C07D471/04 C12Q1/34
1.包含如下通式(I)所示的化合物，
式中，
X 1表示S或O；
X 2，W各自独立地表示N或CR 6；
R 1，R 3，R 4各自独立地表示Y；
R 3，R 4一起也表示-(CY 2) p-；
R 2表示COY、Y、Alk、Cyc、(CY 2) nAr、COAlk、CO(CY 2) nAr、CONY 2、 CONYAlk、CONY(CY 2) nAr、COOY、COOAlk、COO(CY 2) nAr、SO 2Y、 SO 2Alk、SO 2(CY 2) nAr、CY 2OY或CY 2NY 2；
R 5表示(CY 2) qAr、Cyc、Y或NY 2；
R 6表示Y、OY、Hal或CN；
L表示-CY 2-、-CO-或-SO 2-；
Y表示H或A；
A表示含有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Alk表示含有2-10个碳原子的直链或支链烯基，其中1-4个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原子可各自独立地被 Hal取代；
Ar表示含有3-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或者双环的碳环，所 述碳环可被至少一个选自以下组内的取代基取代：Hal、A、(CY 2) n-OY、 (CY 2) n-NY 2、COOY、SO 2Y和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；以及
m，n，p，q各自独立地表示0、1、2或3；
和/或其生理学上可接受的盐；
条件是不包括(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸甲酯。
12.如权利要求1至8中任一项所述的药物，用于预防性或性和/或监测 以下组内的疾病：神经退行性疾病、糖尿病、癌症和应激。
13.如权利要求12所述的药物，其中所述疾病选自以下组内：阿尔茨海默氏病、 肌萎缩侧索硬化症(ALS)、肌萎缩性侧索硬化症合并认知障碍(ALSci)、嗜银颗粒性痴 呆、Bluit病、皮质基底节变性(CBD)、拳击员痴呆、弥散性神经纤维缠结伴钙化、唐 氏综合征、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、与17号染体连锁的额颞痴呆伴 帕金森综合征(FTDP-17)、格-施-沙病、瓜德罗普岛帕金森病、哈-施病(1型脑内铁沉积 性神经系统退化症)、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼-皮病(C型)、苍白球脑桥黑 质变性、关岛型帕金森综合征痴呆复合征、皮克病(PiD)、脑炎后帕金森综合征(PEP)、 朊病毒病(包括克-雅病(CJD)、变异型克-雅病(vCJD)、致死性家族性失眠症和库鲁病)、 进行性皮层上神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、Richardson综合征、亚急性硬 化全脑炎、单纯缠结性痴呆、亨廷顿氏病和帕金森氏病，优选的是阿尔茨海默氏病。
2.如权利要求1所述的药物，其中
X 1表示S。
3.如权利要求1或2所述的药物，其中
X 2表示CY；和/或
W表示N或CH。.
4.如权利要求1至3中任一项所述的药物，其中
W表示N；
R 2表示COY、COAlk、CONY 2或COOY；和/或
L表示CY 2。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物，其中
m，p各自独立地表示1或2，和/或
n，q各自独立地表示0或1。
6.如权利要求1所述的药物，所述药物包含符合如下子结构式(IA)所示的化合物，
式中，
X 1表示S或O；
X 2表示CR 6或N；
R 2表示COY、COAlk、CONY 2或COOY；
R 3，R 4各自独立地表示Y；
R 3，R 4一起也表示-(CY 2) p-；
R 5表示(CY 2) qAr、Cyc或Y；
R 6表示Y、OY或Hal；
Y表示H或A；
A表示含有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Alk表示含有2-6个碳原子的直链或支链烯基，其中1-3个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原子可各自独立地被 Hal取代；
Ar表示含有4-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或者双环的碳环，所 述碳环可被至少一个选自以下组内的取代基取代：Hal、A、OY、COOY 和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；
m，q各自独立地表示0、1或2；以及
p表示1、2或3；
和/或其生理学上可接受的盐；
条件是R 3和R 5不表示A。
7.如权利要求6所述的药物，所述药物包含符合如下子结构式(IB)所示的化合物，
式中，
X 2表示CY或N；
R 3，R 4各自独立地表示Y；
R 3，R 4一起也表示-(CH 2) p-；
R 5表示(CH 2) qAr、Cyc或A；
Y表示H或A；
A表示含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其中1-4个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有43-7个碳原子的环烷基；
Ar表示含有5-10个碳原子的芳香族单环或者双环的碳环，所述碳环可被 至少一个选自以下组内的取代基单取代或二取代：Hal、A、OY、COOH 和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；
m表示0、1或2；
p表示1或2；以及
q表示0或1；
和/或其生理学上可接受的盐。
8.如权利要求1所述的药物，其中所述药物包含选自以下组内的化合物：
和/或其生理学上可接受的盐。
9.一种制备根据权利要求1所述的药物的方法，包括以下步骤：
(a)使通式(II)化合物，
式中，R 7表示Hal、H或OH；以及
X 1、W、R 1、R 2和L具有权利要求1指明的含义，
与通式(II)化合物反应，
式中，X 2、R 3、R 4、R 5和m具有权利要求1指明的含义，
得到通式(I)化合物，
式中，X 1、X 2、W、R 1至R 5、L和m具有权利要求1指明的含义；
任选地
(b)将通式(I)化合物，其中R 2是H，转化为通式(I)所示的另一种化合物，其中R 2 是除H以外的具有权利要求1指明的含义；
(c)将通式(I)化合物的碱或酸转化为其生理学上可接受的盐；和/或
(d)将通式(I)化合物或其生理学上可接受的盐明确地定制为药物。.
10.如子结构式(IE)所示的中间体化合物，
式中，X 1、X 2、W、R 1、R 3至R 5、L和m具有权利要求1指明的含义；
条件是不包括5-吡咯烷-1-基甲基-噻唑-2-基胺。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的如权利要求1至8中任 一项所述的药物以及药学上耐受的佐剂和/或赋形剂，任选地所述药物组合物与一种或 多种其他活性成分联用。
14.一种tau病的方法，其中向有需要此种的哺乳动物给予如权利要求1-8 中任一项所述的药物。
15.一种抑制糖苷酶的方法，其中使表达所述糖苷酶的系统与如权利要求1-8中任 一项所述的化合物和/或其生理学上可接受的盐在抑制所述糖苷酶的体外条件下接触。
糖苷酶抑制剂
技术领域
本发明涉及包含通式(I)所示的化合物和/或其生理学上可接受的盐的药物，
式中，X1、X2、W、R1至R5、L和m具有权利要求书中所给的意义。通式(I)所示 的化合物可用作糖苷酶抑制剂。本发明的目的也涉及包含通式(I)所示的化合物的药物 组合物，以及通式(I)所示的化合物在阿尔茨海默氏病的用途。
发明背景
大量细胞蛋白质，包括核蛋白和胞质蛋白，是通过增加单糖2-乙酰氨基-2-脱氧 -β-D-吡喃葡糖苷(β-N-乙酰葡糖苷)被翻译后修饰的，所述单糖通过O-糖苷键附于蛋白 质上。此修饰通常被称为O-连的N-乙酰葡糖苷或O-GlcNAc。负责翻译后连接β-N- 乙酰葡糖苷(GIcNAc)与许多核质蛋白的特异性丝氨酸和苏氨酸残基的酶是O-GIcNAc 转移酶(OGTase)。第二种酶，被称为O-GlcNAcase，移除该翻译后修饰以释放出蛋白 质，使得O-GlcNAc-修饰成为一个动态循环，可在蛋白质的生命周期中发生多次。
O-GlcNAc修饰的蛋白质调节很多重要的细胞功能，例如包括转录、蛋白酶降解 和细胞信号传导。在许多结构蛋白上也发现了O-GlcNAc。例如，在许多细胞骨架蛋 白上发现，包括神经丝蛋白、突触蛋白、突触蛋白特异性网格蛋白装配蛋白AP-3以及 锚蛋白G。发现O-GlcNAc修饰在脑中大量存在。还在蛋白质上已发现明显涉及几种 疾病(包括阿尔茨海默病(AD)和癌症)病因。
例如，公认的是，AD和许多相关的tau病(tauopathy)(包括唐氏综合征、皮克病、 C型尼-皮病以及肌萎缩性侧索硬化症(ALS))的特征部分表现发生神经原纤维缠结 (NFT)。这些NFT是成对螺旋纤丝(PHF)的聚集体并且由异常形式的细胞骨架蛋白“tau” 组成。通常，tau稳定微管(在神经元内分配蛋白质和营养物质所必需的)的关键细胞网 络。然而，在AD患者中，tau过度磷酸化，破坏了其正常功能，形成PHF，最终聚集 形成NFT。在人脑中发现了6种tau同工型。在AD患者中，在NFT中发现了所有6 种tau，并且所有均显著过度磷酸化。健康脑组织中的tau仅具有2个或3个磷酸基， 而在AD患者脑中发现平均为8个磷酸基。AD患者脑中NFT水平与痴呆严重程度的 明确平行关系强有力地支持了tau功能异常在AD中起到关键作用。Tau过度磷酸化的 准确原因仍然不清楚。因此，在以下方面进行了相当大的努力：a)阐明tau过度磷酸化 的分子生理学基础；以及b)鉴定能够限制tau过度磷酸化的策略，希望这些策略可以 停止或甚至逆转阿尔茨海默病的进程。迄今为止，尽管最近已在所述过度磷酸化的替 代原理方面取得了进展，但是几个证据系列表明许多激酶的上调可能参与了tau的过 度磷酸化。
尤其是，最近出现了tau磷酸化水平受tau上O-GlcNAc水平调节这一说法。tau 上O-GlcNAc的存在激发了将O-GlcNAc水平与tau磷酸化水平关联起来的研究。人们 近来对该领域的兴趣来自下述这一观察：发现O-GlcNAc修饰出现在许多蛋白质上已 知被磷酸化的氨基酸残基处。与该观察一致，发现磷酸化水平的升高导致O-GlcNAc 水平的降低；相反，O-GlcNAc水平的升高与磷酸化水平的降低相关。O-GlcNAc和磷 酸化之间的这种互反关系被称为“阴阳假说”并且得到最近发现(所述酶OGTase与起到 消除蛋白质中磷酸基作用的磷酸酶形成功能复合物)的强有力的生物化学支持。与磷酸 化相似，O-GlcNAc是可在蛋白质生命周期中被除去和重建数次的动态修饰。有启发 性的是，编码O-GlcNAc酶的基因定位在与AD连锁的染体基因座上。人AD脑中 过度磷酸化的tau具有比健康人脑中显著降低的O-GlcNAc水平。最近，已经表明感染 AD的人脑的可溶性tau蛋白的O-GlcNAc水平显著低于健康脑的水平。此外，提示无 论如何患病脑的PHF都完全缺乏任何O-GlcNAc修饰。尽管所述tau的过度磷酸化可 能由激酶活性的增强和/或参与O-GlcNAc加工的酶之一的功能异常而引起，但其分子 基础是未知的。支持后一观点的是，在PC-12神经元细胞和小鼠脑组织的切片中，利 用非选择性N-乙酰基葡萄糖胺酶抑制剂升高tauO-GlcNAc水平，于是观察到磷酸化水 平降低。这些综合结果提示通过维持AD患者的O-GlcNAc健康水平(例如通过抑制 O-GlcNAc酶的作用)，将能够阻滞tau的过度磷酸化以及所有与tau过度磷酸化相关的 作用，包括NFT的形成和下游作用。然而，由于β-氨基己糖苷酶正常运作是至关重要 的，因此阻滞O-GlcNAc酶作用的用于AD的任何潜在性介入将不得不避免 同时抑制氨基己糖苷酶A和B。
与己糖胺生物合成途径的已知性质、O-GlcNAc转移酶(OGTase)的酶性质以及 O-GlcNAc和磷酸化之间的互反关系一致，已经表明脑中葡萄糖利用度降低导致tau过 度磷酸化。葡萄糖转运和代谢逐渐受损导致tau(及其它蛋白质)的O-GlcNAc减少和过 度磷酸化。因此，抑制O-GlcNAcase酶将弥补健康个体以及患有AD或相关神经退行 性病变的患者脑内与年龄相关的葡萄糖代谢受损。
这些结果表明，调节tauO-GlcNAc水平的机制异常可能在NFT和相关神经退行 性病变的形成中至关重要。对阻断tau过度磷酸化作为有用的介入的有力支持来 自研究，其表明当用激酶抑制剂处理人tau转基因小鼠时，它们不发生典型的运动缺 陷，另一种情形显示不溶性tau水平降低。这些研究提供了在AD疾病的小鼠模型中降 低tau磷酸化水平和减轻AD样行为症状之间的明确关联。
还有大量证据表明O-GlcNAc蛋白质修饰水平的提高提供了保护免受心脏组织中 应激的致病作用，包括缺血、出血、高血容量性休克和钙反常(calciumparadox)引起的 应激。例如，通过施用葡萄糖胺使己糖胺生物合成途径(HBP)活化已经表明在缺血/再 灌注、创伤出血、高血容量性休克和钙反常的动物模型中发挥保护作用。此外，强有 力的证据表明这些心脏保护作用是由蛋白质O-GlcNAc修饰水平的提高所介导的。还 有证据表明O-GlcNAc修饰在多种神经退行性疾病(包括帕金森病和亨廷顿病)中发挥 作用。
人具有编码从糖缀合物上切割末端β-N-乙酰基-葡萄糖胺残基的酶的3个基因。这 些基因中的第一种编码酶O-糖蛋白2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷酶 (O-GlcNAcase)。O-GlcNAcase是糖苷水解酶家族84中的一员。O-GlcNAcase的作用在 于将O-GlcNAc从翻译后修饰蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上水解下来。与O-GlcNAc 存在于多种细胞内蛋白质上相一致，所述O-GlcNAc酶似乎在多种疾病(包括II型糖尿 病、AD和癌症)的病因中发挥作用。尽管O-GlcNAc酶很可能早就分离出来了，但是 在约20年前才了解其在将O-GlcNAc从蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上切割下来中所 起的生物化学作用。最近已经克隆并部分表征了O-GlcNAcase，表明其还具有作为组 蛋白乙酰转移酶的其它活性。
然而，开发用于阻断哺乳动物糖苷酶(包括O-GlcNAcase)功能的抑制剂的主要挑 战是在高等真核生物组织中存在大量功能上相关的酶。因此，在研究一种特定酶的细 胞和机体生理作用中利用非选择性抑制剂是难以实现的，因为在抑制这种功能相关酶 的同时产生复杂的表型。在β-N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶的情形下，现有的用来阻断 O-GlcNAcase功能的化合物是非特异性的并且潜在地起到抑制溶酶体β-氨基己糖苷酶 作用。
低分子量OGA抑制剂已经在国际专利申请WO2008/025170、WO2011/140640、 WO2012/061927、WO2012/062157、WO2012/083435中被公开，上述专利申请在此 处被纳入作为参考。因此，需要能够选择性地抑制OGA的低分子量抑制剂。
US2009/0163545描述了可改变生命期的化合物，例如(5--1-基甲基-噻唑-2- 基)-氨基甲酸甲酯。WO2010/108115总体上描述了用作变构Janus激酶抑制剂的杂环 胺衍生物。WO2010/101949描述了用作sirtuin调节剂的8-取代的喹啉的制备方法。 N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺可通过商业途径购买，该合物未有限定 的用途。低分子量OGA抑制剂已经在国际专利申请WO2008/025170中被公开。需要 能够选择性地抑制OGA的低分子量抑制剂。
发明内容
本发明的目的是发现具有有价值的特性的新型化合物，尤其是可用于制备药物的 化合物。
业已惊奇地发现，本发明的化合物及其盐具有高的药学价值特性。具体地，它们 作为糖苷酶抑制剂。本发明涉及用作药物的通式(I)所示的化合物，
式中，
X1表示S或O；
X2，W各自独立地表示N或CR6；
R1，R3，R4各自独立地表示Y；
R3，R4一起也表示-(CY2)p-；
R2表示COY、Y、Alk、Cyc、(CY2)nAr、COAlk、CO(CY2)nAr、CONY2、 CONYAlk、CONY(CY2)nAr、COOY、COOAlk、COO(CY2)nAr、SO2Y、 SO2Alk、SO2(CY2)nAr、CY2OY或CY2NY2；
R1，R2一起也表示-(CY2)p-CONY2-(CY2)p-；
R5表示(CY2)qAr、OAr、Cyc、Y或NY2；
R6表示Y、OY、Hal或CN；
L表示-CY2-、-CO-或-SO2-；
Y表示H或A；
A表示含有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Alk表示含有2-10个碳原子的直链或支链烯基，其中1-4个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原子可各自独立地被 Hal取代；
Ar表示含有3-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或者双环的碳环，所 述碳环可被至少一个选自以下组内的取代基取代：Hal、A、(CY2)n-OY、 (CY2)n-NY2、COOY、SO2Y和CN，或者所述碳环可与含有1-5个碳 原子和1-4个N、O和/或S原子的饱和、不饱和或芳香族单环的杂环 稠合；
Hal表示F、Cl、Br或I；以及
m，n，p，q各自独立地表示0、1、2或3；
和/或其生理学上可接受的盐；
条件是不包括(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸甲酯。
特别地，本发明涉及用作药物的通式(I)所示的化合物，
式中，
X1表示S或O；
X2，W各自独立地表示N或CR6；
R1，R3，R4各自独立地表示Y；
R3，R4一起也表示-(CY2)p-；
R2表示COY、Y、Alk、Cyc、(CY2)nAr、COAlk、CO(CY2)nAr、CONY2、 CONYAlk、CONY(CY2)nAr、COOY、COOAlk、COO(CY2)nAr、SO2Y、 SO2Alk、SO2(CY2)nAr、CY2OY或CY2NY2；
R5表示(CY2)qAr、Cyc、Y或NY2；
R6表示Y、OY、Hal或CN；
L表示-CY2-、-CO-或-SO2-；
Y表示H或A；
A表示含有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Alk表示含有2-10个碳原子的直链或支链烯基，其中1-4个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原子可各自独立地被 Hal取代；
Ar表示含有3-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或者双环的碳环，所 述碳环可被至少一个选自以下组内的取代基取代：Hal、A、(CY2)n-OY、 (CY2)n-NY2、COOY、SO2Y和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；以及
m，n，p，q各自独立地表示0、1、2或3；
和/或其生理学上可接受的盐；
条件是不包括(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸甲酯。
在本发明的意义内，化合物被定义为包括其药学上可用的衍生物、溶剂化物、前 药、互变异构体、对映体、外消旋体和立体异构体，包括以任何比例混合的混合物。
术语“药学上可用的衍生物”用来表示，例如，本发明化合物的盐类和所谓的药物 前体化合物。术语“化合物的溶剂化物”用来表示这些化合物与惰性溶剂分子由于彼此 引力作用而形成的加合物。溶剂化物是，例如，单水合物或双水合物或醇化物。当然， 本发明还涉及本发明化合物的盐的溶剂化物。术语“前药”用来表示用例如烷基或酰基、 糖或寡肽修饰的本发明化合物，它们在机体内迅速裂解形成活性形式的本发明化合物。 这些也包括可生物降解的本发明化合物的聚合衍生物。同样地，可以将本发明化合物 做成任何所希望的前药形式，例如酯类、碳酸盐、氨基甲酸盐、脲、酰胺或磷酸盐， 在这些情况下实际具有生物活性的形式只能通过代谢被释放出来。任何在体内可被转 化为生物活性剂(例如本发明的化合物)的任何化合物都是本发明范围和意义内的前 药。各种形式的前药已为本领域所公知。进一步已知的是，化学物质在体内被转化为 代谢物，后者在适合的条件下同样可诱发所希望的生物作用-在某些情况下，甚至以 更显著的方式发挥所希望的生物作用。本发明任一化合物在体内通过代谢转化为任何 具有生物活性的化合物都是本发明范围和意义内的代谢产物。
本发明的化合物可以是其双键异构体形式(如纯的E或Z异构体)，或者是这些双 键异构体的混合物形式。如果可能的话，本发明的化合物可以是互变异构体形式，如 酮-烯醇互变异构体。本发明考虑本发明化合物全部立体异构体，可以是混合物形式、 纯的形式或者大致纯的形式。本发明化合物中的任一碳原子可以具有不对称中心。因 此，它们可以其外消旋体形式、纯的对映体和/或非对映体形式、或者这些对映体和/ 或非对映体的混合物形式存在。混合物可以具有所希望的立体异构体的混合比例。这 样，例如通过本身已知的方法可以将具有一个或多个手性中心以及以外消旋体或非对 映体混合物形式存在的本发明化合物拆分为它们的光学纯异构体，即对映体或非对映 体。本发明化合物的拆分可以利用针对手性或非手性相的柱拆分法、或者在任选的光 学活性溶剂中重结晶、或者利用光学活性酸或碱、或者利用光学活性剂(如光学活性醇) 进行衍生化再除去基团来实现。
本发明也涉及本发明的化合物的混合物的用途，例如两种非对映体的混合物，例 如混合比例为1：1,1：2，1：3，1：4，1：5，1：10，1：100或1：1000。这些混合 物特别优选立体异构体化合物的混合物。
本说明书所用的定义化合物，尤其是本发明的化合物，的术语通常基于IUPAC组 织关于化合物特别是有机化合物的规则。解释本发明的上述化合物的术语总是具有如 下含义，除非在说明书或权利要求中另有所指。
术语“未取代的”指的是相应的原子团、基团或部分没有取代基。术语"取代的"指 的是相应的原子团、基团或部分具有一或多个取代。若某个原子团有多个取代基并指 定选定的多个取代基，则选定的取代基相互独立，并且不一定相同。即使某个原子团 有多个指定的取代基，该取代基的表示可以相互不同(例如甲基和乙基)。因此，可以 理解的是，本发明任一个原子团的某些取代可以涉及相同或不同的原子团。所以，如 果各个原子团在一个化合物内出现多次，这些原子团适用上述的含义，各自相互地独 立。
术语“烷基”或“A”表示非环状的饱和或不饱和烃基，它们是直链或支链的，较 佳为具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，即C1-10-烷基。烷基的例子有 甲基、乙基、丙基、异丙基、1,1-，1,2-或2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、1-乙基-1-甲 基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-或1,2,2-三甲基丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔 丁基、1-，2-或3-甲基丁基、1,1-，1,2-，1,3-，2,2-，2,3-或3,3-二甲基丁基、1-或2- 乙基丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-，2-，3-或4-甲基戊基、己基、2-己基、 异己基，庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十 八烷基、二十烷基、二十二烷基。
在本发明的一个实施方案中，A是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7 个氢原子可相互独立地被Hal取代。A优选是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基， 其中1-4个氢原子可相互独立地被Hal取代。在本发明的一更优选实施例中，A是具 有1-4个碳原子的直链或支链烷基，其中1-3个氢原子可相互独立地被Hal取代，尤其 被F和/或Cl取代。最优选的是，A是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。高度优选 的是C1-4-烷基。C1-4-烷基是例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1，1-三氟乙基或溴甲基，特别 是甲基、乙基、丙基或三氟甲基。不言而喻，本发明的任何基团中A的各自含义是各 自独立的。
术语“烯基”或“Alk”是指含有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链 或支链烯基，即C2-C10烯基。烯基含有至少一个C-C双键。合适的烯基的实例是烯丙 基、乙烯基、丙烯基、-CH2CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-C(＝CH2)-CH3)、1-，2-或3-丁烯 基、异丁烯基、2-甲基-1-或2-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1,3-丁二烯、2-甲基-1,3-丁二 烯、2,3-二甲基-1,3-丁二烯、1-，2-，3-或4-戊烯基和己烯基。
在本发明的一个实施方案中，Alk表示含有2-10个碳原子的直链或支链烯基，其 中1-4个氢原子可以各自独立地被Hal取代。Alk的优选例子表示含有2-6个碳原子的 直链或支链烯基，其中1-3个氢原子可以各自独立地被Hal取代，尤其是被F和/或Cl 取代。在本发明的一个更优选的实施方案中，Alk表示含有2-6个碳原子的直链或支链 烯基。在本发明的最优选的实施方案中，Alk表示含有2-4个碳原子的直链或支链烯基， 高度优选是乙烯基。
术语“环烷基”或“Cyc”在本发明的意义上表示具有1-3个环的饱和和部分不饱 和非芳环烃基，包含3-20个，较佳为3-12个，特佳为3-9个碳原子。环烷基可以是双 环或多环系统的一部分，其中，例如，环烷基与芳基、杂芳基或杂环基通过任何可能 的和希望的环成员稠合。对通式(I)化合物的连接可以通过环烷基的任何环成员进行。 合适的环烷基的例子为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、 环戊烯基、环己烯基和环辛二烯基。
在本发明的一个实施方案中，Cyc是具有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原 子可相互独立地被Hal取代。优选的是C3-C7-环烷基。更优选的是C4-C7-环烷基。最 优选的是C5-C7-环烷基。即环戊基、环己基或环庚基，高度优选的是环己基。应当理 解，本发明任何基团中Cyc的相应含义是各自独立的。
术语“芳基”或“碳芳基”在本发明的意义上表示具有3-14个碳原子(较佳为3-12 个碳原子，更佳为4-12个碳原子，最佳为5-10个碳原子，特佳为6-8个碳原子)的单 环或多环芳烃系统，所述芳烃系统可被任意地取代。术语“芳基”也包括芳环是二环 或多环饱和、部分不饱和和/或芳香族系统的一部分，例如，当芳环经芳基的任何合乎 要求和可能的环原子稠合到本说明书定义的芳基、环烷基、杂芳基或杂环基上时。经 芳基的任何环原子可进行与通式(I)化合物的连接。合适的芳基的例子是苯基、联苯基、 萘基、1-萘基、2-萘基和蒽基，同样可以是二氢茚基、茚基、1,2,3,4-四氢萘基。优选 的本发明的碳芳基是可被任意取代的苯基、萘基和联苯基，更优选的是可被任意取代 的具有6-8个碳原子的单环碳芳基，最优选的是可被任意取代的苯基。
在本发明的另一实施例中，碳环包括但不限于碳芳基，定义为“Ar”。合适的Ar 基团的例子是苯基、o-，m-或p-甲苯基、o-，m-或p-乙基苯基、o-，m-或p-丙基苯基、 o-，m-或p-异丙基苯基、o-，m-或p-叔丁基苯基、o-，m-或p-羟基苯基、o-，m-或p- 甲氧基苯基、o-，m-或p-乙氧基苯基、o-，m-或p-氟苯基、o-，m-或p-溴苯基、o-， m-或p-氯苯基、o-，m-或p-磺酰基氨基苯基、o-，m-或p-(N-甲基-磺酰基氨基)苯基、 o-，m-或p-(N,N-二甲基-磺酰基氨基)苯基、o-，m-或p-(N-乙基-N-甲基-磺酰基氨基) 苯基、o-，m-或p-(N,N-二乙基-磺酰基氨基)苯基，特别是2,3-，2,4-，2,5-，2,6-，3,4- 或3,5-二氟苯基、2,3-，2,4-，2,5-，2,6-，3,4-或3,5-二氯苯基、2,3-，2,4-，2,5-，2,6-， 3,4-或3,5-二溴苯基、2,3,4-，2,3,5-，2,3,6-，2,4,6-或3,4,5-三氯苯基、2,4,6-三甲氧基 苯基、2-羟基-3,5-二氯苯基、p-碘苯基、4-氟-3-氯苯基、2-氟-4-溴苯基、2,5-二氯-4- 溴苯基、3-溴-6-甲氧基苯基、3-氯-6-甲氧基苯基或2,5-二甲基-4-氯苯基。
Ar优选表示含有3-12个碳原子的不饱和或芳香族单环或双环碳环，该碳环可被至 少一个选自Hal、A、(CY2)n-OY、(CY2)n-NYY、COOY、SO2Y和CN的取代基取代。 在本发明更优选的实施例中，Ar表示含有4-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或 双环碳环，该碳环可被至少一个选自Hal、A、OY、COOY和CN的取代基取代。最 优选的是，Ar表示含有5-10个碳原子的芳香族单环或双环碳环，该碳环可被至少一 个选自Hal、A、OY、COOH和CN的取代基单取代或二取代。在本发明的一高度优 选实施例中，Ar表示含有6-8个碳原子的芳香族单环碳环，该碳环被Hal、A或OY 单取代。在本发明特别高度优选的实施例中，Ar表示苯基，其可被A或OY在对位或 间位取代。应当理解，本发明任何基团中Ar的相应含义是各自独立的。
在本发明的一个实施方案中，Ar可以与含有1-5个碳原子和1-4个N、O和/或S 原子的饱和、不饱和或芳香族单环的杂环稠合。较佳地，Ar可以与含有2-4个碳原子 和1-3个N和/或O原子的饱和或芳香族单环的杂环稠合。更佳地，Ar可以与含有3-4 个碳原子和2个N或O原子的饱和或芳香族单环的杂环稠合。
术语“杂环”或“杂环基”在本发明意义上表示具有包括碳原子和1、2、3、4 或5个相同或不同杂原子(特别是氮、氧和/或硫)的3-9个环原子(较佳为3-7个环原子， 特佳为3-6个环原子)的单环系统。环系统可以是饱和的或一元或多元不饱和，优选为 不饱和，更佳为杂芳基。对于环系统由至少两个环组成的情形，所述环可以通过稠合 或螺合而连接在一起。这些杂环基可通过任何环原子连接。术语“杂环基”包括一些 系统，其中杂环是二环或多环饱和、部分不饱和和/或芳香族系统的一部分，例如，当 杂环经任何合乎要求的和可能的杂环基上的原子稠合到本说明书定义的芳基、环烷基、 杂芳基或杂环基上时。经杂环基的任何环原子可进行与通式(I)化合物的连接。合适的 杂环基的例子为：吡咯烷基、硫代吡咯烷基、基、吡嗪基、噁吡嗪基、噁基、 噁二唑基、四氢呋喃基、咪唑烷基、噻唑烷基、四氢吡喃基、吗啉基、四氢硫代苯基、 二氢吡喃基。
术语“杂芳基”在本发明的意义上表示3-9元、优选4-，5-或6-元单环芳烃基， 包含至少一个(如果合适，还可为2、3、4或5个)杂原子，特别是氮、氧和/或硫，杂 原子可以是相同或不同的。杂原子的数目较佳为1或2，更佳为2。术语“杂芳基”包 括一些系统，其中芳环是二环饱和、部分不饱和和/或芳香族系统的一部分，例如，当 芳环经杂芳基的任何合乎要求的和可能的环原子稠合到本说明书定义的芳基、环烷基、 杂芳基或杂环基上时。经杂芳基的任何环原子可进行与通式(I)化合物的连接。合适的 杂芳基的例子是吡咯基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、噻唑基，异噻唑基、噁唑基、噁 二唑基、异噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基、 异喹啉基、咪唑基、三唑基、三嗪基、四唑基、酞嗪基、吲唑基、吲嗪基、喹喔啉基、 喹唑啉基、喋啶基、咔唑基、吩嗪基、吩噁嗪基、吩噻嗪基和吖啶基。
术语“卤素”、“卤原子”、“卤素取代基”或“Hal”在本发明的意义上表示一 个或几个氟(F)、溴(Br)、氯(Cl)或碘(I)原子。术语“二卤”、“三卤”和“全卤”分别 涉及两个、三个和四个取代基，每个取代基可各自独立地选自F，Cl，Br或I。卤素较 佳为表示F、Cl或Br原子。F和Cl是特别优选的，特别是当卤素取代在烷基(卤代烷 基)或烷氧基(例如CF3和CF3O)上时。应当理解，本发明任何基团中“Hal”的相应含义 是各自独立的。
在本发明的一个实施例中，X1表示S或O，较佳地是S。
在本发明的另一个实施例中，X2表示CR6或N，较佳地是CR6，更佳地是CY， 最佳地是CH。
在本发明的一个实施例中，W表示N或CR6，较佳地是N或CY，更佳地是N或 CH，最佳地是N。
在本发明的另一个实施例中，X2表示CY和/或W表示N或CH。
在本发明的另一个实施例中，R1表示H或A，更佳地是H。
在本发明的一个实施例中，R2表示COY、Y、Alk、Cyc、(CY2)nAr、COAlk、 CO(CY2)nAr、CONY2、CONYAlk、CONY(CY2)nAr、COOY、COOAlk、COO(CY2)nAr、 SO2Y、SO2Alk、SO2(CY2)nAr、CY2OY或CY2NY2；较佳地是COY、Y、Cyc、(CY2)nAr、 COAlk、CO(CY2)nAr、CONY2、CONY(CY2)nAr、COOY、COO(CY2)nAr、SO2Y、CY2OY 或CY2NY2；更佳地是COY、Y、Cyc、(CY2)nAr、COAlk、COAr、CONYY、CONYAr、 COOY、COO(CY2)nAr或SO2Y；最佳地是COY、COAlk、CONY2或COOY；高度优 选地是COA、COAlk、CONHA或COOA；特佳地是COY；最特佳地是COA。
在本发明的另一个优选实施例中，R1和R2同时地表示H。
在本发明的另一个优选实施例中，R3表示H或A，更佳地是A。
在本发明的另一个优选实施例中，R4表示H或A，更佳地是H。
在本发明的一个优选实施例中，R3和R4一起表示-(CY2)p-，更佳地是-(CH2)p-，最 佳地是-(CH2)2-。
在本发明的一个实施例中，R5表示(CY2)qAr、Cyc、Y或NY2；较佳地是(CY2)qAr、 Cyc、H或A；更佳地是(CH2)qAr、Cyc或A；最佳地是(CH2)qAr或Cyc；特佳地是(CH2)qAr； 最特佳地是Ar。
