17是T。

在另一个实施方式中，X1是M、I或S；X2是L、M或I；X3是F或M；X4是I；X5是S或T；X6是D；X7是N或S；X8是T、R或S；X9是A或G；X10是E或D；X11是N或S；X12是N；X13是F或Y；X14是S；X15是S；X16是G或S；X17是T。

在再另一个实施方式中，X1是S；X2是I；X3是M；X4是I；X5是T；X6是D；X7是S；X8是S；X9是G；X10是D；X11是S；X12是N；X13是Y；X14是S；X15是S；X16是S；X17是T。

在另一方面中，所述重链可变区包括如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

在再另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系序列。

在再另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

在再另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

在再另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

在再另一方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包括至少CH1结构域。

在一个更具体的方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包括CH1、CH2和CH3结构域。

在再另一方面中，可变区轻链、抗体或抗体片段还包括CL结构域。

在再另一方面中，抗体还包括CH1、CH2、CH3和CL结构域。

在再另一具体的方面中，抗体还包括人或鼠恒定区。

在再另一方面中，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4所组成的组。

在再另一具体的方面中，人或鼠恒定区是lgG1。

在又另一个实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)、SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，并且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQ IDNO:38)、DVSNRPS(SEQ ID NO:39)和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体的方面中，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在又另一个实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与MYMMM(SEQ ID NO:41)、SIYPSGGITFYADSVKG(SEQ ID NO:42)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGAYNYVS(SEQ IDNO:43),DVSNRPS(SEQ ID NO:39),和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体的方面中，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在再另一方面中，在根据本公开的抗体或抗体片段中，相比HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)在HVR-H1中：SYIMM(SEQ ID NO:35)，

(b)在HVR-H2中：SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)，

(c)在HVR-H3中：IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)；

并且其中，相比HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:38)

(b)HVR-L2 DVSNRPS(SEQ ID NO:39)

(c)HVR-L3 SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)。

在另一方面中，所述重链可变区包括如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包括如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

在又另一方面中，所述框架序列源自人种系序列。

在再另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

在再另一方面中，所述轻链框架序列源自λ轻链序列。

在再另一方面中，所述轻链框架序列中的一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

在再另一具体的方面中，抗体还包括人或鼠恒定区。

在再另一方面中，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4所组成的组。

在某些实施方式中，本公开包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:44)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:45)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:44具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:44具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:45具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:44具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:44具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:45具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:44，轻链序列包含SEQ ID NO:45。

在某些实施方式中，本公开提供一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:47)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:46具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:46具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:47具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:46具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:46具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:47具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:46，轻链序列包含SEQ ID NO:47。

在另一个实施方式中，所述抗体结合人、小鼠或猕猴PD-L1。在一个具体的方面中，抗体能够阻断人、小鼠或猕猴PD-L1与相应人、小鼠或猕猴PD-1受体之间的相互作用。

在另一个实施方式中，抗体以5x10-9 M以下的KD、优选以2x10-9 M以下的KD、甚至更优选以1x10-9 M以下的KD结合人PD-L1。

在又另一个实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其结合包含人PD-L1残基Y56和D61的功能性表位。

在一个具体的方面中，所述功能性表位还包括人PD-L1的E58、E60、Q66、R113和M115。

在一个更具体的方面中，所述抗体结合包括人PD-L1残基54-66和112-122的构象表位。

在某些实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段与本文所述的根据本公开的抗体交叉竞争结合PD-L1。

在某些实施方式中，本公开的特征是包括任何上述抗PD-L1抗体的蛋白质和多肽，其与至少一种药学上可接受的载体组合。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种分离的核酸，其编码本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的多肽、或轻链或重链可变区序列。在某些实施方式中，本公开提供了一种分离的核酸，其编码抗PD-L1抗体的轻链或重链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)、SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％的序列相同性，或

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQID NO:38)、DVSNRPS(SEQ ID NO:39)和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％的序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一方面，重链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:48)

并且轻链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:49)。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗PD-L1抗体可见美国专利申请公开US2010/0203056。在本公开的一个实施方式中，抗体部分是YW243.55S70。在本公开的另一个实施方式中，抗体部分是MPDL3289A。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:13)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:12具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:12具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:12具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:12具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:12，轻链序列包含SEQ ID NO:13。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:14)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:13)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:14具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:14具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:13具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:14具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:14具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:13具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:14，轻链序列包含SEQ ID NO:13。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗PD-L1抗体可见美国专利申请公开US2018/0334504。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:56)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:55具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:55具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:56具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:55具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:55具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:56具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:55，轻链序列包含SEQ ID NO:56。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:58)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:57具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:57具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:58具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:57具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:57具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:58具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:57，轻链序列包含SEQ ID NO:58。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:59)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:60)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:59具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:59具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:60具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:59具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:59具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:60具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:59，轻链序列包含SEQ ID NO:60。

在某些实施方式中，本公开的特征是一种抗PD-L1抗体部分，其包括重链和轻链序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％的序列相同性：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA(SEQ ID NO:61)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％的序列相同性：

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:62)。

在各种实施方式中，重链序列与SEQ ID NO:61具有至少86％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少86％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少87％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少87％的序列相同性；重链序列与SEQ IDNO:61具有至少88％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少88％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少89％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少89％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少90％的序列相同性，轻链序列与SEQID NO:62具有至少90％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少91％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少91％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少92％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少92％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少93％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少93％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少94％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少94％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少95％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少95％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少96％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少96％的序列相同性；重链序列与SEQID NO:61具有至少97％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少97％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少98％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少98％的序列相同性；重链序列与SEQ ID NO:61具有至少99％的序列相同性，轻链序列与SEQ ID NO:62具有至少99％的序列相同性；或重链序列包含SEQ ID NO:61，轻链序列包含SEQ ID NO:62。

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗PD-L1抗体可见美国专利公开文本US 7,943,743。

在本公开的一个实施方式中，抗PD-L1抗体是MDX-1105。

在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是MEDI-4736。

恒定区

本公开的蛋白质和肽可包括免疫球蛋白的恒定区或恒定区片段、类似物、变体、突变体或衍生物。在某些实施方式中，恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类别。在某些实施方式中，恒定区包括CH2结构域。在某些实施方式中，恒定区包括CH2和CH3结合域或包括铰链-CH2-CH3。或者，恒定区可包括铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域的全部或部分。

在一个实施方式中，恒定区包含降低对Fc受体亲和力或降低Fc效应功能的突变。例如，恒定区可包含消除IgG重链恒定区中糖基化位点的突变。在一些实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297或Pro331的突变、缺失或插入(氨基酸根据EU命名法编号)。在一个特定实施方式中，恒定区在对应于IgG1Asn297的氨基酸位置含有突变。在替代的实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344或Pro378的突变、缺失或插入。

在一些实施方式中，恒定区包含源自人IgG2或IgG4重链的CH2结构域。优选地，CH2结构域包含消除CH2结构域中糖基化位点的突变。在一个实施方式中，突变改变IgG2或IgG4重链CH2结构域内Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺。优选地，突变将天冬酰胺变成谷氨酰胺。或者，突变改变Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内苯丙氨酸和天冬酰胺两者。在一个实施方式中，Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列被Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:16)氨基酸序列替换。Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺对应于IgG1的Asn297。

在另一个实施方式中，恒定区包括CH2结构域和至少部分铰链区。铰链区可以是源自免疫球蛋白重链例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类别。优选地，铰链区源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他合适的类别。更优选地，铰链区源自人IgG1重链。在一个实施方式中，IgG1铰链区Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。在某些实施方式中，Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列被Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys(SEQ ID NO:18)氨基酸序列替换。在某些实施方式中，恒定区包括源自第一抗体同种型的CH2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。在某些实施方式中，CH2结构域源自人IgG2或IgG4重链，而铰链区源自经改变的人IgG1重链。

Fc部分与非Fc部分连接处附近的氨基酸改变会显著提高Fc融合蛋白的血清半衰期(PCT公开文本WO 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本公开的蛋白质或多肽的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链和促红细胞生成素天然序列的改变，优选距连接点约10个氨基酸以内。这些氨基酸改变会引起疏水性增强。在一个实施方式中，恒定区源自IgG序列，其中C末端的赖氨酸残基被替换。优选地，IgG序列的C末端赖氨酸被替换成非赖氨酸的氨基酸(诸如丙氨酸或亮氨酸)以进一步提高血清半衰期。在另一个实施方式中，恒定区源自IgG序列，其中，恒定区C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列具有消除潜在接合性T细胞表位的改变。例如，在一个实施方式中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ IDNO:19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:20)氨基酸序列替换。在其他实施方式中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)段内的氨基酸被其他氨基酸(诸如甘氨酸或脯氨酸)替换。在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或他类免疫球蛋白分子的C-末端附近产生Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)段氨基酸取代的方法可详见美国专利公开号20030166877，其公开内容通过引用纳入本文。

本公开的适宜铰链区可源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他免疫球蛋白类别。IgG1铰链区有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两个重链之间的二硫键。这些半胱氨酸使得Fc部分之间二硫键的形成高效且一致。因此，本公开的铰链区之一源自IgG1，例如，人IgG1。在一些实施方式中，人IgG1铰链区内的第一个半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选为丝氨酸。IgG2同种型铰链区有四个二硫键，它们倾向于促成重组系统分泌期间的寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可源自IgG2铰链，优选其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。已知IgG4的铰链区形成链间二硫键不大有效。然而，本公开的合适铰链区可以源自IgG4铰链区，优选含有增强重链衍生部分之间正确形成二硫键的突变(Angal S等，(1993)Mol.Immunol.,30:105-8)。

根据本公开，恒定区可包含源自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域和铰链区，例如杂交(hybrid)恒定区。例如，在一个实施方式中，恒定区含有源自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和源自IgG1的突变铰链区。或者，杂交恒定区中可采用源自其他IgG亚类的突变铰链区。例如，可以采用能够有效形成两个重链间二硫键的IgG4铰链突变形式。突变型铰链也可源自IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。杂交恒定区的组装可见美国专利公开号20030044423，其公开内容通过引用纳入本文。

根据本公开，恒定区可包含一处或多处本文所述的突变。Fc部分中突变的组合对延长血清半衰期和提高双功能分子体内效力具有累加或协同效应。因此，在一个示例性实施方式中，恒定区可包含(i)衍生自IgG序列的区域，其中Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:20)氨基酸序列替换；(ii)C-末端丙氨酸残基代替赖氨酸；(iii)衍生自不同抗体同种型的CH2结构域和铰链区，例如IgG2 CH2结构域和改变的IgG1铰链区；和(iv)消除IgG2衍生的CH2结构域内的糖基化位点的突变，例如IgG2衍生的CH2结构域内的Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:16)氨基酸序列而不是Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。

抗体片段

本公开的蛋白质和多肽还可包括抗体的抗原结合片段。示例性抗体片段包括scFv、Fv、Fab、F(ab’)2和单域VHH片段，例如来自骆驼科动物的那些。

单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)，是重组多肽，它们通常结合抗原或受体；这些片段包含至少一个抗体可变重链氨基酸序列(VH)片段以及用或不用一个或多个互连接头与之相连的至少一个抗体可变轻链序列(VL)片段。这样的接头可以是短的柔性肽，选来确保VL和VH结构域相连后正确的三维折叠，从而保留作为单链抗体片段来源的全抗体的靶分子结合特异性。通常，VL或VH序列的羧基末端通过这样的肽接头共价连接至互补VL和VH序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体文库展示或类似技术来产生。这些蛋白质可以在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中生产。

单链抗体片段包含具有本文所述完整抗体的可变区或CDR中至少其一的氨基酸序列，但缺失那些抗体的全部或部分恒定域。这些恒定域对于抗原结合来说不是必需的，但是构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服与采用包含部分或全部恒定区的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于不在生物分子与重链恒定区之间发生不希望有的相互作用或其他不希望有的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更高的毛细血管通透性，这令单链抗体片段能够更高效地寻址并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其生产。此外，单链抗体片段相对较小使得它们比完整抗体更不会在接受者中引发免疫反应。

还可以存在与完整抗体具有相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)2片段。抗体片段可包含完整抗体的全部六个CDR，但包含少于全部这些区域的片段(例如，三、四或五个CDR)同样具有功能。

药物组合物

本公开的特征还在于包含有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可被配制为用于多种药物递送系统。组合物中还可包括一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体以制成合适的制剂。可用于本公开的合适制剂可参见《雷明顿药物科学》第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company)，1985。关于药物递送方法的简要综述可参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

在一方面中，本公开提供了用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂，其包含500mg-2400mg的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含：能够结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成能结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在本公开的某些实施方式中，用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂可包括约500mg至约2400mg剂量(例如，约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至2400mg、约1400mg至2400mg、约1500mg至2400mg、约1600mg至2400mg、约1700mg至2400mg、约1800mg至2400mg、约1900mg至2400mg、约2000mg至2400mg、约2100mg至2400mg、约2200mg至2400mg或约2300mg至2400mg)的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约2100至约2000mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约2100mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括2100mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约1200mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约1800mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。

在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约2400mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括约2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))。

在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括2100mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包括2400mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))。

在某些实施方式中，用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂可包括约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg、约1200mg至约2900mg、约1200mg至约2800mg、约1200mg至约2700mg、约1200mg至约2600mg、约1200mg至约2500mg、约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约3000mg、约1400mg至约3000mg、约1500mg至约3000mg、约1600mg至约3000mg、约1700mg至约3000mg、约1800mg至约3000mg、约1900mg至约3000mg、约2000mg至约3000mg、约2100mg至约3000mg、约2200mg至约3000mg、约2300mg至约3000mg、约2400mg至约3000mg、约2500mg至约3000mg、约2600mg至约3000mg、约2700mg至约3000mg、约2800mg至约3000mg、约2900mg至约3000mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg)的本公开的蛋白质产物(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂可包括约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg、约1200mg至约2900mg、约1200mg至约2800mg、约1200mg至约2700mg、约1200mg至约2600mg、约1200mg至约2500mg、约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约3000mg、约1400mg至约3000mg、约1500mg至约3000mg、约1600mg至约3000mg、约1700mg至约3000mg、约1800mg至约3000mg、约1900mg至约3000mg、约2000mg至约3000mg、约2100mg至约3000mg、约2200mg至约3000mg、约2300mg至约3000mg、约2400mg至约3000mg、约2500mg至约3000mg、约2600mg至约3000mg、约2700mg至约3000mg、约2800mg至约3000mg、约2900mg至约3000mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg)的第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或者第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列。

在某些实施方式中，用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂可包括约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，包含第一多肽和第二多肽的抗PD-L1/TGFβ阱，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))。

本公开的用于TNBC的方法的静脉内药物递送制剂可以包含在袋、笔或注射器中。在某些实施方式中，袋可以连接包括管和/或针的通道。在某些实施方式中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方式中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，制剂可以是冷冻干燥的，并且约45mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自12、27或45个小瓶的冷冻干燥制剂合并以获得静脉内药物制剂中剂量的蛋白质。在某些实施方式中，制剂可以是第一多肽和第二多肽的蛋白质产物的液体制剂，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或者第一多肽和第二多肽的蛋白质产物的液体制剂，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列，并且储存为约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1900mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1800mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1700mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1600mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1500mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1400mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1300mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1100mg/小瓶、约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶、约250mg/小瓶至约900mg/小瓶、约250mg/小瓶至约800mg/小瓶、约250mg/小瓶至约700mg/小瓶、约250mg/小瓶至约600mg/小瓶、约250mg/小瓶至约500mg/小瓶、约250mg/小瓶至约400mg/小瓶、约250mg/小瓶至约300mg/小瓶、约300mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约400mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约500mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约600mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约700mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约800mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约900mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1000mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1100mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1200mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1300mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1400mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1500mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1600mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1700mg/小瓶至约2000mg/小瓶、约1800mg/小瓶至约2000mg/小瓶、或约1900mg/小瓶至约2000mg/小瓶)。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约600mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1200mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1800mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约2400mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约250mg/小瓶。

本公开提供了液体水物制剂，其在缓冲溶液中包括有效量的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)而形成制剂，该制剂用于TNBC的方法。

这些用于TNBC的方法的组合物可用常规灭菌技术灭菌，或可进行无菌过滤。所得的水性溶液可包装成原样使用(use as-is)型产品或冻干，冻干制剂在给药之前与无菌水性载体合并。制剂的pH通常在3至11之间，更优选为5至9之间或6至8之间，最优选为7至8之间，例如7至7.5之间。所得的固体形式的组合物可包装成多个单剂量单位，每个单剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可包装在容器中以获得灵活的量。

在某些实施方式中，本公开提供了用于TNBC的方法的具有延长的保质期的制剂，所述制剂包括本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))与甘露醇、柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。

在某些实施方式中，本公开的用于TNBC的方法的水性制剂制备成在pH缓冲溶液中包括本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列)；或第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列)。本发明的缓冲液的pH可以为约4至约8，例如约4至约8、约4.5至约8、约5至约8、约5.5至约8、约6至约8、约6.5至约8、约7至约8、约7.5至约8、约4至约7.5、约4.5至约7.5、约5至约7.5、约5.5至约7.5、约6至约7.5、约6.5至约7.5、约4至约7、约4.5至约7、约5至约7、约5.5至约7、约6至约7、约4至约6.5、约4.5至约6.5、约5至约6.5、约5.5至约6.5、约4至约6.0、约4.5至约6.0、约5至约6或约4.8至约5.5，或可具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也意图成为本公开的一部分。例如，意在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如，乙酸钠)、琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，用于TNBC的方法的制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围。在某些实施方式中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方式中，缓冲系统包括约1.3mg/ml的柠檬酸(例如，1.305mg/ml)、约0.3mg/ml的柠檬酸钠(例如，0.305mg/ml)、约1.5mg/ml的二水合磷酸氢二钠(例如，1.53mg/ml)、约0.9mg/ml的二水合磷酸二氢钠(例如，0.86)和约6.2mg/ml的氯化钠(例如，6.165mg/ml)。在某些实施方式中，缓冲系统包括约1-1.5mg/ml的柠檬酸、约0.25至约0.5mg/ml的柠檬酸钠、约1.25至约1.75mg/ml的二水合磷酸氢二钠、约0.7至约1.1mg/ml的二水合磷酸二氢钠和6.0至6.4mg/ml的氯化钠。在某些实施方式中，用氢氧化钠调节制剂的pH。

