开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法及应用

1.本发明涉及肿瘤光动力、光热、化学动力及饥饿技术领域，具体涉及一种负载光敏剂ce6及葡萄糖氧化酶的基于开放式中空二氧化锰与聚多巴胺为基底的纳米复合材料的制备方法及应用。

背景技术：

2.恶性肿瘤发病率和死亡率逐年增高，是威胁大众生命健康的主要因素之一。肿瘤的手段主要包括外科手术、化学和放射等单一疗法。目前，联合疗法在减轻单一疗法的缺点和提高效果方面引起了广泛的兴趣，合理利用肿瘤微环境进行联合被认为是最有效的肿瘤方法之一。因此，探寻一种合理利用肿瘤微环境的协同可能是一种绿肿瘤的方法，具有较高的疗效、效率以及最小的副作用。
3.肿瘤微环境主要包括肿瘤部位的基质细胞、免疫细胞、血管系统、淋巴系统及细胞外基质成分，它们共同构成了肿瘤生长的“土壤”。肿瘤微环境呈现出许多与正常组织不同的特点，如低氧、微酸性、谷胱甘肽过表达、基质纤维化、血管生成因子优势、血液高凝状态和免疫抑制等，这些特点降低了肿瘤对光动力、化学动力、饥饿以及免疫的敏感性，导致乏氧诱导因子高表达，促进肿瘤新生血管形成，诱发肿瘤细胞的复发侵袭和转移，并且严重限制了肿瘤过程中的抗肿瘤能力。