在本发明的另一个实施例中，R6表示Y、OY、Hal或CN；较佳地是H、A、OY 或Hal；更佳地是H、A、OH或Hal；最佳地是H、OH或Hal；特佳地是H。
在本发明的另一个优选实施例中，L表示-CY2-、-CO-或-SO2-；较佳地是CY2；更 佳地是CHY；最佳地是CH2。
在本发明的另一个实施例中，W表示N；R2表示COY、COAlk、CONY2或COOY； 和/或L表示CY2。在本发明的优选实施例中，W表示N；R2表示COY；且L表示CHY。
在本发明的一方面，Y表示H或A。应当理解，本发明任何基团中Y的相应含义 是各自独立的。
在本发明的另一个实施例中，指数m表示0、1、2或3；较佳地是0、1或2；更 佳地是1或2；最佳地是1。
在本发明的另一个实施例中，指数n表示0、1、2或3；较佳地是0、1或2；更 佳地是0或1；最佳地是0。应当理解，本发明任何基团中n的相应含义是各自独立的。
在本发明的一个实施例中，指数p表示0、1、2或3；较佳地是1、2或3；更佳 地是1或2；最佳地是2。
在本发明的一个实施例中，指数q表示0、1、2或3；较佳地是0、1或2；更佳 地是0或1；最佳地是0。
在本发明的一个实施例中，指数m和p各自独立地表示1或2，和/或指数n和q 各自独立地表示0或1。
因此，本发明的主题涉及用作药物的通式(I)化合物，其中至少一个上述基团具有 上面标明的意义，特别是实现以上描述的较佳实施例。在通式(I)、其子结构式或其上 面的其他残基的任何实施例中没有更详细标明的基团应当理解为具有为达到本发明目 的而在此处公开的通式(I)中表示的含义。这意味着上述基团可采取指派给它们的所有 含义，如上面或下面包括任何优选实施方案所描述的，而没有被束缚于其上，并独立 地出现于另外的特定情况下。应当特别理解的是，某个基团的每个实施例可以与一个 或几个其它基团的每个实施例相结合。
在本发明的另一优选实施例中，提供用作药物的子结构式(IA)所示的化合物，
式中，
X1表示S或O；
X2表示CR6或N；
R2表示COY、COAlk、CONY2或COOY；
R3，R4各自独立地表示Y；
R3，R4一起也表示-(CY2)p-；
R5表示(CY2)qAr、Cyc或Y；
R6表示Y、OY或Hal；
Y表示H或A；
A表示含有1-10个碳原子的直链或支链烷基，其中1-7个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Alk表示含有2-6个碳原子的直链或支链烯基，其中1-3个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有3-7个碳原子的环烷基，其中1-4个氢原子可各自独立地被 Hal取代；
Ar表示含有4-12个碳原子的不饱和或者芳香族单环或者双环的碳环，所 述碳环可被至少一个选自以下组内的取代基取代：Hal、A、OY、COOY 和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；
m，q各自独立地表示0、1或2；以及
p表示1、2或3；
和/或其生理学上可接受的盐；
条件是不包括(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸甲酯。
在本发明的另一优选实施例中，提供用作药物的子结构式(IB)所示的化合物，
式中，
X2表示CY或N；
R3，R4各自独立地表示Y；
R3，R4一起也表示-(CH2)p-；
R5表示(CH2)qAr、Cyc或A；
Y表示H或A；
A表示含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其中1-4个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有4-7个碳原子的环烷基；
Ar表示含有5-10个碳原子的芳香族单环或者双环的碳环，所述碳环可被 至少一个选自以下组内的取代基单取代或二取代：Hal、A、OY、COOH 和CN；
Hal表示F、Cl、Br或I；
m表示0、1或2；
p表示1或2；以及
q表示0或1；
和/或其生理学上可接受的盐。
在本发明的另一高度优选实施例中，提供用作药物的子结构式(IC)所示的化合物，
式中，
R3表示A；
R4表示H；
R3，R4一起也表示-(CH2)p-；
R5表示(CH2)qAr、Cyc或A；
Y表示H或A；
A表示含有1-4个碳原子的直链或支链烷基，其中1-3个氢原子可各自 独立地被Hal取代；
Cyc表示含有5-7个碳原子的环烷基；
Ar表示含有6-8个碳原子的芳香族单环的碳环，所述碳环可被Hal、A或 OY单取代；
Hal表示F、Cl、Br或I；
m、p各自独立地表示1或2；以及
q表示0或1；
和/或其生理学上可接受的盐。
通式(I)或(IA)至(IC)的另一方面，不包括R3和R5同时表示A。
在本发明的另一高度优选实施例中，提供用作药物的子结构式(ID)所示的化合物，
式中，
X1表示S或O；
R1表示H或A；
R2表示COA、COAlk、CONHA或COOA；
A表示含有1-6个碳原子的直链或支链烷基；以及
Alk表示含有2-10个碳原子的直链或支链烯基；
和/或其生理学上可接受的盐。
本说明书上文有关通式(I)的化合物，包括其基团定义和优选实施例，的教导是有 效的和适用的，如果合理的话，不限于子结构式(IA)至(ID)的化合物及其盐。
表1列出了通式(I)和子结构式(IA)至(ID)所示化合物和/或其生理学上可接受的盐 的最优选实施例。
表1：通式(I)和子结构式(IA)至(ID)所示的化合物。
OGA酶抑制分析试验：实施例12；细胞的O-GlcNAc糖基化分析试验：实施例13。
通式(I)所示的化合物及其制备用的起始物料通过各自已知的方法进行制备，如文 献中所记载和/或本领域技术人员已知的，即在已知的和适合所述反应的反应条件下进 行制备。也可使用它们已知的变体，此处不作详述。若有需要的话，可以原位形成起 始物料，让它们在粗反应混合物中保持未分离状态，但立即将它们转化为本发明的化 合物。另一方面，可以逐步进行反应。
反应较佳地在碱性条件下进行。合适的碱是金属氧化物，例如氧化铝；碱金属氢 氧化物(氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化锂)；碱土金属氢氧化物(氢氧化钡和氢氧化钙)； 碱金属醇盐(乙醇钾或丙醇钠)；碱金属碳酸盐(例如碳酸氢钠)；以及各种有机碱(例如 N,N-二异丙基乙胺、或二乙醇胺)。
反应通常在在惰性溶剂中进行。合适的惰性溶剂例如是烃类，如己烷、石油醚、 苯、甲苯或二甲苯；氯化烃类，如三氯乙烯、1,2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯 甲烷；醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚类，如乙醚、二 异丙醚、四氢呋喃(THF)或二噁烷；乙二醇醚类，如乙二醇单甲醚或单乙醚、乙二醇二 甲醚(二甘醇二甲醚)；酮类，如丙酮或丁酮；酰胺类，如乙酰胺、二甲基乙酰胺或二 甲基甲酰胺(DMF)；腈类，如乙腈；亚砜类，如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸类， 如甲酸、乙酸或三氟乙酸(TFA)；硝基化合物，如硝基甲烷或硝基苯；酯类，如乙酸乙 酯；或所述溶剂的混合物。特别优选的是TFA、DMF、二氯甲烷、THF、水、甲醇、 叔丁醇、叔戊醇、三乙胺或二噁烷。
根据所用条件，反应时间在几分钟和14天之间，反应温度在-80℃和140℃之间， 通常在-50℃和120℃之间，特别适宜的是在-20℃和100℃之间。
本发明还涉及制备通式(I)化合物的方法，包括如下步骤：
(a)使通式(II)化合物，
式中，R7表示Hal、H或OH；以及
X1、W、R1、R2和L具有上面指明的含义，
与通式(II)化合物反应，
式中，X2、R3、R4、R5和m具有上面指明的含义，
得到通式(I)化合物，
式中，X1、X2、W、R1至R5、L和m具有上面指明的含义；
并任选地
(b)将通式(I)化合物(其中R2是H)转换为通式(I)所示的另一种化合物(其中R2是除 H以外的具有上面指明的含义)；
(c)将通式(I)化合物的碱或酸转换为其生理学上可接受的盐；和/或
(d)将通式(I)化合物或其生理学上可接受的盐明确地定制为药物。.
本发明的范围中特别优选地包括以下反应，包括没有限制性流程、条件和化合物。 其它基团具有上面指明的含义。
流程1：涉及亲核取代步骤的模块化耦合的一般反应顺序
流程2：涉及还原性胺化的模块化耦合的一般反应顺序(程序A)
流程3：涉及钯催化耦合化学的模块化合成的一般反应顺序(程序B)
流程4：涉及酰胺键形成的模块化合成的一般反应顺序
流程5：合成杂芳基-酰胺和杂芳基-胺的一般路径
流程6：合成含有官能团(例如酮、醇和伯胺)的类似物的一般路径
流程7：合成含有官能团(例如脲、氨基甲酸酯和磺酰胺)的类似物的一般路径
流程8：N-(5-(1-(4-苯基-1-基)乙基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
流程9：涉及亲核取代步骤的模块化耦合的一般反应顺序
流程10：涉及Wittig反应的模块化合成的一般反应顺序
流程11：模块化合成苄基取代的哌嗪的一般反应顺序
本发明的另一个目的是提供子结构式(IE)所示的中间体化合物，
式中，X1、X2、W、R1、R3至R5、L和m具有上面指明的含义，条件是不包括5- 吡咯烷-1-基甲基-噻唑-2-基胺。它们优选地用作制备本发明通式(I)所示的其他化合物 的中间体。
通式(IE)所示的中间体化合物的优选方面是，W表示N或CH；且X1具有上面指 明的含义。不考虑糖苷酶抑制活性，特别优选的中间体在下文的实施例中给出，可按 照流程5至7的程序采用它们来制备其他化合物。
更优选的中间体如子结构式(IE1)所示，
式中，W表示N或CH；且X1和R1具有上面指明的含义。
本发明还涉及制备子结构式(IF)化合物的方法，包括如下步骤：
(a)使通式(IV)化合物，
式中，W和X1具有上面指明的含义，
与通式(V)、(VI)、(VII)或(VIII)所示的化合物反应，
式中，
R2’表示Y、Alk、Cyc或(CY2)nAr；
R2”表示R2”’或R2””；
R2”’表示Y、Alk或(CY2)nAr；以及
Y、Alk、Cyc、Ar、Hal和n具有上面指明的含义，
得到通式(IF)化合物，
式中，
R1表示H；
R2表示Y、Alk、Cyc、(CY2)nAr、COY、COAlk、CO(CY2)nAr、CONHY、CONHAlk、
CONH(CY2)nAr、COOY、COOAlk、COO(CY2)nAr、SO2Y、SO2Alk或 SO2(CY2)nAr；以及
W和X1具有上面指明的含义；
并任选地
(b)将步骤(a)获得的子结构式(IF)化合物与卤代烷反应，生成子结构式(IF)所示的 另一种化合物，其中R1是除H以外的具有上面指明的含义；和/或
(c)将子结构式(IF)化合物的碱或酸转换为其生理学上可接受的盐。
通式(I)及其子结构式所示的化合物可以通过上述路径获得。起始物料，包括通式 (II)至(VIII)所示的化合物，对本领域技术人员通常是已知的，或者它们可通过已知的 方法制备。因此，通式通式(II)至(VIII)的任何化合物可以被纯化为中间产物并用作制 备通式(I)化合物的起始物料。
可对通式(I)化合物进行修饰，例如氢化或金属还原处理，以移除氯，或进行取代 反应，和/或用酸或碱(较佳使用强酸)将它转化为盐。关于无机化学、化学策略和技巧、 合成路径、中间体的保护、裂解和纯化程序、分离和表征等等，现在已经有许多文献 和方法可供本领域技术人员使用和参考。一般的化学修饰已为本领域技术人员所知。 芳基或羟基被酸、醇、酚及其互变结构的卤素取代的卤化反应可较佳地使用POCl3或 SOCl2、PCl5、SO2Cl2进行。在某些情况下，也可使用草酰氯。温度可在0℃至回流温 度之间变化，取决于是卤化吡啶酮结构或羧酸或磺酸而定。时间可在数分钟至数小时， 甚至整夜。类似地，烷基化、醚形成、酯形成、酰胺形成已为本领域技术人员所公知。 用芳基硼酸进行芳基化可在钯催化剂和合适的配体和碱(较佳是钠、钾或铯的碳酸盐、 磷酸盐或硼酸盐)存在下进行。也可使用有机碱，如三乙胺、DIPEA或更强碱性的DBU。 溶剂可以是甲苯、二噁烷、THF、二甘醇二甲醚、乙二醇二甲醚、醇类、DMF、DMA、 NMP、乙腈，在某些情况甚至可使用水和其他溶剂。常用的催化剂是PdO催化剂的先 导体Pd(PPh3)4或Pd(OAc)2、PdCl2，它们比许多复杂的催化剂更有利，是更有效的配 体。在C-C芳基化中，不使用硼酸和酯(Stille偶联)，而是可用芳基-三氟硼酸钾盐 (Suzuki-Miyaura偶联)、有机硅烷(Hiyama偶联)、Grignard试剂(Kumada)、锌有机基 (Negishi偶联)和锡有机基(Stille偶联)。这种经验可移至N-和O-烷基化反应中。甚至使 用芳基氯化物和苯胺进行缺电子苯胺的N-烷基化以及用铜和钯催化剂的O-烷基化已 经在无数文献中有记载，本领域技术人员可使用这许多方法。
在上述方法的最后步骤中，任选地提供优选为通式(I)的化合物的盐。本发明的化 合物可以非盐的最终形式加以使用，另一方面，本发明还包括这些化合物以其药学上 可接受的盐的形式加以使用，这些药学上可接受的盐可用本领域已知的方法从各种有 机和无机酸和碱制备得到。大多数情况下，本发明化合物的药学上可接受的盐主要通 过常规方法制备。如果本发明化合物包含羧基，可通过该化合物与合适的碱反应形成 其合适的盐，即得到相应的碱加成盐。这样的碱为，例如，碱金属氢氧化物(如氢氧化 钾、氢氧化钠和氢氧化锂)、碱土金属氢氧化物(如氢氧化钡和氢氧化钙)和碱金属醇盐 (如乙醇钾和丙醇钠)，及各种有机碱，如、二乙醇胺和N-甲基谷氨酰胺。同样也 包括本发明化合物的铝盐。对于某些本发明的化合物，这些化合物可与药学上可接受 的有机酸或无机酸反应生成酸加成盐类，这些酸的实例如卤化氢，如氯化氢、溴化氢 或碘化氢；其它矿酸及其相应的盐类，如硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐等，以及烷基或单 芳基磺酸盐，如乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐，以及其它有机酸及其相应的盐 类，如醋酸盐、三氟乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、枸橼酸盐、苯甲酸盐、 水杨酸盐、抗坏血酸盐等。因此本发明的化合物的药学上可接受的酸加成盐包括：醋 酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、精氨酸盐、天门冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(besylate)、 硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、氢溴酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、辛酸盐、盐酸 盐、氯苯甲酸盐、枸橼酸盐、环戊基丙酸盐、葡萄糖酸盐、磷酸二氢盐、二硝基苯甲 酸盐、十二烷基硫酸盐、乙基磺酸盐、富马酸盐、半乳糖二酸盐(源于粘酸)、半乳糖 醛酸盐、葡萄糖庚酸盐、葡萄糖酸、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、半琥珀酸盐、单硫酸盐、 庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、碘盐、 羟乙基磺酸盐、异丁酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁 桃酸盐、偏磷酸盐、甲烷磺酸盐、甲基苯甲酸盐、磷酸氢盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、 硝酸盐、草酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、盐、3-苯基丙 酸盐、磷酸盐、膦酸盐、邻苯二甲酸盐，但是这些实例并不表示对本发明的限制。
关于上面的描述，可以看到，本说明书中的术语“药学上可接受的盐”和“生理 学上可接受的盐”是可以互换的，在本文中用来表示包含本发明化合物的一种盐形式 的活性成分，特别是如果这种盐形式给活性成分带来与该活性成分游离形式相比改善 的药代动力学性质。活性成分的药学上可接受的盐形式还可第一次给这种活性成分带 来期望的药代动力学性质，甚至可对此活性成分体内效应的药效学具有积极影响。
此外，具有通式(I)的化合物还应包括其同位素标记形式。具有通式(I)的化合物的 同位素标记形式与所述化合物的区别仅在于所述化合物的一个或多个原子被原子量或 质量数与通常是天然存在的原子的原子量或质量数不同的一个或多个原子取代。市场 上容易买到且可通过已知方法被结合到具有通式(I)的化合物中的同位素的例子包括 氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯，例如分别为2H，3H，13C，14C，15N，18O，17O，31P， 32P，35S，18F和36CI。含有一或多个上述同位素和/或其他原子的同位素的通式(I)化合 物、其前药或它们中任一个的药学上可接受的盐都应理解为本发明的一部分。可以多 种有利的方式使用同位素标记的通式(I)化合物。例如，结合了诸如3H或14C的放射性 同位素的同位素标记的通式1化合物可用于药物和/或底物组织分布试验。由于其制备 简单及可检测性良好而尤其优选这两种放射性同位素，即氚(3H)和碳-14(14C)。由于诸 如氘(2H)的较重的同位素具有较高的代谢稳定性，将这种同位素标记化合物结合到通 式(I)化合物中在上是有好处的。较高的代谢稳定性直接导致体内半衰期延长或剂 量减少，这在多数情况下代表了本发明的优选实施例。通常可通过进行本文本的实施 例部分和制备部分中的合成方案和相关描述中公开的步骤来制备同位素标记的通式(I) 化合物，用容易得到的同位素标记反应物代替非同位素标记反应物。
为了通过一级动力学同位素效应控制化合物的氧化代谢，可将氘(2H)结合到所述 化合物中。一级动力学同位素效应是由于同位素核的替换而导致化学反应速率发生变 化，这是由于所述同位素替换之后形成共价键所需的基态能量的变化而引起的。较重 的同位素的替换通常导致化学键的基态能量降低，从而引起速率限制的键断裂反应的 速率降低。如果键断裂发生在沿着多产物反应的坐标的鞍点区中或其附近，产物分布 比率可被显著改变。解释如下：如果氘被键合到碳原子的非可替换位置上，通常速率 差异km/kd＝2-7。如果该速率差异被成功地应用于易于氧化的通式(I)化合物，则该化合 物在体内的性质可被显著地改变，从而改善药物动力学特性。
在发现和开发剂时，本领域技术人员尝试在保持有利的体外特性的同时优化 药物动力学参数。可以合理地认为，许多药物动力学性质差的化合物易于被氧化代谢。 现有的体外肝微粒体试验提供了关于这种类型的氧化代谢过程的有价值的信息，这些 信息使得可以合理地设计具有通式(I)的含氘化合物，使其由于抗氧化代谢而提高稳定 性。因此，通式(I)化合物的药物动力学性质显著地改善了，这种改善可用体内半衰期 (t/2)的延长、疗效最好的浓度(Cmax)、剂量响应曲线下的面积(AUC)以及F来定量地表 示，也可用降低的清除率、剂量和材料成本来定量地表示。
以下阐述用于说明上述内容：把通式(I)化合物制备成一系列类似物，其中所述通 式(I)化合物具有多个氧化代谢可能攻击的位点，例如苯甲基氢原子和与氮原子键合的 氢原子，在所述类似物中各种组合的氢原子被氘原子取代，因此所述氢原子中的一部 分、大多数或全部被氘原子取代。半衰期的确定使得可以有利地及准确地确定对氧化 代谢的抵抗能力提高的程度。通过这种方式确定了，由于这种类型的氘-氢替换，母化 合物的半衰期可被提高高达100％。
通式(I)化合物中的氘-氢替换也可被用来有利地改变起始化合物的代谢物谱，以减 少或消除不良有毒代谢物。例如，如果通过氧化性碳-氢(C-H)键断裂产生了有毒代谢 物，可以合理地认为，含氘类似物将会显著地减少或消除不良代谢物的产生，即使该 具体的氧化反应并不是速率决定步骤。
本发明的目的也是通式(I)所示的化合物和/或其生理学上可接受的盐在抑制糖苷 酶中的用途。术语“抑制”表示基于特定的本发明化合物的作用而使糖苷酶活性发生任 何的减低，本发明化合物能够与靶糖苷酶相互作用，使得识别、结合和阻断成为可能。 应当理解的是，本发明化合物最终与目标相互作用，以展现效果。化合物的特征是具 有与至少一种糖苷水解酶高的亲和力，确保可靠的结合，较佳是完全阻断糖苷酶活性。 更佳的是，物质是单特异性的，以保证对单个糖苷酶靶的唯一和直接识别。在本发明 的上下文中，术语“识别”–非限制性地-涉及在特定化合物和靶之间的任何类别的相 互作用，特别是共价或非共价结合或缔合，例如共价键、亲水/疏水相互作用、范德华 力、离子对、氢键、配体-受体相互作用等等。这样的缔合也可以包含其他分子(例如 肽、蛋白质或核苷酸序列)的存在。本发明的受体/配体相互作用的特征是高亲和力、 高选择性以及与其他靶分子有极小的甚至没有交叉反应，从而排除了对受试者产 生不健康的和有害的作用。
在本发明的一个优选实施例中，糖苷酶包括糖苷水解酶，更优选的是糖苷水解酶 家族84，最优选是O-糖蛋白2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷酶(OGA)，高度优 选的是哺乳动物O-GlcNAcase酶。特别优选的是，本发明的通式(I)化合物选择性地结 合O-GlcNAcase，例如藉此选择性地抑制2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷 (O-GlcNAc)的裂解，而它们不会明显地抑制溶酶体β-氨基己糖苷酶。
本发明的化合物较佳地表现出有利的生物活性，这在此处描述或现有技术已知的 酶活性试验中很容易地验证。在这些体外试验中，化合物较佳地表现出并引致抑制效 应。IC50是化合物产生最大抑制作用的一半时的浓度。此处描述的化合物特别能够抑 制一半糖苷酶靶时的浓度是小于100μM，优选小于10μM，更优选小于1μM，最优选 小于0.2μM。
根据本发明的化合物的有利的生物活性也可在细胞基试验(例如WO2008/025170 中描述的那些试验。当在细胞基试验中测试此处描述的化合物时，测量到GlcNAc糖 基化(由于抑制OGA)增加。EC50是化合物产生最大可能的应答的一半时的有效浓度。 本发明的化合物的EC50值在0.1μM至100μM范围内。较佳地，本发明的化合物的活 性，以EC50标准表示，是小于100μM，优选小于10μM，更优选小于1μM，最优选小 于0.2μM。
本发明的一个优选目的涉及抑制糖苷酶的方法，其中能够表达糖苷酶，尤其表达 所述糖苷酶，的系统与至少一种本发明通式(I)所示的化合物和/或生理学上可接受的盐 在抑制糖苷酶的条件下接触。在所述方法的一个优选方面，糖苷酶与选择性地抑制 O-GlcNAcase酶，更优选地其IC50小于0.2μM的化合物接触。还优选的是所述方法在 体外实施和/或所述方法不对人体实施。在所述方法的范围内优选的是细胞系统。细胞 系统被定义为任何个体，只要所述个体包含细胞。细胞是指任何类型的原代细胞或基 因加工的细胞，无论这些细胞是否在隔离的状态、在培养状态、作为细胞系、装配在 组织、器官或完整的实验室哺乳动物中，只要它们能够表达糖苷酶。还应当理解的是， 细胞表达糖苷酶是把上述抑制方法付诸实践的固有前题条件。虽然特别优选的是细胞 能够表达或确实表达糖苷酶，但不应排除的是也可以使用糖苷酶缺陷细胞或者是把糖 苷酶人工地添加到细胞系统中。本发明的试验甚至可以完全地在体外实施，以致不必 使用细胞，但会使糖苷酶与本发明的通式(I)所示的至少一种化合物和/或其生理学上可 接受的盐接触。因此，提供一定量的分离的糖苷酶用于此目的，糖苷酶可以是未纯化 的或纯化的形式。本说明书上文有关通式(I)化合物(包括其任何优选实施例)的教导是 有效的和适用的，当在抑制糖苷酶的方法中不限于通式(I)化合物及其盐。
如上文所述，糖苷酶信号转导通路与各种疾病，优选是神经退行性疾病、糖尿病、 癌症和应激，有关。因此，使本发明的化合物通过与一或多个所述信号转导通路相互 作用来预防和/或依赖于所述信号转导通路的疾病。因此，本发明涉及根据本发明 的化合物用作本说明书描述的信号转导通路(优选OGA介导的信号转导通路)的抑制 剂。
本发明的方法可以在体外或体内进行。可在研究和临床应用的过程中用体外试验 测定对用本发明化合物具体细胞的敏感性。通常混合培育细胞培养物与各种浓度 的本发明化合物足够时间，其时间使活物得以调节糖苷酶活性，培养时间常介于 1小时与1周之间。可用活检样品或细胞系的培养细胞进行体外处理。
宿主或患者可属于哺乳动物，如灵长类动物，具体是人；啮齿动物，包括小鼠、 大鼠和仓鼠；兔，马，牛，狗，猫等。供实验研究的感兴趣动物模型可提供人类 疾病的模型。
为了鉴定信号转导通路和检测各种信号转导通路之间的相互作用，许多科学家开 发了适当的模型或模型系统，例如细胞培养模型和转基因动物模型。为了检测信号转 导级联反应所处的某些阶段，可采用相互作用的化合物来调节信号。可将本发明化合 物用作试剂来检测动物模型和/或细胞培养模型或本申请书中所提及临床疾病中的 OGA依赖性信号转导通路状况。
本说明书上述段落描述的用途可在体外或体内模型中进行。通过本说明书上下文 描述的技术监测所述抑制。体外用途较佳地用在患有神经退行性疾病、糖尿病、癌症 和应激的人样本。通过测试多种特异性化合物和/或其衍生物就能选择出最适合人患者 的活性成分。所选衍生物的体内剂量率宜与对糖苷酶的易感性和/或考虑到体外 (试验)数据而定的患者疾病的严重程度相匹配，从而显著提高效果。此外，本说 明书以下涉及通式(1)化合物及其衍生物在制备预防、或和/或控制疾病进程的药物 上的用途的教导是有效的和适用的，如果看起来合理，可不限于本发明化合物调节 OGA活性的用途。
本发明涉及含有至少一种本发明化合物和/或其药学上可用的衍生物、盐、溶剂化 物和立体异构体，包括它们的各种比例混合物，的药物。本发明意义的“药物”是药 物领域的任何药剂，包括一或多种通式(I)化合物或其制剂(例如药物组合物或药物制 剂)，可用于预防、、跟进或后调养患有与OGA活性相关的疾病的患者，所 述患者至少暂时地显示整体病况或患者机体个别部分的病理改变。
因此，本发明还涉及包含有效量的至少一种本发明的通式(I)化合物和/或其生理上 可接受的盐作为活性化合物，以及药学上可耐受的佐剂和/或赋形剂的药物组合物。
本发明意义的“佐剂”表示当同时、前后或依次给予时，能促进、增强或改善本 发明的活性成分的特异性反应的任何物质。已知的注射液佐剂例如有：铝组合物，如 氢氧化铝或磷酸铝；皂甙类，如QS21；胞壁酰二肽或胞壁酰三肽；蛋白质，如γ-干 扰素或TNF；MF59；角鲨烯或多元醇。
此外，活性成分可以单独给予或者与其他一起联用。在药物组合物中使用根 据本发明的一或多□化合物可取得增效作用，即通式(I)化合物与作为活性成分的至少 一种其他药剂联用，该其他药剂可以是通式(I)的另一种化合物或者具有不同结构骨架 的化合物。该些活性成分可以同时或依次使用。本发明的化合物适合于与本领域技术 人员所知的试剂联用(例如WO2008/025170)，它们可与本发明的化合物一起使用。
本发明同时还涉及组件(药盒)，其由分开包装的有效量的本发明化合物和/或其药 学上可接受的盐、衍生物、溶剂化物和立体异构体，包括它们的各种比例混合物，以 及有效量的其他活性成分所组成。该药盒包含合适的容器，例如，盒子、各种瓶子、 袋子或安瓿。例如，该药盒可包含分置的安瓿，每个安瓿装有溶解形式或冻干形式的 有效量本发明化合物和/或其药学上可接受的盐、衍生物、溶剂化物和立体异构体，包 括它们的各种比例混合物，和有效量的其他药物活性化合物。
药物制剂可适应于经所需的适当方法给药，例如通过口服(包括口腔或舌下)、直 肠、鼻腔、局部(包括口腔、舌下或透皮)、阴道或非肠道(包括皮下、肌肉注射、静脉 注射或皮内)方法。这种制剂可以用药学领域的专业人员已知的各种方法制备，例如， 将有效成分与赋形剂或佐剂混合。
本发明的药物组合物以合适剂量用已知的方法采用常规药物工程用的固体或液体 运载体、稀释剂和/或添加剂来制备。为了制备单位剂量，与活性成分混合的赋形剂的 量因所个体和给药方式而异。合适的赋形剂包括适合不同给药途径的有机或无机 物质，例如肠内(如口服)、肠胃外或局部给药，这些有机或无机物质不会与通式(I)化 合物或其盐反应。此种类型赋形剂的例子有：水、植物油、苯甲醇类、烷撑二醇、聚 乙二醇、甘油三乙酸盐、明胶、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉和凡士 林。
适合于口服给药的药物制剂可作为独立的单元给药，例如，胶囊或片剂；粉剂或 颗粒剂；在水和非水液体中的溶液或悬浮液；食用泡沫或泡沫食品；或水包油型液体 乳剂与油包水型液体乳剂。
适合于非肠道给药的药物制剂，包括水和非水无菌注射液，由抗氧化剂、缓冲液、 抑菌剂和溶质组成，通过这一手段使制剂与受者的血液呈现等渗；还包括水和非 水无菌悬浮液，其中可包括悬浮介质和增稠剂。该制剂可以装在单剂量或多剂量容器 中给药，例如密封安瓿和小瓶，并以冷冻干燥(冻干)状态储存，这样只需要在临用前 立即加入无菌载体液体，例如注射用水。注射液和悬浮液按照处方可以从无菌粉、颗 粒剂和片剂制备。
不用说，除上述特别提到的成分以外，这些制剂也可包括关于特定制剂类型的本 技术领域人员一般的其他物质，因此，例如，适合口服给药的制剂可以包含芳香剂。
在本发明的一优选实施例中，药物组合物适合于口服。制剂可以被消灭菌或可以 包含佐剂，如载体蛋白质(例如血清白蛋白)、润滑剂、防腐剂、稳定剂、填充剂、螯 合剂、抗氧化剂、溶剂、结合剂、悬浮剂、湿润剂、乳化剂、盐(影响渗透压的盐)、 缓冲物质、着剂、芳香剂以及一或多种其他活性物质(例如一或多种维生素)。添加 剂已为本领域所知，它们可用于各种不同的制剂中。
因此，本发明还涉及一种供口服的药物组合物，其包含有效量的作为活性成分的 至少一种本发明通式(I)化合物和/或其生理学上可接受的盐以及药学上耐受的佐剂，所 述药物组合物任选地与至少一种其他活物成分联用。两种药物活性成分尤其以有 效量提供。说明书上述有关给药途径和联用产品的教导是有效的和适用的，如果看起 来合理，可不限于两个特征的组合。
术语“有效量”或“有效剂量”或“剂量”在本说明书中可互换使用，指对疾病 或病理有预防或作用的药学化合物的量，即能引起组织、系统、动物或人发生研 究人员或医生所寻求或期望的生物或医学反应。“预防作用”是减低疾病发展甚至防 止疾病发作的可能性。“相关作用”指某程度上解除一种或一种以上疾病症状， 或部分或完全地将与疾病或病理相关的或导致疾病或病理改变的一种或一种以上或所 有的生理或生化参数逆转成正常状态。此外，用语“有效量”表示与未接受此量的 相应患者相比，该量产生如下结果：改善，治愈，预防或消除疾病、综合征、疾 病状况、患者主诉、病变或副作用或也减缓疾病、主诉或病变的进程。用语“有效 量”也涵盖了对增进正常生理功能有效的量。
本发明的药物组合物的给药剂量或剂量范围要足够高，以达到所期望的减轻上述 疾病的预防或作用。应当理解，任一具体人的特定剂量水平、频率和给药周期取 决于多种因素，包括，所选用具体化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮 食状态、给药时间和途径、排泄率、药物组合和需要的具体病情及其严重程度。 采用已知的方式和方法，本领域技术人员按常规实验可确定准确剂量。本说明书上文 的教导是有效的和适用的，如果合理的话，不限于包含通式(I)化合物的药物组合物。
药物制剂可以剂量单位的形式给药，剂量单位由每单位剂量的活性成分的预设量 组成。制剂中活性成分的预防浓度或浓度可以在0.1至100wt％之间变化。较佳 地，通式(I)化合物或其药学上可接受的盐的给药剂量可以是大约0.5至1000mg，优选 是1mg至700mg，尤其是优选5mg至100mg。通常，这样的剂量范围对于每日总给 药量是适合的。换言之，日剂量较佳地是大约0.02至100mg/kg体重。但是，每个病 人具体的剂量取决于本说明书上文已经描述的许多因素(例如所的病情、给药方式 和病人年龄、体重和身体状况)。优选的剂量单位制剂包括如上所述活性成分的每日剂 量或部分剂量，或相应的其中一部分。此外，这种类型的药物制剂可以用药学领域的 专业人员普遍熟知的方法加以制备。
虽然本发明化合物的有效量最终由主治医生或兽医考虑多种因素后确定(例 如，动物的年龄和体重、需要的准确病情及其严重程度、制剂的性质和给药方法)， 但本发明化合物用于神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病)的有效剂量一般在每 日0.1至100mg/kg受者(哺乳动物)体重的范围内，特别是通常在每日1到10mg/kg 体重的范围内。因此，体重70kg的成年哺乳动物每日的实际剂量通常在70至700mg 之间，这个剂量可以作为单一剂量每天服用，通常也可以分成部分剂量每天多次服用 (例如，二、三、四、五、六次)，使每日总剂量保持相同。盐类或溶剂化物或其生理 功能衍生物的有效剂量可确定为化合物本身有效剂量的部分。可以设想，类似的剂量 适用于上文提及的其它症状。
本发明的药物组合物可作为人医学和兽医学用药。根据本发明，通式(I)化合物和/ 或其生理学上可接受的盐适合用于预防性或或性和/或监测由OGA活性引 致、介导和/或蔓延的疾病。尤其优选的是，该疾病是神经退行性疾病、糖尿病、癌症 和应激，更佳是神经退行性疾病，最佳是tau病，高度优选是阿尔茨海默氏病。应当 理解，化合物的宿主包括在本发明的保护范围内。
更佳地，神经退行性疾病或失调选自以下组内：阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬 化症(ALS)、肌萎缩性侧索硬化症合并认知障碍(ALSci)、嗜银颗粒性痴呆、Bluit病、 皮质基底节变性(CBD)、拳击员痴呆、弥散性神经纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、家 族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、与17号染体连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征 (FTDP-17)、格-施-沙病、瓜德罗普岛帕金森病、哈-施病(1型脑内铁沉积性神经系统退 化症)、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼-皮病(C型)、苍白球脑桥黑质变性、关岛 型帕金森综合征痴呆复合征、皮克病(PiD)、脑炎后帕金森综合征(PEP)、朊病毒病(包 括克-雅病(CJD)、变异型克-雅病(vCJD)、致死性家族性失眠症和库鲁病)、进行性皮层 上神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、Richardson综合征、亚急性硬化全脑炎、 单纯缠结性痴呆、亨廷顿氏病和帕金森氏病。最优选的是阿尔茨海默氏病。
本发明还涉及通式(I)化合物和/或其生理学上可接受的盐在预防性或性 和/或监测由OGA活性引致、介导和/或蔓延的疾病的用途。本发明还涉及通式(I)化合 物和/或其生理学上可接受的盐在制备用于预防性或性和/或监测由OGA活性 引致、介导和/或蔓延的疾病的药物中的用途。通式(I)化合物和/或其生理学上可接受的 盐也可以用作制备其他药物活性成分的中间体。药物较佳地以非化学方式制备，例如 将活性成分与至少一种固体、液体和/或半液体载体或赋形剂组合，任选地在合适的剂 型中掺合一或多种其他活性物质。