用作等张剂(tonicifier)并可稳定抗体的多元醇也可包括在制剂中。多元醇加入到制剂中的量可以根据制剂的所需等张性而不同。在某些实施方式中，水性制剂可以是等张的。加入的多元醇的量也可以相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(诸如海藻糖)相比，可以加入较低量的单糖(例如，甘露醇)。在某些实施方式中，可以在制剂中用作张力剂(tonicity agent)的多元醇是甘露醇。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约7.5至约15mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约10至约14mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约12mg/ml。在某些实施方式中，制剂中可包含多元醇山梨糖醇。

清洁剂或表面活性剂也可以加入到制剂中。示例性清洁剂包括非离子清洁剂，诸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。加入的清洁剂的量使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方式中，制剂可包括表面活性剂聚山梨醇酯。在某些实施方式中，制剂可含有清洁剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler，《辅料百科》(Lexikon der Hilfsstoffe)，Editio Cantor VerlagAulendorf出版，第4版，1996)。在某些实施方式中，制剂可含有约0.1mg/mL至约10mg/mL、或约0.5mg/mL至约5mg/mL的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。

冻干制剂

本公开的用于TNBC的方法的冻干制剂包括抗PD-L1/TGFβ阱分子和冻干保护剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方式中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包括缓冲剂、表面活性剂、填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。

可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖重量比。在某些实施方式中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。

在冻干之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以调节为约6至约8之间。在某些实施方式中，冻干药物产品的pH范围可以为约7至约8。

在某些实施方式中，可以约10mM-约200mM的量加入盐或缓冲组分。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

在某些实施方式中，可以添加“填充剂(bulking agent)”。“填充剂”是这样一种化合物，它增加冻干混合物的质量并有助于冻干块体的物理结构(例如，有助于生产保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼体)。示例性填充剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有此类填充剂。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。例如，添加防腐剂可以促进复用(多剂量)制剂的生产。

在某些实施方式中，用于在癌症患者中TNBC或抑制肿瘤生长的方法的冻干药物产品可以利用水性载体来复溶。本文所关注的水性载体是药学上可接受的(例如，对人给药安全且无毒)并且可在冻干后用于制备液体制剂。示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干药物产品用USP无菌注射用水(SWFI)或USP0.9％氯化钠注射液复溶。在复溶过程中，冻干粉末溶解成溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干蛋白质产物用4.5mL注射用水复溶并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

液体制剂

在实施方式中，将本公开的蛋白质产物配制成用于TNBC的方法的液体制剂。液体制剂可以10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，小瓶用橡皮塞封口并用铝卷边包封来密封。塞子可以由符合USP和Ph Eur.的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以填充有约61.2mL的蛋白质产物溶液，以允许有60mL的可提取体积。在某些实施方式中，液体制剂可以用0.9％盐水溶液稀释。在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列))的溶液，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，(例如，约1200mg至约3000mg、约1200mg至约2900mg、约1200mg至约2800mg、约1200mg至约2700mg、约1200mg至约2600mg、约1200mg至约2500mg、约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约3000mg、约1400mg至约3000mg、约1500mg至约3000mg、约1600mg至约3000mg、约1700mg至约3000mg、约1800mg至约3000mg、约1900mg至约3000mg、约2000mg至约3000mg、约2100mg至约3000mg、约2200mg至约3000mg、约2300mg至约3000mg、约2400mg至约3000mg、约2500mg至约3000mg、约2600mg至约3000mg、约2700mg至约3000mg、约2800mg至约3000mg、约2900mg至约3000mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg)的蛋白质产物(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列))至对象。

在某些实施方式中，小瓶可包含约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物溶液(第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；或第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，所述第一多肽包含SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:38、39和40的氨基酸序列)，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，(例如，约1200mg至约3000mg、约1200mg至约2900mg、约1200mg至约2800mg、约1200mg至约2700mg、约1200mg至约2600mg、约1200mg至约2500mg、约1200mg至约2400mg、约1200mg至约2300mg、约1200mg至约2200mg、约1200mg至约2100mg、约1200mg至约2000mg、约1200mg至约1900mg、约1200mg至约1800mg、约1200mg至约1700mg、约1200mg至约1600mg、约1200mg至约1500mg、约1200mg至约1400mg、约1200mg至约1300mg、约1300mg至约3000mg、约1400mg至约3000mg、约1500mg至约3000mg、约1600mg至约3000mg、约1700mg至约3000mg、约1800mg至约3000mg、约1900mg至约3000mg、约2000mg至约3000mg、约2100mg至约3000mg、约2200mg至约3000mg、约2300mg至约3000mg、约2400mg至约3000mg、约2500mg至约3000mg、约2600mg至约3000mg、约2700mg至约3000mg、约2800mg至约3000mg、约2900mg至约3000mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约2600mg、约2700mg、约2800mg、约2900mg或约3000mg)的蛋白质产物至对象。

在某些实施方式中，本公开的用于在癌症患者中TNBC或抑制肿瘤生长的方法的液体制剂可以制备成10mg/mL浓度的溶液，并与糖组合处于稳化水平。在某些实施方式中，液体制剂可以制备在水性载体中。在某些实施方式中，可以加入稳定剂，其量不大于可能导致粘度对静脉内给药来说不理想或不合适的量。在某些实施方式中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方式中，液体制剂还可包含缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

在某些实施方式中，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定液体制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，碱可以是氢氧化钠。

除聚集外，脱酰胺是肽和蛋白质的常见产物变体，可发生于发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物/药物产品储存和样本分析期间。脱酰胺是蛋白质中丢失NH3形成可水解的琥珀酰亚胺中间体。琥珀酰亚胺中间体导致亲本肽质量减少17单位。随后的水解导致质量增加18单位。由于在水性条件下的不稳定性，难以分离琥珀酰亚胺中间体。因此，脱酰胺通常可检测为1单位质量增加。天冬酰胺脱酰胺形成天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn后的Gly和Ser导致更易脱酰胺。

在某些实施方式中，本公开的用于在癌症患者中TNBC或抑制肿瘤生长的方法的液体制剂可以在pH和湿度条件下保存以防止蛋白质产物脱酰胺基。

本文所关注的水性载体是药学上可接受的(对人给药安全且无毒)并且可用于制备液体制剂示例性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。例如，添加防腐剂可以促进复用(多剂量)制剂的生产。

特定情况下，静脉内(IV)制剂可以是优选的给药途径，诸如当患者在移植后在医院中通过IV途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在给药前用0.9％氯化钠溶液稀释液体制剂。在某些实施方式中，用于注射的稀释药物产品是等张的并且适于通过静脉内输注给药。

在某些实施方式中，可以约10mM-约200mM的量加入盐或缓冲组分。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子、钾离子或铵离子可以用作反离子。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。例如，添加防腐剂可以促进复用(多剂量)制剂的生产。

本文所关注的水性载体是药学上可接受的(对人给药安全且无毒)并且可用于制备液体制剂示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进复用(多剂量)制剂的生产。

上述说明描述了本发明的多个方面和实施例。专利申请具体地考虑到了所述方面和实施例的所有组合和置换。

实施例

以上是对本公开的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本公开的某些方面和实施方式，无意于以任何方式限制本公开的范围。

实施例1：作为TNBC患者中响应抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质疗法的预测指标的HMGA2和MECOM的识别

该实施例涉及识别HMGA2和MECOM的方法，HMGA2和MECOM是TNBC患者中对于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质疗法的响应的两个预测指标(predictor)。利用抗PD-L1/TGFβ阱双功能蛋白质了33例TNBC患者，并分析这些患者的肿瘤样本以区分对于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应者与无响应者。

30个肿瘤样本中的每一个均由资格认证的病理学家标注。使用用于福尔马林固定、石蜡包埋的样本的Recoverall总核酸分离试剂盒(ThermoFisher Scientific)，从3个肿瘤含量>50％的4–5μm厚切片的全玻片刮片中提取RNA。从使用RNA试剂(LifeTechnologies)定量的200ng总RNA中，使用Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒(Illumina)耗竭核糖体RNA。使用NEBNext Ultra Directional RNA文库制备试剂盒(NEB)制备链特异性文库，并使用2x50碱基对配对末端测序在HiSeq2500(Illumina)上测序。获得了每个样本大约1亿次读数。

使用RECIST 1.1标准对患者对于抗PD-L1/TGFβ阱的响应进行编码。将响应者(具有病情稳定、部分缓解或完全缓解的最佳总体响应的一组对象)中的基因表达水平与无响应者(具有进展性疾病的最佳总体响应的一组对象)之间的基因表达水平进行比较。

使用Bowtie2版本2.2.3将测序读取与Ensembl 75人类基因组(GRCh37，2014年2月)进行比对。(Langmead,Nat Methods,9:357-359(2012))。使用带有Ensembl基因注释的RSEM版本1.2.31确定基因表达。(Li,BMC Bioinformatics 12:323(2011))。从进一步分析中排除一个具有异常少的可检测基因的离样本。通过比较RSEM计算的预期计数进行假设检验。将每百万转录物数(TPM)的值进行上四分位数归一化并进行对数转换用于进一步分析。

使用R版本3.3.1进行描述性统计分析。(Hornik K，R常见问题解答，可见于https://CRAN.R-project.org/doc/FAQ/R-FAQ.html)。相关系数是使用Pearson方法计算的。对于单个基因，使用“R”套件“DESeq2”确定差异表达的显著性；经FDR校正的p值<0.05被认为具有统计学意义。使用“R”套件“ggplot2”生成图。

在测试的60,234个带标注的转录本中，根据以下要求通过过滤鉴定一组候选生物标志物：(1)需要差异表达；(2)需要蛋白质编码基因；(3)需要最低表达；(4)需要组的分离。

需要差异表达：如上所述，首先使用DESeq2测试所有标注的基因；获得q值，表明差异表达的显著性。任何q值大于0.05的基因均被拒绝。

需要蛋白质编码基因：使用BiomaRt来确定我们所映射的每个转录物的Ensembl基因标识符是否对应于蛋白质编码基因模型。获得来自biomaRt的每个基因ID的“gene_biotype”，并将其分类为编码或非编码。以下生物型被归类为非编码：3prime_overlapping_ncrna、antisense、IG_C_pseudogene、IG_J_pseudogene、IG_V_pseudogene、lincRNA、miRNA、misc_RNA、Mt_rRNA、Mt_tRNA、pseudogene、rRNA、sense_intronic、sense_overlapping、snoRNA、snRNA、TR_J_pseudogene和TR_V_pseudogene。以下生物型被分类为编码：TR_D_gene、TR_C_gene、IG_C_gene、IG_J_gene、IG_D_gene、polymorphic_pseudogene、TR_J_gene、TR_V_gene、IG_V_gene、processed_transcript、protein_coding。具有非编码生物型的基因由于其低解释性而被拒绝作为生物标志物候选物。

需要最低表达：对于每个基因，鉴定响应者之间和无响应者之间的中位数TPM。如果给定基因的中位数TPM在响应者中和无响应者中低于0.5，则该基因被拒绝作为生物标志物候选者。

需要组的分离：理想的预测性生物标志物可以精确地将响应者与无响应者分开。DESeq2评估各组之间平均表达的差异，但是，即使每组的表达水平存在明显的重叠，也可以将平均值的差异称为显着(参见图4A-D)。此外，DESeq2可能对大的离值敏感。为了解决这两个问题，应用了Mann-Whitney U检验来测试组的分离。标称p值超过0.05的所有基因均被拒绝。

鉴定出28个基因满足所有要求。在这28个基因中，有两个基因HMGA2和MECOM被鉴定为在所有分析的基因中具有最大的统计学意义。图4A-D示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的若干潜在预测性生物标志物的log-TPM的箱形图。图4A示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的HMGA2的log-TPM的箱形图。图4B示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的MECOM的log-TPM的箱形图。图4C示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的CLEC3A的log-TPM的箱形图。图4D示出相对于利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者的响应状态绘制的CCNDBP1的log-TPM的箱形图。

为了证明组的分离的要求的效果，还分析了CLEC3A和CCNDBP1的表达水平。在通过了差异表达、蛋白质编码和最低表达的要求的所有基因中，这两个基因具有最低的DESeq2计算q值，但它们未能满足组的分离的要求(参见图4C-D(NE数据从假设检验中排除)))。对于这些基因，在响应者和无响应者两者中均观察到大倍数的变化。对于CLEC3A计算的大倍数变化似乎是由单一的大的离值驱动的，并且其余响应者之间的基因表达仅适度升高(参见图4C(NE数据从假设检验中排除))。尽管CCNDBP1表达在响应者中升高了9.6倍，但是响应者中CCNDBP1表达水平几乎覆盖了无响应者中的整个表达范围(参见图4D(NE数据从假设检验中排除))。从Mann-Whitney U检验获得的这些基因的大的p值准确地反映了这些缺点。

HMGA2和MECOM基因的增加的表达与乳腺癌的预后不良相关(Wu等，CancerLetters 2016；Wang等，Cancer Research 2017)。这种关联性表明，与响应呈正相关的观察结果并未因响应者疾病严重程度的降低而混淆。此外，这两个基因都与TGFβ生物学有众所周知的关联(Thualt等，Cell Biology 2006；Liu等，Oncogene 2006)，支持了它们在本发明的利用抗PD-L1/TGFb阱TNBC患者中的预测能力的机理解释。

如图2A(HMGA2)和图3B(MECOM)所示，与无响应者相比，发现了HMGA2和MECOM两者在响应者中的过表达均高出20倍以上。在图2A中，相对于对抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制HMGA2表达水平(每百万转录物数(TPM)的对数)(PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解)。高HMGA2表达被认为是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低HMGA2表达一样高的表达水平。如图2A所示，与无响应者中的表达水平相比，发现HMGA2表达显著更高(至少35倍)。NE数据从假设检验中排除。

在图3B中，相对于对抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的响应绘制MECOM表达水平(每百万转录物数(TPM)的对数)(PD＝进展性疾病；SD＝病情稳定；PR＝部分缓解)。高MECOM表达被认为是至少与响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的最低MECOM表达一样高的表达水平。如图3B所示，与无响应者中的表达水平相比，发现MECOM表达显著更高(至少20倍)。NE数据从假设检验中排除。

为了测试是否可以在利用抗PD-L1抗体的TNBC患者中预测临床响应，从转移性乳腺癌队列(METBRC)的转移性乳腺癌对象中提取数据。进行这项研究是为了区分对于利用抗PD-L1抗体的响应者与无响应者。在这项研究中，利用抗PD-L1抗体了转移性乳腺癌患者。考虑了三种不同的类别：(1)人表皮生长因子受体2阳性，“HER2+”，(2)人表皮生长因子受体2阴性，(雌激素受体阳性或孕激素受体阳性)，“HER2-，(ER+或PR+)”和(3)人表皮生长因子受体2阴性，(雌激素受体阴性且孕激素受体阴性)，“HER2-，(ER-且PR-)”。后一组相当于三阴性乳腺癌(TNBC)，而前2组被视为非TNBC。

对于利用抗PD-L1抗体的16名TNBC对象和21名非TNBC对象，RNAseq数据是可用的。图10是示出HMGA2表达(以每百万转录物数TPM表示)和利用抗PD-L1抗体的对象的TNBC状态的箱形图。图10显示在非TNBC对象与利用抗PD-L1抗体的TNBC对象之间，HMGA2基因的表达没有明显差异。

还评估了HMGA2的表达及其与抗PD-L1抗体的临床响应的关系。图11在单独的面板中示出HMGA2表达(以TPM表示)与利用抗PD-L1抗体的非TNBC(左)和TNBC(右)患者中响应的关系。如图11所示，在具有完全缓解(CR)的1名非TNBC的对象中存在HMGA2基因的低表达水平，而所有其他受试者无论对于抗PD-L1抗体的响应如何均显示出重叠的HMGA2表达水平。在具有部分缓解(PR)的1名TNBC对象中存在HMGA2基因的低表达水平，而所有其他受试者均显示出重叠的HMGA2表达水平。在这两种情况下(非TNBC和TNBC)，响应者(CR/PR)和无响应者(病情稳定，SD/进展性疾病，PD)之间似乎没有明显的区别。

本实施例中展示的数据表明，在利用本发明的抗PD-L1/TGFβ阱的TNBC患者中能够预测临床响应。当仅使用抗PD-L1抗体TNBC患者时，临床响应的预测不明确。

实施例2：HMGA2表达与TGF-β信号传导之间关联的评估

为了评估HMGA2表达与TGF-β信号传导之间的关联，进行了动物研究。简言之，通过将悬浮在0.1mL 1x PBS中的0.2x 106活4T1细胞注射到8-10周大的Balb/C小鼠的乳腺脂肪垫中，进行原位肿瘤注射。一旦肿瘤体积达到100-150mm3，将小鼠随机分配至以下组之一：对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱。对照组的小鼠给药400μg同种型对照(hIgG1)-抗PD-L1(mut)的剂量；阱对照的小鼠给药492μg抗PD-L1(mut)/TGFβ阱(抗PD-L1(mut)/TGFβ阱融合蛋白质，包含类似的重链融合多肽(SEQ ID No:7)和在可变区中具有突变A31G、D52E、R99Y从而消除与PD-L1的结合的轻链(SEQ ID No:6))的剂量；抗PD-L1组的小鼠给药400μg抗PD-L1的剂量；抗PD-L1/TGFβ阱组的小鼠通过静脉内注射给药492μg抗PD-L1/TGFβ阱的剂量，每三周一次。在第6天对实验动物实施安乐死并收获肿瘤样本。

