一种基于荧光免疫层析技术定量检测PSA的试纸条的制作方法

一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条
技术领域
1.本发明属于癌症检测技术领域，尤其涉及一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条。

背景技术：

2.前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,psa)是一种丝氨酸蛋白酶，被fda批准为前列腺癌监测指标，可应用于前列腺癌筛查。目前，psa成为前列腺癌检测最为常见的标志物之一，大大提高了前列腺癌早期诊断的效率，降低了疾病死亡率。
3.目前试纸条主要采用酶联免疫吸附法(elisa)、电化学发光法(eclia)、化学发光法(clia)、时间分辨荧光免疫分析法(trfra)等免疫学检测法检测psa，这些方法或需要较大仪器设备，或操作复杂，适合样本量多的大中型医院，不适合单个标本测定，限制了tpsa(总的前列腺特异性抗原)和fpsa(游离前列腺特异性抗原)检测项目在社区和基层医院的应用。另外，目前市面上很多tpsa(fpsa)检测试纸条，缺少可以准确、快速定量，并且操作简便适合床旁检测的方法。
4.免疫层析技术是用于检测血清蛋白的一种结合免疫技术和谱层析技术的快速检测分析方法，可实现床旁即时快速检验。免疫层析检测包括样品前处理过程及层析过程，将样品进行前处理，通过多种手段将目标物转换成测试液(包括样品液和层析液)，然后利用免疫层析检测装置前端的样品垫吸收液体，导流至层析膜上，进行免疫识别。免疫层析技术利用胶体金、胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料、量子点等作为着的标记物，根据毛细管原理，在层析时，标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显于硝酸纤维素膜上的检测线，以纤维膜上显条带的有无、颜深浅和反射光线来定性或定量。目前荧光免疫层析标记物主要包括胶体金和乳胶等。但在实际应用中，这些荧光免疫层析标记物都存在不同缺陷。例如胶体金和乳胶标记物依靠大量金颗粒聚集达到肉眼可见的效果，使得产品灵敏度低、准确性不够，无法完全满足市场对免疫标记产品的需求；同时存在重复性不高且无法定量的问题，制作方法也比较复杂。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，以至少解决上述技术问题之一。
6.本发明实施例提供一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，包括样品垫、结合垫、包被检测抗体的检测线t线和包被检测抗体的质控线c线；结合垫上喷涂有探针溶液和荧光微球捕获抗体复合物，探针溶液包括psa抗体微球偶联物和兔igg抗体微球偶联物，检测抗体和捕获抗体能够与psa抗原蛋白相结合。
7.优选地，样品垫上布置有用于分离红血球的过滤器。
8.优选地，包被检测抗体的检测线(t线)、包被检测抗体的质控线(c线)由检测抗体制备得到。t线包被psa igg检测抗体，c线包被羊抗兔igg检测抗体。
9.psa抗原蛋白的氨基酸序列为(可以在ncbi上查询uniprot:p07288)：
10.trp gly ser ile glu pro glu glu phe leu thr leu pro lys lys leu(wgsie peefl tlpkkl)
11.检测线和质控线包被检测抗体浓度为0.5-1mg/ml；喷涂面积为1-5μl/cm。
12.检测抗体根据抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和igg抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。当采用鼠源单克隆抗体时，检测抗体与抗原的结合效率较佳，检测的灵敏度较佳。
13.优选地，样品垫上的过滤器上的网孔孔径优选为6-8μm。
14.优选地，荧光微球捕获抗体复合物包括荧光微球和捕获抗体。
15.采用内部染料包埋方法制备荧光微球，得到的荧光微球发光更加稳定。
16.荧光微球内包裹的染料为荧光素、量子点、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白或上转换纳米粒子。采用荧光素为染料的荧光微球的荧光强度强，能与背景信号分开，有利于在最终结果分析时的信号采集，能显著提高检测的精密度。
17.上转换纳米颗粒(ucnp)含有无机晶体基质的晶格中有镧系元素、过渡金属或锕系元素掺杂离子，能够在受到低能量的光激发的情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光。