技术实现要素：

4.本发明开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法以解决目前肿瘤手术切除以及放、化疗方法，灵敏度及特异性不高，且单一的方式对肿瘤杀伤能力不足，以及由于肿瘤微环境的复杂多样性限制肿瘤过程中的抗肿瘤能力的问题。
5.开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，按以下步骤进行：
6.以二氧化硅纳米粒子为模板，通过氧化还原作用在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层，然后以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻，得到开放式中空二氧化锰纳米粒子；再将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂，最后在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层，同时通过静电吸附及ππ堆积吸附葡萄糖氧化酶，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
7.如上述的方法制备得到的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
8.开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的应用，所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料在制备乏氧肿瘤协同级联药物中的应用。
9.本发明的原理：
10.纳米生物材料具有物理性质可控性高、易于表面修饰、血液循环时间长及可功能化等优点，在疾病的诊断与研究中显示出巨大的潜力。二氧化锰可以与肿瘤微环境中的过氧化氢生成二价锰离子和氧气，生成的二价锰离子与h2o2通过类芬顿反应产生有毒的羟基自由基(
·
oh)，多巴胺不仅表现出良好的光热作用，还表现出模拟超氧化物歧化酶
(sod)的活性，并且两者都具备肿瘤微环境响应性的特点。葡萄糖氧化酶可以实现快速消耗葡萄糖和产生过氧化氢，光敏剂ce6可以产生光动力生成活性氧杀伤肿瘤细胞，通过这些组分与肿瘤微环境之间的反应的联系，需要探求一种相互协同、互相促进的更好的肿瘤方式。
11.在近红外光的照射下开放式中空二氧化米纳米马达依靠自身聚多巴胺外壳的光热效应产生的热量，迅速提升马达内部水温，导致腔内受热水体从开放式口处快速喷射而出，推动纳米马达向前运动，类似于飞机引擎的热喷气效应。
12.本发明的有益效果：
13.本发明开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，通过对二氧化锰包覆后的二氧化硅纳米粒子的蚀刻得到开放式的中空二氧化锰纳米粒子，与传统的空心纳米球结构相比，开放式中空纳米材料还可以增加体积堆积密度；同时可以保留较高的比表面积，从而提高载药量。在开放式的中空二氧化锰纳米粒子表面进行聚多巴胺修饰，使pda的光热性能得到改善；另一方面，pda表现出模拟超氧化物歧化酶(sod)的活性，从而促进cdt的效果。葡萄糖氧化酶的负载可以进行葡萄糖的消耗和h2o2分解的循环反应，以增强饥饿。以及加入的ce6可以进行光动力，最终合成的纳米酶表面带有负电荷，具有良好的的生物相容性，粒径大小合适可以通过epr效应到达肿瘤部位。本发明丰富了以二氧化锰为基底的纳米酶的复合材料的种类。
14.由于肿瘤微环境一般表现为ph值低、谷胱甘肽(gsh)浓度高、过氧化氢(h2o2)过多、严重缺氧。这些特征为肿瘤细胞的起源和驻留提供了一个内部环境，并导致肿瘤的进展、转移和耐药性。因此，正常组织和肿瘤组织之间，肿瘤细胞外微环境和内涵体、溶酶体内外的ph差值及肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽值能够作为刺激信号，实现智能化载药系统对肿瘤组织和细胞的靶向作用，增强细胞内吞以及对递送药物的可控释放。肿瘤微环境对纳米载药平台的响应性是实现药物智能纳递送及药物高效低毒的基础。二氧化锰和聚多巴胺都具有肿瘤微环境响应性，有利于将负载的药物在特异性的肿瘤微环境中释放。开放式的中空二氧化锰比表面积大，具有较大的载药量，负载更多的ce6进行光动力产生活性氧杀伤肿瘤细胞。二氧化锰通过与肿瘤微环境中过量的h2o2反应，实现了精确控制的药物释放以及可持续和广泛的o2和二价锰离子的产生。生成的氧气逆转肿瘤组织的缺氧环境，促进god的功能，实现快速消耗葡萄糖和产生过氧化氢。生成的二价锰离子又可以通过芬顿反应进一步催化过氧化氢生成具有细胞毒性的羟基自由基。聚多巴胺用于在近红外照射下提高局部温度，在近红外激光照射下，opmp-c-g的热疗可以进一步提高gox的催化活性。pda同时表现出模拟超氧化物歧化酶(sod)的活性。从而促进cdt的效果。此外，本发明合理的将开放式中空二氧化锰纳米粒子，聚多巴胺，ce6，葡萄糖氧化锰相结合，制备了开放式中空二氧化锰纳米酶复合材料以实现对肿瘤微环境响应性的多种方式协同。
15.本发明可获得开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法及应用。
附图说明
16.图1为实施例1中获得的二氧化硅纳米粒子(s)的扫描电镜图像(sem)；
17.图2为实施例1中获得的二氧化锰覆盖二氧化硅后的纳米粒子(ms)的扫描电镜图像(sem)；
18.图3为实施例1中获得的开放式中空二氧化锰纳米粒子(opm)的扫描电镜图像(sem)；
19.图4为实施例1中获得的opm装载ce6(opm-c)的扫描电镜图像(sem)；
20.图5为实施例1中获得的opm-c包覆聚多巴胺(opmp-c)的扫描电镜图像(sem)；
21.图6为实施例1中获得的opmp-c负载葡萄糖氧化酶(opmp-c-g)的扫描电镜图像(sem)；
22.图7为实施例1中获得的羧opm的透射电子显微镜(tem)像；
23.图8为实施例1中合成的s、ms、opm、opm-c、opmp-c和opmp-c-g的电位图谱；
24.图9为实施例1中合成的opm的xps图谱；
25.图10为实施例1中合成opmp-c的icp图谱；
26.图11为实施例1中合成的opm的eds图谱；
27.图12为图11中锰的分布图；
28.图13为图11中氧的分布图；
29.图14为图11中碳的分布图。
具体实施方式
30.具体实施方式一：本实施方式开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，按以下步骤进行：
31.以二氧化硅纳米粒子为模板，通过氧化还原作用在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层，然后以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻，得到开放式中空二氧化锰纳米粒子；再将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂，最后在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层，同时通过静电吸附及ππ堆积吸附葡萄糖氧化酶，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
32.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：二氧化硅纳米粒子的制备步骤如下：将20～30g无水乙醇、2～4ml氨水与5～8ml去离子水混合，在50～80℃的水浴中以1000～1500r/min的转速搅拌5～10min，然后逐滴加入2～4ml正硅酸乙酯溶液，继续搅拌反应2～6h，搅拌结束后使用去离子水洗涤3～5次，再使用无水乙醇洗涤2～3次，得到二氧化硅纳米粒子。
33.其他步骤与具体实施方式一相同。
34.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层的具体步骤如下：将200～500mg高锰酸钾加入到20～40ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液a；将二氧化硅纳米粒子加入到20～40ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液b；将溶液a和溶液b在室温下混合，磁力搅拌24～48h，搅拌结束后使用去离子水离心洗涤3～5次，得到覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子。
35.其他步骤与具体实施方式一或二相同。