本发明的另一个目的是本发明的通式(I)化合物和/或其生理学上可接受的盐，它们 用于预防性或性和/或监测由OGA活性引致、介导和/或蔓延的疾病。本发明 另一优选目的涉及本发明通式(I)所示的化合物和/或其生理学上可接受的盐用于预防 性或性和/或监测神经退行性疾病、糖尿病、癌症和应激。本说明书上文涉及 通式(1)化合物及其优选实施例的教导是有效的和适用的，不限于通式(1)化合物及其盐 用于预防性或性和/或监测神经退行性疾病、糖尿病、癌症和应激。
本发明通式(I)所示的化合物可在发病前或后给予一次或多次作为。本发明的 上述化合物和医学产品特别用于性。相关作用指某程度上解除一种或多 种疾病症状，或部分或完全地将与疾病或病理相关的或导致疾病或病理改变的一种或 多种生理或生化参数逆转成正常状态。假如化合物以不同的时间间隔给予，监测可被 认为是一种，以增强应答和完全根除疾病病原体和/或症状。可以施加同一种或不 同种化合物。也可以使用药物来减低发展疾病或者甚至预先防止与OGA活性相关的 病症出现，或者出现的或持续有的病症。本发明涉及的疾病较佳地是神经退行性 疾病、糖尿病、癌症和应激。
在本发明的意义中，如果受试者拥有上述生理或病理状况的前置条件，例如家族 性倾向、基因缺陷、或者曾经有过病史，给予预防性是可取的。
本发明的另一个目的是提供由OGA活性引致、介导和/或蔓延的疾病的方法， 其中向有需要此种的哺乳动物给予有效量的至少一种本发明的通式(I)化合物和/ 或其生理学上可接受的盐。本发明的另一个优选目的是提供神经退行性疾病、糖 尿病、癌症和应激的方法，尤其是tau病，其中向有需要此种的哺乳动物给予有 效量的至少一种本发明的通式(I)化合物和/或其生理学上可接受的盐。较佳的是口 服给药。有关本发明及其实施方式的教导是有效的和适用的，如果看起来合理，可不 限于本发明的方法。
在本发明的范围内，首次提供了通式(I)所示的化合物。本发明的低分子化合物是 强的选择性糖苷酶抑制剂，其被动性渗透率增大。通式(I)所示的化合物已被证明与 PUGNAC(一种能在底物袋(substratepocket)中结合的已知OGA抑制剂)竞争。内源性 底物是O-GlcNAc糖基化蛋白质。细胞核蛋白和细胞质蛋白的O-GlcNAc糖基化是哺 乳动物和植物的其中一种最常见翻译后修饰。O-GlcNAc的循环调节大量的细胞过程， 有证据显示O-GlcNAc糖基化的失调对多种疾病(包括阿尔茨海默氏病)的病因发挥一 定作用。O-GlcNAc转移酶(OGT)和O-GlcNAcase酶(OGA)是调节O-GlcNAc循环的两 种酶。现有的数据表明，阻断OGA的抑制剂有助于维持阿尔茨海默氏病患者的健康 O-GlcNAc水平，从而抑制神经原纤维缠结形成。因此，本发明包括使用通式(I)化合 物来调节、调控和/或抑制糖苷酶的信号传导级联反应，从而有利地为诊断和/或应 答OGA信号转导和抑制而引起的任何疾病提供研究工具。
可施加低分子量抑制剂或者将低分子量抑制剂与物理手段结合来诊断效果。 含有所述化合物的药物和药物组合物以及所述化合物用于糖苷酶介导的病症是有 前景的一种新方法，可应用在各种不同的中，能直接和实时改善人或动物的健康 状况。其效果对有效地阿尔茨海默氏病特别有利，不论是单独使用或与其它神经 退行性疾病的方案一起使用。
由于本发明的化合物对OGA具有令人惊讶的抑制活性并伴有被动渗透性，因此 有利的是它们的给药剂量比其它效力小的或选择性差的现有抑制剂低，而仍然能够达 到同样的或者甚至更好的所期望的生物作用。另外，这种剂量减低有利于产生较少的 或者甚至没有医学副作用。
通式(I)化合物及其盐、异构体、互变异构体、对映体形式、非对映体、外消旋体、 衍生物、前药和/或代谢物的特征是高特异性和稳定性、低制造成本和方便处理。这些 特征构成能重复再现作用的基础，其中包括没有交叉反应，并且可靠安全地与靶结构 相互作用。
本说明书引用的全部文献均纳入本发明的内容作为参考。
应当理解，本发明不限于本说明书所述的具体化合物、药物组合物、用途和方法， 因为这些都可以改变。此外应当理解的是，本说明书所用的术语唯一的目的是描述具 体实施方式而不意味着限制本发明的范围。本说明书包括所附权利要求书中所用的单 数词汇，例如，“一个”或“这个”包括其等价复数，只要上下文中没有另外专门地 指出。例如，本领域技术人员知道，提及“一个化合物”包括单个或多个化合物，进 而可以是相同或不同的；或提及“一种方法”，包括多个等价步骤和方法。除非另有 限定，本说明书中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人 员所通常理解的意义。
本发明要点的技术在本说明书中详细描述。没有详细描述的其他技术对应于已为 本领域技术人员公知的已知标准方法，或者在所引用的文献、专利申请或标准文献中 有详细描述。虽然在实践和测试本发明时可以采用此处描述的方法和材料，但下文仍 然给出了合适的实施例。以下实施例仅作为示例给出，没有任何限制作用。在实施例 中使用不含任何污染性(任何实践的场合)的标准试剂和缓冲液。构建实施例，它们不 限于明确示出的各种特征组合，但是如果解决了本发明的问题，验证的特征可以不受 限制地组合起来。同样地，任一权利要求的特征可与其它权利要求的一或多项中的特 征组合起来。
具体实施方式
缩写列表
核磁共振：在Bruker400MHz光谱仪上记录1HNMR，用氘代溶剂的残留信号作 为内标。相对于四甲基硅烷记录化学位移，以在每百万份(ppm)表示。1HNMR数据记 录如下：化学位移(多重性、耦合常数和氢的数目)。多重性表示如下：s(单峰)，d(双 峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽)。
一般分析性LC程序
LC/MS方法A：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA在 水中的溶液，流动相B是0.1％TFA在ACN中的溶液。流速是2.0mL/min。柱是XBridge C8(50x4.6mm，3.5μm)。使用MS检测器的正向模式。
LC/MS方法B：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是10mMNH4HCO3水溶液，流动相B是ACN。流速是0.8mL/min。柱是XBridgeC8(50x4.6mm，3.5μm)。 使用MS检测器的负向模式。
LC/MS方法C：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA水 溶液，流动相B是0.1％TFA在ACN中的溶液。流速是2.0mL/min。柱是XBridgeC8 (50x4.6mm，3.5μm)。使用MS检测器的正向模式。
LC/MS方法D：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是10mMNH4HCO3水溶液，流动相B是ACN。流速是1.0mL/min。柱是XBridgeC8(50x4.6mm，3.5μm)。 使用MS检测器的正向模式。
HPLC方法A：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA水溶 液，流动相B是0.1％TFA在ACN中的溶液。流速是2.0mL/min。柱是XBridgeC8(50 x4.6mm，3.5μm)。使用UV检测器。
HPLC方法B：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是10mMNH4HCO3水溶液，流动相B是ACN。流速是0.8mL/min。柱是XBridgeC8(50x4.6mm，3.5μm)。 使用UV检测器。
HPLC方法C：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA水溶 液，流动相B是0.1％TFA在ACN中的溶液。流速是2.0mL/min。柱是XBridgeC8(50 x4.6mm，3.5μm)。使用UV检测器。
HPLC方法D：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是10mMNH4HCO3水溶液，流动相B是ACN。流速是1.0mL/min。柱是XBridgeC8(50x4.6mm，3.5μm)。 使用UV检测器。
手性HPLC方法A：该方法遵循一般分析性LC程序，流动相A是0.1％DEA在 正己烷：IPA(60：40)中的水溶液。流速是1.0mL/min。柱是CHIRALPAKAD-H(250x 4.6mm，5μm)。使用UV检测器。
MD自动制备方法B：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA 在水的溶液、B-甲醇或ACN。柱是SymmetryC8(300x19mm，7μm)。使用PDA或 UV检测器。
一般制备型HPLC方法：采用SymmetryC8制备型柱(19x300mm，7μm)或Sunfire C8柱(19x250mm，5μm)进行制备型HPLC。流动相A是10mM醋酸铵水溶液或0.1％ TFA水溶液。流动相B是甲醇或乙腈。
对于极性化合物：
对于非极性化合物：
制备型HPLC方法C：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是0.1％TFA 水溶液，流动相B是B-甲醇或ACN。柱是SunfireC8(19x250mm，5μm)或SunfireC18 (30x250mm，10μm)。使用UV检测器。
制备型HPLC方法B：该方法遵循一般分析性LC程序，其中流动相A是10mM NH4HCO3水溶液，流动相B是B-甲醇或ACN。柱是SunfireC8(19x250mm，5μm) 或SunfireC18(30x250mm，10μm)。使用UV检测器。
实施例1：5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺(中间体)的制备
步骤1：0℃和氮气气氛下边搅拌边向2-((叔丁氧基羰基)氨基)噻唑-5-羧酸乙酯(5 g，0.0183mol)在干THF(80mL)中的溶液滴加入LiAlH4(15mL，0.0309mol，2.0M 在THF中的溶液)。反应混合物室温搅拌1小时。待反应完成后，反应混合物冷却至 -10℃至0℃之间。滴加入10％NaOH(5mL)淬灭反应。10分钟后，混合物经硅藻土 过滤，滤液在减压下浓缩，得到粗的(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(6g)，为 浅黄固体。该粗产物用在下一步反应中，无需纯化。LC/MS：(方法A)231.0(M+H)。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ6.78(s，1H)，4.38(s，2H)，1.38(s，9H)。
步骤2：0℃和氮气气氛下向(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(6g，0.026 mol)在DCM(60mL)中的溶液滴加入亚硫酰氯(6.3mL，0.103mol)。反应混合物在0℃ 搅拌2小时。反应混合物通过TLC监测。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩， 得到粗的(5-(氯甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(7g)，为褐液体。该粗产物用在下一 步反应中，无需纯化。
步骤3：向(5-(氯甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(7g，0.028mol)在DCM(70mL) 中的溶液加入4-苯基(4.5g，0.028mol)和三乙胺(12mL，0.0704mol)在DCM(50mL) 中的混合物。反应混合物室温搅拌30分钟。待反应完成后，反应混合物用DCM(200 mL)稀释，先用水再用盐水洗涤。有机相经硫酸钠干燥，减压下浓缩。粗产物在乙腈 中再结晶，然后真空干燥，获得(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯 ((3.8g)，为白固体。LC/MS：(方法A)374.3(M+H)。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ11.09(bs，1H)，7.28-7.21(m，4H)，7.18-7.14(m， 2H)，3.61(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.50-2.42(m，1H)，2.06-2.0(m，2H)，1.73-1.67 (m，4H)，1.45(s，9H)。
步骤4：向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(3.8g)在干二噁烷 (60mL)中的溶液加入HCl在二噁烷(200mL)中的溶液。反应混合物室温搅拌12小时。 待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，得到5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺 盐酸盐，为白固体。得率：(2.9g，92％)。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ9.46(bs，2H)，7.50-7.45(d，J＝19.2Hz，1H)， 7.34-7.30(t，J＝15Hz，2H)，7.23-7.20(m，3H)，4.39(s，2H)，3.55-3.45(m，2H)， 3.04-2.99(m，2H)，2.83-2.77(m，1H)，2.12-2.06(m，2H)，2.03-1.94(m，2H)。
实施例1-3：N-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)丙酰胺的制备
0℃下边搅拌边向5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺盐酸(100mg，1eq.)在二氯 甲烷(5mL)中的溶液加入丙酰氯(29mg，1eq.)和三乙胺(96mg，3eq.)。反应混合物室 温搅拌2小时。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入水，产物用二氯甲烷 萃取。分离出有机相，硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物经制备型HPLC纯化， 得到N-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)丙酰胺三氟乙酸盐，为乳白固体。得率： 35％(41mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：3.03min， 98.9％，(Max)，96.9％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.9(s，1H)，7.29-7.14(m，6H)，3.6(s，2H)， 3.1(t，J＝4.0Hz，1H)，2.9(d，J＝8.0Hz，2H)，2.43-2.37(m，2H)，2.06-2.01(m， 2H)，1.78-1.56(m，4H)，1.25-1.02(m，3H)。
实施例1-7：2-甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑的制备
步骤1：0℃和氮气气氛下边搅拌边向2-甲基噻唑-5-羧酸乙酯(1eq)在干THF(5mL) 中的溶液滴加入LiAlH4(1.1eq.，2.0M在THF中的溶液)。反应混合物室温搅拌1小 时。通过TLC监测反应进程。待反应完成后，反应混合物冷却至-10℃至0℃之间。 滴加入10％NaOH(5mL)淬灭反应。搅拌10分钟后，混合物经硅藻土过滤，滤液在减 压下浓缩，得到(2-甲基噻唑-5-基)甲醇(6g)，为浅黄固体。该粗产物用在下一步反 应中，无需纯化。LC/MS：(方法A)130.0(M+H)。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ7.4(s，1H)，5.5(s，1H)，4.6(d，J＝4.0Hz， 2H)，2.6(s，3H)。
步骤2：0℃和氮气气氛下向(2-甲基噻唑-5-基)甲醇(1eq)在DCM(10mL)中的溶 液滴加入亚硫酰氯(3eq)。反应混合物在0℃搅拌2小时。通过TLC监测反应进程。 待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，得到5-(氯甲基)-2-甲基噻唑，为褐液体。
步骤3：向5-(氯甲基)-2-甲基噻唑(400mg，1eq.)在DCM(5mL)中的溶液加入4- 苯基(480mg，1.1eq.)和DIPEA(1.2eq.)在DCM(2.5mL)中的混合物。反应混合物 室温搅拌1小时。待反应完成后，反应混合物先用二氯甲烷再依次用水和盐水洗涤。 有机相经硫酸钠干燥，减压下浓缩。残留物经制备型HPLC纯化，获得2-甲基-5-((4- 苯基--1-基)甲基)噻唑，为浅黄胶状固体。得率：16％(140mg)。LC/MS：(方法 A)273.0(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.71min，97.8％，(Max)，99.4％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.1(s，1H)，7.5(s，1H)，7.29-7.14(m，5H)， 3.7(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.5(s，3H)，2.09-2.04(m，2H)，1.73-1.70(m，2H)， 1.66-1.57(m，2H)。
实施例1-8：2-乙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑的制备
步骤1：向2-溴-噻唑-5-羧酸乙酯(1eq.)在1,4-二噁烷(5mL)中的溶液加入三丁基(乙 烯基)锡(1.1eq.)，再加入PdCl2(PPh3)2(10mol％)。反应混合物在100℃加热14小时。 待反应完成后，反应混合物经硅藻土过滤，滤液在减压下浓缩，残留物经快速谱法 纯化，得到2-乙烯基噻唑-5-羧酸乙酯，为浅黄胶状固体。得率：65％.LC/MS：(方 法A)184.3(M+H)。
步骤2：向2-乙烯基噻唑-5-羧酸乙酯(1eq.)在甲醇：乙酸乙酯(5mL1：1)中的溶 液加入10％Pd/C。反应混合物室温下进行加氢反应(14psi)1小时。待反应完成后，反 应混合物经硅藻土过滤，滤液在减压下浓缩。残留物经快速谱法纯化，得到2-乙基 噻唑-5-羧酸乙酯，为浅黄胶状固体。得率：60％。LC/MS：(方法A)186.0(M+H)。
步骤3：0℃和氮气气氛下边搅拌边向2-乙基噻唑-5-羧酸乙酯(1eq.)在干THF(5 mL)中的溶液滴加入LiAlH4(1.1eq.，2.0M在THF中的溶液)。反应混合物室温搅拌1 小时。通过TLC监测，待反应完成后，反应混合物冷却至-10℃至0℃之间。滴加入 10％NaOH(5mL)淬灭反应。10分钟后，混合物经硅藻土过滤，滤液在减压下浓缩， 得到(2-乙基噻唑-5-基)甲醇(6g)，为浅黄固体。0℃和氮气气氛下向该粗产物(1eq.) 在DCM(5mL)中的溶液滴加入亚硫酰氯(3eq)。反应混合物在0℃搅拌2小时。通过 TLC监测反应进程，待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，得到5-(氯甲基)-2-乙 基噻唑，为褐液体。向该粗产物用在下一步反应中，无需纯化。得率：40％.LC/MS： (方法A)148.0(M+H)。
步骤4：向5-(氯甲基)-2-乙基噻唑(300mg，1eq.)在DCM(5mL)中的溶液加入4- 苯基(328mg，1.1eq.)和DIPEA(526mg，2eq.)在DCM(5mL)中的混合物。反应 混合物室温搅拌1小时。待反应完成后，反应混合物用DCM稀释，然后依次用水和 盐水洗涤。有机相经硫酸钠干燥，减压下浓缩。残留物经制备型HPLC纯化，获得2- 乙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑，为浅黄胶状固体。得率：27％(145mg)。LC/MS： (方法A)287.0(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：3.02min，99.8％，(Max)，99.5％ (254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.5(s，1H)，7.29-7.14(m，5H)，3.7(s，1H)， 2.95-2.80(m，4H)，2.50-2.43(m，1H)，2.08-2.02(m，2H)，1.73-1.59(m，4H)，1.3(t， J＝8.0Hz，3H)。
实施例2：流程2(程序A)
步骤1：0℃下在10分钟内边搅拌边向2-甲酰基-5-氨基噻唑(1eq.)在干吡啶中的 溶液滴加入CH3COCl(1.2eq.)。待上述的加入完成后，反应物室温搅拌12小时。反应 完成后，减压下蒸发反应混合物，加入水，出现沉淀物，过滤和风干后，得到产物。
步骤2：室温下边搅拌边向N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(1eq.)在THF/甲醇(1： 1)中的溶液加入催化剂CH3COOH、取代胺(1.1eq.)、K-10蒙脱石和Na(OAc)3BH(1eq.)。 反应混合物被加热至90℃，保持12小时。待反应完成后，反应混合物经硅藻土床过 滤，滤液浓缩，得到粗产物，其经柱谱法纯化后，获得所希望的产物。
实施例2-15：N-[5-(4-甲基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-甲 基(172mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-甲基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺。经 制备型HPLC纯化后，获得N-[5-(4-甲基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的三氟乙 酸盐，为白固体。得率：20％(46mg)。LC/MS：(方法A)254.2(M+H)。HPLC：(方 法A)停留时间：1.72min，99.8％，(Max)，99.4％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.30(s，1H)，9.50(s，1H)，7.58(d，J＝5.8Hz， 1H)，4.58-4.47(m，2H)，3.48-3.35(m，2H)，2.90-2.82(m，2H)，2.15(s，3H)，1.81-1.78 (m，2H)，1.56-1.55(m，1H)，1.36-1.32(m，2H)，0.97-0.94(m，3H)。
实施例2-19：N-[5-(4-苯基-哌嗪-1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-苯 基哌嗪(234mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-苯基-哌嗪-1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺，为 白固体。得率：7％(10mg)。LC/MS：(方法A)317.3(M+H)。HPLC：(方法A)停 留时间：2.41min，98.5％，(Max)，97.4％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.96(s，1H)，7.27(s，1H)，7.20-7.16(m，2H)， 6.90(d，J＝8.0Hz，2H)，6.76-6.73(m，1H)，3.66(s，2H)，3.10(d，J＝8.0Hz，4H)， 2.50-2.48(m，4H)，2.10(s，3H)。
实施例2-20：N-{5-[(3-苯基-丙基氨基)-甲基]-噻唑-2-基}-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和3-苯 基-丙基-胺(234mg，1.76mmol)制备N-{5-[(3-苯基-丙基氨基)-甲基]-噻唑-2-基}-乙酰 胺。经制备型HPLC纯化后，获得N-{5-[(3-苯基-丙基氨基)-甲基]-噻唑-2-基}-乙酰胺 的三氟乙酸盐，为乳白固体。得率：13％(16mg)。LC/MS：(方法A)290.2(M+H)。 HPLC：(方法A)停留时间：2.41min，98.2％，(Max)，94.8％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.22(s，1H)，8.78(s，2H)，7.51(s，1H)，7.31-7.18 (m，5H)，4.35(s，2H)，2.89-2.86(m，2H)，2.65-2.61(m，2H)，2.15(s，3H)，1.90-1.86 (m，2H)。
实施例2-21：N-(5-{[甲基-(3-苯基-丙基)-氨基]-甲基}-噻唑-2-基)-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和甲基 -(3-苯基-丙基)-胺(261mg，1.76mmol)制备N-(5-{[甲基-(3-苯基-丙基)-氨基]-甲基}-噻 唑-2-基)-乙酰胺。经制备型HPLC纯化后，获得N-(5-{[甲基-(3-苯基-丙基)-氨基]-甲基}- 噻唑-2-基)-乙酰胺的三氟乙酸盐，为白固体。得率：13％(29mg)。LC/MS：(方法 A)304.3(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.62min，99.2％，(Max)，97.4％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.94(s，1H)，7.26-7.12(m，6H)，3.60-3.58(m， 2H)，2.58-2.48(m，2H)，2.32-2.28(m，2H)，2.13-2.10(m，6H)，1.73-1.70(m，2H)。
实施例2-22：N-[5-(3-苯基-氮杂环丁烷-1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和3-苯 基氮杂环丁烷(231mg，1.76mmol)制备N-[5-(3-苯基-氮杂环丁烷-1-基甲基)-噻唑-2-基]- 乙酰胺，为浅黄固体。得率：31％(48mg)。LC/MS：(方法A)288.0(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.26min，97.7％，(Max)，98.9％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.74(s，1H)，7.35-7.23(m，6H)，3.83-3.76(m， 5H)，3.26-3.23(m，2H)，2.32(s，3H)。
实施例2-23：N-[5-(4-氰基-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-苯 基--4-腈(323mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-氰基-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]- 乙酰胺，为乳白固体。得率：27％(48mg)。LC/MS：(方法A)341.2(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.66min，99.6％，(Max)，99.8％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.98(s，1H)，7.54-7.51(m，2H)，7.44-7.40(m， 2H)，7.37-7.30(m，2H)，3.73(s，2H)，2.98(d，J＝12.0Hz，2H)，2.36-2.30(m，2H)， 2.12-2.10(m，5H)，2.09-2.02(m，2H)。
实施例2-24：N-[5-(4-羟基-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-苯 基--4-醇(307mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-羟基-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]- 乙酰胺，为浅褐固体。得率：31％(16mg)。LC/MS：(方法A)332.2(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.11min，96.2％，(Max)，96.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.47(d，J＝7.4Hz，2H)，7.31-7.17 (m，3H)，4.77(s，1H)，3.66(s，2H)，2.66-2.62(m，2H)，2.49-2.40(m，2H)，2.10(s， 3H)，1.92-1.87(m，2H)，1.58-1.55(m，2H)。
实施例2-25：N-(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和 (370mg，1.76mmol)制备N-(5--1-基甲基-噻唑-2-基)-乙酰胺，为浅褐固体。得 率：14％(18mg)。LC/MS：(方法A)240.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.31 min，97.7％，(Max)，98.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.94(s，1H)，7.22(s，1H)，3.57-3.52(m，2H)， 2.32-2.31(m，4H)，2.11(s，3H)，1.90-1.36(m，6H)。
实施例2-26：N-[5-(4-异丙基-1-基甲基)噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-异 丙基(220mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-异丙基-1-基甲基)噻唑-2-基]-乙酰胺， 为乳白固体。得率：23％(33mg)。LC/MS：(方法A)282.2(M+H)。HPLC：(方法 A)停留时间：2.57min，98.8％，(Max)，96.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.22(s，1H)，3.56(s，2H)，2.85-2.83 (m，2H)，2.09(s，3H)，1.87-1.81(m，2H)，1.58-1.55(m，2H)，1.40-1.33(m，1H)， 1.24-1.23(m，2H)，0.96-0.85(m，7H)。
实施例2-27：N-(5-((4-环己基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-环 己基(290mg，1.76mmol)制备N-(5-((4-环己基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺。 经制备型HPLC纯化后，获得N-(5-((4-环己基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的三氟 乙酸盐，为乳白固体。得率：10％(19mg)。LC/MS：(方法A)322.3(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：3.34min，98.2％，(Max)，95.2％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.30(s，1H)，9.44(s，1H)，7.60-7.55(m，1H)， 4.47(d，J＝4.0Hz，2H)，3.40-3.37(m，2H)，2.88-2.50(m，2H)，2.15(s，3H)，1.84-1.81 (m，2H)，1.74-1.61(m，6H)，1.39-1.32(m，8H)，0.98-0.96(m，2H)。
实施例2-28：N-(5-((4-苄基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-苄 基(304mg，1.76mmol)制备N-(5-((4-苄基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为白 固体。得率：18％(31mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A)停 留时间：3.00min，98.9％，(Max)，98.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.92(s，1H)，7.26-7.12(m，6H)，3.55(s，2H)， 2.79-2.76(m，2H)，1.97(s，3H)，1.86-1.81(m，2H)，1.52-1.42(m，3H)，1.32-1.22(m， 2H)。
实施例2-29：N-(5-((3-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和3-苯 基(280mg，1.76mmol)制备N-(5-((3-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为褐 固体。得率：13％(22mg)。LC/MS：(方法A)316.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留 时间：2.68min，99.3％，(Max)，98.2％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.94(s，1H)，7.28-7.17(m，6H)，3.64(s，2H)， 2.85-2.83(m，2H)，2.74-2.71(m，1H)，2.09(s，3H)，2.00-1.95(m，2H)，1.77-1.68(m， 2H)，1.54-1.42(m，2H)。