18.荧光微球的微球材质可选为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯，优选为聚苯乙烯。二氧化硅本身不易溶胀，无法将染料(荧光素)包裹在其内，荧光强度不稳定。聚丙烯酰胺偶联抗体后，其灵敏度能达到0.091ng/ml，但较聚苯乙烯偶联抗体后的灵敏度低。
19.荧光微球粒径为150-300nm。荧光微球表面修饰官能团羧基、氨基或甲苯磺酰基中的一种或多种，优选荧光微球修饰有羧基，羧基浓度为60μmol/g。
20.捕获抗体根据抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和igg抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体中的一种或多种。优选采用鼠源单克隆抗体时，抗体与抗原的特异性较佳。
21.捕获抗体浓度优选为0.05-0.3mg/ml。
22.荧光微球与抗体偶联用的活化剂，优选微球表面的修饰基团为羧基时，活化剂可以为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、sulfo-nhs、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)等中的一种或多种。
23.优选地，探针溶液的喷涂面积为4-8μl/cm。探针溶液由psa抗体微球偶联物和兔igg抗体微球偶联物制备得到。探针溶液＝兔igg抗体荧光微球偶联物:psa抗体荧光微球偶联物:探针稀释液＝1:3:20。
24.捕获抗体与荧光微球偶联用到活化偶联缓冲液，活化偶联缓冲液采用tris缓冲液、磷酸缓冲液、mes缓冲液、mopes缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种，浓度在10-200mm之间。当采用mes缓冲液时，捕获抗体与荧光微球偶联效率较优，mes缓冲液浓度与荧光微球的状态有关，当mes缓冲液浓度过高时，会出现荧光微球活化过度，引起荧光微球团聚问题，当mes缓冲液浓度过低时，会出现荧光微球活化不充分，造成捕获抗体与荧光微球偶联效率低的问题。当mes缓冲液浓度范围内时，荧光微球的状态较佳。
25.本发明技术方案的原理和有益效果在于：
26.(1)本发明通过控制荧光微球的种类和粒径，得到采用荧光素为染料的200nm绿
荧光微球。
27.荧光强度与所用染料的性质有关，绿荧光微球的荧光强度高(能够达到2473)，荧光半衰期长，试剂的稳定性强。
28.200nm绿荧光微球的流动速度快。流动性主要和荧光微球的粒径大小有关，粒径越小，荧光微球释放越完全，越有利于充分反应，粒径越大，检测的灵敏度越高，当采用200nm的绿荧光微球时能够同时兼顾反应的充分性和检测的灵敏度。
29.在荧光微球上修饰羧基能够实现与捕获抗体的结合，微球上的羧基经活化后能与抗体上的氨基结合，形成微球抗体复合物。在绿荧光微球上编码羧基，有助于进一步增强信号，进一步提高灵敏度。
30.本发明通过控制探针溶液的喷涂面积，当探针溶液的喷涂面积处于4-8μl/cm范围内时，检测准确度较佳。探针溶液的喷涂面积与抗原抗体结合有关，当探针溶液的喷涂面积过高时，会出现假阴性问题，当探针溶液的喷涂面积过低时，会出现假阳性问题。
31.本发明通过控制检测线和质控线包被检测抗体的浓度，发现当检测抗体的浓度处于0.5-1mg/ml范围内时，检测灵敏度较佳。检测抗体浓度与检测灵敏度有关，当检测抗体的浓度过高时，会出现检测抗体与捕获抗体非特异性结合的问题，当检测抗体的浓度过低时，会出现检测灵敏度低的问题。
32.本发明通过控制检测线和质控线喷涂面积，发现当检测线和质控线喷涂面积处于1-5μl/cm范围内时，检测灵敏度较佳。检测线和质控线喷涂面积与检测的灵敏度有关，当检测线和质控线喷涂面积过高时，会出现假阳性的问题，当检测线和质控线喷涂面积过低时，会出现检测灵敏度降低的问题。
33.本发明通过控制结合垫喷涂面积，发现当结合垫喷涂面积处于4-8μl/cm范围内时，重复性较佳。结合垫喷涂面积与检测的重复性有关，当结合垫喷涂面积过高时，会出现重复性差的问题，当结合垫喷涂面积过低时，会出现显不均匀和重复性差的问题。
34.本发明通过控制过滤器的网孔孔径，发现当过滤器的孔径处于6-8μm范围内时，检测结果较佳。过滤器的孔径与样本的流动速度有关，当过滤器的孔径过大时，会出现流动速度快使得样本与检测抗体不能充分接触，造成假阴性的问题，当过滤器的孔径过小时，会出现样本的流动速度降低，会过滤掉样本中的有效物质，造成精确度降低的问题。
35.本发明通过控制荧光微球的粒径，发现当微球粒径处于150-300nm之间时，流动速度和灵敏度较佳。荧光微球的粒径与流动速度和检测灵敏度有关，当微球粒径过大时，会出现流动速度减低，检测的灵敏度降低，当微球粒径过小时，会出现流动速度提高，使得抗原抗体无法充分结合形成双抗体夹心结构。
