一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法

1.本发明涉及食品制备技术、保健食品技术领域，尤其涉及一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法。

背景技术：

2.草菇又名兰花菇，中国菇，隶属于担子菌门、蘑菇亚纲、蘑菇目、光柄菇科、小苞脚菇属。草菇多成长在高温、潮湿的地区，如广东、福建等地，是一种重要的热带亚热带菇类，世界上第三大栽培食用菌。草菇气味清香、味道鲜美、营养丰富，含多糖、凝集素、蛋白、氨基酸、三萜类化合物、甾醇等多种功能成分，因此草菇也被誉为“素中之荤”。据研究，每100g鲜菇含207.7mg维生素c，2.6g糖分，2.68g粗蛋白，2.24g脂肪，0.91g灰分。草菇蛋白质含18种氨基酸，其中必需氨基酸占40.47-44.47％。此外，还含有磷、钾、钙等多种矿质元素。草菇，不仅具有丰富的食用价值，也具有很好的药用价值，是一种优质的食用菌。
3.生物活性肽是一种介于蛋白质和氨基酸之间的有机化合物，较蛋白质而言，多肽易吸收，具有较强生物活性，如降血压、降血脂、抑菌、抗氧化、抑制肿瘤、免疫调节等生物活性，且安全性极高，具有十分广阔的应用前景。然而，人体内天然抗氧化肽含量很小，远不足以抵消自由基对人体细胞的损伤。因此，为了延缓人体衰老与降低人体疾病概率，人工合成或人工提取抗氧化肽成为一种必然。中国食用菌蛋白质资源极其丰富，因此食用菌活性肽的研究成为一大热点。但目前国内外对草菇的研究多集中在其栽培方面，仅有少量文献对其所含的多糖、凝集素、三萜类及黄酮以及蛋白进行药理活性研究。
4.根据世界卫生组织的数据，全世界约有23亿人饮酒，其中约有2.37亿男性和4600万女性遭受饮酒饮酒导致的疾病的困扰。而酒精性肝病作为主要疾病之一，其主要是长期大量饮酒引起的，通常为脂肪变性，然后形成酒精性肝炎、肝硬化和肝纤维化，在严重的情况下，它会引起肝细胞坏死甚至衰竭。随着生活水平的提高，各国的人均饮酒量也在增加，酒精引起肝损伤的患者人数也在增加。当前，酒精对肝脏的损伤是全球范围内严重的公共卫生问题之一；因此寻天然健康，效果好的保肝药物、食品或其他产品已成为迫在眉睫的探索课题。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种服用或食用便利、具有保健功能且具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，该草菇多肽在抗氧化及保肝产品制备中应用能够发挥草菇多肽的生理活性。
6.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
7.一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其包括采用碱提酸沉法在草菇中提取草菇蛋白，然后利用碱性蛋白酶酶解草菇蛋白获得草菇多肽，继而将得到的草菇多肽通过超滤法进行透析和进一步纯化处理后，完成草菇多肽的制备。
8.作为一种可能的实施方式，本方案具体包括如下步骤
9.(1)将草菇干品进行干燥处理后，磨成粉，制得草菇粉，然后将草菇粉溶于蒸馏水中制成草菇溶液，经超声破碎处理后，用预设浓度的naoh溶液将草菇溶液的ph调至预设值，继而浸提处理预设时长后，再离心处理并取上清液，然后用预设浓度的hcl将上清液ph调制等电点，继而静沉处理，待沉淀析出后，再次离心处理，获得草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉；
10.(2)将草菇蛋白粉与蒸馏水按预设比例混合且加热溶解处理，再用预设浓度的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至预设值后，加入碱性蛋白酶酶解处理，继而在高温下灭活处理，再经离心处理后，取上清液，继而用预设浓度的hcl将上清液ph调至中性后，对产物冷冻干燥制得草菇多肽粉；
11.(3)设置过膜压力，料液温度和ph，在回流液流速为预设值时，通过超滤法透析分离出不同组分的体外抗氧化活性，然后将活性最高的组分冻干，制得草菇多肽冻干粉；
12.(4)采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化；将经步骤(3)处理所得的草菇多肽冻干粉用超纯水配置成预设浓度的溶液，然后将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止；其中，制备的溶液通过微滤膜过滤后，加入平衡后的层析柱中，再通过超纯水在预设流速下洗脱，并于预设检测波长下检测后，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力，以实现进一步纯化处理，完成草菇多肽的制备。
13.作为一种较优的实施选择，优选的，本方案步骤(1)包括：
14.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉，制得草菇粉，再将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，再浸提处理1h，以6000r/min速率离心15min，继而取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，然后静沉处理1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将草菇蛋白质沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
15.作为一种较优的实施选择，优选的，本方案步骤(2)包括：
16.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解处理50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，继而在95℃的高温下灭活20min，再以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
17.由于蛋白质经酶解以后形成大小不同的多肽，要继续深入研究多肽的功能性质，就需要获得高纯度的样品，因此必须对蛋白酶解产物进行进一步的分离纯化。探索建立一套高效简单的草菇多肽分离纯化方法，并对分离纯化的多肽组分进行活性跟踪测定，筛选得到分子量均一，纯度较高的组分是有积极意义的。