实施例2-34：N-(5-((4-(二甲基氨基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和N,N- 二甲基-4-胺(222mg，1.76mmol)合成N-(5-((4-(二甲基氨基)-1-基)甲基)噻唑 -2-基)乙酰胺，为白胶状固体。得率：15％(20mg，WhiteGummySolid)。LC/MS： (方法A)283.3(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：3.20min，98.4％，(Max)，97.9％ (254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.96(s，1H)，7.24(s，1H)，3.61(s，2H)，2.89 (d，J＝8.0Hz，2H)，2.31(s，3H)，2.10-1.81(m，4H)，1.47-1.42(m，2H)，0.56-0.10 (m，6H)。
实施例2-41：N-[5-(4-氟-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-乙酰胺的制备
按照程序A的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(0.1g，0.58mmol)和4-氟 -4-苯基-(311mg，1.76mmol)制备N-[5-(4-氟-4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]- 乙酰胺，为白固体。得率：25％(10mg)。LC/MS：(方法A)334.0(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.80min，99.8％，(Max)，99.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.97(s，1H)，7.43-7.29(m，6H)，3.70(s，2H)， 2.79(d，J＝8.0Hz，2H)，2.35-2.30(m，2H)，2.10-2.09(m，5H)，1.87-1.86(m，2H)。
实施例3：流程3(程序B)
步骤1：边搅拌边向4-三氟甲磺酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(1eq.) 在干的脱气二噁烷中的溶液加入取代的硼酸(1.2eq.)、Cs2CO3(1.5eq)，最后加入 PdCl2(dppf)2(6mol％)。反应混合物加热至100℃，保持14小时。待反应完成后，反 应混合物经硅藻土床过滤，滤液在减压下蒸发，再通过柱谱法纯化，得到产物。
步骤2和3：
0℃下边搅拌边向4-取代的苯基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(1eq.)在二噁烷 中的溶液加入二噁烷/HCl(2mL)，室温搅拌4小时。待反应完成后，反应混合物浓缩， 得到产物，其用在下一步骤中，无需纯化。粗反应混合物(1eq.)溶解在THF：甲醇(1： 1)中，加入催化剂CH3COOH、粗的4-取代的苯基-1,2,3,6-四氢-吡啶(1.1eq.)、K-10蒙 脱石(1eq.)和Na(OAc)3BH(1.2eq.)，加热至90℃，保持12小时。待反应完成后，反 应混合物经硅藻土床过滤，滤液浓缩，得到粗产物。
步骤4：由程序B步骤3获得的粗产物溶解在甲醇(10mL)中，进行加氢反应4-12 小时，反应条件是10％Pd/C和H2(14psi)。待反应完成后，反应混合物经硅藻土床过 滤，滤液蒸发和浓缩，再经柱谱法和制备型HPLC纯化，获得产物。
实施例3a：4-(2-氟苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-氟苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰基 氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(704mg，1.1mmol)制备4-(2-氟苯基)-5,6-二氢吡 啶-1(2H)-羧酸叔丁酯，为褐胶状固体(3692mg，62％)。LC/MS：(方法A)278.2(M+H)。
实施例3b：4-(4-氟-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-氟苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰基 氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(704mg，1.1mmol)制备(4-(4-氟-苯基)-3,6-二氢 -2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为褐固体(405mg，68％)。LC/MS：(方法A)278.2(M+H)。
实施例3c：4-对甲苯基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-甲基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(1g，1.1mmol)制备4-对甲苯基-3,6-二氢-2H- 吡啶-1-羧酸叔丁酯，为胶状液体(312mg，52％)。LC/MS：(方法A)274.2(M+H)。
实施例3d：4-(间甲苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由3-甲基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(1g，1.1mmol)制备。4-间甲苯基-3,6-二氢-2H- 吡啶-1-羧酸叔丁酯，为胶状固体(606mg，74％)。LC/MS：(方法A)274.2(M+H)。
实施例3e：4-邻甲苯基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-甲基苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(800mg，1.1mmol)制备4-邻甲苯基-3,6-二氢 -2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为浅黄(363mg，60％)。LC/MS：(方法A)274.2(M+H)。
实施例3f：4-(4-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-甲氧基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺 酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(871mg，1.1mmol)制备(4-(4-甲氧基-苯 基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(410mg，54％)。LC/MS：(方法A)290.2 (M+H)。
实施例3g：4-(3-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由3-甲氧基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺 酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(871mg，1.1mmol)制备(4-(3-甲氧基-苯 基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为黄液体(319mg，42％)。LC/MS：(方法A)290.2 (M+H)。
实施例3h：4-(2-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-甲氧基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺 酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(871mg，1.1mmol)制备(4-(2-甲氧基-苯 基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为浅黄液体(547mg，72％)。LC/MS：(方法 A)290.2(M+H)。
实施例3i：4-(2-氰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-氰基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(990mg，1.1mmol)制备(4-(2-氰基-苯基)-3,6- 二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为白固体(448mg，58％)。LC/MS：(方法A)285.2(M+H)。
实施例3j：4-(4-氰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-氰基苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(990mg，1.1mmol)制备(4-(4-氰基-苯基)-3,6- 二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(770mg，62％)。LC/MS：(方法A)285.1(M+H)。
实施例3k：4-(2-乙氧基羰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-乙氧基羰基-苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟- 甲磺酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(682mg，1.1mmol)制备4-(2-乙氧基羰 基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为淡无液体(328mg，64％)。LC/MS：(方 法A)332.1(M+H)。
实施例3l：4-(4-乙氧基羰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-乙氧基羰基-苯基硼酸(400mg，1mmol)和4-三氟 -甲磺酰基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(682mg，1.1mmol)制备4-(4-乙氧基羰 基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(465mg，68％)。LC/MS：(方法 A)332.1(M+H)。
实施例3m：4-(2-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由2-羟基苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(798mg，1.1mmol)制备(4-(2-羟基-苯基)-3,6- 二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(420mg，72％)。LC/MS：(方法A)276.2(M+H)。
实施例3n：4-(4-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由4-羟基苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(800mg，1.1mmol)制备4-(4-羟基-苯基)-3,6- 二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(380mg，65％。LC/MS：(方法A)276.2(M+H)。
实施例3o：4-(3-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(中间体)的制备
按照程序B步骤1的方法，由3-羟基苯基硼酸(300mg，1mmol)和4-三氟甲磺酰 基氧基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯(790mg，1.1mmol)制备4-(3-羟基-苯基)-3,6- 二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯，为无液体(420mg，72％)。LC/MS：(方法A)276.2(M+H)。
实施例3-14：N-(5-((4-(对甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-对甲苯基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5-甲酰 基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(对甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为白 固体。得率：26％(34mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留 时间：3.20min，98.7％，(Max)，96.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.94(s，1H)，7.25(s，1H)，7.11-7.05(m，4H)， 3.63(s，2H)，2.92(d，J＝12.0Hz，2H)，2.49-2.48(m，1H)，2.23(s，3H)，2.05(s， 3H)，2.02-1.97(m，2H)，1.67-1.58(m，4H)。
实施例3-16：N-(5-((4-(4-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(4-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺制备N-(5-((4-(4-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺。通过制备型HPLC纯化后，获得标题化合物的三氟乙酸盐，为白固体。得率： 25％(67mg)。LC/MS：(方法A)346.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.83min， 97.1％，(Max)，95.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.32(s，1H)，9.51(s，1H)，7.65-7.60(m，1H)， 7.13-7.10(m，2H)，6.91-6.86(m，2H)，4.56(d，J＝4.0Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.53-3.52 (m，2H)，3.03-2.97(m，2H)，2.75-2.72(m，1H)，2.15(s，3H)，1.99-1.95(m，2H)， 1.78-1.72(m，2H)。
实施例3-30：N-(5-((4-(2-氟苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(2-氟苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯和N-(5-甲酰 基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(2-氟苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为浅 黄固体。得率：5％(3mg)。LC/MS：(方法A)334.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留 时间：2.80min，97.4％，(Max)，97.4％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.36-7.32(m，1H)，7.26-7.20(m， 2H)，7.15-7.09(m，2H)，3.64(s，2H)，2.96-2.88(m，2H)，2.77-2.72(m，1H)，2.09-1.98 (m，5H)，1.84-1.75(m，4H)。
实施例3-31：N-(5-((4-(间甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备的制备
按照程序B的方法，由4-(间甲苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯和N-(5-甲酰 基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(间甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为白 固体。得率：17％(32mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留 时间：3.07min，98.7％，(Max)，98.9％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.25(s，1H)，7.13(d，J＝8.0Hz， 1H)，7.04-6.98(m，3H)，3.63(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.49-2.48(m，1H)，2.2(s， 3H)，2.10(s，3H)，2.02-2.01(m，2H)，1.78-1.64(m，4H)。
实施例3-32：N-(5-((4-(3-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(3-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(3-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺，为白固体。得率：14％(29mg)。LC/MS：(方法A)346.2(M+H)。HPLC：(方 法A)停留时间：2.73min，98.9％，(Max)，98.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.25-7.15(m，2H)，6.81-6.71(m， 2H)，3.71(s，3H)，3.63(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.49-2.43(m，1H)，2.10(s，3H)， 2.05-1.97(m，2H)，1.72-1.65(m，4H)。
实施例3-33：N-(5-((4-(2-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(2-甲氧基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(2-甲氧基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺，为乳白固体。得率：30％(62mg)。LC/MS：(方法A)346.0(M+H)。HPLC：(方 法A)停留时间：2.89min，97.9％，(Max)，97.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18-7.12(m，2H)， 6.93-6.85(m，2H)，3.75(s，3H)，3.63(s，2H)，2.93-2.80(m，3H)，2.05(s，3H)，2.03-1.97 (m，2H)，1.67-1.54(m，4H)。
实施例3-35：N-(5-((4-(2-氰基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(2-氰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(2-氰基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺，为浅黄固体。得率：29％(54mg)。LC/MS：(方法A)341.2(M+H)。HPLC：(方 法A)停留时间：2.45min，93.8％，(Max)，95.3％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.97(s，1H)，7.76(d，J＝8.0Hz，1H)，7.67-7.63 (m，1H)，7.55(d，J＝8.0Hz，1H)，7.41(d，J＝4.0Hz，1H)，7.27-7.26(m，1H)，3.68 (s，2H)，2.99-2.97(m，2H)，2.81(s，1H)，2.10-2.08(m，5H)，1.74-1.72(m，4H)。
实施例3-36：N-(5-((4-(4-氰基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(4-氰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(4-氰基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺，为乳白固体。得率：2％(3mg)。LC/MS：(方法A)341.2(M+H)。HPLC：(方 法A)停留时间：2.59min，94.6％，(Max)，89.0％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.73(d，J＝8.0Hz，2H)，7.46 (d，J＝8.0Hz，2H)，7.26(s，1H)，3.65(s，2H)，2.95-2.88(m，2H)，2.58(s，1H)， 2.10-2.02(m，5H)，1.74-1.62(m，4H)。
实施例3-37：N-(5-((4-(2-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(2-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(2-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺。通过制备型HPLC纯化后，得到标题化合物的三氟乙酸盐，为乳白固体。得率： 7％(19mg)。LC/MS：(方法A)332.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.28min， 98.9％，(Max)，98.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.29(s，1H)，9.56-9.51(m，1H)，7.59(s，1H)， 7.05-7.01(m，2H)，6.82-6.74(m，2H)，4.54(m，2H)，3.49-3.47(m，2H)，3.09-3.00(m， 3H)，2.15(s，3H)，1.96-1.85(m，4H)。
实施例3-38：N-(5-((4-(4-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(4-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(4-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺，为白固体。得率：6％(5mg)。LC/MS：(方法A)332.2(M+H)。HPLC：(方法 A)停留时间：1.90min，96.5％，(Max)，97.9％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，9.14(s，1H)，7.24(s，1H)，7.01 (d，J＝8.2Hz，2H)，6.65(d，J＝8.2Hz，2H)，3.62(s，2H)，2.92-2.89(m，2H)，2.32-2.31 (m，1H)，2.10(s，3H)，2.03-1.98(m，2H)，1.68-1.53(m，4H)。
实施例3-39：N-(5-((4-(3-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(3-羟基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5- 甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(3-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰 胺。通过制备型HPLC纯化后，得到N-(5-((4-(3-羟基苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基) 乙酰胺的三氟乙酸盐，为白固体。得率：9％(24mg)。LC/MS：(方法A)332.2(M+H)。 HPLC：(方法A)停留时间：2.11min，98.9％，(Max)，98.8％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.32(s，1H)，9.55-9.37(m，1H)，7.60(s，1H)， 7.12-7.08(m，1H)，6.62-6.58(m，3H)，4.55(d，J＝4.2Hz，2H)，3.50-3.47(m，2H)， 3.03-2.97(m，2H)，2.72-2.66(m，1H)，2.16(s，3H)，1.98-1.82(m，2H)，1.79-1.74(m， 2H)。
实施例3-42：N-(5-((4-(4-氟苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-(4-氟-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5-甲酰 基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(4-氟苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为浅 褐固体。得率：35％(41mg)。LC/MS：(方法A)334.0(M+H)。HPLC：(方法A)停 留时间：2.98min，98.2％，(Max)，96.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.29-7.26(m，3H)，7.10-7.06(m， 2H)，3.64(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.49-2.48(m，1H)，2.10(s，3H)，2.05-2.00(m， 2H)，1.72-1.63(m，4H)。
实施例3-43：N-(5-((4-(邻甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序B的方法，由4-邻甲苯基-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和N-(5-甲酰 基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成N-(5-((4-(邻甲苯基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺。通过 制备型HPLC纯化后，得到标题化合物的三氟乙酸盐，为白固体。得率：40％(76mg)。 LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：3.01min，99.4％，(Max)， 98.8％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.96(s，1H)，8.18(s，1H)，7.26-7.03(m，5H)， 3.66(s，2H)，2.96-2.93(m，2H)，2.67-2.61(m，1H)，2.26(s，3H)，2.11-2.06(m，5H)， 1.65-1.62(m，4H)。
实施例3-44：2-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲酸的制备
按照程序B的方法，由N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺和4-(2-乙氧基羰基-苯 基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯合成2-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基) 苯甲酸乙酯。边搅拌边向2-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲酸乙酯(1eq.) 在THF/甲醇/H2O(1：1：1)(3mL)中的溶液加入LiOH.H2O(1eq.)。反应混合物室温 搅拌3小时。待反应完成后，用柠檬酸中和反应混合物，再用DCM萃取。有机层经 Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。粗产物经制备型HPLC纯化，得到2-(1-((2-乙酰氨基 噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲酸的盐酸盐，为浅褐固体。得率：10％(9mg)。LC/MS： (方法A)360.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.35min，99.0％，(Max)，98.6％ (254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.05(s，1H)，12.32(s，1H)，9.63(s，1H)， 7.76-7.70(m，1H)，7.60-7.53(m，1H)，7.35-7.31(m，3H)，4.56(s，2H)，3.60-3.49(m， 3H)，3.11-3.05(m，2H)，2.15(s，3H)，2.00-1.86(m，4H)。
实施例3-45：4-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲酸的制备
按照程序B的方法，由4-(4-乙氧基羰基-苯基)-3,6-二氢-2H-吡啶-1-羧酸叔丁酯和 N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺合成4-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲 酸乙酯。边搅拌边向4-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5-基)甲基)-4-基)苯甲酸乙酯(1eq./)在 THF/甲醇/H2O(1：1：1)(3mL)中的溶液加入LiOH.H2O(1eq.)，反应混合物室温搅拌 3小时。待反应完成后，用柠檬酸中和反应混合物，再用DCM萃取。有机层经Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。粗产物经制备型HPLC纯化，得到4-(1-((2-乙酰氨基噻唑-5- 基)甲基)-4-基)苯甲酸的盐酸盐，为褐固体。得率：26％(37mg)。LC/MS：(方 法A)360.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：1.96min，99.0％，(Max)，97.8％(254 nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.89(s，1H)，12.31(s，1H)，10.54(s，1H)， 7.90(d，J＝8.2Hz，2H)，7.65(s，1H)，7.34(d，J＝8.3Hz，2H)，4.53(s，1H)，3.49-3.47 (m，2H)，3.01-2.88(m，3H)，2.88(s，3H)，1.99-1.96(m，4H)。
实施例4-12：N-环丙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺的制备
步骤1：边搅拌边向用冰浴冷却的苯甲酰基异硫氰酸酯(1eq.，17.5mmol)在干氯 仿(20mL)中的溶液加入环丙胺(1eq.，17.5mmol)。反应混合物室温搅拌45分钟。待 反应完成后，反应混合物减压下浓缩。残留物粗的1-苯甲酰基-3-环丙基-硫脲用在下 一步反应中，无需纯化。边搅拌边向用冰浴冷却的1-苯甲酰基-3-环丙基-硫脲(1eq.， 17.2mmol)在甲醇(35mL)中的溶液加入NaOH(4N，1eq.)。反应混合物在60℃搅拌 1.5小时。待反应完成后，反应混合物减压下浓缩，加入冰水。过滤收集固体，获得 1-环丙基硫脲，为白固体，其可用在下一步骤中，无需纯化。得率：74％(1.16g)。
1HNMR：(400MHz，CD3OD)：δ2.47(bs，1H)，0.81-0.76(m，2H)，0.60-0.58(m， 2H)。
步骤2：边搅拌边向1-环丙基硫脲(1eq，9.2mmol)在乙醇(25mL)中的溶液加入 DMF-DMA(1.5eq，14.9mmol)。反应混合物加热至90℃，搅拌3小时。待反应完成 后，反应混合物减压下浓缩，获得的残留物在乙酸乙酯中研磨，得到1-环丙基-3-[1- 二甲基氨基-亚甲基]-硫脲，为白固体，其可用在下一步骤中，无需纯化。得率：78％ (1.61g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.6(s，1H)，3.21-3.16(m，1H)，3.1(s，3H)， 3.0(s，3H)，0.68-0.63(m，2H)，0.58-0.56(m，2H)。
步骤3：边搅拌边向1-环丙基-3-[1-二甲基氨基-亚甲基]-硫脲(1eq.)在CH3CN(15 mL)中的溶液加入氯代乙酸乙酯(1.1eq)。反应混合物在90℃搅拌14小时。待反应完 成后，反应混合物减压下浓缩。残留物在饱和NaHCO3水溶液中研磨。过滤收集固体， 得到2-环丙基氨基-噻唑-5-羧酸乙酯，为褐固体，其可用在下一步骤中，无需纯化。 得率：55％(0.85g)。LC/MS：(方法A)213.0(M+H)。
步骤4：0℃下边搅拌边向2-环丙基氨基-噻唑-5-羧酸乙酯(1g，1eq.)在乙醇(15mL) 中的溶液加入NaOH(2N，1.1eq.)。反应混合物室温搅拌14小时。待反应完成后，反 应混合物减压下浓缩，加入盐酸水溶液(1N)中和。过滤收集固体，得到2-(环丙基氨基) 噻唑-5-羧酸，为白固体，其可用在下一步骤中，无需纯化。得率：98％(0.85g)。LC/MS： (方法B)183.0(M-H)。