36.基于上述发明内容，本发明得到的试剂条适合单个标本测定，检测快速，灵敏度高，重复性佳，准确度高的试纸条，便于实现前列腺癌的分级诊断和早期筛查，便于床旁即时快速检验，便于在基层医院普及，且没有放射性污染，具有广泛的应用前景。
37.(2)本发明提供的试纸条具有低检测限(最低检测限为0.08ng/ml)、灵敏度高、线性范围宽(0-200ng/ml)、价格低廉等优点，无需先对病人进行直肠检查和穿刺，能减少对病人的伤害，可以实现普筛，只需要加入血液样本，即可获得检测结果，检测快，用户使用友好。
38.灵敏度更高：荧光定量免疫层析产品以功能化纳米微球荧光微球技术，结合荧光
标记物探针，仪器直接检测激发荧光信号而非传统金标定量所采用的ccd表层光密度扫描技术。检测信号具有更高的信噪比、更高的信号检测量和检测灵敏度。
39.检测范围更宽：与传统光度百分率分析及光密度扫描分析技术不同，荧光免疫层析技术采用荧光直接激发发光检测手段，荧光信号强度与荧光微球数量呈直线相关。同时避免了酶催化发光技术存在的催化效率及底物量限制等问题，定量范围与反应体系内参与反应的特异性蛋白量直接相关。根据目前已经在临床应用的全自动化学发光检测技术相比，现有荧光免疫层析技术灵敏度可达到0.05pg，线性范围可达到200-1000倍，产品变异系数(cv/％)低于10％，性能指标远高于其它快速检测技术，接近全自动化学发光检测技术水平。
40.价格更加低廉：与传统定量检测技术相比，荧光免疫层析技术具有快速，无需较大的仪器设备，无需专业的人员操作，结果简单易懂，价格低廉等优点。
附图说明
41.图1为实施例1中得到的标准曲线，横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度；
42.图2为免疫层析技术试纸条的示意图。
具体实施方式
43.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
44.以下实施例所用到的主要试剂来源如下：
45.荧光微球购买自江苏为度生物技术有限公司，货号为fg0100ca、fg0200ca；
46.捕获抗体购买自上海优宁维生物科技股份有限公司，货号为a45180；
47.1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号为pg82079；
48.n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号为56485；
49.2-(n-啉)乙磺酸(mes)购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号为m367；
50.三羟甲基氨基甲烷购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a600194；
51.蔗糖购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a100335；
52.牛血清白蛋白购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号为12003c；
53.proclin300购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号为48912u；
54.十二水合磷酸氢二钠购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a607793；
55.二水合磷酸二氢钠购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为a61087；
56.封闭液购买自北京博尔迈生物技术有限公司，货号为ce510。
57.实施例1：一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条(荧光微球粒径为200nm，微球终浓度为0.1mg/ml)
58.1、制备方法：
59.s1、制备荧光微球捕获抗体复合物
60.(1)清洗活化
61.检查荧光微球是否有聚集，超声波两分钟，用移液吸取100μl 200nm绿的荧光微球，加入至1.5ml离心管中，加入500μl清洗液吹打混匀，低温17500r/min离心10min后除去上清。
62.用活化偶联缓冲液分别配制10mg/ml edc溶液和soufl-nhs溶液。取100μl活化好的荧光微球，吹打混匀，超声2min，加入10mg/ml edc溶液和soufl-nhs溶液，置于混匀仪中，室温孵育30min，然后17500r/min离心10min，除去上清，加入活化偶联缓冲液重悬，离心清洗一次。