36.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻的具体步骤如下：将覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子分散在50～80ml、2～4m氢氧化钠溶液中，在室温下以360～720r/min的转速磁力搅拌4～8h，再在8000～10000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3～5次，最后冷冻干燥，得到开放
式中空二氧化锰纳米粒子。
37.其他步骤与具体实施方式一至三相同。
38.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：所述的氢氧化钠溶液按以下步骤制备：将4～6g氢氧化钠加入到50～100ml去离子水中，搅拌均匀后，得到2～4m氢氧化钠溶液。
39.其他步骤与具体实施方式一至四相同。
40.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂的具体步骤如下：将5～10mg二氢卟吩加入到1～2ml二甲基亚砜溶液中，分散均匀后，得到溶液c；将开放式中空二氧化锰纳米粒子均匀分散在49～80ml去离子水中，得到溶液d；将溶液c加入到溶液b中，避光过夜搅拌12～24h，在8000～10000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3～5次，冷冻干燥，得到负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。
41.其他步骤与具体实施方式一至五相同。
42.具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层的具体步骤如下：将负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到500～800ml、ph为8.5～10.0的tris缓冲液中，分散均匀后加入10～50mg多巴胺，避光搅拌2～4h后，得到包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。
43.其他步骤与具体实施方式一至六相同。
44.具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：吸附葡萄糖氧化酶的具体步骤如下：将包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到49～80ml去离子水中，得到溶液e；将10～20mg葡萄糖氧化酶加入到1～2ml去离子水中，得到溶液f；再将溶液e和溶液f混合，避光搅拌24～48h后，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
45.其他步骤与具体实施方式一至七相同。
46.具体实施方式九：本实施方式如具体实施方式一所述的方法制备的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
47.具体实施方式十：本实施方式如具体实施方式一所述的方法制备的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的应用，所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料在制备乏氧肿瘤协同级联药物中的应用。
48.采用以下实施例验证本发明的有益效果：
49.实施例1：开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，按以下步骤进行：
50.一、制备二氧化硅纳米粒子模版：将22g无水乙醇、1ml氨水与4ml去离子水加入到50ml圆底烧瓶中，在50℃的水浴中以1000r/min的转速搅拌5min，然后取2ml正硅酸乙酯用移液逐滴加入至圆底烧瓶中，继续搅拌反应2h，搅拌结束后使用去离子水洗涤三次，再使用无水乙醇洗涤一次，得到二氧化硅纳米粒子。
51.二、以二氧化硅纳米粒子为核，通过原位生长的方式制备二氧化锰包覆的二氧化硅纳米粒子材料：将300mg高锰酸钾加入到20ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液a；将步骤一中得到的二氧化硅纳米粒子加入到20ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液b；将溶液a
和溶液b在室温下混合，磁力搅拌24h，搅拌结束后使用去离子水离心洗涤3～5次，得到覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子。
52.三、开放式中空二氧化锰纳米粒子的制备：将步骤二中得到的覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子分散在50ml、2m氢氧化钠溶液中，在室温下以360r/min的转速磁力搅拌4h，再在8000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥，得到开放式中空二氧化锰纳米粒子。
53.四、开放式中空二氧化锰纳米粒子进行光敏剂ce6的装载：将10mg二氢卟吩加入到1ml二甲基亚砜溶液中，分散均匀后，得到溶液c；将步骤三中得到的开放式中空二氧化锰纳米粒子均匀分散在49ml去离子水中，得到溶液d；将溶液c加入到溶液b中，避光过夜搅拌12h，在8000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3次，冷冻干燥，得到负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。
54.五、开放式中空二氧化锰-ce6聚多巴胺的包覆：将步骤四中得到的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到500ml、ph为8.5的tris缓冲液中，分散均匀后加入10mg多巴胺，避光搅拌2h后，得到包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。
55.六、开放式中空二氧化锰-ce6-聚多巴胺葡萄糖氧化酶的装载：将包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到49ml去离子水中，得到溶液e；将10mg葡萄糖氧化酶加入到1ml去离子水中，得到溶液f，再将溶液e和溶液f混合，避光搅拌24h后，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。
56.图1-6依次为实施例1中获得的s、ms、opm、opm-c、opmp-c和opmp-c-g的扫描电镜图像(sem)；如图1-6所示，制备的二氧化硅纳米粒子尺寸在100～200nm，经氢氧化钠蚀刻后，完整的球形结构被破坏，形成了开放式中空二氧化锰纳米粒子，其中图3(图中标注箭头位置)可清楚的看到纳米粒子表现有大小不一的开放式缺口，载药之后纳米粒子形貌完整，粒径均匀，聚多巴胺包覆之后纳米粒子的壳层增厚，最后制备的纳米粒子均一，具有开放式结构。
57.图7为实施例1中获得的羧opm的透射电子显微镜(tem)像，如图7所示，经氢氧化钠溶液蚀刻后的纳米粒子表现为开放式中空结构，使纳米粒子表现出更大的比表面积及更好的载药率。
58.图8为实施例1中合成的s、ms、opm、opm-c、opmp-c和opmp-c-g的电位图谱(三组柱状图分别代表三组平行数据)；二氧化硅纳米粒子经二氧化锰包覆后电位进一步变负，由于聚多巴胺表面呈正电，经聚多巴胺包覆后，电位有较大而正向改变，葡萄糖氧化酶带负电，与聚多巴胺产生静电吸附作用如图8所示，吸附葡萄糖氧化酶后电位稍变负，符合各个组分的表面电位。
59.图9为实施例1中合成的opm的xps图谱；如图9所示，xps中mn 2p3/2为641.2e v，mn 2p1/2为653.0e v，表明合成产物中锰的价态主要为+4价，与文献报道一致，证明合成的是二氧化锰纳米粒子。
60.图10为实施例1中合成opmp-c的icp图谱；如图10所示，经过不同比例聚多巴胺的包覆之后锰元素的含量，经多巴胺包覆后锰元素的含量在百分之35左右，证明合成的纳米粒子中含有较多的锰，为后续锰元素发挥作用奠定基础。
61.图11为实施例1中合成的opm的eds图谱；如图11所示，验证了二氧化锰的成功包覆。图12为图11中锰的分布图，图13为图11中氧的分布图，图14为图11中碳的分布图；如图12-14所示，可以看到锰，氧，碳，以及可忽略的硅均匀分散在纳米粒子表面，证明了纳米粒子的成功合成。