18.作为一种较优的实施选择，优选的，本方案步骤(3)包括：
19.设置过膜压力为1.5～6bar，料液温度为15～45℃，ph为5.0～9.0，在回流液流速为4～8lmh时，通过超滤法透析分离出不同组分的体外抗氧化活性，将活性最高的组分冻干，制得草菇多肽冻干粉。
20.作为一种举例，所述纯化的方法可以包括如下步骤：
21.使用装有截留分子量为10k da、3k da、1k da超滤膜的amicon ultra-15离心超滤
管对草菇蛋白酶解液进行分离，然后分别收集四个组分：分子量小于10k da的组分、分子量在3k da～10k da范围内的组分、分子量在1k da～3k da范围内的组分以及分子量小于1k da的组分，将所得的各个组分冷冻干燥，以备后续使用。
22.步骤(4)中，将上述步骤分出的四个组分采用sephadex g-25凝胶层析谱进行分离纯化，以期得到分子量成分组成较为单一的草菇多肽。
23.作为一种较优的实施选择，优选的，本方案步骤(4)包括：
24.采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化，将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止；其中，制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中；再通过超纯水洗脱，其流速为1ml/min，最后置于波长254nm下检测，再分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力，实现进一步纯化处理，完成草菇多肽的制备。
25.作为一种较优的实施参数选择，优选的，本方案步骤(3)中，设置过膜压力为1.5bar，料液温度为25℃。
26.作为一种较优的实施参数选择，优选的，步骤(3)中，设置ph为7.0，回流液流速为6lmh。
27.基于上述，本发明还提出一种草菇多肽，其由上述所述的制备方法制得。
28.基于上述，本发明还提出上述所述制备方法制得的草菇多肽在抗氧化及保肝产品制备中的应用。
29.采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案巧妙性采用碱性蛋白酶酶解草菇蛋白溶液，该方案所制得的草菇多肽得率高，并且两次对草菇多肽进行分离纯化，通过探索建立一套高效简单的草菇多肽分离纯化方法，并对分离纯化的多肽组分进行活性跟踪测定，筛选得到分子量均一，纯度较高的组分。通过动物试验可得出草菇多肽对酒精性肝损伤具有良好的抑制效果；除此之外，本发明方案的产品及其制备方法的优点还包括：制作工艺简单、成本低廉、易于推广、易于携带、食用方便和可大规模生产。
具体实施方式
30.下面结合实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
33.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
34.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
35.设置超滤回流液流速为6lmh，料液温度为30℃，ph为7.0，探究压力为3bar时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
36.实施例2
37.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
38.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
39.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
40.设置超滤回流液流速为6lmh，料液温度为30℃，ph为7.0，探究压力为4bar时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
41.实施例3
42.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
43.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
44.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，
g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
56.实施例6
57.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
58.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
59.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
60.设置过膜压力为1.5bar，料液温度为30℃，ph为7.0，探究回流液流速为5lmh时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
61.实施例7
62.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
63.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
64.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
65.设置过膜压力为1.5bar，料液温度为30℃，ph为7.0，探究回流液流速为6lmh时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。
超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
66.实施例8
67.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
68.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
69.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