对从四个组收获的肿瘤组织样本进行RNAseq。如实施例1中所述，除了将测序读数与Ensembl 75小鼠基因组(GRCm38，2014年2月)进行映射之外，用标准质量控制(QC)和比对流水线处理原始测序数据。生成归一化的表达数据，并将其用于HMGA2和TGF-β相关基因的表达分析。

为了评估HMGA2表达与TGF-β信号转导之间的关联，对HMGA2和TGF-β基因标签进行了Spearman相关分析(参见Korkut等，Cell Syst.2018,7,422-437.e7)。对对照动物(N＝12)和抗PD-L1/TGFβ阱的动物(N＝15)进行了单独的分析。在对照组中，HMGA2/TGF-β信号基因对中的30％(27/89)显示出统计学显著的R。换言之，在从对照的小鼠中提取的RNA中，有27个TGF-β信号基因的表达与HMGA2的表达相关。表1列出了在对照的动物中与基因对(HMGA2和TGF-β信号基因)相关的Spearman相关性R和p值。在抗PD-L1/TGFβ阱组中，HMGA2/TGF-β信号基因对中的55％(48/89)显示出统计学显著的R。抗PD-L1/TGFβTrap诱导的TGF-ββ特异的转录组变化，导致48个TGF-β信号转导基因表达与HMGA2表达相关。表2列出了在抗PD-L1/TGFβ阱组中与基因对相关的Spearman相关性R和p值。图5A-F是分别示出HMGA2与选择的TGF-β信号转导核心基因Tgfbr1、Tgfbr2、Smad3、Tgfb1、Tgfb2和Tgfb3之间的关联的散点图。图5A是示出HMGA2表达与Tgfbr1表达之间的关联的散点图。图5B是示出HMGA2与Tgfbr2表达之间的关联的散点图。图5C是示出HMGA2表达与Smad3表达之间的关联的散点图。图5D是示出HMGA2表达与Tgfb1表达之间的关联的散点图。图5E是示出HMGA2表达与Tgfb2表达之间的关联的散点图。图5F是示出HMGA2表达与Tgfb3表达之间的关联的散点图。图6A-F是分别示出HMGA2与选择的TGF-β信号转导靶基因Col1a1、Col1a2、Fn1、Vim、Vegfa和Zeb1之间的关联的散点图。图6A-F是示出HMGA2与选择的TGF-β信号转导靶基因之间的关联的散点图。图6A是示出HMGA2表达与Col1a1表达之间的关联的散点图。图6B是示出HMGA2表达与Col1a2表达之间的关联的散点图。图6C是示出HMGA2表达与Fn1表达之间的关联的散点图。图6D是示出HMGA2表达与Vim表达之间的关联的散点图。图6E是示出HMGA2表达与Vegfa表达之间的关联的散点图。图6F是示出HMGA2表达与Zeb1表达之间的关联的散点图。这些图表明HMGA2表达与TGF-β信号通路基因表达相关联。

表1.在对照动物中与HMGA2和TGF-β信号通路基因相关的Spearman相关性R和p值。

表2.在抗PD-L1/TGFβ阱组中与HMGA2和TGF-β信号通路基因相关的Spearman相关性R和p值。

除了关联研究，与对照小鼠相比，在抗PD-L1/TGFβ阱的小鼠中观察到HMGA2和关键TGF-β信号转导核心和靶基因表达的显着下调。图7A-F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中TGF-β信号基因表达的图表。图7A是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfbr1表达的图表。图7B是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfbr2表达的图表。图7C是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Smad3表达的图表。图7D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb1表达的图表。图7E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb2表达的图表。图7F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Tgfb3表达的图表。这些图表明抗PD-L1/TGFβ的动物组在Tgfbr1、Tgfbr2、Smad3、Tgfb1、Tgfb2和Tgfb3的表达中展现了下调。图8A-G是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中关键TGF-β靶基因表达的图表。图8A是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中HMGA2表达的图表。图8B是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Col1a1表达的图表。图8C是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Col1a2表达的图表。图8D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Fn1表达的图表。图8E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Vim表达的图表。图8F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Vegfa表达的图表。图8G是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中Zeb1表达的图表。图8A-8G分别表明抗PD-L1/TGFβ的动物组在HMGA2和TGF-β靶基因Col1a1、Col1a2、Fn1、Vim、Vegfa和Zeb1的表达中展现了下调。

还对HMGA2和PD-1/IFNγ(干扰素γ)信号标签进行了Spearman相关分析(参见M.Ayers等，J.Clin.Invest.127,2930–2940(2017))，分析表明，在对照组和抗PD-L1/TGFβ阱组中，分别只有11％(2/18)和17％(3/18)的PD-1/IFNγ信号基因对具有统计学显著的R。表3列出了在对照动物组中与基因对相关的Spearman相关性R和p值。表4列出了在抗PD-L1/TGFβ阱组中与基因对相关的Spearman相关性R和p值。图9A-C是分别示出HMGA2与选择的PD-1/IFNγ相关基因Ifng、Gzmb和Gzmk之间的关联的散点图。图9D-F分别示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中选择的PD-1/IFNγ相关基因Ifng、Gzmb和Gzmk的表达水平的图表。图9A是示出HMGA2表达与Ifng表达之间的关联的散点图。图9B是示出HMGA2表达与Gzmb表达之间的关联的散点图。图9C是示出HMGA2表达与Gzmk表达之间的关联的散点图。图9D是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Ifng表达的图表。图9E是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Gzmb表达的图表。图9F是示出对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物中Gzmk表达的图表。

表3.在对照动物组中与HMGA2和PD-1/IFNγ信号通路基因相关的Spearman相关性R和p值。

基因对 Spearman R P值 Hmga2-Cxcr6 -0.66434 0.021901 Hmga2-Gzmk -0.59441 0.045705 Hmga2-Ifng -0.49387 0.105021 Hmga2-Cxcl9 -0.3986 0.200954 Hmga2-Tagap -0.39161 0.209711 Hmga2-Cd3d -0.36364 0.246411 Hmga2-Nkg7 -0.32867 0.297333 Hmga2-Ccl5 -0.3007 0.342415 Hmga2-Stat1 -0.23077 0.470802 Hmga2-Lag3 -0.1958 0.543064 Hmga2-Gzmb 0.174825 0.588091 Hmga2-Cd2 -0.13287 0.68316 Hmga2-Cxcl10 -0.11888 0.71599 Hmga2-Ciita -0.1049 0.749263 Hmga2-Ido1 -0.08392 0.800385 Hmga2-Il2rg 0.013986 0.973891 Hmga2-Cd3e 0.006993 0.991026 Hmga2-Cxcl13 -0.00699 0.991026

表4.在抗PD-L1/TGFβ阱组中与HMGA2和PD-1/IFNγ信号通路基因相关的Spearman相关性R和p值。

基因对 Spearman R P值 Hmga2-Lag3 -0.89643 1.76E-05 Hmga2-Cd3d -0.875 4.78E-05 Hmga2-Gzmb 0.717857 0.0035 Hmga2-Nkg7 -0.47857 0.073469 Hmga2-Ccl5 -0.45219 0.091978 Hmga2-Cd2 -0.39286 0.148547 Hmga2-Tagap 0.389286 0.152504 Hmga2-Gzmk -0.375 0.169155 Hmga2-Ifng -0.32857 0.231684 Hmga2-Cxcl10 0.3 0.276736 Hmga2-Cxcr6 -0.26988 0.328113 Hmga2-Stat1 -0.25357 0.360726 Hmga2-Ciita 0.253571 0.360726 Hmga2-Cxcl9 -0.24643 0.374827 Hmga2-Ido1 0.235714 0.396592 Hmga2-Cxcl13 -0.20714 0.457799 Hmga2-Cd3e -0.20357 0.465738 Hmga2-Il2rg 0.175 0.532005

表5提供了对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中TGF-β信号基因的基因表达数据的总结。表6提供了对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中PD-1/IFNγ信号基因的基因表达数据的总结。

表5.对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中TGF-β信号基因的基因表达数据的总结。

表6.对照、阱对照、抗PD-L1和抗PD-L1/TGFβ阱的动物组中PD-1/IFNγ信号基因的基因表达数据的总结。

总体而言，基于Spearman R的量级和具有统计学显著的P值的基因对的数量，与对照组相比，在抗PD-L1/TGFβTrap组中HMGA2的表达与TGF-β信号传导具有更强的关联，表明HMGA2表达对于通过抗PD-L1/TGFβ阱诱导的TGF-β特异性转录组学改变有响应。HMGA2和PD-1阻断响应应信号之间的统计学显著关联的较低百分比表明HMGA2的表达较少指示免疫相关基因的变化。数据说明HMGA2表达指示TGF-β信号传导活性，因此可以用作分层和/或响应生物标志物。

实施例3：鉴别可能响应抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质疗法的TNBC患者的方法

RT-qPCR是分析靶标的基因表达的半定量方法，并且是一种用于确定HMGA2基因表达水平的方法。或者，使用数字液滴PCR(ddPCR)确定HMGA2基因表达水平，其允许在给定样品中对于靶标的拷贝的绝对定量。确定HMGA2基因表达水平的另一种替代检测方法是HTGEdgeSeq NGS技术，这是一种基于定量核酸酶保护化学的靶向RNA测序，可实现对FFPE组织和多种其他样本类型的mRNA/miRNA的无提取定量，并且可以提供HMGA2和上游/下游标志物的扩大的通路覆盖范围。检测接受指标包括特异性、鲁棒性、灵敏度(LOD和LOQ)、效率和线性度、精密度(重复性)以及检测内和检测间变异性。一旦建立了检测方法，将在CLIA/CAP认证的实验室中进行分析验证和临床验证。

RT-qPCR

RT-qPCR是一种相对于持家基因的表达水平分析靶标的基因表达的半定量方法。有许多针对HMGA2的Taqman qPCR检测分析以及针对HMGA2的Bio-Rad PrimePCR检测分析，可商购获得。使用一组引物/探针在从TNBC患者中获得的样本中确定HMGA2RNA表达水平，使用合成构建体(SEQ ID NO:65)确保确保检测的线性度和引物/探针组的效率，该合成构建体跨越各个检测中涵盖的所有区域。使用从高HMGA2表达细胞系(例如乳腺癌细胞系，例如SW480或MCF7，用HMGA2转染)提取的RNA转化的cDNA和从TNBC患者的FFPE样本提取的RNA转化的cDNA，测试生物样品。

合成构建体提供于SEQ ID NO:65

GCGAAGCGGCTGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCGGGAGGCAGGATGAGCGCACGCGGTGAGGGCGCGGGGCAGCCGTCCACTTCAGCCCAGGGACAACCTGCCGCCCCAGCGCCTCAGAAGAGAGGACGCGGCCGCCCCAGGAAGCAGCAGCAAGAACCAACCGGTGAGCCCTCTCCTAAGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCACAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAGGTCAATGTTGCCTTGCCTGGGAAGGACCACCCGGGCAATCTTATATATCTACTGTTCTCTAAA

数字液滴PCR

数字液滴PCR(ddPCR)允许在给定样品中对于靶标的拷贝的绝对定量。与qPCR相比，这是一个明显的优势，但是在临床环境中可能更难以实施。然而，对于具有低HMGA2组织丰度的组织样本，考虑使用ddPCR以确定HMGA2表达水平。使用稀释的cDNA构建体、源自患者的cDNA和来自HMGA2阳性或阴性的细胞系的cDNA，对每个检测进行比较。

HTG EdgeSeq

HTG EdgeSeq NGS技术是一种基于定量核酸酶保护化学的靶向RNA测序，可实现对FFPE组织和多种其他样本类型的mRNA/miRNA的无提取定量。与标准RNA测序相比，该化学方法显著降低了样品输入量要求。低样品输入量和简化的工作流程的结合使HTG EdgeSeqNGS成为临床应用中的引人注意的技术。该面板(panel)现成可用，并且用于扩大HMGA2和上游/下游标志物的通路覆盖范围。

RNA-seq分析

因为RNA-seq仅提供相对RNA丰度，所以如下确定相对于人平均值的截止值：首先，检查大的RNA-seq数据集(TCGA)，并从数据库中获得HMGA2和MECOM的体中位数表达。确认将此数据库的人中位数从本研究的响应者中的最低表达分离开的分离因子对于HMGA2为2.27，对于MECOM为1.54。

在使用RNA-seq确定了这些因素之后，如下获得绝对截止值：首先选择具有绝对(而非相对)表达定量的基因表达检测法，使用该检测法在TNBC患者中分别测量HMGA2和MECOM表达中位数，然后将该中位数乘以相应的分离因子。

用ComBat进行批次校正后，发现响应者中最低的HMGA2表达为0.700log-TPM。TCGA-BRCA-TNBC中HMGA2的中位数表达为-0.483。log-2标度下1.18的差异对应于2.27的分离系数。换言之，HMGA2表达高于TNBC患者中人平均值至少2.27倍的患者可能响应抗PD-L1-TGFβ。对于MECOM，在响应者中的最低表达是2.35log-TPM，而在TCGA-BRCA-TNBC中的中位数表达是1.73log-TPM，分离因子为1.54，这表明MECOM表达表达高于TNBC患者中人平均值至少1.54倍的患者可能响应抗PD-L1-TGFβ。

实施例4：在从利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC患者获得的样本中确定HMGA2水平的方法

该实施例涉及在从TNBC患者获得的样本中确定HMGA2水平的方法，以确定对于抗PD-L1/TGFβ蛋白质疗法的响应性。使用定量实时PCR、数字液滴PCR和HTG EdgeSeq系统，用于使用人类FFPE样本的高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)的检测。

RNA提取：从各种商业来源获得三阴性乳腺癌(TNBC)的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本(肿瘤百分率范围为25-100％)。将FFPE块切成5μM切片，并单独收集在试管中。对于每个样本，使用Qiagen RNesay FFPE试剂盒(产品号73504)从两个FFPE卷中提取RNA。每个样本的两个等分试样保持分开，直到将样本添加到膜旋转谱柱(membrane spincolumn)中为止。这样可以使石蜡更完全熔化，而且也可以浓缩样本。在30μL水中从旋转谱柱洗脱样品。

RNA定量

提取后，使用Qubit RNA宽幅检测试剂盒(产品号Q10211)对RNA进行定量。将提取的RNA稀释至1：66.67(3μL RNA+197μL Qubit工作溶液)。如果样本超出了Qubit检测中作为对照的可接受范围，则将样本进一步稀释，或根据需要使用较低的稀释度以产生可靠的浓度读数。

RNA质量评估

还使用Agilent RNA 6000 Nano试剂盒(产品号5067-1512)在AgilentBioanalyzer平台上运行RNA样本以评估提取的RNA的质量。

反转录

使用Invitrogen/ThermoFisher Superscript IV VILO预混液(产品号11766050)从模板RNA转录cDNA。每个反应使用100ng RNA。根据制造商的规程，向每个反应中添加4μLSuperscript IV VILO预混液以及足够的无核酸酶水，使总体积达到20μL。对于每个样本，可以将多个反应组合，从而在一个反应中将尽可能多的RNA转化为cDNA。在RNA浓度太低的情况下，以最大可能的浓度进行转录反应。然后将所有反应混合物在25℃孵育15分钟，然后在50℃孵育15分钟，最后在85℃孵育10分钟。然后将cDNA储存在-20℃直至准备使用。

使用Applied Biosystems 7500Dx仪器进行qPCR。简言之，qPCR混合物由来自Thermo Fisher的10μL Taqman 2X基因表达预混液(产品号4369016)、1μL的Taqman HMGA2引物探针组Hs0017569_m1(SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:64)或Taqman ACTB引物探针组Hs01060665_g1、4μL来自样品的cDNA和5μL H2O组成，总反应体积为20μL。如果没有“现成的”基因表达检测方法，靶基因(SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:64)和持家基因的引物/探针组可以使用Primer设计。然后按照以下规程运行qPCR：在50℃保持2分钟，在95℃保持10分钟，在95℃15秒然后在60℃1分钟的循环进行40次。使用软件的自动分析功能执行阈值化处理。

qPCR分析：

对于基因表达的相对定量，使用比较delta Ct(ΔCt)法。进行qPCR样品分析时，查看原始HMGA2循环阈值(Ct)值和持家基因Ct值两者，并且计算(HMGA2的Ct值-持家基因的Ct值)得出Delta Ct值。在示例性实施方式中，ACTB(β肌动蛋白)可用作持家基因。在示例性实施方式中，ΔCt值可以计算为(HMGA2的Ct值-ACTB的Ct值)。在某些实施方式中，可以使用多于一个持家基因，并且可以平均从持家基因获得的Ct值。在某些实施方式中，ΔCt值可以计算为(HMGA2的Ct值-一个或多个持家基因的平均Ct值)。较低的ΔCt值或较低的原始Ct值表示较高的HMGA2表达。

数字液滴PCR(ddPCR)