步骤5：0℃下边搅拌边向2-(环丙基氨基)噻唑-5-羧酸(800mg，1eq.)在DCM(15 mL)中的溶液加入三乙胺(870mg，1.1eq.)、4-苯基(760mg，1.1eq.)和T3P(2.76g， 2eq.)。反应混合物室温搅拌4小时。待反应完成后，反应混合物减压下浓缩。残留物 经快速谱法纯化，得到(2-(环丙基氨基)噻唑-5-基)(4-苯基-1-基)甲酮，为白固 体。得率：45％(0.64g)。LC/MS：(方法A)328.0(M-H)。
步骤6：0℃下边搅拌边向(2-(环丙基氨基)噻唑-5-基)(4-苯基-1-基)甲酮(100 mg，1eq.)在THF(15mL)中的溶液加入在THF(2M，0.75mL，2eq.)中的-甲硫 醚络合物。反应混合物在60℃搅拌4小时，用甲醇(5mL)处理，然后加热至60℃， 搅拌1小时。待反应完成后，反应混合物减压下浓缩。残留物经快速谱法纯化，得 到N-环丙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺，为乳白固体。得率：28％(34.4mg)。 LC/MS：(方法B)314.3(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.49min，98.1％，(Max)， 98.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.30-7.16(m，5H)，6.87-7.05(m，1H)，3.70-3.68 (m，2H)，3.11-3.09(m，4H)，2.30-2.25(m，2H)，1.84-1.80(m，2H)，1.68-1.64(m， 2H)，0.71-0.65(m，2H)，0.50-0.46(m，2H)。
实施例5a：N-甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺(中间体)的制备
按照实施例1步骤3的方法，0℃下边搅拌边向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2- 基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，1eq.)在THF(10mL)中的溶液加入LiAlH4(2.0M，在THF 中的溶液，0.8mL，1.5eq)。反应混合物加热至65℃，保持90分钟。待反应完成后， 反应混合物在减压下浓缩，加入水，产物用DCM萃取。分离出有机相，硫酸钠干燥， 过滤，减压浓缩。残留物经快速谱法纯化，得到甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑 -2-胺，为乳白固体。得率：80％(120mg)。LC/MS：(方法B)288.3(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.23min，99.9％，(Max)，99.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.31-7.21(m，4H)，7.18-7.14(m，1H)，6.8(s， 1H)，3.5(s，2H)，2.9(d，J＝8.0Hz，2H)，2.76-2.75(m，3H)，2.45-2.42(m，1H)， 2.02-1.96(m，2H)，1.73-1.70(m，2H)，1.64-1.57(m，2H)。
实施例5b：N-乙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑-2-胺(中间体)的制备
步骤1：向2-氨基噁唑-5-羧酸乙酯(200mg，1eq.)在干DMF(2mL)中的溶液加入 BOC-酸酐(418mg，1.2eq.)、DIPEA(0.6mL，3eq.)，最后加入DMAP(78mg，0.5eq.)。 反应混合物室温搅拌过夜。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入水。产物 用DCM萃取。有机相在减压下浓缩，残留物经快速谱法纯化，得到2-((叔丁氧基羰 基)氨基)噁唑-5-羧酸乙酯，为乳白固体。得率：79％(1.3g)。LC/MS：(方法A)257.0 (M+H)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：11.3(s，1H)，7.8(s，1H)，4.29-4.27(m，2H)， 1.5(s，9H)，1.3(t，J＝8.0Hz，3H)。
步骤2：向2-((叔丁氧基羰基)氨基)噁唑-5-羧酸乙酯(500mg，1eq)在THF/甲醇/H2O (3：1：1,15mL)中的溶液加入LiOH(165mg，2eq.)，反应混合物室温搅拌4小时。待 反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入水。加入HCl水溶液(1N)中和混合物。 过滤收集乳白固体，干燥，得到2-((叔丁氧基羰基)氨基)噁唑-5-羧酸，其直接用在 下一步骤中，无需纯化。得率：76％(880mg)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.2(s，1H)，7.7(s，1H)，1.5(s，9H)。
步骤3：0℃下向2-((叔丁氧基羰基)氨基)噁唑-5-羧酸(320mg，1eq.)在DCM(15mL) 中的溶液加入三乙胺(0.6mL，3eq.)和4-苯基(248mg，1.54mmol，1.1eq.)。冷却 至0℃，15分钟后，反应混合物用T3P(900mg，2eq.)处理。反应混合物室温搅拌14 小时。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入水。产物用DCM萃取。有机 相经硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残留物通过快速谱法纯化，得到(5-(4-苯基哌 啶-1-羰基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为乳白固体。得率：82％(430mg)。LC/MS： (方法B)372.0(M+H)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.0(s，1H)，7.5(s，1H)，7.31-7.18(m，5H)， 4.4(d，J＝12.0Hz，2H)，3.01-2.83(m，2H)，1.84-1.81(m，2H)，1.60-1.58(m，2H)， 1.4(s，9H)。
步骤4：0℃下向(5-(4-苯基-1-羰基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(400mg，1eq.) 在干THF(15mL)中的溶液加入LAH在THF(1M，1.6mL，1.5eq.)中的溶液。反应 混合物室温搅拌30分钟。待反应完成后，加入NaOH水溶液(1N)淬灭反应，用二氯甲 烷萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残留物通过快速谱法纯化，得 到(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为乳白固体。得率：40％ (150mg)。LC/MS：(方法B)358.0(M+H)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.4(s，1H)，7.28-7.16(m，5H)，6.9(s，1H)， 3.5(s，2H)，2.92-2.89(m，2H)，2.45-2.43(m，1H)，2.08-2.03(m，2H)，1.73-1.60(m， 4H)，1.6(s，9H)。
步骤5：0℃下向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(50mg，1eq) 在干DMF(5mL)中的溶液加入NaH(20mg，1.5eq)和碘乙烷(0.02mL，1.5eq)。反应 混合物室温搅拌2小时。待反应完成后，加入冰水淬灭反应。产物用DCM萃取。有 机相经硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残留物通过快速谱法纯化，得到(5-((4-苯 基-1-基)甲基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁基乙酯，为乳白固体。得率：56％(30mg)。 LC/MS：(方法B)386.2(M+H)。
步骤6：0℃下向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑-2-基)氨基甲酸叔丁基乙酯(30 mg，1eq.)在干1,4-二噁烷(1mL)中的溶液加入二噁烷/HCl(1mL)。反应混合物室温搅 拌12小时。待反应完成后，反应混合物减压下浓缩，得到N-乙基-5-((4-苯基-1- 基)甲基)噁唑-2-胺的盐酸盐，为乳白固体。得率：80％(18.3mg)。LC/MS：(方法 A)286.3(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：5.41min，99.6％，(Max)，99.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.9(s，1H)，8.6(s，1H)，7.35-7.30(m，2H)， 7.26-7.20(m，3H)，4.5(d，J＝8.0Hz，2H)，3.50-3.47(m，2H)，3.30-3.27(m，2H)， 3.08-3.01(m，2H)，2.81-2.75(m，1H)，2.01-2.05(m，4H)，1.2(t，J＝4.0Hz，3H)。
实施例5-1：N-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照实施例1的方法，0℃下向5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺盐酸盐(2.2g， 0.007mol)在DCM(30mL)中的溶液加入吡啶(2.86mL，0.0355mol)，再在5分钟内滴 加入乙酰氯(0.8mL，0.0113mol)。反应混合物室温搅拌1小时。通过TLC监测反应进 程。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入10％NaHCO3水溶液中和。产物 用乙酸乙酯(200mL)萃取。有机相依次用水和盐水洗涤，硫酸钠干燥，减压浓缩。残 留物经快速谱法(60-120目硅胶)纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，得到N-(5-((4-苯 基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(1.2g，53.8％)，为浅黄固体。TLC(石油醚/乙酸 乙酯，5：5，Rf＝0.2)。LC/MS：(方法A)316(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间： 2.7min，97％.
1HNMR(DMSO-d6，400MHz)δ11.94(bs，1H)，7.28-7.21(m，5H)，7.18-7.14(m， 1H)，3.64(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.49-2.42(m，4H)，2.10-1.97(m，2H)，1.73-1.70 (m，4H)。
实施例5-4：N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-丙烯酰胺的制备
按照实施例1的方法，0℃下向5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺盐酸盐(100 mg，1eq.)在二氯甲烷(5mL)中的溶液加入丙烯酰氯(29mg，1eq.)和三乙胺(96mg，3 eq.)。反应混合物-20℃搅拌1小时。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入 水，产物用DCM萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物经制备型HPLC 纯化，得到N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-丙烯酰胺的三氟乙酸盐(1.2g， 53.8％)，为乳白固体。得率：14％(16mg)。LC/MS：(方法A)328.2(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.96min，96.2％，(Max)，92.5％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.6(s，1H)，9.5(s，1H)，7.7(s，1H)，7.67-7.20 (m，5H)，6.57-6.50(m，1H)，6.44-6.39(m，1H)，5.9(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H)，4.6 (dd，J＝8.0Hz，2H)，3.5(dd，J＝12.0Hz，2H)，3.07-3.01(m，2H)，2.82-2.76(m， 1H)，2.01-2.15(m，2H)，1.85-1.92(m，2H)。
实施例5-5：N-乙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺的制备
步骤1：按照实施例1步骤3的方法，边搅拌边向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑 -2-基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，1eq.)在DMF(5mL)中的溶液加入NaH(80mg，1.5eq.)。 反应混合物用碘乙烷(0.08mL，1.5eq.)处理，加热至65℃，保持90分钟。待反应完成 后，反应混合物在减压下浓缩，加入水，产物用DCM萃取。分离出有机相，硫酸钠 干燥，过滤，减压浓缩。残留物经快速谱法纯化，得到(5-((4-苯基-1-基)甲基) 噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁基乙酯，为乳白固体。得率：45％(100mg)。LC/MS：(方 法A)402.2(M+H)。
步骤2：边搅拌边向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁基乙酯(50 mg)在干二噁烷(2mL)中的溶液加入HCl在二噁烷(5mL)中的溶液，反应混合物室温搅 拌12小时。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，得到N-乙基-5-((4-苯基-1- 基)甲基)噻唑-2-胺，为乳白固体。得率：22％(7.3mg)。LC/MS：(方法B)302.2(M+H)。 HPLC：(方法B)停留时间：5.89min，99.5％，(Max)，99.1％(254nm)。 1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.4(t，J＝12.0Hz，1H)，7.28-7.16(m，5H)，6.8(s， 1H)，3.5(s，2H)，3.32-3.14(m，2H)，2.9(t，J＝12.0Hz，2H)，2.46-2.45(m，1H)， 2.0(t，J＝4.0Hz，2H)，1.7(t，J＝12.0Hz，2H)，1.63-1.57(m，2H)，1.1(t，J＝12.0 Hz，3H)。
实施例5-6：5-((4-苯基-1-基)甲基)-N-丙基噻唑-2-胺的制备
按照制备N-乙基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺(实施例5-5)描述的方法，以 (5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯和1-碘丙烷为起始材料制备 5-((4-苯基-1-基)甲基)-N-丙基噻唑-2-胺。得率：14％(8mg，乳白固体)。LC/MS： (方法B)316.2(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.59min，99.6％，(Max)，99.2％ (254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.4(d，J＝4.0Hz，1H)，7.28-7.14(m，5H)， 6.8(s，1H)，3.5(s，2H)，3.13-3.08(m，2H)，2.9(t，J＝12.0Hz，2H)，2.45-2.42(m， 2H)，2.01-1.96(m，2H)，1.73-1.70(m，2H)，1.64-1.48(m，4H)，0.9(t，J＝12.0Hz， 3H)。
实施例5-9：N-甲基-N-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照实施例5a的方法，0℃下边搅拌边向N-甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑 -2-胺(50mg，1eq.)在吡啶(3mL)中的溶液加入乙酰氯(0.05mL，6eq.)和DMAP(催化 剂)。反应混合物室温搅拌12小时。待反应完成后，反应混合物在减压下浓缩，加入 水，产物用DCM萃取。有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残留物经制备型HPLC 纯化，得到N-甲基-N-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的三氟乙酸盐，为 乳白固体。得率：13％(10mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：(方法A) 停留时间：2.91min，98.9％，(Max)，95.0％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.32-7.21(m，4H)，7.17-7.14(m，1H)，3.7(s， 2H)，3.6(s，3H)，2.9(d，J＝12.0Hz，2H)，2.49-2.45(m，1H)，2.4(s，3H)，2.06-2.01 (m，2H)，1.73-1.60(m，4H)。
实施例5-10：1-甲基-3-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基)脲的制备
按照实施例1的方法，0℃下边搅拌边向5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺盐酸 盐(400mg，1eq.)在干THF(5mL)中的溶液加入三乙胺(261mg，2.0eq.)和光气(0.35 eq.)。反应混合物室温搅拌30分钟。反应混合物再次冷却至0℃，再用CH3NH2在THF 中的溶液(2M，1.2eq.)处理。反应混合物室温搅拌2小时。待反应完成后，反应混合 物在减压下浓缩。加入水，产物用DCM萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤，减压浓 缩。残留物经制备型HPLC纯化，得到1-甲基-3-(5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-基) 脲的三氟乙酸盐，为浅黄固体。得率：5％(16mg)。LC/MS：(方法A)331.0(M+H)。 HPLC：(方法A)停留时间：2.87min，95.2％，(Max)，95.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.2(s，1H)，7.28-7.22(m，4H)，7.18-7.14(m， 1H)，7.1(s，1H)，6.4(d，J＝4.0Hz，1H)，3.6(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.67-2.66 (m，3H)，2.46-2.43(m，1H)，2.05-2.02(m，2H)，1.73-1.57(m，4H)。
实施例5-13：N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噁唑2-基]-乙酰胺的制备
步骤1：按照实施例5b步骤4的方法，0℃下向(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑 2-基)氨基甲酸叔丁酯(80mg，1eq.)在干DCM(10mL)中的溶液加入DMAP(12mg， 0.5eq.)和乙酰氯(0.02mL，1.5eq.)。反应混合物室温搅拌12小时。待反应完成后， 加入冰水淬灭反应，用DCM萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残留 物通过快速谱法纯化，得到乙酰基(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑2-基)氨基甲酸叔 丁酯，为乳白固体。得率：40％(150mg)。得率：48％(80mg)。LC/MS：(方法 A)400.2(M+H)。
步骤2：0℃下向乙酰基(5-((4-苯基-1-基)甲基)噁唑2-基)氨基甲酸叔丁酯(1eq) 在干1,4-二噁烷(5mL)中的溶液加入二噁烷/HCl(1mL)。反应混合物室温搅拌2小时。 待反应完成后，反应混合物减压下浓缩。残留物通过制备型HPLC纯化，得到N-(5-((4- 苯基-1-基)甲基)噁唑2-基)乙酰胺的三氟乙酸盐，为乳白固体。得率：19％(12.2 mg)。LC/MS：(方法A)300.3(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.36min，97.5％， (Max)，98.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.1(s，1H)，7.28-7.14(m，5H)，6.9(s，1H)， 3.5(s，2H)，2.9(d，J＝8.0Hz，2H)，2.41-2.40(m，1H)，2.09-1.99(m，5H)，1.73-1.57 (m，4H)。
实施例6-17：1-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-propan-2-酮的制备
按照实施例1-7的方法，-78℃下边搅拌边向2-甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻 唑(200mg，0.73mmol)在干THF中的溶液滴加入正丁基锂(1.6M在己烷中的溶液，0.5 mL，0.807mmol)。反应混合物搅拌15分钟。然后加入乙酸乙酯，在-78℃搅拌3小时。 待反应完成后，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，反应混合物干燥，减压下蒸发。粗 产物经柱谱法纯化，得到浅黄固体。得率：35％(75mg)。LC/MS：(方法A)315.2 (M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.66min，93.7％，(Max)，90.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.54(s，1H)，7.28-7.14(m，5H)，4.21(s，2H)， 3.70(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.46-2.45(m，1H)，2.19(s，3H)，2.08-2.03(m，2H)， 1.73-1.65(m，4H)。
实施例6-18：1-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-丁-2-酮的制备
按照实施例1-7的方法，-78℃下边搅拌边向2-甲基-5-((4-苯基-1-基)甲基)噻 唑(150mg，0.5mmol)在干THF中的溶液滴加入正丁基锂(1.6M在己烷中的溶液，0.5 mL，0.807mmol)，反应混合物搅拌15分钟。然后加入丙酸甲酯(0.12mL，1.1mmol)， 在-78℃搅拌3小时。待反应完成后，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，混合物用DCM (10mL)萃取，干燥，减压下蒸发。粗产物经柱谱法纯化，得到浅黄固体。得率： 44％(57mg)。LC/MS：(方法A)329.0(M+H)。HPLC：(方法A)停留时间：2.96min， 98.7％，(Max)，97.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.54(s，1H)，7.28-7.16(m，5H)，4.19(s，2H)， 3.70(s，2H)，2.94-2.91(m，2H)，2.59-2.43(m，3H)，2.08-2.02(m，2H)，1.73-1.65(m， 4H)，1.84(t，J＝4.0Hz，3H)。
实施例7-2：[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-氨基甲酸甲酯的制备
按照实施例1-7的方法，再加上流程7的具体步骤，制备[5-(4-苯基--1-基甲基)- 噻唑-2-基]-氨基甲酸甲酯。
实施例7-11：N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]-甲磺酰胺的制备
-0℃下边搅拌边向5-((4-苯基-1-基)甲基)噻唑-2-胺盐酸盐(20mg，1eq.)在吡 啶(2mL)中的溶液加入甲磺酰氯(10mg，1.1eq.)和DMAP(催化剂)。待反应完成后， 反应混合物减压下浓缩，加入水。产物用DCM萃取。有机相经硫酸钠干燥，过滤， 减压下浓缩。残留物经快速谱法纯化，得到N-[5-(4-苯基--1-基甲基)-噻唑-2-基]- 甲磺酰胺，为乳白固体。得率：80％(19.4mg)。LC/MS：(方法A)352.2(M+H)。HPLC： (方法A)停留时间：2.55min，94.2％，(Max)，92.0％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.2(s，1H)，7.29-7.14(m，6H)，3.5(s，2H)， 2.96-2.87(m，5H)，2.09-2.04(m，2H)，1.75-1.62(m，4H)。
实施例8：N-(5-(1-(4-苯基-1-基)乙基)噻唑-2-基)乙酰(化合物编号40)的制备
步骤1：-78℃下边搅拌边向N-(5-甲酰基-噻唑-2-基)-乙酰胺(1g，0.58mmol)在干 THF(20mL)中的溶液加入MeMgBr(11.7mL，11.7mmol)。反应混合物室温搅拌5小 时。待反应完成后，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，混合物用DCM(10mL)萃取。 分离出有机层，经硫酸钠干燥，减压下蒸发，得到粗产物N-[5-(1-羟基-乙基)-噻唑-2- 基]-乙酰胺，其可用在下一步骤中，无需纯化。
1HNMR：(400MHz，DMSO-d6)：δ11.90(s，1H)，7.20(s，1H)，5.47(d，J＝6.2 Hz，1H)，4.92-4.86(m，1H)，2.10(s，3H)，1.40(d，J＝4.5Hz，3H)。
步骤2：边搅拌边向N-[5-(1-羟基-乙基)-噻唑-2-基]-乙酰胺(0.27g，1.34mmol)在 干THF(10mL)中的溶液加入PPh3(0.52g，1.20mmol)和DIAD(0.4mL，2.01mmol)。 反应混合物室温搅拌12小时。待反应完成后，加入水溶液淬灭反应，混合物用DCM 萃取。分离出有机层，经硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残留物经柱谱法纯化， 得到N-(5-(1-(4-苯基-1-基)乙基)噻唑-2-基)乙酰胺，为无胶质液体。得率：54％(22 mg)。LC/MS：(方法A)330.2(M+H)。HPLC：方法A)停留时间：2.83min，98.5％， (Max)，98.8％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.91(s，1H)，7.29-7.14(m，6H)，3.97-3.92(m， 1H)，2.96-2.81(m，2H)，2.50-2.49(m，1H)，2.20-2.10(m，5H)，1.76-1.60(m，4H)， 1.32-1.29(m，3H)。
实施例9：流程9(程序C)–5-(氯甲基)噻唑-2-基中间体的胺加成的一般程序
室温下边搅拌边向胺(0.5to1.2eq.)在干乙腈(5to10mL)中的溶液加入(5-(氯甲基) 噻唑-2-基)中间体(1to2eq.)和TEA或DIPEA(2至4eq.)。得到的溶液在80℃加热6 小时。反应混合物真空浓缩，残留物用DCM(20to50mL)稀释。DCM层用盐水溶液 (5至10mL)、水(5至10mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物经柱谱法 纯化，结晶或沉淀，获得纯产物。
实施例9a：N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(中间体)的制备
步骤1：0℃下边搅拌边向乙基-2-氨基噻唑-5-羧酸酯(10.0g，58.1mmol)、吡啶(9.47 mL，116.27mmol)和DMAP(200mg，1.6mmol)在DCM(100mL)中的溶液加入 (8.89g，87.20mmol)，回流小时。反应混合物减压下浓缩，加入HCl(1.5N水溶液， 50mL)。混合物搅拌10分钟。滤出得到的沉淀物，用水(250mL)和己烷(50mL)洗涤， 得到2-乙酰氨基噻唑-5-羧酸乙酯，为乳白固体。得率：98％(12.1g)。LC/MS：(方 法C)215.0(M+H)，停留时间：2.77min，97.11％(Max)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.10(s，1H)，4.24(q，J＝6.2,2H)，2.17(s，3H)， 1.26(t，J＝6.2Hz，3H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向2-乙酰氨基噻唑-5-羧酸乙酯(4.0g18.6mmol)在干甲苯 (110mL)中的溶液缓慢地加入三乙基硼氢化锂(36.0mL，37.3mmol，1M在THF中的 溶液)。反应混合物室温搅拌2小时。通过TLC监测反应完成。用甲醇(2.0mL)淬灭反 应混合物。加入水(20mL)，溶液搅拌10分钟。分离两层，用己烷(3x25mL)洗涤水层。 水层用乙酸(4mL)酸化。过滤回收得到的沉淀物，用水(10mL)和己烷(20mL)洗涤，生 成N-(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为白固体。得率：84％(2.7g)。LCMS：(方 法C)173.0(M+H)，停留时间：2.02min，99.89％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.86(s，1H)，7.23(br.s，1H)，5.32(s，1H)， 4.54(s，2H)，2.09(s，3H)。
步骤3：0℃下边搅拌边向N-(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(10.0g，58.1mmol) 在干DCM(27mL)中的溶液缓慢地加入亚硫酰氯(12.9mL，174.4mmol)，回流3小时。 反应混合物减压下浓缩。得到的残留物与DCM(2x50mL)和二乙醚(50mL)共蒸馏， 生成N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺，为浅黄固体。得率：92％(10.2g)。LCMS：(方 法C)187.0(M+H)，停留时间：1.77min，90.36％(Max)(在甲醇中制备分析样本，在 质谱仪中看到生成甲氧基加成物)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.18(s，1H)，7.50(s，1H)，5.02(s，2H)，2.14 (s，3H)。
实施例9-46：N-(5-((4-(4-氯苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(139mg，0.73mmol)、4-[(4- 氯苯基)盐酸盐(150mg，0.61mmol，HDHPharma)、DIPEA(315mg，2.44mmol) 和ACN(10mL)合成N-(5-((4-(4-氯苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺。粗产物经 制备型HPLC(方法C)纯化，生成预期的化合物，为乳白固体。得率：9％(20mg)。 LC/MS：(方法C)364.0(M+H)。HPLC：(方法C)停留时间：3.40min，95.9％(Max)， 97.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.31(d，J＝8.4Hz，2H)，7.19 (t，J＝8.4Hz，2H)，7.1(s，1H)，3.57(s，2H)，2.81-2.78(m，2H)，2.58-2.51(m，2H)， 2.11(s，3H)，1.88-1.83(m，2H)，1.51-1.45(m，3H)，1.24-1.15(m，2H)。
实施例9-48：N-(5-((4-(4-氟苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(300mg，1.57mmol)、4-[(4- 氟苯基)甲基(152mg，0.786mmol，ISDIInc.Chemicals)、TEA(636mg，6.29mmol) 和ACN(4.5mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化合物，为黄 固体。得率：15％(84mg)。LC/MS：(方法C)348.0(M+H)，HPLC：(方法C)停留 时间：3.07min，97.6％(Max)，95.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.21-7.16(m，3H)，7.01-7.05(m， 2H)，3.56(s，2H)，2.81-2.78(m，2H)，2.50-2.47(m，2H)，2.10(s，3H)，1.88-1.82(m， 2H)，1.52-1.44(m，3H)，1.19-1.15(m，2H)。