70.设置过膜压力为1.5bar，料液温度为30℃，ph为7.0，探究回流液流速为7lmh时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
71.实施例9
72.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
73.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
74.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
75.设置过膜压力为1.5bar，料液温度为30℃，ph为7.0，探究回流液流速为8lmh时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
76.实施例10
77.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
78.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
79.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
80.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液ph为7.0，探究料液温度为15℃时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
81.实施例11
82.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
83.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
84.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
85.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液ph为7.0，探究料液温度为25℃时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
86.实施例12
87.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
88.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以
6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
89.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
90.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液ph为7.0，探究料液温度为35℃时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
91.实施例13
92.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
93.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
94.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
95.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液ph为7.0，探究料液温度为45℃时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
96.实施例14
97.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
98.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
99.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
100.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液温度为25℃时，探究料液ph 5为时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
101.实施例15
102.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
103.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
104.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
105.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液温度为25℃时，探究料液ph 6为时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
106.实施例16
107.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
108.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
109.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，
冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
110.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液温度为25℃时，探究料液ph 8为时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
111.实施例17
112.本实施例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
113.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
114.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
115.设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液温度为25℃时，探究料液ph 9为时，超滤法分离出四种不同组分的体外抗氧化活性。将活性最高的组分冻干备用。采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1ml/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
116.对比例1
117.本对比例一种具有抗氧化活性的草菇多肽的纯化方法，其包括：
118.将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉。将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，静沉1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。
119.将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，在95℃的高温下灭活20min，以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。
120.采用sephadex g-25凝胶层析谱进行分离纯化。将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口
处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止。制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中。超纯水洗脱，流速1m l/min，于波长254nm下检测，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力。
121.对比测试
122.将实施例1-17以及对比例1所得到的草菇多肽进行体外抗氧化，得到的dpph清除率如表1所示。
123.其中，dpph自由基清除率/％＝
×
100％
124.a
x
──
添加样品的反应体系的吸光值；
125.a
x0
──
无水乙醇代替dpph的反应体系的吸光值；
126.a0──
无水乙醇代替样品的反应体系的吸光值。
127.表1.各实施例dpph清除率对比表
128.项目dpph清除率(％)实施例158.62％实施例278.36％实施例388.36％实施例487.57％实施例570.42％实施例690.68％实施例765.01％实施例893.95％实施例995.50％实施例1080.65％实施例1198.33％实施例1270.63％实施例1359.66％实施例1469.84％实施例1579.43％实施例1689.88％实施例1794.64％对比例150.09％
129.根据实施例1-17与对比例1体外抗氧化活性结果对比可知，实施例11抗氧化活性最好。本技术实施例11采用超滤法以及sephadex g-25凝胶层析谱进行分离纯化，设置过膜压力为1.5bar，回流液流速为6lmh，料液温度为25℃，料液ph为7.0，最终得到的dpph自由基清除能力为98.33％。
130.应用实施例
131.本发明为了说明草菇多肽在预防酒精性肝损伤方面具有的积极效果，下面通过动物实验数据加以进一步的说明。
132.实验动物：icr级雄性小鼠，体重均在18～20g之间，由吴氏小鼠动物上有限责任公司提供。小鼠被安置在独立通风式正负压动物笼具中饲养，保持控制温度(23
±
2℃)和湿度
(50
±
15％)，并保持12小时光/黑暗循环。饲养期间可自由获取食物和水，使小鼠适应实验环境。
133.药物管理：实施例11中制备草菇多肽以及联苯双酯滴丸。
134.动物给药：小鼠按体重随机分为6组，分别为：空白组、模型组、阳性对照组、多肽低剂量组、多肽中剂量组和多肽高剂量组。空白组和模型组灌胃10ml/kg的生理盐水，阳性对照组灌胃200mg/kg bw的联苯双酯滴丸溶液，草菇多肽低中高剂量组分别灌胃100mg/kg bw、200mg/kg bw、400mg/kg bw的草菇多肽。
135.试验方法：在给药时间内连续灌胃4周。最后一次给药后5h，除了空白对照组外，其他各组均以12ml/kg的剂量一次灌胃56
°
红星二锅头，建立小鼠急性酒精性肝损伤模型。建模时间为12h，期间断食不断水，眼球取血，颈椎脱臼处死后解剖，取肝脏置于液氮内，检测相关指标。
136.肝脏是脂类和胆固醇代谢的主要脏器，摄入大量酒精后伴有脂类和胆固醇代谢的异常，这也是酒精性肝损伤的早期表现。肝功能过氧化指标检测：超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、乙醛脱氢酶(adh)。
137.sod作为体内重要的抗氧化酶，能清除过氧化产生的自由基，因此机体内sod含量变化可间接反映体内自由基的动态变化和物质代谢情况；mda是体内脂质过氧化代谢产物之一，其含量可反映出机体脂质过氧化的程度，间接表明了细胞的损伤程度；adh大量存在于人和动物肝脏中作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，是在肝脏中代谢酒精的一条主要途径。检测结果如表2所示。
138.表2肝功能过氧化指标检测
139.组别sod活力mda含量adh活力空白组120.77
±
3.2219.47
±
2.3843.34
±
3.93模型组71.89
±
15.39
**
58.23
±
4.89
**
23.31
±
2.49
**
阳性对照组88.43
±
13.47
**##
28.37
±
5.29
**##
38.32
±
1.27
**##
多肽低剂量组97.10
±
23.89
**##
29.89
±
1.36
**##
35.64
±
2.94
**##
多肽中剂量组119.27
±
43.26
**##
25.34
±
2.53
**##
41.58
±
4.27
**##
多肽高剂量组103.78
±
23.47
**##
27.21
±
3.34
**##
36.37
±
1.83