为了证实最初的qPCR结果，在相同的样本上进行作为正交方法的ddPCR，但是使用更适合于ddPCR应用的不同的引物/探针组。制备22μL ddPCR反应混合物，其由11μL的Bio-Rad ddPCR探针超混合液(产品号186-3026)、1μL的HMGA2 Bio-Rad ddPCR检测ID:dHSaCPE5029086 FAM探针、1μL的ACTB Bio-Rad ddPCR检测ID:dHsaCPE5190200 HEX探针、4μL来自样品的cDNA和5μL H2O组成。在Bio-Rad AutoDG仪器中生成液滴，然后在以下条件下在VeritiDx热循环仪中扩增：保持95℃10分钟，94℃30秒然后60℃1分钟的循环40次，保持98℃10分钟，保持4℃至少30分钟。扩增后，将PCR反应转移至Bio-Rad QX200读板仪，并分析液滴。为每个样本手动设置阈值，以为每个样本区分阳性液滴和阴性液滴。

ddPCR分析：

使用QuantaSoft软件进行各个实验的样本分析。基于在相应的无模板对照(NTC)中检测到的阴性簇，使用手动设置的荧光阈值确定所有样本中的阳性液滴浓度。单个样本中的靶DNA浓度(份数/mL)和绝对液滴计数用作定量结果测量。ddPCR提供作为分数/孔(反应)的绝对定量，因此更高的ddPCR比率值对应于更高的HMGA2表达。进行qPCR样品分析时，查看原始HMGA2拷贝数和已依据从一个或多个管家基因获得的拷贝数归一化的HMGA2拷贝数两者。归一化的拷贝数计算为(HMGA2的拷贝数/单一(或平均)持家基因的拷贝数)。在示例性实施方式中，ACTB(β肌动蛋白)可用作持家基因。

HTG EdgeSeq：

将FFPE标本刮入试管中并在HTG的裂解缓冲液中裂解，随后引入基因特异性DNA核酸酶保护探针(NPP)。在使NPP与可在生物基质中溶解或交联的它们的靶RNA杂交后，添加S1核酸酶以去除过量的未杂交的NPP和RNA，仅留下与它们的靶RNA杂交的NPP。由此，实现了靶RNA向NPP的化学计量转化，产生了NPP与RNA的实质上的1:1比例。qNPA步骤在HTG EdgeSeq处理器上是自动执行的，随后进行PCR以添加测序接头和标签。使用标准规程，在新一代测序(NGS)平台上对标记的样本进行汇总、清洁和测序。来自NGS仪器的数据由HTG EdgeSeq解析器软件处理和报告。

基于HMGA2表达的利用抗PD-L1/TGFβ阱的患者人选择

实施例1中给出的数据表明，与不响应抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC患者(无响应者)相比，响应抗PD-L1/TGFβ阱的TNBC患者(响应者)中HMGA2存在显著过表达。此部分说明了使用表示高HMGA2表达的截止值(例如，Ct值或计数水平)选择利用抗PD-L1/TGFβ的患者的方法。在某些实施方式中，用以选择将响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者人的HMGA2高表达截止值是通过整合从RNA-seq获得的数据以及从qPCR和/或ddPCR获得的数据而推论的。从RNA-seq获得的TPM值可以转换为能够从绝对定量方法(例如，qPCR或ddPCR)中获得的定量值。生成一个传递函数，该函数将从RNA-seq获得的TPM值映射到Ct值(对于qPCR)或ddPCR比率值(对于ddPCR)。此传递函数用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct或ddPCR比率水平。在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct值的传递函数是：

Y1＝X1-log2(TPM最低/TPM基线)；

其中Y1＝Ct值截止值；

X1＝归一化的ΔCt值(HMGA2的相对qPCR表达中位数)；

TPM最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的Ct值的传递函数是：

Y1＝X1-log2(TPM第二最低/TPM基线)；

其中Y1＝Ct值截止值；

X1＝归一化的ΔCt值(HMGA2的相对qPCR表达中位数)；

TPM第二最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的ddPCR比率值的传递函数是：

Y1＝X1×(TPM最低/TPM基线)；

其中Y1＝ddPCR比率值截止值；

X1＝归一化的ddPCR比率值(HMGA2的ddPCR比率值中位数)；

TPM最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，用于查能够提供关于HMGA2高表达的截止值的相应的ddPCR比率值的传递函数是：

Y1＝X1×(TPM第二最低/TPM基线)；

其中Y1＝ddPCR比率值截止值；

X1＝归一化的ddPCR比率值(HMGA2的ddPCR比率值中位数)；

TPM第二最低＝从响应于抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的患者中的RNA-seq获得的第二最低的HMGA2表达(TPM值)；

TPM基线＝不论临床响应如何，所有患者中的HMGA2表达中位数。

在某些实施方式中，获得一组足够大小的肿瘤样本(例如，50、100、150、200或250个肿瘤样本)，并且对每个样进行RNA-seq和qPCR(或ddPCR)以产生匹配的数据集，该数据集允许通过RNA-seq和qPCR的HMGA2表达定量的直接比较。通过执行作为TPM的函数的样条回归建模表达水平，可以qPCR Ct值(或ddPCR比率值)的模型传递函数(参见Friedman,JeromeH.“多元自适应回归样条(Multivariate adaptive regression splines.)”Annals ofStatistics 19.1(1991):1-67；还参见Kuhn,Max和Kjell Johnson.应用预测建模(AppliedPredictive Modeling).Vol.26.New York:Springer,2013)。通过将新数据集中的HMGA2分布与从实施例1所述的数据集获得的HMGA2分布进行比较，来测试传递函数的有效性和任何总体批次效应的量级。一旦确定了批次效应不会损害此模型传递函数的实用性，则可以采用此传递函数获得高HMGA2表达截止值。

来自RNA-seq的HMGA2表达数据(倍数变化推导法)：在利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC患者的示例性人队列中，使用福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)肿瘤样本(n＝118)提取RNA并评估RNA的质量，如实施例4中所述。对通过质量控制的样本(n＝103)进行的RNA-seq分析(如实施例1中所述)显示，HMGA2表达在响应者与无响应者相比中的平均值差异为32倍。相同的示例性人队列显示，无论临床响应如何，所有患者中HMGA2的中位数表达为9.82每百万转录本数(TPM)，响应者中最低的HMGA2表达为18.86TPM，响应者中第二最低的HMGA2表达为177.75TPM。

使用Ct值的HMGA2表达截止值(倍数变化推导法)：并行地，使用实施例4中所述的方法对通过质量控制的所有样本(n＝103)进行qPCR实验，以获得HMGA2和管家基因β-肌动蛋白的表达Ct值。使用实施例4中描述的用于qPCR实验的分析方法(比较ΔCt方法)，获得12.1的ΔCt(HMGA2的中位数相对qPCR表达)。然后使用以下等式获得自由(liberal)截止Ct值：

自由截止Ct值＝归一化的HMGA2ΔCt值-log2(18.86/9.82)

在示例性实施例中，使用12.1的ΔCt值获得11.6的自由截止Ct值，这表明具有11.16以下的Ct值的患者被分类为高HMGA2并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。

类似地，使用以下等式获得保守(conservative)截止Ct值：

保守截止Ct值＝归一化的HMGA2ΔCt值-log2(177.75/9.82)

在示例性实施例中，使用12.1的ΔCt值获得7.92的保守截止Ct值，这表明具有7.92以下的Ct值的患者被分类为高HMGA2并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。

使用ddPCR比率值的HMGA2表达截止值(倍数变化推导法)：并行地，使用实施例4中所述的方法对103个肿瘤样本中的58个进行ddPCR实验，以获得HMGA2和管家基因β-肌动蛋白的表达值。在某些实施方式中，进行通过ddPCR的相对于β-肌动蛋白的HMGA2表达的定量，以建立高和低HMGA2表达之间的截止值。在示例性实施方式中，使用以下等式获得的中位数ddPCR比率为0.054：

ddPCR比率＝(HMGA2拷贝数/β-肌动蛋白拷贝数)x 10000

使用中位数ddPCR比率，使用以下等式获得自由截止值：

自由截止值＝HMGA2中位数ddPCR比率x(18.86/9.82)

在示例性实施方式中，使用0.054的中位数ddPCR比率获得0.104的自由截止值，这表明具有0.104以上的ddPCR比率的患者被分类为高HMGA2并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。类似地，使用以下等式获得保守截止值：

保守截止值＝HMGA2中位数ddPCR x(177.75/9.82)

在示例性实施方式中，使用0.054的中位数ddPCR值获得0.976的保守截止值，这表明具有0.976以上的ddPCR比率的患者被分类为高HMGA2并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。

来自RNA-seq的HMGA2表达数据(百分位数推导法)：在利用抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质的TNBC患者的示例性人队列中，使用福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)肿瘤样本(n＝118)提取RNA并评估RNA的质量，如实施例4中所述。对通过质量控制的样本(n＝103)进行的RNA-seq分析(如实施例1中所述)显示，在响应者中最低的HMGA2表达在28个样本中排名第22，对应于第78.6百分位。在响应者中第二最低的HMGA2表达在28个样本中排名第26，对应于第92.9百分位。

使用Ct值的HMGA2表达截止值(百分位数推导法)：在某些实施方式中，进行qPCR实验以获得HMGA2表达的相对定量，以建立高和低HMGA2表达之间的截止值。在一个示例性实施方式中，在第78.6百分位的相对qPCR表达为8.7的ΔCt值(自由截止值)，表明ΔCt值为8.7以下的患者将被分类为HMGA2高并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。在另一个示例性实施方式中，在第92.9百分位的相对qPCR表达为6.9的ΔCt值(保守截止值)，表明ΔCt值为6.9以下的患者将被分类为HMGA2高并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。

使用ddPCR比率值的HMGA2表达截止值(百分位数推导法)：在某些实施方式中，可以通过ddPCR定量HMGA2表达，以建立高和低HMGA2表达之间的截止值。在一个示例性实施方式中，在第78.6百分位的相对ddPCR表达为0.467的ddPCR比率值(自由截止值)，表明HMGA2相对表达为0.467以上的患者将被分类为HMGA2高并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。在另一个示例性实施方式中，在第92.9百分位的相对ddPCR表达为1.375(保守截止值)，表明HMGA2相对表达为1.375以上的患者将被分类为HMGA2高并且适合于利用抗PD-L1/TGFβ阱的。表7列出了通过qPCR和ddPCR获得的示例性表达截止值，并且通过倍数变化推导法和百分位数推导法进行了分析。截止值取决于分析方法的能力(例如人队列大小)，并且可以随着样本大小和人特征之间的差异(例如，年龄、性别、种族、吸烟习惯、饮食习惯、身体质量指数(BMI)、娱乐物使用、医疗使用和/或运动习惯)而变化。

表7.HMGA2表达截止值和经计算预测响应于利用抗PD-L1/TGFβ阱的的样本数量的总结

实施例5：对先前的难治或有抗性的TNBC患者的

目的：选择转移性和难治性(3L+)三阴性乳腺癌(TNBC)患者，利用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱，并评估安全性和效力。

研究设计和结果：利用抗PD-L1/TGFβ阱以每2周一次1200mg的剂量总共33例患者，直到确认为进展性疾病、不可耐受的毒性或退出试验。三阴性乳腺癌患者中抗PD-L1/TGFβ阱扩展队列的安全摘要在下面列出。该队列中的患者每2周接受1200mg抗PD-L1/TGFβ阱。

参加该队列的33名患者的中位数随访时间为18.0周(范围：4.0-31.7周)，并且接受了平均3.8剂(范围：1.0-12.0剂)。两名患者(6.1％)为正在进行中。31名患者因进展性疾病(n＝26，78.8％)、死亡(n＝1，3.0％，由于疾病进展)、不良事件(n＝2，6.1％，转氨酶升高，溶血)、不遵守规程(n＝1，3.0％，患者不能守约)以及撤回同意书(n＝1，3.0％，临床进展并接受临终关怀)而中止试验。

表8列出了在3个以上患者中发生的不论与抗PD-L1/TGFβ阱关系如何的紧急不良事件(TEAE)，以及所有3级以上的AE。最常见的TEAE包括呼吸困难(n＝10，30.3％)、贫血(n＝9，27.3％)、腹泻(n＝8，24.2％)、乏力(n＝8，24.2％)、发热(n＝8，24.2％)、食欲下降(8，24.2％)和头痛(n＝8，24.2％)。有5例患者(15.2％)经历了被研究者评估为与抗PD-L1/TGFβ阱有关的7个3+级事件。这些包括溶血(5级)、血小板减少(5级)、呼吸困难(5级)、贫血(3级，3个事件)和转氨酶升高(3级)。被研究者评估为与抗PD-L1/TGFβ阱有关的3个G5事件发生于一名患者，该患者在试验进入时患有广泛的疾病，并在3剂后同时发现多发性肺栓塞、进展性疾病和扩大的胸腔积液。在病情检查中未鉴定出自身抗体介导的溶血或血小板减少。包括角化棘皮瘤和皮肤鳞状细胞癌在内的皮肤病变(与对于其他TGF-β抑制剂所鉴定的相似)在试验中接受给药的约3-5％的患者中发生，并通过手术切除得到了良好的控制。但是，在该队列中未发生这些皮肤病变。总之，抗PD-L1/TGFβ阱的耐受性良好，并且安全特性与该经过大量预处理的晚期三阴性乳腺癌队列的期望相符。

表8.利用抗PD-L1/TGFβ阱的三阴性乳腺癌患者的紧急不良事件(TEAE)。列出了在三例以上患者发生的AE以及所有3+级事件作为首选项。列出了不论与抗PD-L1/TGFβ阱关系如何的事件。

主要系统器官类别 任何级别 级别≥3 级别≥4 级别5 首选项 n(％) n(％) n(％) n(％) 具有至少1个事件的对象 33(100％) 19(57.6) 11(33.3) 8(24.2) 呼吸困难 10(30.3) 3(9.1) 1(3.0) 1(3.0) 贫血 9(27.3) 5(15.2) 0 0 腹泻 8(24.2) 0 0 0 乏力 8(24.2) 2(6.1) 2(6.1) 0 发热 8(24.2) 1(3.0) 0 0

主要系统器官类别 任何级别 级别≥3 级别≥4 级别5 首选项 n(％) n(％) n(％) n(％) 食欲下降 8(24.2) 0 0 0 头痛 8(24.2) 0 0 0 腹痛 5(15.2) 0 0 0 便秘 5(15.2) 0 0 0 恶心 5(15.2) 0 0 0 呕吐 5(15.2) 0 0 0 疾病进展 5(15.2) 4(12.1) 4(12.1) 4(12.1) AST升高 5(15.2) 2(6.1) 0 0 四肢疼痛 5(15.2) 1(3.0) 0 0 鼻出血 4(12.1) 0 0 0 咳嗽 5(15.2) 0 0 0 上呼吸道感染 4(12.1) 0 0 0 低钾血症 4(12.1) 1(3.1) 0 0 焦虑 4(12.1) 0 0 0 胸腔积液 4(12.1) 2(6.1) 0 0 瘙痒 4(12.1) 0 0 0 心动过速 3(9.1) 0 0 0 一般身体健康恶化 3(9.1) 3(9.1) 1(3.0) 1(3.0) 疲劳 3(9.1) 1(3.0) 0 0 外周性水肿 3(9.1) 0 0 0 干性皮肤 3(9.1) 0 0 0 皮疹 3(9.1) 0 0 0 ALT升高 2(6.1) 1(3.0) 0 0 ALP升高 2(6.1) 2(6.1) 0 0 GGT升高 2(6.1) 2(6.1) 0 0 血胆红素升高 2(6.1) 1(3.0) 0 0 低白蛋白血症 2(6.1) 1(3.0) 0 0 关节痛 2(6.1) 1(3.0) 0 0 溶血 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 白细胞增多 1(3.0) 1(3.0) 0 0 血小板减少 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 血栓性微血管病 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 心包填塞 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 0 多器官功能障碍 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 乳腺炎 1(3.0) 1(3.0) 0 0 挫伤 1(3.0) 1(3.0) 0 0

主要系统器官类别 任何级别 级别≥3 级别≥4 级别5 首选项 n(％) n(％) n(％) n(％) 脊柱压缩性骨折 1(3.0) 1(3.0) 0 0 淀粉酶升高 1(3.0) 1(3.0) 0 0 血红蛋白降低 1(3.0) 1(3.0) 0 0 淋巴细胞计数降低 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 0 转氨酶升高 1(3.0) 1(3.0) 0 0 低镁血症 1(3.0) 1(3.0) 0 0 低钠血症 1(3.0) 1(3.0) 0 0 肌肉骨骼痛 1(3.0) 1(3.0) 0 0 转移至中枢神经系统 1(3.0) 1(3.0) 1(3.0) 0 肿瘤疼痛 1(3.0) 1(3.0) 0 0 脑病 1(3.0) 1(3.0) 0 0 肺栓塞 1(3.0) 1(3.0) 0 0 皮肤病变 1(3.0) 1(3.0) 0 0 颈静脉血栓形成 1(3.0) 1(3.0) 0 0 淋巴水肿 1(3.0) 1(3.0) 0 0 上腔静脉综合症 1(3.0) 1(3.0) 0 0

如叙述中所述，1例患者被研究者评估为具有与抗PD-L1/TGFβ阱有关的3个G5TEAE(呼吸困难、溶血、血小板减少)。另外7例具有G5事件的患者未归因为与抗PD-L1/TGFβ阱有关。根据规程，当患者在最近一次给药后的28天内因进展性疾病死亡而死亡时，或者如果研究者评估疾病进展比预期的发生得更快时，则记录TEAE“进展性疾病”。