63.活化偶联缓冲液：称取2-(n-啉)乙磺酸(mes)9.762g，放入洁净烧杯中，加depc水800ml，搅拌至充分溶解，调节ph值至6.0，搅拌至充分溶解，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用depc水定容至1000ml。混匀倒入试剂瓶中，4℃保存。
64.(2)偶联
65.在活化后的荧光微球中，加入0.1mg/ml的psa捕获抗体，吹打混匀后置于混匀仪中，室温偶联2h。17500r/min离心10min，除去上清，加入清洗液重悬，离心清洗三次。
66.(3)封闭保存
67.将封闭液加入到已经偶联好的荧光微球中，置于混匀仪中，室温孵育2h。17500r/min离心10min，除去上清，加入清洗液重悬，离心清洗三次。加入微球保存液，置于4℃保存。
68.微球保存液：称取9g的nacl(氯化钠)和2g的fbs(胎牛血清)于烧杯中，加入50mm pbs(ph 7.4)搅拌至溶解，倒入容量瓶中定容至1l。置于4℃保存。
69.s2、制备样品垫
70.现有的免疫层析检测装置包括底板，在底板上依次搭接有样品垫、反应膜和吸收垫。
71.在现有免疫层析检测装置基础上，本实施例在样品垫上布置有过滤器，过滤器上的网孔孔径为6μm。
72.在样本为全血的情况下，过滤器能够把红血球分离出来，仅让血浆和血清通过检测条，防止杂质影响实验结果。具体地：
73.过滤器的材料采用聚对苯二甲酸丁二醇酯非织造布(pbtnw，南京金邦医用材料有限公司)进行涂层改性，经改性处理后能提高材料的亲水性和生物相容性。经壳聚糖(cs，上海蓝季科技发展有限公司)改性后的膜材料与单体结合稳定，改性后膜材料具有良好的抗凝血性能，具有良好的血液相容性以及生物安全性。
74.壳聚糖(cs)溶液制备：取一定量壳聚糖溶入体积分数为2％醋酸溶液中制备成质量分数为3％的壳聚糖溶液。
75.(1)将聚对苯二甲酸丁二酯(pbtnw)切片溶解于体积比1∶1的硝酸铈铵(can，国药集团化学试剂有限公司)和烷基糖苷(apg，金陵石化公司)。称取2.0gpbtnw切片溶解于5ml can和5ml apg的混合液中，制备成质量体积百分数为20％的纺丝液。切片加入至纺丝液后，采用磁力搅拌机进行搅拌，搅拌过程中溶液采用封口膜密封，搅拌12h。
76.(2)将纺丝液放入容量为10ml的注射器内，纺丝针头到接收装置的距离为13cm；纺丝液的挤出速度为0.8ml/h，注射针头上加电压为20kv的高压。采用105g/m2的pbtnw熔喷非织造材料为接收材料，纺丝时间为1h。
77.(3)静电纺丝后，将pbtnw静电纺熔喷复合材至于真空干燥箱，干燥时间24h。
78.熔喷部分纤维平均直径3.89μm，静电纺部分纤维平均直径2.11μm，复合材料平均孔径6μm。
79.s3、制备结合垫
80.(1)处理结合垫
81.①
将玻璃纤维平铺到水平槽内，倒入足量结合垫处理液，使其完全浸入；
82.②
浸泡至少15min，保证玻璃纤维完全浸透，玻璃纤维表面无气泡；
83.③
玻璃纤维浸透后，将玻璃纤维取出，45℃恒温干燥6h；干燥后4℃保存备用。
84.结合垫处理液：称取十二水合磷酸氢二钠17.19g、二水合磷酸二氢钠1.87g，加depc水800ml，搅拌至充分溶解，并调节ph值至7.4，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用depc水定容至1000ml，混匀倒入试剂瓶中，4℃保存。
85.(2)制备结合垫
86.①
处理后的结合垫裁剪成29mm宽度；
87.②
按照兔igg抗体荧光微球偶联物:psa抗体荧光微球偶联物:探针稀释液＝1:3:20的体积比配制探针溶液；参照s1方法制备兔igg抗体荧光微球偶联物和psa抗体荧光微球偶联物，然后按照体积1：3混合。
88.③
按4μl/cm喷量，将配置好的探针溶液均匀喷到已裁切的结合垫上，45℃恒温干燥、湿度小于30％的环境下干燥6h；干燥结束后4℃封存备用。
89.探针稀释液：称取三羟甲基氨基甲烷2.4228g，放入洁净烧杯中，加depc水800ml，搅拌至充分溶解，并调节ph值至8.4，在依次加入蔗糖150g、牛血清白蛋白5g、proclin300 0.3ml，搅拌至充分溶解，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用depc水定容至1000ml。混匀倒入试剂瓶中，4℃保存。
90.s4、在反应膜上制备检测线(t线)和质控线(c线)
91.(1)包被psa igg检测抗体的检测线(t线)
92.用微球保存液稀释psa igg检测抗体1mg/ml，选择使用独立质控抗体一同喷涂在反应膜上，喷涂面积为2μl/cm，在结合垫上喷涂s1得到的荧光微球捕获抗体复合物，37℃烘干4h。独立质控抗体购买北京博奥森生物技术有限公司，货号为bsm-33179m。荧光微球捕获抗体复合物主要是用来识别抗原，喷涂在结合垫上。