实施例9-55：N-(5-((4-(4-甲氧基苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(240mg，1.24mmol)、4-(4- 甲氧基苄基)盐酸盐(300mg，1.24mmol，GencoreBiopharma)、DIPEA(518mg， 3.73mmol)和ACN(10mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化 合物，为乳白固体。得率：5％(22mg)。LC/MS：(方法C)360.2(M+H)，HPLC：(方 法C)停留时间：2.93min，97.6％(Max)，96.5％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.92(s，1H)，7.21(s，1H)，7.05(d，J＝8.0Hz， 2H)，6.82(d，J＝8.0Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.56(s，2H)，2.81-2078(m，2H)，2.42 (d，J＝7.2Hz，2H)，2.11(s，3H)，1.88-1.82(m，2H)，1.52-1.40(m，3H)，1.15-1.13 (m，2H)。
实施例9b：4-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)哌嗪-2-酮(中间体)的制备
步骤1：0℃下边搅拌边向2-氨基噻唑-5-羧酸乙酯(10.0g，46.45mmol，Combiblock) 在48％HBr(75mL)中的溶液滴加入亚硝酸钠(4.80g，69.68mmol)在水(50mL)中的溶 液，反应混合物0℃下搅拌15分钟。然后0℃下滴加入溴化亚铜(6.66g，46.45mmol) 在48％HBr(75mL)中的溶液，得到的反应混合物室温搅拌4小时。反应混合物用DCM (200mL)稀释，水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，Na2SO4干燥，减压下浓缩。得到的粗 产物经快速谱法(100％CHCl3)纯化，生成2-溴噻唑-5-羧酸乙酯，为黄液体。得率： 50％(5.5g)。LCMS：(方法A)235.9(M+H)，停留时间：3.85min，98.6％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.16(s，1H)，4.38(q，J＝7.1Hz，2H)，1.39(t， J＝7.1Hz，3H)。
步骤2：室温下边搅拌边向2-溴噻唑-5-羧酸乙酯(0.75g，3.17mmol)在干DMF(6mL) 中的溶液加入2-噁哌嗪(0.318g，3.17mmol)和三乙胺(0.642g，6.3mmol)，反应混合 物在90℃搅拌过夜。反应混合物浓缩，得到的残留物溶解在5％甲醇-DCM中。有机 层用水、盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得到2-(3-噁哌嗪-1-基)噻唑-5-羧酸乙酯， 为乳白固体。得率：75％(0.61g)。LCMS：(方法A)256.0(M+H)，停留时间：2.38 min，99.4％(Max)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.26(s，1H)，7.88(s，1H)，4.24-4.17(m，2H)， 4.00(s，2H)，3.70-3.67(m，2H)，3.35-3.30(m，2H)，1.23(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤3：0℃下边搅拌边向2-(3-噁哌嗪-1-基)噻唑-5-羧酸乙酯(0.5g1.95mmol)在 干THF(10mL)中的溶液缓慢地加入三乙基硼氢化锂(3.9mL，3.91mmol，1M在THF 中的溶液)，反应混合物在室温搅拌2小时。通过TLC监测反应完成。反应混合物冷 却至0℃，用甲醇(10mL)淬灭，减压下浓缩。得到的粗产物经快速谱法纯化，得到 4-(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)哌嗪-2-酮，为乳白固体。得率：50％(210mg)。LCMS： (方法A)214.0(M+H)，停留时间：0.39min，92.9％(Max)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.13(s，1H)，7.00(s，1H)，5.26-5.22(m，1H)， 4.42(d，J＝5.6Hz，2H)，3.87(s，2H)，3.58-3.54(m，2H)。
步骤4：0℃下边搅拌边向4-(5-(羟基甲基)噻唑-2-基)哌嗪-2-酮(180g，0.84mmol) 在干DCM(1.8mL)中的溶液缓慢地加入亚硫酰氯(0.12mL，1.68mmol)，回流3小时。 反应混合物减压下浓缩。得到的残留物与DCM(2x50mL)共蒸馏，生成4-(5-(氯甲基) 噻唑-2-基)哌嗪-2-酮，为黄胶状体，可用在下一步骤中，无需纯化。得率：92％(0.18 g)。LCMS：(方法A)228.0(M+H，甲醇加成物)，停留时间：0.85min，84.7％(Max)。
实施例9-59：4-(5-((4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)噻 唑-2-基)哌嗪-2-酮的制备
按照程序C的方法，由4-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)哌嗪-2-酮(0.18g，1.17mmol)、 1-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪盐酸盐(0.139g，0.62mmol)、TEA(0.235 g，2.33mmol)和ACN(3.6mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题 化合物，为乳白固体。得率：24％(87.49mg)。LC/MS：(方法C)430.0(M+H)，HPLC： (方法C)RT1.86min，97.1％(Max)，98.2％(254nm)。
1HNMR(400MHz，CD3OD)：δ7.06(s，1H)，6.92(s，1H)，6.83(s，2H)，5.97(s， 2H)，4.06(s，2H)，3.71-3.68(m，5H)，3.48-3.46(m，3H)，2.85-2.52(m，7H)，1.50(s， 3H)。
实施例9-61：N-(5-((4-苯氧基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(500mg，2.9mmol)、4-苯 氧基(250mg，1.45mmol，GencoreBiopharma)、TEA(1.17g，11.62mmol)和ACN (8mL)合成标题化合物。粗产物经柱谱法纯化，获得标题化合物，为黄固体。得 率：5％(43mg)。LC/MS：(方法A)332.0(M+H)，HPLC：(方法A)停留时间：2.77min， 96.8％(Max)，95.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.27-7.23(m，3H)，6.93-6.87(m， 3H)，4.38-4.35(m，1H)，3.64(s，2H)，2.69-2.66(m，2H)，2.31-2.23(m，2H)，2.10 (s，3H)，1.93-1.90(m，2H)，1.63(m，2H)。
实施例9-62：N-(5-((4-苯乙基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(500mg，2.9mmol)、4- 苯乙基(270mg，1.45mmol，Fchemicals)、TEA(1.17g，11.62mmol)和ACN(8mL) 合成标题化合物。粗产物经滴定纯化，获得标题化合物，为褐固体。得率：12％(12 mg)。LC/MS：(方法C)344.2(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：3.45min，98.9％(Max)， 96.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.92(s，1H)，7.27-7.21(m，3H)，7.18-7.12(m， 3H)，3.57(s，2H)，2.80(d，J＝10.8Hz，2H)，2.56-2.51(m，2H)，2.10(s，3H)，1.89-1.84 (m，2H)，1.66(d，J＝9.6Hz，2H)，1.50-1.45(m，2H)，1.18-1.12(m，3H)。
实施例10b：4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：边搅拌边向5-(溴甲基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯(1g，4.65mmol)在甲苯 (10mL)中的溶液加入三苯基膦(1.2g，4.65mmol)。反应混合物回流2小时。通过TLC 监测反应完成。反应混合物真空浓缩，用三乙醚研磨。滤出得到的固体，用二乙醚洗 涤，干燥，用在下一步骤中，无需进一步纯化。分离出苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5- 基甲基)溴三苯基磷烷，为白固体。得率：82％(1.8g)。LCMS：(方法C)397.0(M-Br)， 停留时间：4.21min，97.2％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.94-7.90(m，3H)，7.79-7.74(m，6H)，7.70-7.64 (m，6H)，6.81-6.79(m，1H)，6.47-6.44(m，2H)，5.98(s，2H)，5.07-5.03(m，2H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)溴三苯基磷烷(1.0 g，4.65mmol)在THF(10mL)中的溶液加入叔丁醇钾(423mg，3.77mmol)。反应混合 物室温搅拌2小时。0℃下加入1-Boc-4-酮(375mg，1.88mmol)在THF(10mL) 中的溶液。反应混合物室温搅拌2小时。通过TLC监测反应完成。反应混合物真空浓 缩，粗混合物溶解在乙酸乙酯中，用水洗涤，硫酸钠干燥，蒸发。再用快速谱法纯 化，获得4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-1-羧酸叔丁酯，为浅褐固体。 得率：58％。LCMS：(方法C)262.0(M-t-Bu+H)，停留时间：5.58min，95.9％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.88(d，J＝7.9Hz，1H)，6.79(s，1H)，6.69(dd， J＝1.2，8.0Hz，1H)，6.28(s，1H)，6.00(s，2H)，3.39(t，J＝5.8Hz，2H)，3.33-3.31 (m，2H)，2.37(t，J＝5.6Hz，2H)，2.24(t，J＝5.5Hz，2H)，1.41(s，9H)。
步骤3：边搅拌边向4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-1-羧酸酯(350 mg，1.10mmol)在甲醇(10mL)中的溶液加入10％Pd/C(100mg)。反应混合物室温和 氢气压力下(2kg/cm3)搅拌2小时。再用硅藻土过滤，真空浓缩，粗混合物用在下一步 骤中，无需进一步纯化。分离出4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-1-羧酸叔 丁酯，为乳白固体。0℃下加入1-Boc-4-酮(375mg，1.88mmol)在THF(10mL) 中的溶液。得率：80％(280mg)。LCMS：(方法C)264.0(M-t-Bu+H)，停留时间：5.61 min，95.7％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.80-6.74(m，2H)，6.60-6.57(m，1H)，5.94(s， 2H)，3.90-3.86(m，2H)，2.71-2.49(m，2H)，2.41-2.38(m，3H)，1.52-1.48(m，2H)， 1.36(s，9H)，0.98-0.94(m，2H)。
步骤4：4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-1-羧酸叔丁酯(280mg，319.4 mmol)溶解在HCl在二噁烷中的溶液(1mL，4M)中。反应混合物室温搅拌1小时。待 反应完成后，减压浓缩，得到4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)的盐酸盐， 为白固体。得率：99％(220mg)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.82-6.76(m，2H)，6.63-6.58(m，1H)，5.97(s， 2H)，3.94-3.89(m，2H)，2.73-2.51(m，2H)，2.41-2.38(m，3H)，1.52-1.48(m，2H)， 0.98-0.94(m，2H)。
实施例10-47：N-(5-((4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-1-基)甲基)噻唑 -2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(149mg，0.78mmol)、4-(苯 并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)盐酸盐(220mg，0.78mmol)、DIPEA(302mg， 2.34mmol)和DMF(10mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化 合物，为浅褐固体。得率：7％(20mg)。LCMS：(方法C)374.0(M+H)。HPLC：(方 法C)停留时间：2.91min，95.9％(Max)，97.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.21(s，1H)，6.79(d，J＝8.0Hz， 1H)，6.74(s，1H)，6.59(d，J＝7.6Hz，1H)，5.95(s，2H)，3.56(s，2H)，2.81-2.78(m， 2H)，2.41-2.40(m，2H)，2.11(s，3H)，1.85-1.77(m，2H)，1.53-1.41(m，3H)，1.18-1.10 (m，2H)。
实施例10d：4-(4-(三氟甲基)苄基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下向1-(溴甲基)-4-(三氟甲基)苯(4.0g，16.7mmol)加入亚磷酸三乙酯 (3.7mL，22.0mmol)，混合物在150℃搅拌过夜。反应混合物冷却，真空蒸发。粗产 物用在下一步骤中，无需进一步纯化。分离得到三乙氧基(4-(三氟甲基)苄基)溴化磷， 为无液体。得率：91％(6.1g)。LCMS：(方法C)297.0(M+H)，停留时间：4.35min， 96.92％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.66(d，J＝12.0Hz，2H)，7.48(d，J＝8.0Hz， 2H)，3.97-3.94(m，6H)，2.49-2.48(m，2H)，1.23-1.21(m，9H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向三乙氧基(4-(三氟甲基)苄基)溴化磷(6.1g，15.0mmol)、 15-冠-5醚(0.27g，1.2mmol)在干THF(35mL)中的溶液加入NaH(60％，0.59g，14.4 mmol)，搅拌1小时。在同一温度下加入1-Boc-4-酮(2.5g，12.6mmol)在THF(25 mL)中的溶液，反应混合物室温搅拌过夜。反应混合物用冰水淬灭，乙酸乙酯(120mL) 萃取。有机层用10％NaHCO3(20mL)、水(20mL)和盐水(15mL)洗涤，再用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物经硅胶柱谱法纯化，获得4-(4-(三氟甲基)亚芐基)-1-羧酸 叔丁酯，为白固体。得率：84％(4.3g)。LCMS：(方法C)242.0(M+H)，停留时间： 6.24min，98.79％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.66(d，J＝8.0Hz，2H)，7.42(d，J＝8.0Hz， 2H)，6.43(s，1H)，3.43-3.39(m，2H)，3.35-3.31(m，2H)，2.40-2.36(m，2H)，2.31-2.28 (m，2H)，1.22(s，9H)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(4-(三氟甲基)亚芐基)-1-羧酸叔丁酯(3.8g， 11.1mmol)在甲醇(100mL)中的溶液加入Pd/C(0.380g，10％)。反应混合物在室温和 氢气压力(2kg/cm3)搅拌2小时。反应混合物经硅藻土过滤，浓缩，生成4-(4-(三氟甲 基)苄基)-1-羧酸叔丁酯，为白固体。得率：84％(3.2g)。LCMS：(方法C)244.0 (M+H)，停留时间：6.25min，99.66％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.61(d，J＝8.0Hz，2H)，7.38(d，J＝8.0Hz， 2H)，4.09-4.05(m，1H)，3.89-3.86(m，2H)，3.20-3.14(m，2H)，2.59-2.57(m，4H)， 1.51-1.47(m，2H)，1.36(s，9H)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(4-(三氟甲基)苄基)-1-羧酸叔丁酯(3.2g，9.3mmol) 在1,4-二噁烷(6mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(30mL，4M)，搅拌2小时。 反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚洗涤，直接用于合成实施例10-49化合物， 无需进一步纯化。分离得到4-(4-(三氟甲基)苄基)盐酸盐，为乳白固体。得率： 85％(2g)。LCMS：(方法C)244.0(M+H)，停留时间：3.41min，99.20％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.64(d，J＝8.0Hz，2H)，7.41(d，J＝8.0Hz， 2H)，3.36(m，2H)，2.77-2.73(m，3H)，2.61(d，J＝12.0Hz，2H)，1.84-1.81(m，1H)， 1.68-1.63(m，2H)，1.39-1.35(m，2H)。
实施例10-49：N-(5-((4-(4-(三氟甲基)苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制 备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(490mg，2.57mmol)、 4-(4-(三氟甲基)苄基)盐酸盐(600mg，2.15mmol)、DIPEA(867mg，6.89mmol) 和ACN(10mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化合物，为褐 固体。得率：1％(8mg)。LC/MS：(方法C)398.0(M+H)，HPLC：(方法C)停留时 间：3.71min，97.6％(Max)，96.9％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.62(d，J＝8.0Hz，2H)，7.39 (d，J＝8.0Hz，2H)，7.21(s，1H)，3.57(s，2H)，2.81-2.78(m，2H)，2.59(d，J＝6.4 Hz，2H)，2.11(s，3H)，1.88-1.83(m，2H)，1.52-1.49(m，3H)，1.23-1.18(m，2H)。
实施例10e：4-(3-氟苄基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下向1-(溴甲基)-3-氟苯(2.3g，11.6mmol)加入亚磷酸三乙酯(2.7mL， 15.3mmol)，混合物在150℃搅拌过夜。反应混合物冷却至室温，真空蒸发。粗产物 用在下一步骤中，无需进一步纯化。分离得到三乙氧基(3-氟苄基)溴化磷，为无液体。 得率：76％(3.2g)。LCMS：(方法C)247.0(M-Et-Br+H)，停留时间：3.67min，97.58％ (Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.35-7.34(m，1H)，7.10-7.09(m，3H)，3.96-3.95 (m，6H)，3.31-3.24(m，2H)，1.23-1.20(m，9H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向三乙氧基(3-氟苄基)溴化磷(3.2g，9.03mmol)和15-冠-5- 醚(0.16g，0.7mmol)在干THF(25mL)中的溶液加入NaH(60％，0.33g，8.1mmol)， 搅拌1小时。然后加入1-boc-4-酮(1.5g，7.71mmol)在THF(15mL)中的溶液， 反应混合物室温搅拌过夜。反应混合物用冰水淬灭，乙酸乙酯(100mL)萃取。有机层 用10％NaHCO3(20mL)、水和盐水洗涤。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物经硅 胶柱谱法纯化，获得4-(3-氟亚芐基)-1-羧酸叔丁酯，为无液体。得率：55％(1.5 g)。LCMS：(方法C)192.2(M-Boc+H)，停留时间：5.79min，98.67％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.38-7.36(m，1H)，7.07-7.02(m，3H)，6.3(s， 1H)，3.42-3.40(m，2H)，3.34(d，J＝8.0Hz，2H)，2.40-2.39(s，3H)，2.40-2.39(s， 3H)。2.40-2.37(s，2H)。2.30-2.27(s，2H)，1.41(s，9H)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(3-氟亚芐基)-1-羧酸叔丁酯(1.5g，11.1mmol) 在干甲醇(75mL)中的溶液加入Pd/C(0.150g，10％)。反应混合物在室温和氢气压力(2 kg/cm3)搅拌2小时。反应混合物经硅藻土过滤，浓缩，生成4-(3-氟苄基)-1-羧酸 叔丁酯，为无液体。得率：73％(1.1g)。LCMS：(方法C)194.2(M-Boc+H)，停留 时间：5.82min，98.76％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.33-7.25(m，1H)，7.01-6.96(m，3H)，3.90-3.58 (m，2H)，2.61-2.51(m，4H)，1.76-1.65(m，3H)，1.30(s，9H)0.90-0.81(m，2H)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(3-氟苄基)-1-羧酸叔丁酯(1.1g，3.7mmol)在二 噁烷(6mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(10mL，4M)，搅拌2小时。反应混合 物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，直接用于合成实施例10-50化合物，无 需进一步纯化。分离得到4-(3-氟苄基)盐酸盐，为乳白固体。得率：90％(0.9g)。 LCMS：(方法C)194.0(M+H)，停留时间：2.77min，90％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.35-7.28(m，1H)，7.04-6.98(m，3H)，3.21-3.16 (m，2H)，2.79-2.71(m，2H)，2.51(d，J＝9.4Hz，2H)，1.81-1.75(m，1H)，1.68-1.63 (m，2H)1.30-1.25(m，2H)。
实施例10-50：N-(5-((4-(3-氟苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(300mg，1.57mmol)、4-(3- 氟苄基)盐酸盐(350mg，1.53mmol)、DIPEA(740mg，4.6mmol)和ACN(10mL) 合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化合物，为褐固体。得率： 13％(67mg)。LC/MS：(方法C)348.2(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：3.09min， 98.5％(Max)，96.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.33-7.27(m，1H)，7.22(s，1H)， 7.01-6.97(m，3H)，3.57(s，2H)，2.81-2.78(m，2H)，2.51-2.50(m，2H)，2.11(s，3H)， 1.89-1.84(m，2H)，1.52-1.49(m，3H)，1.21-1.13(m，2H)。
实施例10f：4-苄基-2-甲基盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下边搅拌边向溴化苯甲基三苯基磷(8.1g，18.7mmol)在干THF(20mL) 中的溶液加入叔丁醇钾(2.0g，17.8mmol)。得到的混合物搅拌1小时。在同一温度下 加入2-甲基-4-氧代-1-羧酸叔丁酯(2.0g，9.3mmol)，反应混合物搅拌3小时。蒸 发溶剂。向粗产物加入水(20mL)，用DCM(80mL)萃取。有机层用Na2SO4干燥，浓 缩。粗产物经硅胶柱谱法(5％乙酸乙酯在己烷中的溶液)纯化，获得4-亚芐基-2-甲基 -1-羧酸叔丁酯，为无胶质液体。得率：59％(1.4g)。LCMS：(方法C)232 (M-t-Bu+H)，停留时间：6.05min，95.8％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.36-7.31(m，2H)，7.31-7.19(m，3H)，6.50-6.35 (m，1H)，4.36-4.32(m，1H)，3.95-3.82(m，1H)，2.93(d，J＝11.8Hz，1H)，2.73-2.69 (m，1H)，2.50-2.14(m，3H)，1.35(s，9H)，1.01(d，J＝8.0Hz，3H)。
步骤2：氮气气氛下边搅拌边向4-亚芐基-2-甲基-1-羧酸叔丁酯(1.4g，4.87 mmol)在干甲醇(10mL)中的溶液加入Pd/C(200mg，10％，Aldrich)。反应混合物在室 温和氢气压力(2kg/cm3)下搅拌2小时。反应混合物浓缩，真空干燥，生成4-苄基-2- 甲基-1-羧酸叔丁酯，为褐液体。得率：80％(1.2g)。LCMS：(方法C)234 (M-t-Bu+H)，停留时间：6.07min，96.68％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.26-7.24(m，2H)，7.27-7.23(d，3H)，3.68-3.51 (m，1H)，3.51-3.49(d，1H)，3.33-3.11(m，1H)，2.58-2.55(m，1H)，2.47-2.44(m， 1H)，1.76-1.55(m，4H)，1.35(s，9H)，1.12(s，3H)，0.98-1.01(m，1H)。
步骤3：室温下边搅拌边向4-苄基-2-甲基-1-羧酸叔丁酯(1.2g，4.15mmol)在 1,4-二噁烷(10mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(20mL，4M)，搅拌2小时。 反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，直接用于合成实施例10-51化 合物，无需进一步纯化。分离得到4-苄基-2-甲基盐酸盐，为浅蓝固体。得率： 98％(0.85g)。LCMS：(方法C)190.02(M+H)，停留时间：2.79min，95.04％(Max)。
实施例10-51：N-(5-((4-苄基-2-甲基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(300mg，1.57mmol)、 4-苄基-2-甲基盐酸盐(350mg，1.56mmol)、DIPEA(740mg，4.6mmol)和ACN(10 mL)合成标题化合物。粗产物经柱谱法纯化，获得标题化合物，为褐固体。得率： 7％(32mg)。LC/MS：(方法C)344.2(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：3.11min， 98.9％(Max)，97.2％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.28-7.22(m，3H)，7.18-7.13(m， 3H)，3.95(d，J＝14.8Hz，1H)，3.55(d，J＝14.0Hz，1H)，2.77-2.74(m，1H)，2.50-2.44 (m，2H)，2.11(br.s，5H)，1.97-1.91(m，1H)，1.49-1.39(m，3H)，1.08-1.06(m，4H)。
实施例10g：4-苄基-3-氟盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：边搅拌边向1-Boc4-酮(20.0g，0.10mol，spectrochem)在干DMF(50 mL)中的溶液加入三乙胺(33.5mL，0.24mol)，再加入三甲基氯硅烷(15.2g，0.12mol， chempure)，密封反应物，在80℃加热20小时。蒸发反应物，将反应物溶解在乙酸乙 酯中，用水洗涤，硫酸钠干燥，蒸发。粗产物用在下一步骤中，无需纯化。分离得到 4-((叔丁基甲硅烷基)氧基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯，为褐液体。得率：92％ (25.0g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.98-3.95(m，1H)，3.72(t，J＝8.16Hz，2H)， 2.96-2.89(m，1H)，1.51-1.47(m，2H)，1.47(s，9H)，0.16(s，9H)。
步骤2：边搅拌边向4-((叔丁基甲硅烷基)氧基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯 (25.0g，0.09mol)在干乙腈(200mL)中的溶液加入1-(氯甲基)-4-氟-1,4-二叠氮双环 [2.2.2]辛烷二(四氟硼酸盐)(选择氟)(35.8g，0.101mol)。反应物室温搅拌1小时。反应 物用乙酸乙酯稀释，水洗涤，硫酸钠干燥，蒸发。粗产物经硅胶快速谱法纯化，获 得3-氟-4-氧代-1-羧酸叔丁酯，为乳白固体。得率：73％(8.1g)。LCMS：(方法 C)118.2(M-Boc+H)，停留时间：2.53min，96.5％(ELSD)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.92-4.89(m，1H)，4.76-4.73(m，1H)，4.21-4.17 (m，1H)，3.30-3.20(m，2H)，2.60-2.45(m，2H)，1.47(s，9H)。
步骤3：室温下边搅拌边向溴化苯甲基三苯基磷(10.0g，18.3mmol)在干THF(20 mL)中的溶液加入叔丁醇钾(2.0g，9.21mmol)。在同一温度下加入3-氟-4-氧代-1- 羧酸叔丁酯(1.8g，18.3mmol)，反应混合物搅拌3小时。在同一温度下加入2-甲基-4- 氧代-1-羧酸叔丁酯(2.0g，9.3mmol)，反应混合物搅拌3小时。反应混合物浓缩。 向得到的粗产物加入水，用DCM(80mL)萃取。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产 物经硅胶柱谱法(5％乙酸乙酯在己烷中的溶液)纯化，获得4-亚芐基-3-氟-1-羧酸 叔丁酯，为黄固体。得率：57％(1.6g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.39-7.32(m，2H)，7.30-7.24(m，3H)，6.68(s， 1H)，5.36(d，J＝46Hz，1H)，4.43-4.07(m，2H)，3.11-2.60(m，4H)，1.50(s，9H)。
步骤4：氮气气氛下边搅拌边向4-亚芐基-3-氟-1-羧酸叔丁酯(1.6g，5.4mmol) 在干甲醇(10mL)中的溶液加入Pd/C(200mg，10％，Aldrich)。反应混合物在室温和氢 气压力(2kg/cm3)下搅拌2小时。反应混合物过滤，浓缩。得到的粗产物经快速柱谱 法纯化，生成两种异构体。总得率：33％。
洗脱出的第一异构体：14％(0.55g，无液体)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ 7.31-7.28(m，2H)，7.23-7.14(m，3H)，4.08(d，J＝13.2Hz，1H)，2.68-2.61(m，2H)， 2.55(d，J＝6.9Hz，2H)，1.68-1.57(m，3H)，1.46(s，9H)，1.27-1.15(m，2H)。
洗脱出的第二异构体：19％(0.29g，无液体)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6) 异构体2：δ7.32-7.29(m，2H)，7.23-7.13(m，3H)，4.45(d，J＝46.8Hz，1H)，2.90-2.80 (m，2H)，2.65-2.63(m，2H)，2.54-2.50(m，2H)，1.37(s，9H)，1.37-1.36(m，2H)。 洗脱出的第二异构体用在下一步骤中。