在一个示例性实施方式中，每三周一次以1800mg的BW非依赖性剂量向TNBC癌症患者施用抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2100mg的BW非依赖性剂量向TNBC癌症患者施用抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2400mg的BW非依赖性剂量向TNBC癌症患者施用抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个示例性实施方式中，每三周一次以2400mg、2800mg或3000mg的BW非依赖性剂量向TNBC癌症患者施用抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，例如，50分钟至80分钟)。在一个以上示例性实施方式中，为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，在每剂抗-PD-L1/TGFβ阱之前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间观察到≥2级输液反应，则不停止预先用药。禁止使用类固醇作为预先用药。

下面是该实施例中患者的纳入标准。患者：

-在知情同意时≥18岁(包括)

-具有组织学确诊的TNBC

-局有基于RECIST 1.1版(参见Eisenhauer等，EJC.2009；45:228-247)可测量的疾病

-自诊断为转移性和难治性(3L+)TNBC(完成细胞毒性化疗、生物疗法、和/或作为新辅助/辅助疗法的一部分的放射是允许的，只要在诊断为转移性疾病前至少6个月完成)起未接受在先系统性疗法，或靶向T-细胞共调节蛋白(免疫检查点)的抗体或药物如抗-PDL1或抗-CTLA-4抗体

-预期寿命至少为12周(根据医生对诊断后患者预后的评估)

-有可用的肿瘤物质(<6个月大)足以进行生物标志物分析

-东部合作肿瘤协作组表现状态(ECOG PS)为0到1

-有足够的血液学功能，其认定为绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×109/L，血小板计数≥100×109/L，血红蛋白(Hgb)≥9g/dL

-具有足够的肝功能，其认定为总胆红素水平≤1.5×正常上限(ULN)，天冬氨酸转氨酶(AST)水平≤3.0×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)水平≤3.0×ULN且碱性磷酸酶≤2.5ULN。对于肝脏受累于肿瘤的参试者，天冬氨酸转氨酶(AST)≤5.0×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)≤5.0×ULN，且胆红素≤3.0是可接受的。

-具有足够的肾功能，其认定为肌酐≤1.5×ULN，或计算的肌酐清除率>30mL/分钟；已及

-有足够的凝血功能，其认定为国际标准化比值(INR)或凝血酶原时间(PT)≤1.5×ULN，除非参试者正在接受抗凝血剂；且活化部分凝血活酶时间(aPTT)≤1.5×ULN，除非参试者正在接受抗凝血剂。

实施例6：具有高HMGA2表达的TNBC患者的

目的：本研究的目的是确定在患有晚期三阴性乳腺癌(TNBC)的患者中抗PD-L1/TGFβ阱的最佳总体响应(BOR)，所述患者具有在一线全身化疗时或之后具有高HMGA2表达肿瘤和疾病进展。

研究设计：这是II期单臂生物标志物驱动的试验，以评价抗PD-L1/TGFβ阱对高表达HMGA2的晚期三阴性乳腺癌(TNBC)患者的临床疗效。

在一个示例性实施方式中，对来自TNBC患者的肿瘤筛查高HMGA2表达，其认定为至少高于TNBC患者中人平均的2.27倍的HMGA2表达水平。所有参试者都需要肿瘤材料，以通过集中式RT-PCR确认HMGA2状态，并且可以包括新鲜的活检或存档材料。

约29名满足高HMGA2表达的预定截止值的患者参与到研究中。每14天(+/-3天)一次，以每次输注1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白患者。持续直至确认了疾病进展、不可耐受的毒性、持续的确定的完全缓解或试验退出为止，最长可长达两年。可选地，在与研究医学监测机构讨论之后，如果确定患者可以从持续中受益，则可以进行更长的和超过已确认的疾病进展的。

为了减轻潜在的输液相关反应，可选择地，在前两剂抗PD-L1/TGFβ阱之前施用抗组胺药和对乙酰氨基酚的预先用药。曾接受类固醇药物预先的患者未从研究中排除。

效力评估：根据RECIST 1.1标准，每6-8周+/-7天通过CT成像评估对抗PD-L1/TGFβ阱的响应。在后续访试中重复在基线执行的扫描。通常，在随后的肿瘤评估访视时使用相同的成像方法并且优选相同的成像设备跟踪在基线处检测到的病灶。计算总体缓解率(ORR)、无进展生存期(PFS)和缓解持续时间(DOR)，并将其与历史对照进行比较。

持续至根据《实体瘤疗效评估标准1.1版》(RECIST 1.1)确认的进展性疾病(PD)、不可耐受的毒性或长达24个月。出现病情稳定(SD)、部分缓解(PR)或完全缓解(CR)的患者持续，直至24个月的终点，尽管可能有额外的。在与研究医学监测机构讨论之后，如果确定患者可以从持续中受益，则可以进行超过已确认的疾病进展的。

在整个过程中，通过记录、报告和分析医学基线状况、不良事件、体检发现(包括生命体征、ECOG表现状态和实验室检查)持续评估在高HMGA2的患有晚期经历的三阴性乳腺癌(TNBC)的患者中抗PD-L1/TGFβ阱的安全性。

结果：通过总体缓解率(ORR)评估客观肿瘤疗效，其定义为达到完全缓解(CR)或部分缓解(PR)的总体最佳响应(BOR)的参试者数除以在此分析中的参试者数。无进展生存期定义为从随机分组到根据RECIST 1.1评估的客观疾病进展(PD)的首次记录日或到任何原因所致死亡的时间，取二者中先发生的那个。预期的是利用抗PD-L1/TGFβ阱的对于高HMGA2表达的TNBC患者产生改善的临床响应。接受的患者表现出疾病缓解(如部分缓解、完全缓解、病情稳定)和/或生存期(如无进展生存期和/或总生存期)改善。预期的是利用抗PD-L1/TGFβ阱的与系统性化疗相比导致高HMGA2表达的TNBC患者的优异的生存率。

在另一个示例性实施方式中，对TNBC患者筛查高MECOM表达，其认定为高于TNBC患者中人平均的1.73倍的MECOM表达水平。然后，对满足高MECOM表达预定截止值的30名患者进行了相同的研究。

总之，发现HMGA2是用于确定在TNBC患者中利用抗PD-L1/TGFβ阱的改善的响应的可靠的新生物标志物。

编号的实施方式

本文中公开的实施方式包括本公开的编号的实施方式中提供的实施方式P1至P92。

实施方式P1：一种或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包含向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)相对于已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而所述患者的TNBC。

实施方式P2：一种实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，所述方法包含向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)相对于已知对照水平具有增加的表达水平的患者施用抗TGFβ剂，从而实现所述患者的TNBC的至少部分响应。

实施方式P3：一种识别适合于利用抗TGFβ剂或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述方法包含确定所述患者的高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)水平，其中在所述患者中HMGA2相对于已知对照水平的增加的表达水平将所述患者识别为适合于利用所述抗TGFβ剂TNBC。

实施方式P4：根据实施方式P1至P3的任意一项所述的方法，其中通过分析源自所述患者的组织样本确定所述患者的HMGA2水平。

实施方式P5：根据实施方式P4所述的方法，其中所述组织样本是活检样本、血液、血清或血浆样本。

实施方式P6：根据实施方式P4或P5所述的方法，其中通过免疫化学或通过RNA表达分析确定HMGA2水平。

实施方式P7：根据实施方式P1至P6的任意一项所述的方法，其中所述抗TGFβ剂是抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区；其中所述第一多肽的所述重链和所述第二多肽的所述轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

实施方式P8：根据实施方式P7所述的方法，其中向所述患者施用至少1200mg所述抗TGFβ剂。

实施方式P9：根据实施方式P7所述的方法，其中向所述患者施用至少1800mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P10：根据实施方式P7所述的方法，其中向所述患者施用1800mg至3000mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P11：根据实施方式P7所述的方法，其中向所述患者施用1800mg至2100mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P12：根据实施方式P7所述的方法，其中向所述患者施用1200mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P13：根据实施方式P12所述的方法，其中每三周一次向所述患者施用1200mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P14：根据实施方式P10所述的方法，其中向所述患者施用2400mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P15：根据实施方式P14所述的方法，其中每三周一次向所述患者施用2400mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P16：根据实施方式P10所述的方法，其中每三周一次向所述患者施用2100mg或3000mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P17：根据实施方式P1至P16的任意一项所述的方法，其中增加的HMGA2表达已经通过定量HMGA2 mRNA表达而确定。

实施方式P18：根据实施方式P17所述的方法，其中通过PCR定量HMGA2mRNA表达。

实施方式P19：根据实施方式P1至P18的任意一项所述的方法，其中增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值HMGA2表达的至少2.27倍。

实施方式P20：根据实施方式P1至P19的任意一项所述的方法，其中增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值HMGA2表达的至少5倍。

实施方式P21：根据实施方式P1至P18的任意一项所述的方法，其中增加的HMGA2表达比HMGA2正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

实施方式P22：根据实施方式P1至P18的任意一项所述的方法，其中在患者中增加的HMGA2表达是对利用所述抗TGFβ剂的无响应的患者中的HMGA2表达的至少19-35倍。

实施方式P23：根据实施方式P1至P16的任意一项所述的方法，其中增加的HMGA2表达已经通过HMGA2蛋白表达水平而确定。

实施方式P24：根据实施方式P23所述的方法，其中增加的HMGA2蛋白表达水平已经通过免疫组织化学而确定。

实施方式P25：根据实施方式P24所述的方法，其中来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞表达HMGA2蛋白确定了增加的HMGA2蛋白表达水平。

实施方式P26：一种或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包含向已被确定为MECOM相对于已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而所述患者的TNBC。

实施方式P27：一种实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，所述方法包含向已被确定为MECOM相对于已知对照水平具有增加的表达水平的患者施用抗TGFβ剂，从而实现所述患者的TNBC的至少部分响应。

实施方式P28：一种识别适合于利用抗TGFβ剂或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述方法包含确定所述患者的MECOM水平，其中在所述患者中MECOM相对于已知对照水平的增加的表达水平将所述患者识别为适合于利用所述抗TGFβ剂TNBC。

实施方式P29：根据实施方式P26至P28的任意一项所述的方法，其中通过分析源自所述患者的样本确定所述患者的MECOM水平。

实施方式P30：根据实施方式P29所述的方法，其中所述样本是活检样本、血液、血清或血浆样本。

实施方式P31：根据实施方式P29或P30所述的方法，其中通过免疫化学或通过RNA表达分析确定MECOM水平。

实施方式P32：根据实施方式P26至P31的任意一项所述的方法，其中所述抗TGFβ剂是抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区；其中所述第一多肽的所述重链和所述第二多肽的所述轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

实施方式P33：根据实施方式P32所述的方法，其中向所述患者施用至少1200mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P34：根据实施方式P32或P33所述的方法，其中向所述患者施用至少1800mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P35：根据实施方式P34所述的方法，其中向所述患者施用1800mg至3000mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P36：根据实施方式P35所述的方法，其中向所述患者施用1800mg至2100mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P37：根据实施方式P36所述的方法，其中向所述患者施用1200mg所述蛋白质。

实施方式P38：根据实施方式P37所述的方法，其中每两周一次向所述患者施用1200mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P39：根据实施方式P35所述的方法，其中向所述患者施用2400mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P40：根据实施方式P39所述的方法，其中每三周一次向所述患者施用2400mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P41：根据实施方式P35所述的方法，其中每三周一次向所述患者施用3000mg所述抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质。

实施方式P42：根据实施方式P26至P41的任意一项所述的方法，其中增加的MECOM表达已经通过定量MECOM mRNA表达而确定。

实施方式P43：根据实施方式P42所述的方法，其中通过PCR定量MECOM mRNA表达。

实施方式P44：根据实施方式P26至P43的任意一项所述的方法，其中增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均MECOM表达水平的至少1.5倍。

实施方式P45：根据实施方式P26至P43的任意一项所述的方法，其中增加的MECOM表达是TNBC患者中所述已知人平均MECOM表达水平的至少2.5倍。

实施方式P46：根据实施方式P26至P43的任意一项所述的方法，其中增加的MECOM表达比MECOM正常表达水平更高至少100％、更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

实施方式P47：根据实施方式P26至P43的任意一项所述的方法，其中在患者中增加的MECOM表达是对利用所述抗TGFβ剂的无响应的患者中的MECOM表达的至少19倍。

实施方式P48：根据实施方式P26至P41的任意一项所述的方法，其中增加的MECOM表达已经通过定量MECOM蛋白而确定。

实施方式P49：根据实施方式P48所述的方法，其中增加的MECOM蛋白水平已经通过免疫组织化学而确定。

实施方式P50：根据实施方式P49所述的方法，其中来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞表达MECOM蛋白确定了增加的MECOM蛋白表达水平。

实施方式P51：一种抗TGFβ剂，其用于或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包含向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)相对于已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而所述患者的TNBC。

实施方式P52：一种抗TGFβ剂，其用于实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，所述方法包含向已被确定为高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)相对于已知对照水平具有增加的表达水平的患者施用抗TGFβ剂，从而实现所述患者的TNBC的至少部分响应。

实施方式P53：一种抗TGFβ剂，其用于识别适合于利用抗TGFβ剂或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述方法包含确定所述患者的高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)水平，其中在所述患者中HMGA2相对于已知对照水平的增加的表达水平将所述患者识别为适合于利用所述抗TGFβ剂TNBC。

实施方式P54：根据实施方式P51至P53的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中通过分析源自所述患者的组织样本确定所述患者的HMGA2水平。

实施方式P55：根据实施方式P54所述用途的抗TGFβ剂，其中所述组织样本是活检样本、血液、血清或血浆样本。

实施方式P56：根据实施方式P54或P55所述用途的抗TGFβ剂，其中通过免疫化学或通过RNA表达分析确定HMGA2水平。

实施方式P57：根据实施方式P51至P56的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2表达已经通过定量HMGA2 mRNA表达而确定。

实施方式P58：根据实施方式P57所述用途的抗TGFβ剂，其中通过PCR定量HMGA2mRNA表达。

实施方式P59：根据实施方式P51至P58的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值HMGA2表达的至少2.27倍。

实施方式P60：根据实施方式P51至P59的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2表达是TNBC患者中已知人平均值HMGA2表达的至少5倍。

实施方式P61：根据实施方式P51至P58的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2表达比HMGA2正常表达水平更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

实施方式P62：根据实施方式P51至P58的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中在患者中增加的HMGA2表达是对利用所述抗TGFβ剂的无响应的患者中的HMGA2表达的至少19-35倍。

实施方式P63：根据实施方式P51至P56的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2表达已经通过HMGA2蛋白表达水平而确定。

实施方式P64：根据实施方式P63所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的HMGA2蛋白表达水平已经通过免疫组织化学而确定。

实施方式P65：根据实施方式P64所述用途的抗TGFβ剂，其中来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞表达HMGA2蛋白确定了增加的HMGA2蛋白表达水平。

实施方式P66：一种抗TGFβ剂，其用于或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包含向已被确定为MECOM相对于已知对照水平具有增加的表达水平的对象施用抗TGFβ剂，从而所述患者的TNBC。

实施方式P67：一种抗TGFβ剂，其用于实现三阴性乳腺癌(TNBC)患者的或提高生存率的至少部分响应的方法，所述方法包含向已被确定为MECOM相对于已知对照水平具有增加的表达水平的患者施用抗TGFβ剂，从而实现所述患者的TNBC的至少部分响应。

实施方式P68：一种抗TGFβ剂，其用于识别适合于利用抗TGFβ剂或管理患者的三阴性乳腺癌(TNBC)的患者的方法，所述方法包含确定所述患者的MECOM水平，其中在所述患者中MECOM相对于已知对照水平的增加的表达水平将所述患者识别为适合于利用所述抗TGFβ剂TNBC。

实施方式P69：根据实施方式P66至P68的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中通过分析源自所述患者的样本确定所述患者的MECOM水平。

实施方式P70：根据实施方式P69所述用途的抗TGFβ剂，其中所述样本是活检样本、血液、血清或血浆样本。

实施方式P71：根据实施方式P69或P70所述用途的抗TGFβ剂，其中通过免疫化学或通过RNA表达分析确定MECOM水平。

实施方式P72：根据实施方式P66至P71的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM表达已经通过定量MECOM mRNA表达而确定。

实施方式P73：根据实施方式72所述用途的抗TGFβ剂，其中通过PCR定量MECOMmRNA表达。

实施方式P74：根据实施方式P66至P73的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM表达是TNBC患者中已知人平均MECOM表达水平的至少1.5倍。

实施方式P75：根据实施方式P66至P73的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM表达是TNBC患者中所述已知人平均MECOM表达水平的至少2.5倍。

实施方式P76：根据实施方式P66至P73的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM表达比MECOM正常表达水平更高至少100％、更高至少200％、更高至少300％、更高至少400％、更高至少500％、更高至少600％、更高至少700％、更高至少800％、更高至少900％、更高至少1000％或更多。

实施方式P77：根据实施方式P66至P73的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中在患者中增加的MECOM表达是对利用所述抗TGFβ剂的无响应的患者中的MECOM表达的至少19倍。

实施方式P78：根据实施方式P66至P71的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM表达已经通过定量MECOM蛋白而确定。

实施方式P79：根据实施方式P78所述用途的抗TGFβ剂，其中增加的MECOM蛋白水平已经通过免疫组织化学而确定。

实施方式P80：根据实施方式P79所述用途的抗TGFβ剂，其中来自TNBC患者的组织样本中多于1％肿瘤细胞表达MECOM蛋白确定了增加的MECOM蛋白表达水平。

实施方式P81：根据实施方式P51至P80的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中所述抗TGFβ剂是抗PD-L1/TGFβ阱蛋白质，包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：(a)能够结合人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，所述第二多肽包含结合PD-L1的抗体的至少轻链可变区；其中所述第一多肽的所述重链和所述第二多肽的所述轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