93.psa igg检测抗体购买自上海优宁维生物科技股份有限公司，货号为a45190。
94.(2)包被羊抗兔igg检测抗体的质控线(c线)
95.用微球保存液稀释羊抗兔igg检测抗体至储存浓度1.5mg/ml，羊抗兔igg检测抗体的最终工作浓度为1mg/ml，喷涂面积为2μl/cm，划线后37℃过夜烘干。
96.羊抗兔igg检测抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，货号bs0295g。
97.s5、制备吸收垫
98.吸收垫主要采用吸水性好的滤纸，吸收多余的液体。
99.s6、制备底板
100.将底板制作成宽3mm，长6cm的长方板，方便进行组板。
101.s7、组板
102.在底板上粘接反应膜，然后在靠近反应膜上的c线一端连接吸收垫，在靠近反应膜t线一端连接结合垫，结合垫上面连接样品垫。具体粘接、连接方式可以采用双面胶。
103.s8、包装
104.将剪切好的试纸条压入检测卡壳内。
105.2、检测步骤：
106.将采集到的患者的全血样本采用加入稀释缓冲液稀释后，加入到样品垫中，将试剂条插入到干式荧光免疫分析仪(fs-205)，3min后就可以出结果。血液样本与稀释缓冲液的比例为1:2-1:8。稀释缓冲液用于稀释血液样本。
107.稀释缓冲液：称取1g的bsa(牛血清白蛋白)和100g蔗糖于烧杯中，加入20mm pbs(ph 7.4)搅拌置溶解，再加入0.1％的吐温-20(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号为93773)，搅拌混匀，倒入容量瓶中定容至1l。置于4℃保存。
108.实施例2-19
109.实施例2-19与实施例1的区别主要如下表1所示；测试实施例1-19的灵敏度(检测下限)和cv/％值，结果见表1。实施例1拟合的校准曲线见图1。
110.表1：实施例1-19区别
[0111][0112][0113]
注：cv/％值主要反应数据的离散程度，越小越佳，3％以下最佳。
[0114]
实施例1-19中，实施例1制备试剂盒的灵敏度最佳，且数据离散程度最小。
[0115]
采用pbs配制多个浓度的参考品(曲线应至少覆盖6个浓度值)，每个样本均重复测试3次，求得荧光强度均值。以各参考品浓度值为横坐标，以荧光强度均值作为纵坐标，绘制标准曲线，拟合线性方程。对初始曲线的线性进行微调，剔除偏离曲线较远的高值或低值，直到出现最宽的线性范围和最大的r2值。
[0116]
表2：7个浓度参考品荧光强度检测结果
[0117][0118][0119]
图1为实施例1拟合的校准曲线，可以根据图的标准曲线查出待测物质的含量，校准曲线是指一系列已知含量(浓度/量)的物质与仪器响应/信号之间的关系。r2越接近1，相关性越佳。
[0120]
实施例1的性能评估
[0121]
1、灵敏度试验
[0122]
采用25％的胎牛血清作为空白样品，将空白样品滴加在试纸条上检测，重复测定20次，计算其t/c的平均值(x)和标准差(sd)将t/c的均值减二倍标准差x-2sd作为bx代入计量-反应曲线求出相对应的浓度值，即为该试纸条的灵敏度。根据表3计算得到实施例1的得出最低检测限为0.08ng/ml。
[0123]
表3：空白标准品psa荧光强度值
[0124]
12345678910205.09205.09185.04190.42210.65205.49221.11219.09228.89255.76213.42205.09196.03189.37226.84235.09235.89225.09219.78206.16
[0125]
2、精密度/重复性试验
[0126]
采用弱阳性(psa 3.91ng/ml)、阳性(psa 15.62ng/ml)和强阳性(psa 62.5ng/ml)3种不同浓度的血清，用实施例1制备的试纸条进行分析内/检验，重复检测30次，计算各浓度检测样本ft/fc平均值(x)、标准差及cv值(cv＝标准差/均数
×
100％)。由表4和表5可知批内变异系数小于5％，批间变异系数小于10％，重复性佳。
[0127]
表4：批内精密性结果
[0128][0129]
表5：批间精密性结果
[0130][0131]
3、特异性试验
[0132]
用已知浓度的阴性血清(tpsa:0.96ng/ml、fpsa：0.23ng/ml)，分为6组，分别加入甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、糖类抗原125(ca125)，制成含有500ng/ml afp、500ng/ml cea、200u/ml ca125的混合血清，并以无任何添加的血清作为对照组。
[0133]