步骤5：室温下边搅拌边向4-苄基-3-氟-1-羧酸叔丁酯(洗脱出的第二异构体) (0.29g，1.5mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(10mL， 4M)，搅拌2小时。反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，并作为单一 异构体用于合成实施例10-52化合物。分离得到4-苄基-3-氟盐酸盐，为白固体。 得率：98％(0.18g)。LCMS：(方法C)194.2(M+H)，停留时间：2.5-2.6min，95.3％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.42(s，1H)，8.50(s，1H)，7.33-7.14(m，5H)， 4.77-4.61(s，1H)，3.54-3.28(m，4H)，3.17-2.99(m，5H)，2.56-2.42(m，2H)，1.57-1.15 (m，2H)。
实施例10-52：N-(5-((-4-苄基-3-氟-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(190mg，0.98mmol)、 作为单一异构体的4-苄基-3-氟盐酸盐(150mg，0.65mmol)、DIPEA(125mg，1.98 mmol)和ACN(10mL)合成标题化合物。粗产物经快速柱谱法再用MD自动制备型(方 法B)纯化，获得标题化合物，为褐固体，单一异构体。得率：2％(15mg)。LCMS： (方法C)348.0(M+H)HPLC：(方法C)停留时间：2.89min，99.4％(Max)，98.2％(254 nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.31-7.27(m，2H)，7.24(s，1H)， 7.20-7.19(m，3H)，4.46(d，J＝47.6Hz，1H)，3.63(s，2H)，3.06-3.03(m，1H)，2.81 (d，J＝10.8Hz，1H)，2.70-2.65(m，1H)，2.56-2.46(m，2H)，2.11(s，3H)，1.99-1.93 (m，1H)，1.56-1.23(m，3H)。
实施例10h：4-苄基-3-甲基盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下边搅拌边向溴化苯甲基三苯基磷在干THF(20mL)中的溶液加入叔 丁醇钾(2.0g，17.8mmol)，得到的混合物搅拌1小时。室温下加入3-甲基-4-氧代 -1-羧酸叔丁酯(2.0g，9.3mmol)，反应混合物搅拌3小时。在同一温度下加入2-甲基-4- 氧代-1-羧酸叔丁酯(2.0g，9.3mmol)，反应混合物搅拌3小时。反应混合物浓缩。 向得到的粗产物加入水(20mL)，用DCM(80mL)萃取。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。 粗产物经硅胶柱谱法纯化，获得4-亚芐基-3-甲基-1-羧酸叔丁酯，为浅黄固体。 得率：63％(1.7g)。LCMS：(方法C)232.0(M-t-Bu+H)，停留时间：6.03min，95.27％ (Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.34-7.29(m，2H)，7.21-7.17(m，3H)，6.32(s， 1H)，3.37-3.31(m，2H)，2.38-2.25(m，5H)，1.45(s，9H)，1.08(d，J＝9.2Hz，3H)。
步骤2：氮气气氛下边搅拌边向4-亚芐基-3-甲基-1-羧酸叔丁酯(1.7g，5.9mmol) 在干甲醇(10mL)中的溶液加入Pd/C(0.180g，10％，Aldrich)。反应混合物在室温和氢 气压力(2kg/cm3)下搅拌2小时。反应混合物过滤，浓缩。得到的粗产物直接用在下一 步骤中。分离得到4-苄基-3-甲基-1-羧酸叔丁酯，为褐固体。得率：82％(1.4g)。 LCMS：(方法C)234.0(M-t-Bu+H)，停留时间：6.01min，60.01％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.28-7.23(m，2H)，7.18-7.12(m，3H)，2.97-2.93 (m，2H)，2.48-2.47(m，2H)，1.88-1.83(m，2H)，1.40(s，3H)，1.34-1.32(m，4H)， 0.9(d，J＝9.2Hz，3H)。
步骤3：室温下边搅拌边向4-苄基-3-甲基-1-羧酸叔丁酯(1.4g，4.8mmol)在 1,4-二噁烷(8mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(20mL，4M)，搅拌2小时。反 应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，并作为单一异构体用于合成实施 例10-53化合物。分离得到4-苄基-3-甲基盐酸盐，为乳白固体。得率：98％(0.85 g)。LCMS：(方法C)234.0(M+H)，停留时间：2.85min，63.36％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.30-7.27(m，2H)，7.25-7.14(m，3H)，3.02-2.82 (m，4H)，2.56-2.54(m，2H)，1.89-1.88(m，2H)，1.60-1.40(m，3H)，0.9(d，J＝9.2Hz， 3H)。
实施例10-53：N-(5-((4-苄基-3-甲基-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(400mg，2.1mmol)、 4-苄基-3-甲基盐酸盐(300mg，1.3mmol)、DIPEA(740mg，4.6mmol)和ACN(20 mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化合物，为白固体。得 率：5％(21mg)。LC/MS：(方法D)344.0(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：3.27min， 98.7％(Max)，98.6％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.92(s，1H)，7.28-7.24(m，2H)，7.21(s，1H)， 7.18-7.16(m，3H)，3.58(d，J＝13.6Hz，1H)，3.48(d，J＝14.4Hz，1H)，2.76-2.73(m， 1H)，2.46-2.43(m，3H)，2.11(s，3H)，2.04-2.02(m，1H)，1.94-1.90(m，1H)，1.68(br s，2H)，1.42-1.37(m，1H)，1.31-1.28(m，1H)，0.95-0.94(d，J＝4.0Hz，3H)。
实施例10i：4-(4-甲基苄基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下向4-(溴甲基)苯甲腈(2.0g，10.2mmol)加入亚磷酸三乙酯(2.3mL， 13.4mmol)，150℃回流过夜。反应混合物冷却，真空蒸发。粗产物用在下一步骤中， 无需纯化。得率：84％(3.1g，无液体)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.77(d，J＝10.68Hz，2H)，7.46(d，J＝10.68Hz， 2H)，3.99-3.88(m，6H)，3.40(s，2H)，1.24-1.02(m，9H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向(4-氰基苄基)三乙氧基溴化磷(3.1g，8.56mmol)、15- 冠-5醚(0.15g，0.68mmol)在干THF(25mL)中的溶液加入NaH(60％，0.31g，7.7mmol)， 搅拌1小时。室温下加入1-boc-4-酮(1.43g，7.1mmol)在THF(15mL)中的溶液， 反应混合物室温搅拌过夜。反应混合物用冰水淬灭，乙酸乙酯(80mL)萃取。有机层用 10％NaHCO3(10mL)、水(10mL)和盐水(10mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。 粗产物经硅胶柱谱法纯化，获得4-(4-氰基亚芐基)-1-羧酸叔丁酯，为白固体。 得率：56％(4.3g，白固体)。LCMS：(方法C)199.2(M-Boc+H)，停留时间：5.39min， 98.42％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.77(d，J＝8.0Hz，2H)，7.39(d，J＝12.0Hz， 2H)，6.42(s，1H)，3.38-3.35(m，4H)，2.34-2.32(m，4H)，1.40(s，9H)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(4-氰基亚芐基)-1-羧酸叔丁酯(1.4g，4.69 mmol)在甲醇/THF(100mL)中的溶液加入Pd/C(0.15g，10％)。反应混合物在室温和氢 气压力(2kg/cm3)搅拌1小时。反应混合物经硅藻土过滤，浓缩，生成4-(4-甲基苄基) -1-羧酸叔丁酯，为乳白固体。得率：78％(1.1g)。LCMS：(方法C)190.2 (M-Boc+H)，停留时间：6.11min，75.33％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.35-7.30(m，1H)，7.04-7.03(m，3H)，3.86(d， J＝12.0Hz，2H)，2.59(m，2H)，2.49-2.48(m，3H)，2.23(s，3H)，1.59-1.56(m，3H)， 1.367(s，9H)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(4-甲基苄基)-1-羧酸叔丁酯(1.1g，3.6mmol)在 1,4-二噁烷(6mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(10mL，4M)，搅拌2小时。反 应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(10mL)洗涤，得到4-(4-甲基苄基)，为乳 白固体。它直接用于合成实施例10-54化合物。得率：88％(0.75g)。LCMS：(方法 C)190.2(M+H)，停留时间：3.00min，86.43％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.56(s，1H)，7.06-7.04(m，4H)，3.20-3.16(m， 3H)，2.76-2.72(m，3H)，2.24(s，3H)，1.72-1.63(m，4H)，1.35-1.32(m，2H)。
实施例10-54：N-(5-((4-(4-甲基苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(290mg，1.53mmol)、 4-(4-甲基苄基)盐酸盐(300mg，1.27mmol)、DIPEA(518mg，3.82mmol)和ACN(10 mL)合成标题化合物。粗产物经快速谱法纯化，获得标题化合物，为白固体。得 率：3％(14mg)。LC/MS：(方法C)344.2(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：3.33min， 97.1％(Max)，95.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.92(s，1H)，7.21(s，1H)，7.06(d，J＝7.6Hz， 2H)，7.02(d，J＝7.6Hz，2H)，3.56(s，2H)，2.80-2.78(m，2H)，2.44(d，J＝6.4Hz， 2H)，2.25(s，3H)，2.11(s，3H)，1.87-1.82(m，2H)，1.52-1.42(m，3H)，1.19-1.11(m， 2H)。
实施例10k：4-(萘-2-基甲基)盐酸盐(中间体)
步骤1：室温下边搅拌边向2-溴甲基萘(2.5g，11.3mol，Spectrochem)在干甲苯(25 mL)中的溶液加入三苯基膦(2.66g，10.1mmol，Spectrochem)，回流16小时。反应混 合物冷却至室温，真空蒸发。分离出粗产物，为白固体。它可用在下一步骤中，无 需纯化。得率：70％(5g)。LCMS：(方法C)403.2(M-Br)，停留时间：4.66min，99.07％ (Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.91-7.89(m，4H)，7.88-7.75(m，13H)，7.73-7.68 (m，4H)，7.07-7.05(m，1H)，5.37-5.34(m，2H)。
步骤2：室温下边搅拌边向萘基三苯基溴化磷(4.8g，10.0mmol)在干THF(10mL) 中的溶液加入叔丁醇钾(1.0g，10.0mmol)，得到的混合物搅拌1小时。加入1-boc哌 啶-4-酮(1.0g，5.02mmol，GLRscientific)，反应混合物搅拌3小时。反应混合物浓缩。 加入水(20mL)，用DCM(50mL)萃取。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物经硅胶 柱谱法(3％乙酸乙酯在己烷中的溶液)纯化，获得4-(萘-2-基亚甲基)-1-羧酸叔丁 酯，为白固体。得率：56％(0.91g)。LCMS：(方法C)268(M-t-Bu+H)，停留时间： 6.18min，95.39％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.84(t，J＝7.8Hz，3H)，7.72(s，1H)，7.50-7.39 (m，2H)，7.38-7.35(m，1H)，6.51(m，1H)，3.45-3.31(m，4H)，2.34-2.25(m，4H)， 1.40(s，9H)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(萘-2-基亚甲基)-1-羧酸叔丁酯(0.91g，2.8 mmol)在干甲醇(10mL)中的溶液加入Pd/C(0.09g，10％，Aldrich)。反应混合物在室温 和氢气压力(2kg/cm3)下搅拌2小时。反应混合物浓缩，真空干燥。分离得到的粗产物 为白固体。它可直接用在下一步骤中，无需纯化。得率：55％(0.55g)。LCMS：(方 法C)270.0(M-t-Bu+H)，停留时间：6.22min，95.4％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.87-7.82(m，2H)，7.67(s，1H)，7.50-7.43(m， 2H)，7.43-7.37(m，1H)，3.91(s，2H)，2.67-2.51-1.57(m，3H)，1.58-1.55(m，2H)， 1.38(s，9H)，1.11-1.03(m，2H)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(萘-2-基甲基)-1-羧酸叔丁酯(0.55g，1.6mmol) 在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(20mL，4M)，反应混合物 搅拌2小时。反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，分离得到白固 体。粗的4-(萘-2-基甲基)盐酸盐用于合成实施例10-56化合物，无需进一步纯化。 得率：90％(0.5g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.74(s，1H)，8.48(s，1H)，7.83(d，J＝9.0Hz， 3H)，7.45(s，1H)，7.35(d，J＝11.2Hz，1H)，7.02-6.82(m，1H)，3.22-3.18(m，3H)， 2.83-2.67(m，4H)，1.86(s，1H)，1.73-1.68(m，2H)，1.42-1.25(m，2H)。
实施例10-56：N-(5-((4-(萘-2-基甲基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(180mg，0.95mmol)、 4-(萘-2-基甲基)盐酸盐(250mg，0.95mmol)、DIPEA(365mg，2.8mmol)和DMF(10 mL)合成标题化合物。粗产物经MD自动制备(方法B)纯化，获得标题化合物，为褐 固体。得率：5％(12mg)。LC/MS：(方法C)380.2(M+H)，HPLC：(方法C)停留时 间：3.64min，97.9％(Max)，98.5％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.90(s，1H)，7.86-7.81(m，3H)，7.65(s，1H)， 7.48-7.41(m，2H)，7.34(dd，J＝2.8，8.4Hz，1H)，7.21(s，1H)，3.57(s，2H)，2.82-2.79 (m，2H)，2.67-2.66(m，2H)，2.11(s，3H)，1.90-1.84(m，2H)，1.57-1.55(m，3H)， 1.28-1.22(m，2H)。
实施例10i：6-(-4-基甲基)喹喔啉盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：78℃和氮气气氛下边搅拌边向甲基三苯基溴化磷(14.3g，40.02mmol)在 干THF(40mL)中的溶液滴加入正丁基锂(12.0mL，30.15mmol)，混合物在同一温度 下搅拌1小时。然后加入1-boc-4-酮(4.0g，20.1mmol)在THF(20mL)中的溶液， 反应混合物搅拌1小时。反应混合物冷却至0℃，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭反应。 产物用乙酸乙酯(100mL)萃取。有机层用盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。 得到的粗产物经硅胶柱谱法纯化，获得4-亚甲基-1-羧酸叔丁酯，为无液体。 得率：67％(2.6g)。LCMS：(方法C)98.2(M-Boc+H)，停留时间：4.83min，93.41％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.73(s，2H)，3.30(t，J＝12.0Hz，4H)，2.08(t， J＝12.0Hz，4H)，1.38(s，9H)。
步骤2：向4-亚甲基-1-羧酸叔丁酯(0.6g，3.04mmol)在干THF(10mL)中的 脱气样本加入9-BBN(6.1mL，3.04mmol)。得到的混合物回流1小时。冷却至室温后， 室温下加入6-溴喹喔啉(0.55g，2.78mmol)、Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(0.15g，0.18mmol)、 DMF(10mL)、水(1mL)和K2CO3(0.6g，4.5mmol)。得到的混合物在60℃加热3小时。 反应混合物冷却至室温，用水(20mL)稀释。用10％NaOH水溶液调pH至11，混合物 用乙酸乙酯萃取。有机层经无水Na2SO4干燥，浓缩，获得粗产物，为无液体。4-(喹 喔啉-6-基甲基)-1-羧酸叔丁酯可用在下一步骤中，无需纯化。得率：24％(0.23g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.89-8.86(m，2H)，8.04-8.01(m，3H)，2.73-2.67 (m，2H)，2.25(m，9H)，1.13(s，9H)。
步骤3：室温下边搅拌边向4-(喹喔啉-6-基甲基)-1-羧酸叔丁酯(0.3g，0.7mmol) 在1,4-二噁烷(5mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(10mL，4M)，得到的反应混 合物搅拌2小时。反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，得到6-( -4-基甲基)喹喔啉盐酸盐，为灰固体。它用于合成实施例10-63化合物，无需进一步 纯化。得率：77％(0.2g)。LCMS：(方法C)228.2(M+H)，停留时间：1min，96.98％ (Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.90(d，J＝12.0Hz，2H)，8.02-7.90(m，3H)， 3.24-3.20(m，2H)，2.82-2.80(m，4H)，2.25(m，4H)。
实施例10-63：N-(5-((4-(喹喔啉-6-基甲基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由6-(-4-基甲基)喹喔啉盐酸盐(0.1g，0.38mmol， 10mL)、DIPEA(0.3mL，1.14mmol)、在干乙腈中的N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(0.11 g，0.57mmol)合成标题化合物。粗产物经快速柱谱法纯化，获得标题化合物，为褐 固体。得率：16.8％(75mg)。LCMS：(方法C)382.2(M+H)。HPLC：(方法C)停 留时间：2.21min，99.69％(Max)，99.01％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.98(s，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，2H)，7， 88(s，1H)，7.72(d，J＝8.0Hz，1H)，7.23(s，1H)，3.58(br.s，2H)，2.79(d，J＝5.6 Hz，3H)，2.12(s，3H)，2.09(s，1H)，1.99-1.88(m，2H)，1.58(m，3H)，1.26-1.23(m， 2H)。
实施例10m：4-(3,5-二氟苄基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下向3,5-二氟芐基溴(3g，14.4mmol)加入亚磷酸三乙酯(3.4mL，19.1 mmol)，在150℃回流过夜。反应混合物冷却，真空蒸发。分离出来的粗产物为无 液体，可用在下一步骤中，无需纯化。得率：95％(5.2g)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.14-7.07(m，1H)，7.00-6.98(m，2H)，4.03-3.90 (m，6H)，3.34-3.14(m，2H)，1.26-1.22(m，9H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向(3,5-二氟苄基)三乙氧基溴化磷(5.2g，13.9mmol)、15- 冠-5醚(0.24mL，1.1mmol)在干THF(35mL)中的溶液加入NaH(60％，0.5g，12.5 mmol)，搅拌1小时。室温下加入1-boc-4-酮(2.3g，11.7mmol)在THF(25mL) 中的溶液，反应混合物室温搅拌过夜。反应混合物用冰水淬灭，乙酸乙酯(100mL)萃 取。有机层用10％NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物经 硅胶柱谱法纯化，获得4-(3,5-二氟亚芐基)-1-羧酸叔丁酯，为无液体。得率： 57％(2g)。LCMS：(方法C)254.0(M-t-Bu+H)，停留时间：5.65min，99.6％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.11-7.06(m，1H)，6.94(d，J＝6.8Hz，1H)， 6.35(s，1H)，3.42-3.32(m，4H)，2.40(t，J＝3.4Hz，2H)，2.39(t，J＝5.6Hz，2H)， 1.41(s，9H)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(3,5-二氟亚芐基)-1-羧酸叔丁酯(2g，6.4 mmol)在干甲醇(100mL)中的溶液加入Pd/C(0.20g，10％)。反应混合物在室温和氢气 压力(2kg/cm3)搅拌2小时。反应混合物经硅藻土过滤，浓缩，直接用在下一步骤中。 得率：95％(0.9g，白固体)。LCMS：(方法C)256.0(M-t-Bu+H)，停留时间：5.60min， 99.73％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.04-6.98(m，1H)，6.94-6.91(m，2H)，3.89(d， J＝10.6Hz，2H)。2.65(t，J＝1.8Hz，2H)。2.50(d，J＝5.3Hz，2H)，1.72-1.65(m， 1H)，1.51-1.47(m，2H)，1.36(s，9H)，1.05-0.95(m，2H)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(3,5-二氟苄基)-1-羧酸叔丁酯(1.9g，6.1mmol) 在1,4-二噁烷(6mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(20mL，4M)，搅拌2小时。 反应混合物浓缩。得到的粗产物用二乙醚(5mL)洗涤，得到4-(3,5-二氟苄基)盐酸 盐，为乳白固体。它直接用于合成实施例10-64化合物，无需进一步纯化。得率： 93％(1.4g)。LCMS：(方法C)212.0(M+H)，停留时间：2.84min，99.69％(Max)。
实施例10-64：N-(5-((4-(3,5-二氟苄基)-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(0.35g，1.82mmol)、 4-(3,5-二氟苄基)盐酸盐(0.3g，1.21mmol)、在干ACN(20mL)中的DIPEA(0.7mL， 3.6mmol)合成标题化合物。粗产物经快速柱谱法纯化，获得标题化合物，为褐固 体。得率：16.8％(75mg)。LCMS：(方法C)366.0(M+H)。HPLC：(方法C)RT3.27 min，98.9％(Max)，96.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.93(s，1H)，7.21(s，1H)，7.03-6.98(m，1H)， 6.91(d，J＝6.4Hz，2H)，3.57(s，2H)，2.81-2.78(m，2H)，2.53(s，2H)，2.11(s，3H)， 1.89-1.84(m，2H)，1.51-1.48(m，3H)，1.23-1.13(m，2H)。
实施例10n：4-(萘-1-基甲基)盐酸盐(中间体)的制备
步骤1：室温下边搅拌边向1-溴甲基萘(1.97g，8.9mol，Combiblocks)在干甲苯(25 mL)中的溶液加入三苯基膦(2.1g，8.02mmol，Spectrochem)，回流16小时。反应混合 物冷却至室温，真空蒸发。得到的粗产物用二乙醚洗涤，直接用在下一步骤中，无需 纯化。得率：87％(3.5g，白固体)。LCMS：(方法A)403.2(M-Br)，停留时间：4.43 min，97.5％(Max)。
步骤2：室温下边搅拌边向(萘-1-基甲基)三苯基溴化磷(3.5g，7.24mmol)在干THF (10mL)中的溶液加入叔丁醇钾(2.0g，17.8mmol)，搅拌1小时。然后在同一温度下加 入1-boc--4-酮(0.722g，3.62mmol，GLRscientific)，反应混合物搅拌3小时。加 入水(20mL)淬灭反应，用DCM(50mL)萃取。有机层用Na2SO4干燥，浓缩。粗产物 经硅胶柱谱法(3％乙酸乙酯在己烷中的溶液)纯化，获得4-(萘-1-基亚甲基)-1-羧 酸叔丁酯，为乳白固体。得率：34％(0.4g)。LCMS：(方法A)268.1(M-t-Bu+H)， 停留时间：5.85min，45.9％(Max)。
步骤3：氮气气氛下边搅拌边向4-(萘-1-基亚甲基)-1-羧酸叔丁酯(0.4g，1.23 mmol)在干甲醇(20mL)中的溶液加入Pd/C(0.04g，10％，Aldrich)。反应混合物在室温 和氢气压力(2kg/cm3)搅拌2小时。反应混合物经硅藻土过滤，真空浓缩。得到的粗产 物直接用在下一步骤中，无需进一步纯化。得率：87％(0.35g，无液体)。LCMS： (方法A)270.0(M-t-Bu+H)，停留时间：5.78min，58.0％(Max)。
步骤4：室温下边搅拌边向4-(萘-1-基甲基)-1-羧酸叔丁酯(0.35g，1.07mmol) 在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(10mL，4M)，搅拌2小时。 反应混合物真空浓缩。粗产物与二乙醚(5mL)共蒸馏，它直接用于下一步骤中。得率： 89％(0.25g，白固体)。LCMS：(方法A)226.2(M+H)，停留时间：3.22min，88.8％ (Max)。
实施例10-65：N-(2-((4-(萘-1-基甲基)-1-基)甲基)噻唑-5-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(79mg，0.42mmol)、 4-(萘-1-基甲基)盐酸盐(110mg，0.42mmol)、DIPEA(0.163mg，1.26mmol)和ACN (5mL)合成标题化合物。粗产物经MD-自动制备方法B纯化，获得乳白固体。得率： 2.1％(5.7mg)。LCMS：(方法A)380.0(M+H)，停留时间：3.62min，98.8％(Max)， 98.3(220nm)。HPLC：(方法A)停留时间：3.58min，99.22％(Max)，99.18％(220nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6：δ12.6(s，1H)，7.92-7.86(m，2H)，7.74(d，J＝3.6 Hz，2H)，7.53-7.49(m，2H)，7.40(t，J＝7.2Hz，1H)，4.33(s，2H)，3.51-3.46(m， 2H)，3.10-3.03(m，1H)，2.70-2.56(m，2H)，2.34-2.32(m，2H)，2.19-2.16(m，2H)， 1.89-1.85(m，2H)，1.59-1.50(m，2H)，1.26-1.20(m，2H)。
实施例11a：1-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪盐酸盐(中间体)的制 备
步骤1：0℃下边搅拌边向3,4-亚甲基二氧化苯乙铜(10.0g，60.91mmol，Alfaaesar) 在干甲醇(200mL)中的溶液缓慢地加入NaBH4(2.7g，71.3mmol，Lobachemie)。反 应混合物室温搅拌1小时。然后让反应混合物真空浓缩，用DCM稀释。DCM层用水、 盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。减压除去溶剂，得到的粗醇直接用在下一步骤中。
得率：99％(10.0g，无液体)。LCMS：(方法D)149.0(M-H2O+H)，停留时间： 2.513min，98.6％(Max)，97.7％(254nm)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ6.89(s，1H)，6.89-6.75(m，2H)，5.95(s，2H)， 4.81(t，J＝8.0Hz，1H)，1.46(d，J＝8.0Hz，3H)。
步骤2：0℃下边搅拌边向1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙-1-醇(10.0，60.2 mmol)在干DCM(27mL)中的溶液缓慢地加入亚硫酰氯(23.4g，180.72mmol)，回流3 小时。反应混合物减压下浓缩。得到的残留物与DCM共蒸馏，生成5-(1-氯乙基)苯并 [d][1,3]二氧杂环戊烯，为褐液体。得率：72％(6.3g)。LCMS：(方法D)149.0 (M-HCl+H)，停留时间：3.705min，80.15％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.06(d，J＝4.0Hz，1H)，6.93(d，J＝8.0Hz.1H)， 6.86(d，J＝8.0Hz，1H)，6.01(s，2H)，2.49(q，J＝8.9Hz，1H)，1.74(d，J＝8.9Hz， 3H)。
步骤3：室温下边搅拌边向1-Boc-哌嗪(6.5g，34.0mmol)在干ACN(100mL)中的 溶液加入5-(1-氯乙基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯(6.39，34.7mmol)和DIPEA(13.45g， 104.0mmol)，在80℃加热过夜。反应混合物真空浓缩，得到的残留物用乙酸乙酯稀 释。有机层用水、盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物经硅胶柱谱法纯 化，获得4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯，为无胶质 液体。得率：20％(2.0g)。LCMS：(方法C)335.2(M+H)，停留时间：3.10min，93.15％ (Max)，96.06％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.85-6.82(m，2H)，6.74-6.71(m，1H)，5.98(d， J＝1.6Hz，2H，)，3.37-3.36(m，1H)，3.27(m，4H)，2.28-2.21(m，4H)，1.37(s，9H)， 1.25(d，J＝6.8Hz，3H)。
步骤4：边搅拌边向4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (2.0g，5.9mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液加入HCl在二噁烷中的溶液(20mL，4 M)，室温搅拌2小时。反应混合物真空浓缩，粗产物通过在二乙醚中重结晶而纯化， 得到1-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪盐酸盐，为乳白固体。
得率：82％(1.2g)。LCMS：(方法D)235.0(M+H)，停留时间：4.2min，98.56％ (Max)，97.3％(220nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.09(m，1H)，9.43(m，1H)，9.20(m，1H)， 7.30(s，1H)，7.07-7.02(m，2H)，6.08(s，2H)，4.55(m，1H)，3.82(m，1H)，3.50-3.39 (m，3H)，3.17-2.96(m，2H)，1.68(s，3H)，.