实施方式P82：根据实施方式P51至P81的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是1200mg至3000mg。

实施方式P83：根据实施方式P82所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是1200mg。

实施方式P84：根据实施方式P83所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是1200mg，每两周施用一次。

实施方式P85：根据实施方式P51至P82的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是2100mg至2400mg。

实施方式P86：根据实施方式P85所述用途的抗TGFβ剂，其中蛋白质每三周施用一次。

实施方式P87：根据实施方式P86所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是2100mg，每三周施用一次。

实施方式P88：根据实施方式P86所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是2400mg，每三周施用一次。

实施方式P89：根据实施方式P51至P82的任意一项所述用途的抗TGFβ剂，其中剂量是3000mg，每三周施用一次。

实施方式P90：根据实施方式P51至P89的任意一项所述的抗TGFβ剂，其中蛋白质通过静脉内给药施用。

实施方式P91：根据实施方式P90所述用途的抗TGFβ剂，其中所述静脉内给药是用包含制剂的预填充袋、预填充笔或预填充注射器进行的，所述制剂包含所述蛋白质。

实施方式P92：根据实施方式P91所述用途的抗TGFβ剂，其中所述袋连接包含管和/或针的通道。

序列

SEQ ID NO:1

分泌的抗PD-L1λ轻链的肽序列

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:2

分泌的抗PDL1的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:3

分泌的抗PDL1/TGFβ阱的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:4

抗PD-L1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的DNA序列(VL之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)

atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggcCAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTGggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcccccaccgagtgctcaTGA

SEQ ID NO:5

从翻译起始密码子至翻译终止密码子的DNA序列(mVK SP前导序列：小写下划线；VH：大写；含K至A突变的IgG1m3：小写字母；(G4S)x4-G(SEQ ID NO:11)接头：粗体大写字母；TGFβRII：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)

atggaaacagacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccacaggcGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtgct

SEQ ID NO:6

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱的λ轻链的多肽序列，具有突变A31G、D52E、R99Y

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:7

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱的重链的多肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:8

人TGFβRII同种型A前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_001020018)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:9

人TGFβRII同种型B前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_003233)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:10

人TGFβRII同种型B胞外域多肽

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:11

(Gly4Ser)4Gly接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG

SEQ ID NO:12

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A的重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:13

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A的轻链可变区的多肽序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR

SEQ ID NO:14

分泌的抗PD-L1抗体YW243.55S70的重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO:50

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:51

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:52

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:53

截短的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

LCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:54

突变的人TGFβRII同种型B胞外域多肽

VTDNAGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:55

抗PD-L1抗体的重链可变区的多肽序列

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO:56

抗PD-L1抗体的轻链可变区的多肽序列

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:57

抗PD-L1抗体的重链可变区的多肽序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:58

抗PD-L1抗体的轻链可变区的多肽序列

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:59

抗PD-L1抗体的重链的多肽序列

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:60

抗PD-L1抗体的轻链的多肽序列

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:61

抗PD-L1抗体的重链的多肽序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA

SEQ ID NO:62

抗PD-L1抗体的轻链的多肽序列

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:63

HMGA2变体1RefSeq NM_003483.4

>NM_003483.4智人高迁移率组蛋白AT-钩2(HMGA2)，转录变体1，mRNA

CTTGAATCTTGGGGCAGGAACTCAGAAAACTTCCAGCCCGGGCAGCGCGCGCTTGGTGCAAGACTCAGGAGCTAGCAGCCCGTCCCCCTCCGACTCTCCGGTGCCGCCGCTGCCTGCTCCCGCCACCCTAGGAGGCGCGGTGCCACCCACTACTCTGTCCTCTGCCTGTGCTCCGTGCCCGACCCTATCCCGGCGGAGTCTCCCCATCCTCCTTTGCTTTCCGACTGCCCAAGGCACTTTCAATCTCAATCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC

TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCAGGGTGGGGGGAAGAGGAGGAGGAATTCTTTCCCCGCCTAACATTTCAAGGGACACAATTCACTCCAAGTCTCTTCCCTTTCCAAGCCGCTTCCGAAGTGCTCCCGGTGCCCGCAACTCCTGATCCCAACCCGCGAGAGGAGCCTCTGCGACCTCAAAGCCTCTCTTCCTTCTCCCTCGCTTCCCTCCTCCTCTTGCTACCTCCACCTCCACCGCCACCTCCACCTCCGGCACCCACCCACCGCCGCCGCCGCCACCGGCAGCGCCTCCTCCTCTCCTCCTCCTCCTCCCCTCTTCTCTTTTTGGCAGCCGCTGGACGTCCGGTGTTGATGGTGGCAGCGGCGGCAGCCTAAGCAACAGCAGCCCTCGCAGCCCGCCAGCTCGCGCTCGCCCCGCCGGCGTCCCCAGCCCTATCACCTCATCTCCCGAAAGGTGCTGGGCAGCTCCGGGGCGGTCGAGGCGAAGCGGCTGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCGGGAGGCAGGATGAGCGCACGCGGTGAGGGCGCGGGGCA

GCCGTCCACTTCAGCCCAGGGACAACCTGCCGCCCCAGCGCCTCAGAAGAGAGGACGCGGCCGCCCCAGGAAGCAGCAGCAAGAACCAACCGGTGAGCCCTCTCCTAAGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCACAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAGGAGGAAACTGAAGAGACATCCTCACAAGAGTCTGCCGAAGAGGACTAGGGGGCGCCAACGTTCGATTTCTACCTCAGCAGCAGTTGGATCTTTTGAAGGGAGAAGACACTGCAGTGACCACTTATTCTGTATTGCCATGGTCTTTCCACTTTCATCTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGGAGGGGGGGGTGGGGTGGGGAGAAATCACATAACCTTAAAAAGGACTATATTAATCACCTTCTTTGTAATCCCTTCACAGTCCCAGGTTTAGTGAAAAACTGCTGTAAACACAGGGGACACAGCTTAACAATGCAACTTTTAATTACTGTTTTCTTTTTTCTTAACCTACTAATAGTTTGTTGATCTGATAAGCAAGAGTGGGCGGGTGAGAAAAACCGAATTGGGTTTAGTCAATCACTGCACTGCATGCAAACAAGAAACGTGTCACACTTGTGACGTCGGGCATTCATATAGGAAGAACGCGGTGTGTAACACTGTGTACACCTCAAATACCACCCCAACCCACTCCCTGTAGTGAATCCTCTGTTTAGAACACCAAAGATAAGGACTAGATACTACTTTCTCTTTTTCGTATAATCTTGTAGACACTTACTTGATGATTTTTAACTTTTTATTTCTAAATGAGACGAAATGCTGATGTATCCTTTCATTCAGCTAACAAACTAGAAAAGGTTATGTTCATTTTTCAAAAAGGGAAGTAAGCAAACAAATATTGCCAACTCTTCTATTTATGGATATCACACATATCAGCAGGAGTAATAAATTTACTCACAGCACTTGTTTTCAGGACAACACTTCATTTTCAGGAAATCTACTTCCTACAGAGCCAAAATGCCATTTAGCAATAAATAACACTTGTCAGCCTCAGAGCATTTAAGGAAACTAGACAAGTAAAATTATCCTCTTTGTAATTTAATGAAAAGGTACAACAGAATAATGCATGATGAACTCACCTAATTATGAGGTGGGAGGAGCGAAATCTAAATTTCTTTTGCTATAGTTATACATCAATTTAAAAAGCAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGCAATCTCTCTCTGTGTCTTTCTCTCTCTCTCTTCCTCTCCCTCTCTCTTTTCATTGTGTATCAGTTTCCATGAAAGACCTGAATACCACTTACCTCAAATTAAGCATATGTGTTACTTCAAGTAATACGTTTTGACATAAGATGGTTGACCAAGGTGCTTTTCTTCGGCTTGAGTTCACCATCTCTTCATTCAAACTGCACTTTTAGCCAGAGATGCAATATATCCCCACTACTCAATACTACCTCTGAATGTTACAACGAATTTACAGTCTAGTACTTATTACATGCTGCTATACACAAGCAATGCAAGAAAAAAACTTACTGGGTAGGTGATTCTAATCATCTGCAGTTCTTTTTGTACACTTAATTACAGTTAAAGAAGCAATCTCCTTACTGTGTTTCAGCATGACTATGTATTTTTCTATGTTTTTTTAATTAAAAATTTTTAAAATACTTGTTTCAGCTTCTCTGCTAGATTTCTACATTAACTTGAAAATTTTTTAACCAAGTCGCTCCTAGGTTCTTAAGGATAATTTTCCTCAATCACACTACACATCACACAAGATTTGACTGTAATATTTAAATATTACCCTCCAAGTCTGTACCTCAAATGAATTCTTTAAGGAGATGGACTAATTGACTTGCAAAGACCTACCTCCAGACTTCAAAAGGAATGAACTTGTTACTTGCAGCATTCATTTGTTTTTTCAATGTTTGAAATAGTTCAAACTGCAGCTAACCCTAGTCAAAACTATTTTTGTAAAAGACATTTGATAGAAAGGAACACGTTTTTACATACTTTTGCAAAATAAGTAAATAATAAATAAAATAAAAGCCAACCTTCAAAGAAACTTGAAGCTTTGTAGGTGAGATGCAACAAGCCCTGCTTTTGCATAATGCAATCAAAAATATGTGTTTTTAAGATTAGTTGAATATAAGAAAATGCTTGACAAATATTTTCATGTATTTTACACAAATGTGATTTTTGTAATATGTCTCAACCAGATTTATTTTAAACGCTTCTTATGTAGAGTTTTTATGCCTTTCTCTCCTAGTGAGTGTGCTGACTTTTTAACATGGTATTATCAACTGGGCCAGGAGGTAGTTTCTCATGACGGCTTTTGTCAGTATGGCTTTTAGTACTGAAGCCAAATGAAACTCAAAACCATCTCTCTTCCAGCTGCTTCAGGGAGGTAGTTTCAAAGGCCACATACCTCTCTGAGACTGGCAGATCGCTCACTGTTGTGAATCACCAAAGGAGCTATGGAGAGAATTAAAACTCAACATTACTGTTAACTGTGCGTTAAATAAGCAAATAAACAGTGGCTCATAAAAATAAAAGTCGCATTCCATATCTTTGGATGGGCCTTTTAGAAACCTCATTGGCCAGCTCATAAAATGGAAGCAATTGCTCATGTTGGCCAAACATGGTGCACCGAGTGATTTCCATCTCTGGTAAAGTTACACTTTTATTTCCTGTATGTTGTACAATCAAAACACACTACTACCTCTTAAGTCCCAGTATACCTCATTTTTCATACTGAAAAAAAAAGCTTGTGGCCAATGGAACAGTAAGAACATCATAAAATTTTTATATATATAGTTTATTTTTGTGGGAGATAAATTTTATAGGACTGTTCTTTGCTGTTGTTGGTCGCAGCTACATAAGACTGGACATTTAACTTTTCTACCATTTCTGCAAGTTAGGTATGTTTGCAGGAGAAAAGTATCAAGACGTTTAACTGCAGTTGACTTTCTCCCTGTTCCTTTGAGTGTCTTCTAACTTTATTCTTTGTTCTTTATGTAGAATTGCTGTCTATGATTGTACTTTGAATCGCTTGCTTGTTGAAAATATTTCTCTAGTGTATTATCACTGTCTGTTCTGCACAATAAACATAACAGCCTCTGTGATCCCCATGTGTTTTGATTCCTGCTCTTTGTTACAGTTCCATTAAATGAGTAATAAAGTTTGGTCAAAACAGAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:64

MECOM RefSeq NM_001105077.3

>NM_001105077.3智人MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)，转录变体1，mRNA

CCTTGCCAAGTAACAGCTTTGCTGTCCAACATCGTGTGCTGCTTCGCGAGAAAGTCACATTCGGACCCTTTGGCTAGATTGCTTATTCATAGGGCTTCTTGACTAAAGCCCTTGGAGCACTGGGTTTTTCTTGAAGTATATGATCTTAGACGAATTTTACAATGTGAAGTTCTGCATAGATGCCAGTCAACCAGATGTTGGAAGCTGGCTCAAGTACATTAGATTCGCTGGCTGTTATGATCAGCACAACCTTGTTGCATGCCAGATAAATGATCAGATA

TTCTATAGAGTAGTTGCAGACATTGCGCCGGGAGAGGAGCTTCTGCTGTTCATGAAGAGCGAAGACTATCCCCATGAAACTATGGCGCCGGATATCCACGAAGAACGGCAATATCGCTGCGAAGACTGTGACCAGCTCTTTGAATCTAAGGCTGAACTAGCAGATCACCAAAAGTTTCCATGCAGTACTCCTCACTCAGCATTTTCAATGGTTGAAGAGGACTTTCAGCAAAAACTCGAAAGCGAGAATGATCTCCAAGAGATACACACGATCCAGGAGTGTAAGGAATGTGACCAAGTTTTTCCTGATTTGCAAAGCCTGGAGAAACACATGCTGTCACATACTGAAGAGAGGGAATACAAGTGTGATCAGTGTCCCAAGGCATTTAACTGGAAGTCCAATTTAATTCGCCACCAGATGTCACATGACAGTGGAAAGCACTATGAATGTGAAAACTGTGCCAAGCAGGTTTTCACGGACCCTAGCAACCTTCAGCGGCACATTCGCTCTCAGCATGTCGGTGCCCGGGCCCATGCATGCCCGGAGTGTGGCAAAACGTTTGCCACTTCGTCGGGCCTCAAACAACACAAGCACATCCACAGCAGTGTGAAGCCCTTTATCTGTGAGGTCTGCCATAAATCCTATACTCAGTTTTCAAACCTTTGCCGTCATAAGCGCATGCATGCTGATTGCAGAACCCAAATCAAGTGCAAAGACTGTGGACAAATGTTCAGCACTACGTCTTCCTTAAATAAACACAGGAGGTTTTGTGAGGGCAAGAACCATTTTGCGGCAGGTGGATTTTTTGGCCAAGGCATTTCACTTCCTGGAACCCCAGCTATGGATAAAACGTCCATGGTTAATATGAGTCATGCCAACCCGGGCCTTGCTGACTATTTTGGCGCCAATAGGCATCCTGCTGGTCTTACCTTTCCAACAGCTCCTGGATTTTCTTTTAGCTTCCCTGGTCTGTTTCCTTCCGGCTTGTACCACAGGCCTCCTTTGATACCTGCTAGTTCTCCTGTTAAAGGACTATCAAGTACTGAACAGACAAACAAAAGTCAAAGTCCCCTCATGACACATCCTCAGATACTGCCAGCTACACAGGATATTTTGAAGG

CACTATCTAAACACCCATCTGTAGGGGACAATAAGCCAGTGGAGCTCCAGCCCGAGAGGTCCTCTGAAGAGAGGCCCTTTGAGAAAATCAGTGACCAGTCAGAGAGTAGTGACCTTGATGATGTCAGTACACCAAGTGGCAGTGACCTGGAAACAACCTCGGGCTCTGATCTGGAAAGTGACATTGAAAGTGATAAAGAGAAATTTAAAGAAAATGGTAAAATGTTCAAAGACAAAGTAAGCCCTCTTCAGAATCTGGCTTCAATAAATAATAAGAAAGAATACAGCAATCATTCCATTTTCTCACCATCTTTAGAGGAGCAGACTGCGGTGTCAGGAGCTGTGAATGATTCTATAAAGGCTATTGCTTCTATTGCTGAAAAATACTTTGGTTCAACAGGACTGGTGGGGCTGCAAGACAAAAAAGTTGGAGCTTTACCTTACCCTTCCATGTTTCCCCTCCCATTTTTTCCAGCATTCTCTCAATCAATGTACCCATTTCCTGATAGAGACTTGAGATCGTTACCTTTGAAAATGGAACCCCAATCACCAGGTGAAGTAAAGAAACTGCAGAAGGGCAGCTCTGAGTCCCCCTTTGATCTCACCACTAAGCGAAAGGATGAGAAGCCCTTGACTCCAGTCCCCTCCAAGCCTCCAGTGACACCTGCCACAAGCCAAGACCAGCCCCTGGATCTAAGTATGGGCAGTAGGAGTAGAGCCAGTGGGACAAAGCTGACTGAGCCTCGAAAAAACCACGTGTTTGGGGGAAAAAAAGGAAGCAACGTCGAATCAAGACCTGCTTCAGATGGTTCCTTGCAGCATGCAAGACCCACTCCTTTCTTTATGGACCCTATTTACAGAGTAGAGAAAAGAAAACTAACTGACCCACTTGAAGCTTTAAAAGAGAAATACTTGAGGCCTTCTCCAGGATTCTTGTTTCACCCACAATTCCAACTGCCTGATCAGAGAACTTGGATGTCAGCTATTGAAAACATGGCAGAAAAGCTAGAGAGCTTCAGTGCCCTGAAACCTGAGGCCAGTGAGCTCTTACAGTCAGTGCCCTCTATGTTCAACTTCAGGGCGCCTCCCAATGCCCTGCCAGAGAACCTTCTGCGGAAGGGAAAGGAGCGCTATACCTGCAGATACTGTGGCAAGATTTTTCCAAGGTCTGCAAACCTAACACGGCACTTGAGAACCCACACAGGAGAGCAGCCTTACAGATGCAAATACTGTGACAGATCATTTAGCATATCTTCTAACTTGCAAAGGCATGTTCGCAACATCCACAATAAAGAGAAGCCATTTAAGTGTCACTTATGTGATAGGTGTTTTGGTCAACAAACCAATTTAGACAGACACCTAAAGAAACATGAGAATGGGAACATGTCCGGTACAGCAACATCGTCGCCTCATTCTGAACTGGAAAGTACAGGTGCGATTCTGGATGACAAAGAAGATGCTTACTTCACAGAAATTCGAAATTTCATTGGGAACAGCAACCATGGCAGCCAATCTCCCAGGAATGTGGAGGAGAGAATGAATGGCAGTCATTTTAAAGATGAAAAGGCTTTGGTGACCAGTCAAAATTCAGACTTGCTGGATGATGAAGAAGTTGAAGATGAGGTGTTGTTAGATGAGGAGGATGAAGACAATGATATTACTGGAAAAACAGGAAAGGAACCAGTGACAAGTAATTTACATGAAGGAAACCCTGAGGATGACTATGAAGAAACCAGTGCCCTGGAGATGAGTTGCAAGACATCCCCAGTGAGGTATAAAGAGGAAGAATATAAAAGTGGACTTTCTGCTCTAGATCATATAAGGCACTTCACAGATAGCCTCAAAATGAGGAAAATGGAAGATAATCAATATTCTGAAGCTGAGCTGTCTT