另取一份已知浓度的阳性血清(tpsa:26ng/ml、fpsa:8.23ng/m l)，分为6份，分别加入afp、cea、ca125抗原，制成含有500ng/ml afp、500ng/ml cea、200u/ml ca125的混合血清，并以无任何添加的血清作为对照组。用两组血清点样后用荧光定量仪检测，重复检测6次，求得平均值，比较各荧光强度值。由表6可知试纸条无交叉反应，特异性良好。
[0134]
表6：psa荧光强度值
[0135]
组别阴性血清阳性血清对照样本758.81
±
15.851836.87
±
17.81添加样本1(afp)755.87
±
23.131829.49
±
29.63添加样本2(cea)753.49
±
23.231845.06
±
25.46添加样本3(ca125)759.6
±
16.691847.16
±
28.13p0.9130.865
[0136]
4、稳定性试验(包括对标记物保存的稳定性)
[0137]
将实施例1制备的若干个试纸条随机分装在铝箔袋中，密封牢固，并将其分为两组，一组存放在4℃环境下，另一组存放在37℃环境下。存放在4℃环境的试纸条于保存第7天、14天、30天、60天、90天、180天抽样，考察试纸条的特异性、精密性。储存于37℃的试纸条在1、2、4、7、9、12、16天抽样检测试纸条的特异性、精密性。在4℃下储存180天，其精密度均小于5％，37℃下精密度小于10％，试纸条在4℃下可稳定保存6个月，在37℃下能稳定保存两周。
[0138]
表7：4℃稳定性检测结果
[0139]
时间交叉反应精密性7无4.7515无4.6530无4.8960无4.0190无4.21180无4.92
[0140]
表8：37℃稳定性检测结果
[0141]
时间交叉反应精密性1无4.562无4.24
4无4.817无5.649无6.1412无8.9416无9.51
[0142]
5、粒径大小对流速的影响
[0143]
采用不同粒径的荧光微球抗体复合物，喷涂在结合垫上，其他条件与实例1相同，每个粒径制备6个试纸条，向样品孔中加入样本，用计时器进行计时，统计液体流动到检测线的时间，并检测其灵敏度和cv％值。
[0144]
表9：粒径大小对流速的影响
[0145]
微球粒径(nm)150200250300流速(s)10123040灵敏度(ng/ml)1.080.080.0810.095cv/％6243
[0146]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的本发明，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：

1.一种基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合垫、包被检测抗体的检测线t线和包被检测抗体的质控线c线；结合垫上喷涂有探针溶液和荧光微球捕获抗体复合物，探针溶液包括psa抗体微球偶联物和兔igg抗体微球偶联物，检测抗体和捕获抗体能够与psa抗原蛋白相结合。2.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，t线包被psa igg检测抗体，c线包被羊抗兔igg检测抗体。3.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，荧光微球捕获抗体复合物包括荧光微球和捕获抗体，荧光微球内包裹的染料为荧光素、量子点、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白或上转换纳米粒子。4.根据权利要求3所述的基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，荧光微球粒径为150-300nm。5.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，探针溶液的喷涂面积为4-8μl/cm。6.根据权利要求1所述的基于荧光免疫层析技术定量检测psa的试纸条，其特征在于，捕获抗体与荧光微球偶联用到活化偶联缓冲液，活化偶联缓冲液采用tris缓冲液、磷酸缓冲液、mes缓冲液、mopes缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种，浓度在10-200mm之间。

技术总结

本发明属于癌症检测技术领域，具体公开了一种基于荧光免疫层析技术定量检测PSA的试纸条，包括样品垫、结合垫、包被检测抗体的检测线T线和包被检测抗体的质控线C线；结合垫上喷涂有探针溶液和荧光微球捕获抗体复合物，探针溶液包括PSA抗体微球偶联物和兔IgG抗体微球偶联物，检测抗体和捕获抗体能够与PSA抗原蛋白相结合。本发明提供的试纸条适合单个标本测定，检测快速，灵敏度高，重复性佳，准确度高，便于床旁即时快速检验，没有放射性污染、标记物保存时间长等优点，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。