实施例11-58：N-(5-((4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪-1-基)甲基) 噻唑-2-基)乙酰胺的制备
按照一般程序C的方法，由N-(5-(氯甲基)噻唑-2-基)乙酰胺(0.28g，1.48mmol)、 1-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪盐酸盐(0.4g，1.48mmol)、DIPEA(0.57 g，4.44mmol)和ACN(5mL)合成标题化合物。粗产物经快速柱谱法纯化，获得标 题化合物，为褐固体。得率：2％(3.71mg)。LC/MS：(方法C)389.0(M+H)，HPLC： (方法C)停留时间：2.09min，92.6％(Max)，91.1％(254nm)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.94(s，1H)，6.83-6.81(m，3H)，6.71(d，J＝ 8.4Hz，1H)，5.98(s，2H)，3.58(s，2H)，3.35-34(m，1H)，2.33-2.32(m，7H)，2.10 (s，3H)，1.23(d，J＝2.8Hz，3H)。
实施例11-57和11-60：(S)-N-(5-((4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基)哌嗪 -1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺和(R)-N-(5-((4-(1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙基) 哌嗪-1-基)甲基)噻唑-2-基)乙酰胺的制备
通过手性HPLC(ChiralcellOJ-H柱(250x4.6mm，5μm)；洗脱液为0.1％DEA在 己烷中的溶液：IPA90：10；流速：1.0mL/min)分离出实施例58的两个对映异构体。 洗脱出的第一个化合物浓缩，得到实施例60化合物，为白固体。得率：3％(16mg)。 LC/MS：(方法C)389.0(M+H)，HPLC：(方法C)停留时间：2.12min，98.9％(Max)， 99.2％(254nm)。HPLC手性纯度：(方法C)停留时间：16.97min，100.0％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.95(s，1H)，7.23(s，1H)，6.83(s，1H)，(d， J＝8.4Hz，1H)，6.71(d，J＝8.0Hz，1H)，5.97(d，J＝1.2Hz，2H)，3.57(s，2H)， 3.31-3.28(m，1H)，2.33-2.32(m，8H)，2.10(s，3H)，1.22(d，J＝8.0Hz，3H)。
洗脱出的第二个化合物浓缩，得到实施例57化合物，为白固体。得率：2％(13 mg)。LC/MS：(方法C)389.0(M+H)。HPLC：(方法C)停留时间：2.12min，99.7％(Max)， 99.7％(254nm)。HPLC手性纯度：(方法C)停留时间：29.60min，100.0％(Max)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.91(s，1H)，7.21(s，1H)，6.81(s，1H)，(d， J＝8.4Hz，1H)，6.70(d，J＝8.0Hz，1H)，5.96(d，J＝1.2Hz，2H)，3.56(s，2H)， 3.30-3.29(m，1H)，2.32-2.31(m，8H)，2.09(s，3H)，1.22(d，J＝8.0Hz，3H)。
两个标题化合物的hOGA酶抑制值(IC50)都在1至10μM之间(“++”)。
实施例12：人O-GlcNAcase的酶抑制试验
采用TTPLabTechMosquito液体处理仪器把100nL适量浓度的抑制剂在 100％DMSO(用于剂量应答曲线计算)中的溶液移入384孔板(AuroraBiotechnologieS， Part#30311)的每一孔中。将以下反应成分加入至终容积10μLMcIlvaine缓冲溶液(pH 6.5)中：
20nMHis-Tagged标记hOGA和10μM荧光素单-β-D-(2-脱氧-2-N-乙酰基)吡喃 葡糖苷(FL-GlcNAc；MarkerGeneTechnologiesInc，Part#M1485)。孔板在室温培育 60分钟，然后加入10μL终止缓冲液(200mM甘氨酸，pH10.75)终止反应。在Envision 平台上采用顶镜以荧光格式读取孔板，485nm+阻尼(dampener)作为激发滤光设置， 520nm作为发射滤光设置。将测到的荧光量相对于抑制剂浓度绘制曲线，产生S形剂 量应答曲线，从该曲线计算IC50。
实施例13：细胞性O-GlcNAc糖基化试验
把B35大鼠成神经细胞瘤细胞(ATCC；CRL-2754)铺在用聚-D-赖氨酸处理过的96 孔板(BDFalcon；354640)中，密度为每孔10,000个细胞，完全培养基的总体积为90μl。 第二天，细胞用适当浓度的抑制剂在37℃和5％CO2条件下处理16小时。将细胞固定 于100μl的4％多聚甲醛15分钟，再用PBS缓冲液洗三次。然后在室温下细胞浸透在 0.1％TritonX-10060分钟。用PBS洗三次后，室温下将细胞用在PBS缓冲液中且含1 ％BSA的10％山羊血清的封闭2小时。然后4℃下将细胞与单克隆兔抗体以1：1000 的稀释浓度在丝氨酸400(Epitomics)中培育过夜，其中单克隆兔抗体对tauO-GlcNAc 糖基化具有特异性。洗掉初级抗体，所述细胞与和山羊抗兔AlexaFluor488共轭的第二 抗体(MolecularProbes；A11034)一起培育，加入浓度为1μg/ml的Hoechst33342核染 料。在AcumenExplorereX3板读数仪器上读取细胞。将总的峰强度与抑制剂浓度制图， 制作产生S形剂量反应曲线，从而计算EC50值。
实施例14：药物制剂
(A)注射液瓶：将100g本发明化合物作为活性成分与5g磷酸二氢钠在3L再蒸 馏水中的溶液用2N盐酸调它的pH至6.5，无菌过滤，转移到注射瓶中，冻干，并在 无菌条件下密封。每个注射液瓶含有5mg活性成分。
(B)栓剂：将20g本发明化合物作为活性成分与100g大豆卵磷脂和1400g可可油 混合，倒入模中，冷却。每片栓剂含20mg活性成分。
(C)溶液制剂：由1g作为活性成分的本发明化合物、9.38gNaH2PO4·2H2O、28.48 gNa2HPO4·12H2O和0.1g苯扎氯铵在940mL再蒸馏水中制成一种溶液。将该溶液的 pH调至6.8，再将该溶液配至1L，放射灭菌。该溶液以眼药水形式使用。
(D)软膏：在无菌条件下将500mg本发明化合物作为活性成分与99.5g凡士林混 合。
(E)片剂：将1kg本发明化合物作为活性成分、4kg乳糖、1.2kg马铃薯粉、0.2kg 滑石和0.1kg硬脂酸镁按照常规方法压成片剂，以致于每片含10mg活性成分。
(F)包衣片剂：类似实施例E压成片剂，然后按照常规方法用蔗糖包衣、马铃薯粉、 滑石、黄芪胶和染料来包衣片剂。
(G)胶囊剂：将2kg本发明化合物作为活性成分按照常规方法导入硬胶囊中，以 致于每个胶囊含20mg活性成分。
(H)安瓿剂：将1kg本发明化合物作为活性成分在60L再蒸馏水中的溶液无菌过 滤，转移到安瓿中，无菌条件下冻干，并在无菌条件下密封。每个安瓿含有10mg活 性成分。
(I)吸入喷雾剂：将14g本发明化合物作为活性成分溶解在10L等渗氯化钠溶液中， 将该溶液转移至商业可买到的带泵机构的喷雾容器中。可将溶液喷入嘴或鼻内。一次 喷射(约0.1ml)相当于一剂约0.14mg。
实施例15：O-GlcNAc糖基化的增加减少tau病小鼠模型中病理性tau，而不影响 tau的正常磷酸化
附图说明
图1：急性或亚急性ThiametG对Tg4510小鼠内O-GlcNAc糖基化和磷酸化的影 响。A：单次给予ThiametG后4小时或者14内每天重复用ThiametG后4小时， 小鼠半前脑内增加了总O-GlcNAc糖基化水平。B：动物经14天后免疫沉淀的tau (HT7抗体)在S400的O-GlcNAc糖基化与介质对照组相比大大地增加。C：用ThiametG (％)单次4小时后在小鼠半前脑的TauO-GlcNAc糖基化蛋白水平略有增加，而14 内每天用ThiametG(％)，在最后一次4小时后在小鼠半前脑的TauO-GlcNAc 糖基化蛋白水平显著增加4。D：单次ThiametG4小时后抗原表位S202/205、S262 和S396的Tau磷酸化减少，但14内每天用ThiametG(％)后Tau磷酸化返回正常 水平。单次ThiametG4小时后和重复给予ThiametG(14天)后抗原表位S356的Tau 磷酸化显著减少(单因素方差分析，*p<.05)。蛋白质印迹法数据(N＝13-15/组)以平均值 ±s.e.m.介质的对照组的百分比表示。单因素方差分析；与对照组相比*P<.05。
图2：慢性ThiametG对Tg4510小鼠内tauO-GlcNAc糖基化和病理tau的影 响。A：给予ThiametG4个月后，小鼠半前脑内O-GlcNAc糖基化维持在高水平。B： 给予ThiametG4个月后抗原表位pS202/205、pS400、pS356和pS262的过度磷酸化病 理Tau(60kD)显著减少。C：在Tg4510小鼠的海马的CA1区域中检测到O-GlcNActau (Otau(S400)抗体；上部)和AT8(中部)的局部表达，其识别过度磷酸化聚集的tau。进行 双重免疫染来证明O-GlcNActau和病理性tau没有共存(下部，63x图像)。D：给予 ThiametG4个月后50-60kDtau种类的Tau磷酸化状态保持不变。蛋白质印迹法 数据(N＝13-15/组)以平均值±s.e.m.介质的对照组的百分比表示。单因素方差分析； 与对照组相比*P<.05。
图3：慢性ThiametG对海马区内营养不良性神经元和缠结的影响。A：给予 ThiametG4个月后在海马的CA1和CA3区内AT8阳性神经元显著减少。B：给予 ThiametG4个月后在海马的CA1区内嗜银纤维(经由比耳朔夫斯基染剂测量)显著减 少，但CA3区则没有出现这种情况。IHC和比耳朔夫斯基染剂的定量(N＝13-15/组) 以平均值±s.e.m.介质的对照组的百分比表示。
材料和方法
动物：按现有方法(Santacruz等人，2005，Science309：476-481)产生 Tg(tauP301L)4510小鼠。将动物饲养和安置在McLaughlin研究所(大瀑布，蒙大拿)内。 所有实验均经MRI机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。评价了ThiametG对3 个月大雄性和雌性Tg4510小鼠的急性(1天)和亚慢性(14天)影响。所述评价 始于小鼠2个月大时。ThiametG溶于水，腹腔给药，给药浓度为500mg/kg/天。
对O-GlcNActau具有特异性的抗体(Otau(S400))：要产生针对丝氨酸400的tau O-GlcNAc糖基化具有特异性的兔单克隆抗体，用肽 (cVYKSPVV-(O-GlcNAc)S-GDTSPRH)免疫家兔，所述肽对应于2N4R人tau蛋白的氨 基酸393到407。分离出具有高效价抗血清的兔淋巴细胞，产生杂交瘤。从阳性杂交 瘤细胞亚克隆的上清液纯化IgG抗体。Western印迹法确认了从共表达OGT和人 2N4Rtau的HEK293细胞取得的重组O-GlcNAc糖基化tau和溶解物样本中抗体的特异 性(数据未示出)。
Tau免疫印迹：使用交联免疫印迹试剂盒(Pierce26147)进行脑溶解物的tau蛋白免 疫印迹法。按照制造商的指将A/G树脂与10μgHT7tau抗体(ThermoScientificMN1000) 或对照小鼠IgG(SantaCruzBiotechsc-2025)进行交联。按以下方法制备250μg脑溶解 物，与交联后的树脂在4℃培育，过夜。样本用50μl低pH洗脱缓冲液洗脱，并立即 离心分离，装入含有5μl1MTrispH9.5的收集管内。免疫印迹的tau按以下方法经历 Western印迹法。
Western印迹法：为了检查O-GlcNAc糖基化和磷酸化的变化，在急性或亚慢性实 验中注射后4小时以及在慢性实验中最后一次注射后24小时处死动物。快速地切开半 前脑，用干冰冷冻。用Phosphosafe缓冲液(EMDChemicals)使组织样本匀质化，然后 低速离心(15，000g)，除去细胞碎片。通过Lowry方法分析得到的上清液(低速上清液， Lss)，以确定蛋白质浓度。20μg蛋白质样本用4-15％SDS-PAGE(Tris-HClgels，Bio-Rad) 处理，再转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，IBlotsystem)，以确定O-GlcNAc糖基化和 磷酸化。室温下用Licor封闭缓冲液封闭膜1小时，4℃下与初级抗体培育过夜。用 RL2抗体(1：500，ThermoScientific)检测总蛋白质的O-GlcNAc糖基化，用Otau(S400) 抗体(1：500)检测tau的O-GlcNAc糖基化，而用AT8(1：500，ThermoScientific)、pS396、 pS262、pS356(1：500，Abcam)和pS400(1：5000，GenScript)检测tau的磷酸化。GAPDH (1：1000，Abcam)或总tau(1：50，000ThermoScientific)抗体用作内部装载对照。膜 与种类特异性荧光团-共轭的第二(1：10,000；Licor)抗体室温培育多1小时，用Licor 公司的Odyssey技术检测。
Tau分馏：分析50-60kDtau蛋白和64kDtau蛋白，将含有50-60kD和64kDtau 蛋白的Lss馏分高速离心(110，000g，15分钟)。移出并测定含有50-60kDtau蛋白的 上清液(S1馏分)，以确定蛋白浓度。分析50-60kDtau蛋白和64kDtau蛋白的变化，将 Lss和S1馏分用10％SDS-PAGE(Tris-HClgels，Bio-Rad)处理，再按上述方法转移。 脑溶解物中的64kDtau蛋白以一条完整带出现，其(Lss馏分)表观质量约64kD，但在 高速离心将50-60kDtau蛋白与64kDtau蛋白分开后，上清液不存在64kDtau(图2B)。 50-60kDtau蛋白以多条带出现，其表观质量约50-60kD。
免疫组化分析：要检查缠结病理的变化，切开半脑，浸没固定在10％中性福尔马 林缓冲液中24-48小时，随后包埋在石蜡块内。将10微米一系列的冠状切片安装在 SuperfrostPlus载玻片上，用BondIntenseR试剂盒染。要检测营养不良性AT8神经 元，安装后的载玻片用抗原修复液(antigenretrievalsolution)预处理10分钟，再用BOND 洗涤缓冲液洗涤。然后用BondIntenseR试剂盒中的过氧化氢淬灭切片，用M.O.M.封 闭缓冲液(M.O.M免疫检测试剂盒，VectorLaboratories)封闭，再与pS202/205初级抗 体(1：500；ThermoScientific)一起培育。接着，切片依次与生物素化驴抗小鼠第二抗 体(1：200；JacksonImmunoresearch)、链霉亲和素-HRP、以及3,3'-二氨基联苯胺(后两 者是BONDIntenseR试剂盒)一起培育。要检测嗜银性缠结，切片去石蜡，再水化在 蒸馏水中并在37℃用甲醛(4％)处理过夜。切片用自来水洗涤，在黑暗条件下于20％ 硝酸银溶液中培育15分钟，洗涤，在黑暗条件下于氨化银溶液中培育10分钟，用氨 水洗涤，再用显影剂处理。接着，切片用氨水、蒸馏水、硫代硫酸钠洗涤，脱水，安 装。
免疫荧光法：要检查O-GlcNAc糖基化tau和AT8是否共存，切片用5％正常山羊 血清(JacksonImmunoresearch)封闭1小时，再依次与Otau(S400)；(1：100，1h)和AT8 (1：500，1h)一起培育。切片被清洗后，与第二FITC共轭的山羊抗兔和TexasRed共 轭的山羊抗小鼠(Invitrogen)抗体在PBS中培育1小时。载玻片被清洗后，用ProlongGold 抗淬灭试剂(Invitrogen)盖上载玻片。
统计分析：对只有两组组的那些研究中的蛋白质O-GlcNAc糖基化和磷酸化 的变化用单因素方差分析法分析，然后通过Dunnett’s事后比较检定或通过t-检验法检 定。免疫组化分析采用t-检验法检定。
结果
(i)急性和亚慢性抑制OGA增加tauO-GlcNAc糖基化并瞬时减少tau磷酸化。
要研究tauO-GlcNAc糖基化的增加对tau磷酸化的影响，选择Tg4510小鼠模型， 这是因为该模型与人Tau病非常相似，也是研究与tau相关的神经退行性疾病的一个 重要模型。对Tg4510小鼠注射单剂或重复多剂OGA抑制剂ThiametG或媒介质。 ThiametG是OGA的有效抑制剂，其IC50约是5nM。OGA催化蛋白质除去O-GlcNAc 残基，而抑制OGA会导致蛋白质中的O-GlcNAc修饰相对地增加。注射单剂ThiametG (F(2,43)＝20.98；p<.01，与媒介质相比较；图1A)或者注射14天ThiametG(F(2,43)＝12.57；p<.01)后，观察到中枢神经系统的总蛋白O-GlcNAc糖基化显著增加。注射 14天所获得的总蛋白O-GlcNAc糖基化显著高于单剂注射(p<.05)。
为了具体研究ThiametG对tauO-GlcNAc糖基化的影响，产生对丝氨酸400 的tauO-GlcNAc糖基化具有特异性的兔单克隆抗体Otau(S400)。S400可被-O-GlcNAc 糖基化修改(Yuzawa等人，2010，AminoAcids40：857-868)，位于S396和S404之间， S396和S404已公知是tau病所涉及的磷酸化位点。为了证实Otau(S400)确实能识别 O-GlcNAc糖基化tau，采用Tg4510小鼠脑的泛特异性tau蛋白抗体(HT7)免疫沉淀tau， 而所述Tg4510小鼠脑已用ThiametG亚慢性地处理过，并用Otau(S400)抗体探测。所 述Otau(S400)抗体强烈地识别用ThiametG处理过的动物内免疫沉淀的tau，但在媒介 物处理过的动物内的识别则少得多(图1B)。有趣的是，在tau的较低分子量带上检测 出O-GlcNAc糖基化tau蛋白，这表示只有tau子集O-GlcNAc糖基化。注射单剂 ThiametG后检测到tauO-GlcNAc糖基化只有轻微增加。但重复注射多剂ThiametG产 生的tauO-GlcNAc糖基化增加9倍(F(2,42)＝22.04；p<.05，与媒介质处理相比较d； 图1C)。这证实了tau蛋白是tauO-GlcNAc糖基化的底物，抑制OGA能可靠地增加tau 病小鼠模型中丝氨酸400的tauO-GlcNAc糖基化。
注射单剂ThiametG降低了表位S202/205(F(2,43)＝43.49；p<.05)、S262(F(2,43)＝ 27.36；p<.05)、S356(F(2,43)＝33.31；p<.05)和S396(F(2,43)＝22.48；p<.05；图1D) 的tau蛋白磷酸化。急性ThiametG没有改变S400的tau蛋白磷酸化，这表明 O-GlcNAc糖基化不能调节这个抗原表位的tau蛋白磷酸化。有趣的是，重复注射多剂 ThiametG不会使所研究的表位的tau磷酸化有更大程度的减少。对于表位S202/205、 S262和S396，注射14天ThiametG后磷酸化返回基线水平，而表位S356的磷酸化仍 然有显著减少(F(2,43)＝26.72；p<.05)，但显示的趋向是磷酸化会增加。
(ii)慢性抑制OGA减少tau病。
为了研究ThiametG对tau病的慢性影响，Tg4510动物从2个月大开始接受 ThiametG。有目的地选择这个年龄的小鼠，在出现病理性tau积聚和神经退化之 前开始进行示范。在最后一次注射后24小时收集脑组织，通过免疫印迹法以及对 缠结作组织学分析，进行tau蛋白质分析。用ThiametG4个月后总蛋白O-GlcNAc 糖基化水平与14天的总蛋白O-GlcNAc糖基化水平相似(185％)(数据未示出)。此 外，4个月后的tauO-GlcNAc糖基化上升了9倍，与14天相当，这表明tau O-GlcNAc糖基化在抑制OGA两个星期后会到达稳定状态(T27＝18.95；p<.0001；图 2A)。尤其是，较低分子量带的tau上出现O-GlcNAc糖基化，但在有病理性tau的64 kD带上没有O-GlcNAc糖基化，这表明只有非病理性tau才会被O-GlcNAc糖基化。 为了证实病理性tau不会被O-GlcNAc糖基化，Tg4510小鼠的脑切片用ThiametG处理， 用Otau(S400)抗体(图2C，上部)和AT8抗体(图2C，中部)对所述脑切片进行双标记免 疫荧光实验，所述两种抗体识别过度磷酸化聚集的tau。海马的CA1区的各个神经元 在胞体和突起中表现出较强的AT8免疫反应性(图2B，中部)，而O-GlcNAc-tau的免 疫反应性主要位于神经元细胞体(图2C，上部)。观察不到O-GlcNAc-tau与病理性tau 共存(图2C，下部)，这与Tg4510脑内病理性tau种类不会出现O-GlcNAc糖基化的生 化分析一致。
通过差速离心Tg4510小鼠脑匀浆和检测磷酸化tau特异性抗体来生化鉴定过度磷 酸化病理性tau蛋白。全脑匀浆中的病理性tau以一条紧凑高分子量带出现，在64kD 左右(低速旋转馏分；LSS)，但高速离心后在上清液中不到病理性tau(S1馏分)，高 速离心将正常tau与病理性tau分开(图2B)。S1馏分所含有的tau种类的表观分子量大 约在50-60kD的范围内。采用针对tau的S202/205(T27＝2.984；p<.01)、S400(T27＝ 2.769；p<.01)、S356(T27＝2.132；p<.05)和S262(T27＝3.030；p<.01；图2B)的磷 酸化特异性抗体检测到，ThiametG慢性显著地减少了64kDtau蛋白，这表明持 续增加tau的O-GlcNAc糖基化会防止病理性tau的积聚。
tau蛋白聚集涉及的各种表位，即S202/205、S356和S262，其50-60kDtau种类 的磷酸化状态没有发生任何变化(图2D)。这表明，O-GlcNAc糖基化的持续增加不会 调节50-60kDtau种类的磷酸化，因此不管磷酸化水平如何，都可以防止病理性tau积 聚。这与注射单剂ThiametG后观察到tau磷酸化减少的现象相反，也与本领域关于通 过竞争性或相邻位点占据的O-GlcNAc糖基化来直接调节tau磷酸化的观点不一致。
为了确认抑制OGA对tau聚集产生的影响，使用经过ThiametG处理的Tg4510小 鼠脑切片评价tau病理的组织学。与生化分析相一致，ThiametG慢性显著减少海 马的CA1(T26＝3.053，p<.01)和CA3(T25＝3.046，p<.01)区中的pS202/205(AT8) 阳性营养不良性神经元(图3)。此外，为了证明AT8免疫反应性神经元确实反映带有 神经元的缠结，在用ThiametG和媒介质体处理过的动物脑切片上进行比耳朔夫斯基染 (Bielschowskystaining)。与AT8免疫组织化学分析一致，发现在海马CA1区中的缠 结病理显著减少(T(25)＝2.309；p<.05；图3B)。但是，在海马CA3区中的缠结负载没 有观察到有任何不同。这可能是由于各种方法对早期tau聚集的灵敏度存在差异。
综上所述，这些结果表明增加tau的O-GlcNAc水平能减少Tg4510小鼠模型产生 病理性tau种类。
讨论
己经显示，采用有效的选择性OGA抑制剂ThiametG对Tg4510tau小鼠模型进行 ，经生化和病理方面测定，能显著地减少tau病理。在ThiametG处理过的动物脑 均浆中观察到病理性64kDtau大大地减少。这种tau种类代表一个低速可溶性但高速 沉降性聚集的tau库，最可能由tau二聚体和低聚体组成。这些早期tau聚集物先于神 经原纤维缠结(NFT)形成，与肌氨酸不溶性tau蛋白或NFT相比，所述早期tau聚集物 与Tg4510小鼠脑内的神经元功能障碍和变性的相关性更密切。同样地，在阿耳茨海默 氏病(AD)脑的某些区域中，丧失神经元和NFT病理与变性神经元的数目是完全分开 的，变性神经元的数目远远大于带有神经元的NFT的数目，这意味着NFT不可能在 疾病进程中成为初级神经毒性剂。此外还发现，在人tau病中的异常tau结构与在 Tg4510小鼠的病理性64Kdtau蛋白种类相似，因此这些聚集tau中间体有可能成为潜 在的标靶。该研究清楚地表明，通过长期抑制OGA能够减少病理性64kDtau种 类，使得OGA成为研究药物的一个有吸引力的分子标靶。这种观察也与以下免疫组 织的发现接近一致：在用ThiametG过的动物中非常少神经元对AT8抗体产生免 疫反应，AT8抗体是一种病理性tau聚集物标记。
重要的是，响应于慢性抑制OGA，tau的O-GlcNAc糖基化明显地增强，这可能 是抑制OGA对病理性tau蛋白有更明显的效果的原因。在本研究使用Tg4510tau小鼠 模型可以解释tauO-GlcNAc糖基化的差异，该小鼠模型比JNPL3小鼠模型更高水平地 转基因表达tau。此外，位点特异性O-GlcNAc-tau抗体比3925抗体对S400的O-GlcNAc 糖基化tau有更高的亲和力。值得注意的是，在本研究中，只在迁移至聚丙烯酰胺凝 胶的低分子量tau中才发现S400的O-GlcNAc糖基化修饰，在AT8免疫阳性神经元中 没有发现O-GlcNAc糖基化修饰，这表明只有非病理性tau才会发生O-GlcNAc糖基化。 这符合O-GlcNAc糖基化维持tau在一种使得它更不容易聚集的状态的观点。与此相一 致的是，由阿尔茨海默氏病患者的脑免疫纯化而来的非病理性tau被发现比过度磷酸 化病理性tau发生更多O-GlcNAc糖基化。
慢性OGA抑制减少Tg4510小鼠脑的过多病理性tau聚集物，而不影响非病理性 tau的磷酸化。这表明O-GlcNAc糖基化不会直接调节tau的磷酸化，但通过一种与磷 酸化无关的机制减少tau积聚。虽然不可能完全排除其他与O-GlcNAc相关的机制对tau 聚集有影响，但有可能的是tau的O-GlcNAc糖基化直接减少其低聚化倾向，这已在 O-GlcNAc修饰的tau截短形式中获得证实。在这种情况下，重要的是要注意，S400 的O-GlcNAc糖基化似乎在抑制tau低聚化方面发挥主导作用，这符合本研究的以下发 现：S400的tauO-GlcNAc糖基化大幅地增加9倍，响应于慢性OGA抑制，tau积聚同 时减少。O-GlcNAc糖基化对蛋白质积聚的这种保护性作用不仅仅对tau有效，而且 TAB1和α-突触核蛋白肽的O-GlcNAc糖基化形式与其未修饰的对应物相比也更不容 易出现低聚化。因为O-GlcNAc糖基化防止不同类型的淀粉样蛋白质聚集，所以抑制 OGA可以是供一种策略，除了用于阿尔茨海默氏病以外，还可适用于由异常蛋白 聚集而引起的其他多种疾病。
概括而言，这些数据第一次表明，tau的O-GlcNAc糖基化慢慢地增加能防止形成 过度磷酸化tau蛋白聚集体，这与阿尔茨海默氏病或其他tau病观察到的神经毒性密切 相关。这项研究有力地支持OGA作为一个缓解疾病疗法的分子标靶，可以减轻阿尔 茨海默氏病或其他tau病的tau病理进程。
本文发布于:2024-09-24 19:19:44，感谢您对本站的认可！
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