CTTTTAGTACTTCCCATGTGCCAGAGGAACTTAAGCAGCCGTTACACAGAAAGTCCAAATCGCAGGCATATGCTATGATGCTGTCACTGTCTGACAAGGAGTCCCTCCATTCTACATCCCACAGTTCTTCCAACGTGTGGCACAGTATGGCCAGGGCTGCGGCGGAATCCAGTGCTATCCAGTCCATAAGCCACGTATGACGTTATCAAGGTTGACCAGAGTGGGACCAAGTCCAACAGTAGCATGGCTCTTTCATATAGGACTATTTACAAGACTGCTG

AGCAGAATGCCTTATAAACCTGCAGGGTCACTCATCTAAAGTCTAGTGACCTTAAACTGAATGATTTAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAAGAAACTATTTATTCTCGATATTTTGTTTTGCACAGCAAAGGCAGCTGCTGACTTCTGGAAGATCAATCAATGCGACTTAAAGTGATTCAGTGAAAACAAAAAACTTGGTGGGCTGAAGGCATCTTCCAGTTTACCCCACCTTAGGGTATGGGTGGGTGAGAAGGGCAGTTGAGATGGCAGCATTGATATGAATGAACACTCCATAGAAACTGAATTCTCTTTTGTACAAGATCACCTGACATGATTGGGAACAGTTGCTTTTAATTACAGATTTAATTTTTTTCTTCGTTAAAGTTTTATGTAATTTAACCCTTTGAAGACAGAAGTAGTTGGATGAAATGCACAGTCAATTATTATAGAAACTGATAACAGGGAGTACTTGTTCCCCCTTTTGCCTTCTTAAGTACATTGTTTAAAACTAGGGAAAAAGGGTATGTGTATATTGTAAACTATGGATGTTAACACTCAAAG

AGGTTAAGTCAGTGAAGTAACCTATTCATCACCAGTACCGCTGTACCACTAATAAATTGTTTGCCAAATCCTTGTAATAACATCTTAATTTTAGACAATCATGTCACTGTTTTTAATGTTTATTTTTTTGTGTGTGTTGCGTGTATCATGTATTTATTTGTTGGCAAACTATTGTTTGTTGATTAAAATAGCACTGTTCCAGTCAGCCACTACTTTATGACGTCTGAGGCACACCCCTTTCCGAATTTCAAGGACCAAGGTGACCCGACCTGTGTATGAGAGTGCCAAATGGTGTTTGGCTTTTCTTAACATTCCTTTTTGTTTGTTTGTTTTGTTTTCCTTCTTAATGAACTAAATACGAATAGATGCAACTTAGTTTTTGTAATACTGAAATCGATTCAATTGTATAAACGATTATAATTTCTTTCATGGAAGCATGATTCTTCTGATTAAAAACTGTACTCCATATTTTATGCTGGTTGTCTGCAAGCTTGTGCGATGTTATGTTCATGTTAATCCTATTTGTAAAATGAAGTGTTCCCAACCTTATGTTAAAAGAGAGAAGTAAATAACAGACTGTATTCAGTTATTTTGCCCTTTATTGAGGAACCAGATTTGTTTTCTTTTTGTTTGTAATCTCATTTTGAAATAATCAGCAAGTTGAGGTACTTTCTTCAAATGCTTTGTACAATATAAACTGTTATGCCTTTCAGTGCATTACTATGGGAGGAGCAACTAAAAAATAAAGACTTACAAAAAGGAGTATTTTT

SEQ ID NO:65

合成构建体

GCGAAGCGGCTGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCGGGAGGCAGGATGAGCGCACGCGGTGAGGGCGCGGGGCAGCCGTCCACTTCAGCCCAGGGACAACCTGCCGCCCCAGCGCCTCAGAAGAGAGGACGCGGCCGCCCCAGGAAGCAGCAGCAAGAACCAACCGGTGAGCCCTCTCCTAAGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCACAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAGGTCAATGTTGCCTTGCCTGGGAAGGACCACCCGGGCAATCTTATATATCTACTGTTCTCTAAA

SEQ ID NO:66

>NP_003474.1高迁移率组蛋白HMGI-C同种型a[智人]

MSARGEGAGQPSTSAQGQPAAPAPQKRGRGRPRKQQQEPTGEPSPKRPRGRPKGSKNKSPSKAAQKKAEATGEKRPRGRPRKWPQQVVQKKPAQEETEETSSQESAEED

SEQ ID NO:67

>NP_001098547.3MDS1和EVI1复合基因座蛋白同种型a[智人]

MILDEFYNVKFCIDASQPDVGSWLKYIRFAGCYDQHNLVACQINDQIFYRVVADIAPGEELLLFMKSEDYPHETMAPDIHEERQYRCEDCDQLFESKAELADHQKFPCSTPHSAFSMVEEDFQQKLESENDLQEIHTIQECKECDQVFPDLQSLEKHMLSHTEEREYKCDQCPKAFNWKSNLIRHQMSHDSGKHYECENCAKQVFTDPSNLQRHIRSQHVGARAHACPECGKTFATSSGLKQHKHIHSSVKPFICEVCHKSYTQFSNLCRHKRMHADCRTQIKCKDCGQMFSTTSSLNKHRRFCEGKNHFAAGGFFGQGISLPGTPAMDKTSMVNMSHANPGLADYFGANRHPAGLTFPTAPGFSFSFPGLFPSGLYHRPPLIPASSPVKGLSSTEQTNKSQSPLMTHPQILPATQDILKALSKHPSVGDNKPVELQPERSSEERPFEKISDQSESSDLDDVSTPSGSDLETTSGSDLESDIESDKEKFKENGKMFKDKVSPLQNLASINNKKEYSNHSIFSPSLEEQTAVSGAVNDSIKAIASIAEKYFGSTGLVGLQDKKVGALPYPSMFPLPFFPAFSQSMYPFPDRDLRSLPLKMEPQSPGEVKKLQKGSSESPFDLTTKRKDEKPLTPVPSKPPVTPATSQDQPLDLSMGSRSRASGTKLTEPRKNHVFGGKKGSNVESRPASDGSLQHARPTPFFMDPIYRVEKRKLTDPLEALKEKYLRPSPGFLFHPQFQLPDQRTWMSAIENMAEKLESFSALKPEASELLQSVPSMFNFRAPPNALPENLLRKGKERYTCRYCGKIFPRSANLTRHLRTHTGEQPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHNKEKPFKCHLCDRCFGQQTNLDRHLKKHENGNMSGTATSSPHSELESTGAILDDKEDAYFTEIRNFIGNSNHGSQSPRNVEERMNGSHFKDEKALVTSQNSDLLDDEEVEDEVLLDEEDEDNDITGKTGKEPVTSNLHEGNPEDDYEETSALEMSCKTSPVRYKEEEYKSGLSALDHIRHFTDSLKMRKMEDNQYSEAELSSFSTSHVPEELKQPLHRKSKSQAYAMMLSLSDKESLHSTSHSSSNVWHSMARAAAESSAIQSISHV

通过引用的并入

本文提及的每篇专利文献和科学论文的全部公开内容通过援引纳入本文用于所有目的。

等同形式

在不脱离本公开的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文所述的公开内容。不同实施例中的各种结构元件和所述各种方法步骤可以任意组合排列而所有这些变型都应视为本公开的方式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。

序列表

<110> 默克专利有限公司（MERCK PATENT GMBH）

<120> 利用靶向TGF-β抑制的三阴性乳腺癌的

<130> EMD-009WO

<150> 62/721,249

<151> 2018-08-22

<160> 67

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 1

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

465 470 475 480

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

485 490 495

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

500 505 510

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

515 520 525

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

545 550 555 560

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

565 570 575

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

580 585 590

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 4

atgagggccc tgctggctag actgctgctg tgcgtgctgg tcgtgtccga cagcaagggc 60

cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg tctggctccc ctggccagtc catcaccatc 120

agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 180

caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 240

tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 300

caggcagagg acgaggccga ctactactgc tcctcctaca cctcctccag caccagagtg 360

ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg ggccagccca aggccaaccc aaccgtgaca 420

ctgttccccc catcctccga ggaactgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 480

tcagatttct atccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgatggctc cccagtgaag 540

gccggcgtgg aaaccaccaa gccctccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 600

tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctacagctg ccaggtcaca 660

cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtc gcccccaccg agtgctcatg a 711

<210> 5

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 5

atggaaacag acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccacaggc 60

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 120

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 180

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 240

gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 300

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 360

ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 420

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtgct ggcggcggag gaagcggagg aggtggcagc 1440

ggtggcggtg gctccggcgg aggtggctcc ggaatccctc cccacgtgca gaagtccgtg 1500

aacaacgaca tgatcgtgac cgacaacaac ggcgccgtga agttccctca gctgtgcaag 1560

ttctgcgacg tgaggttcag cacctgcgac aaccagaagt cctgcatgag caactgcagc 1620

atcacaagca tctgcgagaa gccccaggag gtgtgtgtgg ccgtgtggag gaagaacgac 1680

gaaaacatca ccctcgagac cgtgtgccat gaccccaagc tgccctacca cgacttcatc 1740

ctggaagacg ccgcctcccc caagtgcatc atgaaggaga agaagaagcc cggcgagacc 1800

ttcttcatgt gcagctgcag cagcgacgag tgcaatgaca acatcatctt tagcgaggag 1860

tacaacacca gcaaccccga ctgataa 1887

<210> 6

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 6

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 7

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr

20 25 30

Met Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

465 470 475 480

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

485 490 495

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

500 505 510

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

515 520 525

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

545 550 555 560

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

565 570 575

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

580 585 590

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

595 600 605

<210> 8

<211> 592

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp

20 25 30

Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn

35 40 45

Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

50 55 60

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

65 70 75 80

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

85 90 95

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

100 105 110

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

115 120 125

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

130 135 140

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

145 150 155 160

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

165 170 175

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val

180 185 190

Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile

195 200 205

Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser

210 215 220

Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His

225 230 235 240

Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys

245 250 255

Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp

260 265 270

Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu

275 280 285

Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe

290 295 300

Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser

305 310 315 320

Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu

325 330 335

Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe

340 345 350

His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser

355 360 365

Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala

370 375 380

His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile

385 390 395 400

Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr

420 425 430

Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg

435 440 445

Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val

450 455 460

Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp

465 470 475 480

Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu

485 490 495

Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met

500 505 510

Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe

515 520 525

Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu

530 535 540

Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala

545 550 555 560

Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser

565 570 575

Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

580 585 590

<210> 9

<211> 567

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu

165 170 175

Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn

180 185 190

Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys

195 200 205

Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg

210 215 220

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu

225 230 235 240

Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala

245 250 255

Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu

260 265 270

Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys

275 280 285

Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile

290 295 300

Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln

305 310 315 320

Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr

325 330 335

Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser

340 345 350

Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys

355 360 365

Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn

370 375 380

Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser

405 410 415

Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser

420 425 430

Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr

435 440 445

Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val

450 455 460

Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu

465 470 475 480

His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly

485 490 495

Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met

500 505 510

Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg

515 520 525

Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu

530 535 540

Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp

545 550 555 560

Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

565

<210> 10

<211> 136

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 15

Gln Phe Asn Ser

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 16

Gln Ala Gln Ser

1

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 17

Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 18

Pro Lys Ser Ser Asp Lys

1 5

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 19

Leu Ser Leu Ser

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 20

Ala Thr Ala Thr

1

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Lys, Arg, Thr, Gln, Gly, Ala, Trp, Met, Ile或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Val, Arg, Lys, Leu, Met或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> His, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Tyr, Trp, Phe或Met

<400> 21

Xaa Tyr Xaa Met Xaa

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Phe或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Ser或Thr

<400> 22

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Xaa Thr Phe Tyr Ala Asp Xaa Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Glu或Asp

<400> 23

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Xaa Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 25

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 26

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 27

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Thr, Arg或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Ala或Gly

<400> 28

Thr Gly Thr Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Glu或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ile, Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asp, His或Asn

<400> 29

Xaa Val Xaa Xaa Arg Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Phe或Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Arg, Thr或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Ile或Thr

<400> 30

Ser Ser Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

1 5 10

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 31

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 32

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 33

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 34

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 35

Ser Tyr Ile Met Met

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 36

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 37

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 38

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 39

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 40

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 41

Met Tyr Met Met Met

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 42

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 43

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 44

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Val Trp Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Trp Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 45

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 46

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr

20 25 30

Met Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Trp

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 47

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 48

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 48

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctag ctccagcgag 60

gtgcagctgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120

tgcgccgcct ccggcttcac cttctccagc tacatcatga tgtgggtgcg acaggcccct 180

ggcaagggcc tggaatgggt gtcctccatc tacccctccg gcggcatcac cttctacgcc 240

gacaccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gatcaagctg 360

ggcaccgtga ccaccgtgga ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccgcc 420