技术特征：

1.开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：以二氧化硅纳米粒子为模板，通过氧化还原作用在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层，然后以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻，得到开放式中空二氧化锰纳米粒子；再将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂，最后在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层，同时通过静电吸附及ππ堆积吸附葡萄糖氧化酶，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。2.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于二氧化硅纳米粒子的制备步骤如下：将20～30g无水乙醇、2～4ml氨水与5～8ml去离子水混合，在50～80℃的水浴中以1000～1500r/min的转速搅拌5～10min，然后逐滴加入2～4ml正硅酸乙酯溶液，继续搅拌反应2～6h，搅拌结束后使用去离子水洗涤3～5次，再使用无水乙醇洗涤2～3次，得到二氧化硅纳米粒子。3.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层的具体步骤如下：将200～500mg高锰酸钾加入到20～40ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液a；将二氧化硅纳米粒子加入到20～40ml去离子水中，充分溶解后，得到溶液b；将溶液a和溶液b在室温下混合，磁力搅拌24～48h，搅拌结束后使用去离子水离心洗涤3～5次，得到覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子。4.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻的具体步骤如下：将覆盖有二氧化锰的二氧化硅纳米粒子分散在50～80ml、2～4m氢氧化钠溶液中，在室温下以360～720r/min的转速磁力搅拌4～8h，再在8000～10000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3～5次，最后冷冻干燥，得到开放式中空二氧化锰纳米粒子。5.根据权利要求4所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于所述的氢氧化钠溶液按以下步骤制备：将4～6g氢氧化钠加入到50～100ml去离子水中，搅拌均匀后，得到2～4m氢氧化钠溶液。6.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂的具体步骤如下：将5～10mg二氢卟吩加入到1～2ml二甲基亚砜溶液中，分散均匀后，得到溶液c；将开放式中空二氧化锰纳米粒子均匀分散在49～80ml去离子水中，得到溶液d；将溶液c加入到溶液b中，避光过夜搅拌12～24h，在8000～10000r/min的转速条件下使用去离子水离心洗涤3～5次，冷冻干燥，得到负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。7.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层的具体步骤如下：将负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到500～800ml、ph为8.5～10.0的tris缓冲液中，分散均匀后加入10～50mg多巴胺，避光搅拌2～4h后，得到包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子。8.根据权利要求1所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于吸附葡萄糖氧化酶的具体步骤如下：将包裹有多巴胺的负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子加入到49～80ml去离子水中，得到溶液e；将10～20mg葡萄糖氧化酶加
入到1～2ml去离子水中，得到溶液f；再将溶液e和溶液f混合，避光搅拌24～48h后，得到开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。9.如权利要求1所述的方法制备的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料。10.如权利要求1所述的方法制备的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的应用，其特征在于所述的开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料在制备乏氧肿瘤协同级联药物中的应用。

技术总结

开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法及应用，涉及肿瘤光动力、光热、化学动力及饥饿技术领域。本发明要解决目前肿瘤手术切除以及放、化疗方法，灵敏度及特异性不高，且单一的方式对肿瘤杀伤能力不足，以及由于肿瘤微环境的复杂多样性限制肿瘤过程中的抗肿瘤能力的问题。方法：通过氧化还原作用在二氧化硅纳米粒子表面覆盖二氧化锰层，以氢氧化钠溶液作为蚀刻剂进行蚀刻，将开放式中空二氧化锰纳米粒子负载ce6光敏剂，在负载有ce6光敏剂的开放式中空二氧化锰纳米粒子表面覆盖聚多巴胺层，同时通过静电吸附及ππ堆积吸附葡萄糖氧化酶。本发明可获得开放式中空二氧化锰基纳米酶复合材料的制备方法及应用。备方法及应用。备方法及应用。