**##
140.注：与空白组相比，*：p《0.05，**：p《0.01；与模型组相比，#：p《0.05，##：p《0.01从表2可知，与空白组相比，模型组小鼠肝脏中sod活力和adh活力明显降低(p《0.01)，mda含量显著提高(p《0.01)，说明建模成功。与模型组相比，阳性对照组、多肽低剂量组、多肽中剂量组、多肽高剂量组的sod活力和adh活力显著提高(p《0.01)，mda含量明显降低，说明草菇多肽可以减轻酒精引起的肝损伤。
141.以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，其包括采用碱提酸沉法在草菇中提取草菇蛋白，然后利用碱性蛋白酶酶解草菇蛋白获得草菇多肽，继而将得到的草菇多肽通过超滤法进行透析和进一步纯化处理后，完成草菇多肽的制备。2.如权利要求1所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将草菇干品进行干燥处理后，磨成粉，制得草菇粉，然后将草菇粉溶于蒸馏水中制成草菇溶液，经超声破碎处理后，用预设浓度的naoh溶液将草菇溶液的ph调至预设值，继而浸提处理预设时长后，再离心处理并取上清液，然后用预设浓度的hcl将上清液ph调制等电点，继而静沉处理，待沉淀析出后，再次离心处理，获得草菇蛋白质沉淀，将沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉；(2)将草菇蛋白粉与蒸馏水按预设比例混合且加热溶解处理，再用预设浓度的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至预设值后，加入碱性蛋白酶酶解处理，继而在高温下灭活处理，再经离心处理后，取上清液，继而用预设浓度的hcl将上清液ph调至中性后，对产物冷冻干燥制得草菇多肽粉；(3)设置过膜压力，料液温度和ph，在回流液流速为预设值时，通过超滤法透析分离出不同组分的体外抗氧化活性，然后将活性最高的组分冻干，制得草菇多肽冻干粉；(4)采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化；将经步骤(3)处理所得的草菇多肽冻干粉用超纯水配置成预设浓度的溶液，然后将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止；其中，制备的溶液通过微滤膜过滤后，加入平衡后的层析柱中，再通过超纯水在预设流速下洗脱，并于预设检测波长下检测后，分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力，以实现进一步纯化处理，完成草菇多肽的制备。3.如权利要求2所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：将草菇干品放入干燥箱中，60℃干燥至恒重，然后磨成粉，制得草菇粉，再将磨好的草菇粉溶于蒸馏水中，经超声破碎30min后，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇溶液ph调至10.0，再浸提处理1h，以6000r/min速率离心15min，继而取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调制等电点，然后静沉处理1h，待沉淀析出后，再次以6000r/min速率离心15min，得到草菇蛋白质沉淀，将草菇蛋白质沉淀调至中性后进行冷冻干燥制得草菇蛋白粉，置于干燥皿中保存。4.如权利要求3所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：将草菇蛋白粉与蒸馏水以1：50的比例45℃加热溶解处理50min，用0.1mol/l的naoh溶液将草菇蛋白溶液ph调至11后加入7000u/g碱性蛋白酶酶解2.5h，继而在95℃的高温下灭活20min，再以6000r/min速率离心20min，取上清液，再用0.1mol/l的hcl将上清液ph调至中性，冷冻干燥制得草菇多肽粉，置于干燥皿中保存。5.如权利要求4所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括：设置过膜压力为1.5～6bar，料液温度为15～45℃，ph为5.0～9.0，在回流液流速为4～
8lmh时，通过超滤法透析分离出不同组分的体外抗氧化活性，将活性最高的组分冻干，制得草菇多肽冻干粉。6.如权利要求5所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括：采用sephadex g-25凝胶层析谱进行第二次分离纯化，将草菇多肽冻干粉用超纯水配置成浓度为50mg/ml的溶液，将葡聚糖凝胶充分溶胀后，缓慢匀速地注入层析柱中至距柱口处，使之不出现气泡，观察凝胶床的状态至光滑为止；其中，制备的溶液过0.22μm微滤膜，加入平衡后的层析柱中；再通过超纯水洗脱，其流速为1ml/min，最后置于波长254nm下检测，再分管收集，并测其不同浓度的dpph自由基清除能力，实现进一步纯化处理，完成草菇多肽的制备。7.如权利要求5所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，设置过膜压力为1.5bar，料液温度为25℃。8.如权利要求5所述的具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，设置ph为7.0，回流液流速为6lmh。9.一种草菇多肽，其特征在于，其由权利要求1至8之一所述的制备方法制得。10.根据权利要求1至8之一所述制备方法制得的草菇多肽在抗氧化及保肝产品制备中的应用。

技术总结

本发明公开了一种具有抗氧化活性和保肝功效的草菇多肽的制备方法，其包括采用碱提酸沉法在草菇中提取草菇蛋白，然后利用碱性蛋白酶酶解草菇蛋白获得草菇多肽，继而将得到的草菇多肽通过超滤法进行透析和进一步纯化处理后，完成草菇多肽的制备；本发明方法采用碱性蛋白酶酶解草菇蛋白溶液，草菇多肽得率高，并且两次对草菇多肽进行分离纯化，探索建立一套高效简单的草菇多肽分离纯化方法，并对分离纯化的多肽组分进行活性跟踪测定，筛选得到分子量均一，纯度较高的组分；通过动物试验可得出草菇多肽对酒精性肝损伤具有良好的抑制效果；本发明方案制作工艺简单、成本低廉、易于推广、易于携带、食用方便和可大规模生产。食用方便和可大规模生产。