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407

<210> 49

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 49

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60

tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120

tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180

cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240

aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300

gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360

ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420

ttccccccat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480

gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540

ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600

ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660

gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705

<210> 50

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 50

Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe

1 5 10 15

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

20 25 30

Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

35 40 45

Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

50 55 60

Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile

65 70 75 80

Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys

85 90 95

Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn

100 105 110

Thr Ser Asn Pro Asp

115

<210> 51

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr

1 5 10 15

Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile

20 25 30

Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp

35 40 45

Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr

50 55 60

His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys

65 70 75 80

Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser

85 90 95

Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser

100 105 110

Asn Pro Asp

115

<210> 52

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

20 25 30

Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val

35 40 45

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

50 55 60

His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

115 120

<210> 53

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 53

Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys

1 5 10 15

Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln

20 25 30

Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu

35 40 45

Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu

50 55 60

Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro

65 70 75 80

Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp

85 90 95

Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

100 105 110

<210> 54

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 54

Val Thr Asp Asn Ala Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser

20 25 30

Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val

35 40 45

Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys

50 55 60

His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe

100 105 110

Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

115 120

<210> 55

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 55

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 56

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 57

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 58

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 59

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 60

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 60

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 61

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala

435 440 445

<210> 62

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 62

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 63

<211> 4150

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 63

cttgaatctt ggggcaggaa ctcagaaaac ttccagcccg ggcagcgcgc gcttggtgca 60

agactcagga gctagcagcc cgtccccctc cgactctccg gtgccgccgc tgcctgctcc 120

cgccacccta ggaggcgcgg tgccacccac tactctgtcc tctgcctgtg ctccgtgccc 180

gaccctatcc cggcggagtc tccccatcct cctttgcttt ccgactgccc aaggcacttt 240

caatctcaat ctcttctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 300

tctctctctc gcagggtggg gggaagagga ggaggaattc tttccccgcc taacatttca 360

agggacacaa ttcactccaa gtctcttccc tttccaagcc gcttccgaag tgctcccggt 420

gcccgcaact cctgatccca acccgcgaga ggagcctctg cgacctcaaa gcctctcttc 480

cttctccctc gcttccctcc tcctcttgct acctccacct ccaccgccac ctccacctcc 540

ggcacccacc caccgccgcc gccgccaccg gcagcgcctc ctcctctcct cctcctcctc 600

ccctcttctc tttttggcag ccgctggacg tccggtgttg atggtggcag cggcggcagc 660

ctaagcaaca gcagccctcg cagcccgcca gctcgcgctc gccccgccgg cgtccccagc 720

cctatcacct catctcccga aaggtgctgg gcagctccgg ggcggtcgag gcgaagcggc 780

tgcagcggcg gtagcggcgg cgggaggcag gatgagcgca cgcggtgagg gcgcggggca 840

gccgtccact tcagcccagg gacaacctgc cgccccagcg cctcagaaga gaggacgcgg 900

ccgccccagg aagcagcagc aagaaccaac cggtgagccc tctcctaaga gacccagggg 960

aagacccaaa ggcagcaaaa acaagagtcc ctctaaagca gctcaaaaga aagcagaagc 1020

cactggagaa aaacggccaa gaggcagacc taggaaatgg ccacaacaag ttgttcagaa 1080

gaagcctgct caggaggaaa ctgaagagac atcctcacaa gagtctgccg aagaggacta 1140

gggggcgcca acgttcgatt tctacctcag cagcagttgg atcttttgaa gggagaagac 1200

actgcagtga ccacttattc tgtattgcca tggtctttcc actttcatct ggggtggggt 1260

ggggtggggt gggggagggg ggggtggggt ggggagaaat cacataacct taaaaaggac 1320

tatattaatc accttctttg taatcccttc acagtcccag gtttagtgaa aaactgctgt 1380

aaacacaggg gacacagctt aacaatgcaa cttttaatta ctgttttctt ttttcttaac 1440

ctactaatag tttgttgatc tgataagcaa gagtgggcgg gtgagaaaaa ccgaattggg 1500

tttagtcaat cactgcactg catgcaaaca agaaacgtgt cacacttgtg acgtcgggca 1560

ttcatatagg aagaacgcgg tgtgtaacac tgtgtacacc tcaaatacca ccccaaccca 1620

ctccctgtag tgaatcctct gtttagaaca ccaaagataa ggactagata ctactttctc 1680

tttttcgtat aatcttgtag acacttactt gatgattttt aactttttat ttctaaatga 1740

gacgaaatgc tgatgtatcc tttcattcag ctaacaaact agaaaaggtt atgttcattt 1800

ttcaaaaagg gaagtaagca aacaaatatt gccaactctt ctatttatgg atatcacaca 1860

tatcagcagg agtaataaat ttactcacag cacttgtttt caggacaaca cttcattttc 1920

aggaaatcta cttcctacag agccaaaatg ccatttagca ataaataaca cttgtcagcc 1980

tcagagcatt taaggaaact agacaagtaa aattatcctc tttgtaattt aatgaaaagg 2040

tacaacagaa taatgcatga tgaactcacc taattatgag gtgggaggag cgaaatctaa 2100

atttcttttg ctatagttat acatcaattt aaaaagcaaa aaaaaaaaag gggggggcaa 2160

tctctctctg tgtctttctc tctctctctt cctctccctc tctcttttca ttgtgtatca 2220

gtttccatga aagacctgaa taccacttac ctcaaattaa gcatatgtgt tacttcaagt 2280

aatacgtttt gacataagat ggttgaccaa ggtgcttttc ttcggcttga gttcaccatc 2340

tcttcattca aactgcactt ttagccagag atgcaatata tccccactac tcaatactac 2400

ctctgaatgt tacaacgaat ttacagtcta gtacttatta catgctgcta tacacaagca 2460

atgcaagaaa aaaacttact gggtaggtga ttctaatcat ctgcagttct ttttgtacac 2520

ttaattacag ttaaagaagc aatctcctta ctgtgtttca gcatgactat gtatttttct 2580

atgttttttt aattaaaaat ttttaaaata cttgtttcag cttctctgct agatttctac 2640

attaacttga aaatttttta accaagtcgc tcctaggttc ttaaggataa ttttcctcaa 2700

tcacactaca catcacacaa gatttgactg taatatttaa atattaccct ccaagtctgt 2760

acctcaaatg aattctttaa ggagatggac taattgactt gcaaagacct acctccagac 2820

ttcaaaagga atgaacttgt tacttgcagc attcatttgt tttttcaatg tttgaaatag 2880

ttcaaactgc agctaaccct agtcaaaact atttttgtaa aagacatttg atagaaagga 2940

acacgttttt acatactttt gcaaaataag taaataataa ataaaataaa agccaacctt 3000

caaagaaact tgaagctttg taggtgagat gcaacaagcc ctgcttttgc ataatgcaat 3060

caaaaatatg tgtttttaag attagttgaa tataagaaaa tgcttgacaa atattttcat 3120

gtattttaca caaatgtgat ttttgtaata tgtctcaacc agatttattt taaacgcttc 3180

ttatgtagag tttttatgcc tttctctcct agtgagtgtg ctgacttttt aacatggtat 3240

tatcaactgg gccaggaggt agtttctcat gacggctttt gtcagtatgg cttttagtac 3300

tgaagccaaa tgaaactcaa aaccatctct cttccagctg cttcagggag gtagtttcaa 3360

aggccacata cctctctgag actggcagat cgctcactgt tgtgaatcac caaaggagct 3420

atggagagaa ttaaaactca acattactgt taactgtgcg ttaaataagc aaataaacag 3480

tggctcataa aaataaaagt cgcattccat atctttggat gggcctttta gaaacctcat 3540

tggccagctc ataaaatgga agcaattgct catgttggcc aaacatggtg caccgagtga 3600

tttccatctc tggtaaagtt acacttttat ttcctgtatg ttgtacaatc aaaacacact 3660

actacctctt aagtcccagt atacctcatt tttcatactg aaaaaaaaag cttgtggcca 3720

atggaacagt aagaacatca taaaattttt atatatatag tttatttttg tgggagataa 3780

attttatagg actgttcttt gctgttgttg gtcgcagcta cataagactg gacatttaac 3840

ttttctacca tttctgcaag ttaggtatgt ttgcaggaga aaagtatcaa gacgtttaac 3900

tgcagttgac tttctccctg ttcctttgag tgtcttctaa ctttattctt tgttctttat 3960

gtagaattgc tgtctatgat tgtactttga atcgcttgct tgttgaaaat atttctctag 4020

tgtattatca ctgtctgttc tgcacaataa acataacagc ctctgtgatc cccatgtgtt 4080

ttgattcctg ctctttgtta cagttccatt aaatgagtaa taaagtttgg tcaaaacaga 4140

aaaaaaaaaa 4150

<210> 64

<211> 4900

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 64

ccttgccaag taacagcttt gctgtccaac atcgtgtgct gcttcgcgag aaagtcacat 60

tcggaccctt tggctagatt gcttattcat agggcttctt gactaaagcc cttggagcac 120

tgggtttttc ttgaagtata tgatcttaga cgaattttac aatgtgaagt tctgcataga 180

tgccagtcaa ccagatgttg gaagctggct caagtacatt agattcgctg gctgttatga 240

tcagcacaac cttgttgcat gccagataaa tgatcagata ttctatagag tagttgcaga 300

cattgcgccg ggagaggagc ttctgctgtt catgaagagc gaagactatc cccatgaaac 360

tatggcgccg gatatccacg aagaacggca atatcgctgc gaagactgtg accagctctt 420

tgaatctaag gctgaactag cagatcacca aaagtttcca tgcagtactc ctcactcagc 480

attttcaatg gttgaagagg actttcagca aaaactcgaa agcgagaatg atctccaaga 540

gatacacacg atccaggagt gtaaggaatg tgaccaagtt tttcctgatt tgcaaagcct 600

ggagaaacac atgctgtcac atactgaaga gagggaatac aagtgtgatc agtgtcccaa 660

ggcatttaac tggaagtcca atttaattcg ccaccagatg tcacatgaca gtggaaagca 720

ctatgaatgt gaaaactgtg ccaagcaggt tttcacggac cctagcaacc ttcagcggca 780

cattcgctct cagcatgtcg gtgcccgggc ccatgcatgc ccggagtgtg gcaaaacgtt 840

tgccacttcg tcgggcctca aacaacacaa gcacatccac agcagtgtga agccctttat 900

ctgtgaggtc tgccataaat cctatactca gttttcaaac ctttgccgtc ataagcgcat 960

gcatgctgat tgcagaaccc aaatcaagtg caaagactgt ggacaaatgt tcagcactac 1020

gtcttcctta aataaacaca ggaggttttg tgagggcaag aaccattttg cggcaggtgg 1080

attttttggc caaggcattt cacttcctgg aaccccagct atggataaaa cgtccatggt 1140

taatatgagt catgccaacc cgggccttgc tgactatttt ggcgccaata ggcatcctgc 1200

tggtcttacc tttccaacag ctcctggatt ttcttttagc ttccctggtc tgtttccttc 1260

cggcttgtac cacaggcctc ctttgatacc tgctagttct cctgttaaag gactatcaag 1320

tactgaacag acaaacaaaa gtcaaagtcc cctcatgaca catcctcaga tactgccagc 1380

tacacaggat attttgaagg cactatctaa acacccatct gtaggggaca ataagccagt 1440

ggagctccag cccgagaggt cctctgaaga gaggcccttt gagaaaatca gtgaccagtc 1500

agagagtagt gaccttgatg atgtcagtac accaagtggc agtgacctgg aaacaacctc 1560

gggctctgat ctggaaagtg acattgaaag tgataaagag aaatttaaag aaaatggtaa 1620

aatgttcaaa gacaaagtaa gccctcttca gaatctggct tcaataaata ataagaaaga 1680

atacagcaat cattccattt tctcaccatc tttagaggag cagactgcgg tgtcaggagc 1740

tgtgaatgat tctataaagg ctattgcttc tattgctgaa aaatactttg gttcaacagg 1800

actggtgggg ctgcaagaca aaaaagttgg agctttacct tacccttcca tgtttcccct 1860

cccatttttt ccagcattct ctcaatcaat gtacccattt cctgatagag acttgagatc 1920

gttacctttg aaaatggaac cccaatcacc aggtgaagta aagaaactgc agaagggcag 1980

ctctgagtcc ccctttgatc tcaccactaa gcgaaaggat gagaagccct tgactccagt 2040

cccctccaag cctccagtga cacctgccac aagccaagac cagcccctgg atctaagtat 2100

gggcagtagg agtagagcca gtgggacaaa gctgactgag cctcgaaaaa accacgtgtt 2160

tgggggaaaa aaaggaagca acgtcgaatc aagacctgct tcagatggtt ccttgcagca 2220

tgcaagaccc actcctttct ttatggaccc tatttacaga gtagagaaaa gaaaactaac 2280

tgacccactt gaagctttaa aagagaaata cttgaggcct tctccaggat tcttgtttca 2340

cccacaattc caactgcctg atcagagaac ttggatgtca gctattgaaa acatggcaga 2400

aaagctagag agcttcagtg ccctgaaacc tgaggccagt gagctcttac agtcagtgcc 2460

ctctatgttc aacttcaggg cgcctcccaa tgccctgcca gagaaccttc tgcggaaggg 2520

aaaggagcgc tatacctgca gatactgtgg caagattttt ccaaggtctg caaacctaac 2580

acggcacttg agaacccaca caggagagca gccttacaga tgcaaatact gtgacagatc 2640

atttagcata tcttctaact tgcaaaggca tgttcgcaac atccacaata aagagaagcc 2700

atttaagtgt cacttatgtg ataggtgttt tggtcaacaa accaatttag acagacacct 2760

aaagaaacat gagaatggga acatgtccgg tacagcaaca tcgtcgcctc attctgaact 2820

ggaaagtaca ggtgcgattc tggatgacaa agaagatgct tacttcacag aaattcgaaa 2880

tttcattggg aacagcaacc atggcagcca atctcccagg aatgtggagg agagaatgaa 2940

tggcagtcat tttaaagatg aaaaggcttt ggtgaccagt caaaattcag acttgctgga 3000

tgatgaagaa gttgaagatg aggtgttgtt agatgaggag gatgaagaca atgatattac 3060

tggaaaaaca ggaaaggaac cagtgacaag taatttacat gaaggaaacc ctgaggatga 3120

ctatgaagaa accagtgccc tggagatgag ttgcaagaca tccccagtga ggtataaaga 3180

ggaagaatat aaaagtggac tttctgctct agatcatata aggcacttca cagatagcct 3240

caaaatgagg aaaatggaag ataatcaata ttctgaagct gagctgtctt cttttagtac 3300

ttcccatgtg ccagaggaac ttaagcagcc gttacacaga aagtccaaat cgcaggcata 3360

tgctatgatg ctgtcactgt ctgacaagga gtccctccat tctacatccc acagttcttc 3420

caacgtgtgg cacagtatgg ccagggctgc ggcggaatcc agtgctatcc agtccataag 3480

ccacgtatga cgttatcaag gttgaccaga gtgggaccaa gtccaacagt agcatggctc 3540

tttcatatag gactatttac aagactgctg agcagaatgc cttataaacc tgcagggtca 3600

ctcatctaaa gtctagtgac cttaaactga atgatttaaa aaagaaaaga aagaaaaaag 3660

aaactattta ttctcgatat tttgttttgc acagcaaagg cagctgctga cttctggaag 3720

atcaatcaat gcgacttaaa gtgattcagt gaaaacaaaa aacttggtgg gctgaaggca 3780

tcttccagtt taccccacct tagggtatgg gtgggtgaga agggcagttg agatggcagc 3840

attgatatga atgaacactc catagaaact gaattctctt ttgtacaaga tcacctgaca 3900

tgattgggaa cagttgcttt taattacaga tttaattttt ttcttcgtta aagttttatg 3960

taatttaacc ctttgaagac agaagtagtt ggatgaaatg cacagtcaat tattatagaa 4020

actgataaca gggagtactt gttccccctt ttgccttctt aagtacattg tttaaaacta 4080

gggaaaaagg gtatgtgtat attgtaaact atggatgtta acactcaaag aggttaagtc 4140

agtgaagtaa cctattcatc accagtaccg ctgtaccact aataaattgt ttgccaaatc 4200

cttgtaataa catcttaatt ttagacaatc atgtcactgt ttttaatgtt tatttttttg 4260

tgtgtgttgc gtgtatcatg tatttatttg ttggcaaact attgtttgtt gattaaaata 4320

gcactgttcc agtcagccac tactttatga cgtctgaggc acaccccttt ccgaatttca 4380

aggaccaagg tgacccgacc tgtgtatgag agtgccaaat ggtgtttggc ttttcttaac 4440

attccttttt gtttgtttgt tttgttttcc ttcttaatga actaaatacg aatagatgca 4500

acttagtttt tgtaatactg aaatcgattc aattgtataa acgattataa tttctttcat 4560

ggaagcatga ttcttctgat taaaaactgt actccatatt ttatgctggt tgtctgcaag 4620

cttgtgcgat gttatgttca tgttaatcct atttgtaaaa tgaagtgttc ccaaccttat 4680

gttaaaagag agaagtaaat aacagactgt attcagttat tttgcccttt attgaggaac 4740

cagatttgtt ttctttttgt ttgtaatctc attttgaaat aatcagcaag ttgaggtact 4800

ttcttcaaat gctttgtaca atataaactg ttatgccttt cagtgcatta ctatgggagg 4860

agcaactaaa aaataaagac ttacaaaaag gagtattttt 4900

<210> 65

<211> 386

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 65

gcgaagcggc tgcagcggcg gtagcggcgg cgggaggcag gatgagcgca cgcggtgagg 60

gcgcggggca gccgtccact tcagcccagg gacaacctgc cgccccagcg cctcagaaga 120

gaggacgcgg ccgccccagg aagcagcagc aagaaccaac cggtgagccc tctcctaaga 180

gacccagggg aagacccaaa ggcagcaaaa acaagagtcc ctctaaagca gctcaaaaga 240

aagcagaagc cactggagaa aaacggccaa gaggcagacc taggaaatgg ccacaacaag 300

ttgttcagaa gaagcctgct caggtcaatg ttgccttgcc tgggaaggac cacccgggca 360

atcttatata tctactgttc tctaaa 386

<210> 66

<211> 109

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 66

Met Ser Ala Arg Gly Glu Gly Ala Gly Gln Pro Ser Thr Ser Ala Gln

1 5 10 15

Gly Gln Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gln Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro

20 25 30

Arg Lys Gln Gln Gln Glu Pro Thr Gly Glu Pro Ser Pro Lys Arg Pro

35 40 45

Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Lys Asn Lys Ser Pro Ser Lys Ala Ala

50 55 60

Gln Lys Lys Ala Glu Ala Thr Gly Glu Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro

65 70 75 80

Arg Lys Trp Pro Gln Gln Val Val Gln Lys Lys Pro Ala Gln Glu Glu

85 90 95

Thr Glu Glu Thr Ser Ser Gln Glu Ser Ala Glu Glu Asp

100 105

<210> 67

<211> 1116

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 67

Met Ile Leu Asp Glu Phe Tyr Asn Val Lys Phe Cys Ile Asp Ala Ser

1 5 10 15

Gln Pro Asp Val Gly Ser Trp Leu Lys Tyr Ile Arg Phe Ala Gly Cys

20 25 30

Tyr Asp Gln His Asn Leu Val Ala Cys Gln Ile Asn Asp Gln Ile Phe

35 40 45

Tyr Arg Val Val Ala Asp Ile Ala Pro Gly Glu Glu Leu Leu Leu Phe

50 55 60

Met Lys Ser Glu Asp Tyr Pro His Glu Thr Met Ala Pro Asp Ile His

65 70 75 80

Glu Glu Arg Gln Tyr Arg Cys Glu Asp Cys Asp Gln Leu Phe Glu Ser

85 90 95

Lys Ala Glu Leu Ala Asp His Gln Lys Phe Pro Cys Ser Thr Pro His

100 105 110

Ser Ala Phe Ser Met Val Glu Glu Asp Phe Gln Gln Lys Leu Glu Ser

115 120 125

Glu Asn Asp Leu Gln Glu Ile His Thr Ile Gln Glu Cys Lys Glu Cys

130 135 140

Asp Gln Val Phe Pro Asp Leu Gln Ser Leu Glu Lys His Met Leu Ser

145 150 155 160

His Thr Glu Glu Arg Glu Tyr Lys Cys Asp Gln Cys Pro Lys Ala Phe

165 170 175

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His Ala Cys Pro Glu Cys Gly Lys Thr Phe Ala Thr Ser Ser Gly Leu

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Lys Gln His Lys His Ile His Ser Ser Val Lys Pro Phe Ile Cys Glu

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Ser His Ala Asn Pro Gly Leu Ala Asp Tyr Phe Gly Ala Asn Arg His

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Ser His Val

1115

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月22日提交的美国临时专利申请号62/721,249的权益和优先权，其全部公开内容通过引用纳入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。于2019年6月27日创建的所述ASCII拷贝命名为EMD-009WO_SL_ST25.txt，大小为99,098字节。