一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法

1.本发明涉及临床医学、生物医学和医学检验技术领域，具体地说，是一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法。

背景技术：

2.肝功能衰竭疾病是一种受到多种因素(如病毒、酒精、药物等)引起肝细胞大量坏死，导致肝功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要临床表现的复杂综合征。由于缺乏有效的措施，其内科综合的短期病死率高达50-90％。目前临床上诊断肝衰竭和判断疾病转归的方法是综合各类肝衰竭的特点并结合生化指标，如检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素等判断肝功能损害程度及肝脏合并储备能力，检测凝血国际标准化比值、凝血酶原活动度等判断凝血功能。肝衰竭的预后取决于肝细胞坏死程度和再生能力之间的“较量”，如肝细胞大量再生超过坏死，则疾病逐渐恢复，反之，则病情恶化，预后较差。但由于肝衰竭诱因、病因、临床类型、病程、并发症及临床干预措施等的多样性及个体化差异，目前尚无统一的评估预后的指标。因此，寻肝衰竭疾病转归预警预测的检测标志物，可实现早期，降低肝衰竭短期高病死率具有重要的意义。
3.随着生物技术和分子医学的发展，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出疾病诊断和预后预测的技术在临床上已得到广泛应用，如检测与疾病相关的各类结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子基因等，实现对患者的早期诊断与疾病转归预警预测，提高效果。目前分子诊断主要集中在检测特异性、相对较短的dna或rna片段上，其中mrna的表达水平随着个体病理生理变化而变化，更能实时反映出患者当前的疾病状态和发生发展趋势。
4.本课题组研究发现vsig4在肝衰竭发生、发展和转归等不同阶段过程中发挥着重要作用，参与肝衰竭疾病进展及转归的核心功能，如与免疫、凋亡和代谢等多个生物学途径密切相关。并发现，vsig4在肝衰竭短期转归不良(死亡)患者中呈高表达水平，并与肝衰竭短期转归良好(存活)患者的表达水平存在显著差异。因此，vsig4可以作为一种肝衰竭疾病转归预警预测的特异性指标，具有潜在的应用价值。

技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术存在的技术问题之一。为此，提供了一种具有良好的预后评价价值的肝衰竭分子标志物vsig4，以及定量检测vsig4的试剂盒能够用于肝衰竭疾病转归早期预警预测。
6.为了实现上述目的，对肝衰竭患者的临床样本(外周血单个核细胞)进行了高通量转录组测序，并与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析。结果发现，vsig4在肝衰竭短期转归不良(死亡)患者中呈高表达水平，并与肝衰竭短期转归良好(存活)患者的表达水平
存在显著差异。并通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)方法验证了vsig4分子在肝衰竭疾病不同转归(死亡、存活)患者中表达水平存在显著差异，可作为肝衰竭疾病转归的预后评价的分子标志物。本发明提供了具有良好的预后评价价值的肝衰竭分子标志物，所述标志物包含vsig4分子,其特异性实时荧光定量pcr引物对序列如下所示：
7.seq id no.1：前引物tcctggaagtgccagagagt；
8.seq id no.2:后引物ctttgcctgctggatatggt；
9.本发明采用的技术方案如下：
10.本发明公开了生物标志物vsig4分子在制备肝衰竭转归预后试剂中的应用。
11.作为进一步地改进，本发明所述的预后包括预测肝衰竭患者短期的存活、死亡情况。
12.作为进一步地改进，本发明所述试剂通过检测细胞、组织或体液等临床样本中所述的肝衰竭转归预后vsig4分子标志物的含量，来判断肝衰竭转归预后效果。
13.作为进一步地改进，本发明所述试剂通过测序、qrt-pcr对vsig4分子在细胞、组织或体液临床样本中的表达量进行定量检测。
14.本发明还公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒，试剂盒包含用于检测vsig4分子表达量的检测试剂。
15.作为进一步地改进，本发明所述检测试剂为实时荧光定量pcr引物。序列如seq id no.1所示的前引物和如seq id no.2所示的后引物；还包括与vsig4分子表达量相关的阈值为15，还包括与vsig4分子表达量相关的阈值为15。
16.作为进一步地改进，本发明所述的试剂盒预测肝衰竭预后的步骤如下：
17.1)患者试剂盒检测细胞、组织或体液等临床样本中vsig4分子表达量；
18.2)当检测到的vsig4分子表达量大于15时，患者被预测为短期死亡的高危人。
19.作为进一步地改进，本发明所述检测试剂包含：
20.1)如seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的用于扩增vsig4的引物对；和/或
21.2)对mrna进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性pcr扩增的试剂，包含：2.5u/μlpolya聚合酶、逆转录酶、5
×
逆转录缓冲液、去rna酶水；和/或
22.3)如seq id.no.3前引物和seq id no.4后引物所示的内参引物对；和/或
23.4)完成pcr实验所需的必要溶剂和完成pcr实验所需的扩增核酸和完成rna抽提的试剂，包含：2
×
qpcr混合液、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。
24.本发明还公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒的应用方法，包括：
25.1)所需检测样本，进行rna提取；
26.2)将rna样本1ng-100μg与逆转录酶0.01-10μl，rt混合液0.01-10μl混合后进行反转录；
27.3)所得产物cdna与0.2μl polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl充分混匀后进行pcr扩增。
28.作为进一步地改进，本发明所述的pcr扩增的条件为:检测样本提取rna、逆转录酶0.01-10μl、rt混合液0.01-10μl、polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl；所述疾病的检测样本为细胞样本、组织样本或体液样本。疾病检测细胞样本为外周血单个核细胞
样本；疾病检测组织样本为肝组织样本；所述疾病检测体液样本优选为血液样本，所述疾病检测血液样本为血清样本或血浆样本。
29.本发明提供了肝衰竭疾病转归的预后标志物vsig4及其应用，包含vsig4检测试剂盒及其用于肝衰竭疾病转归的预后评价，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为肝衰竭患者疾病转归的预后评价提供可靠依据。采用本发明的检测试剂盒对收集的八十多例肝衰竭患者外周血单个核细胞样本进行检测，对所述的八十多例肝衰竭患者外周血单个核细胞的vsig4表达水平与预后关系进行分析。研究结果表明，存在vsig4高表达患者的病死率明显高于vsig4低表达患者。研究结果显示，本发明的检测试剂盒可通过检测样本的vsig4表达水平情况预测肝衰竭患者的转归，为进一步方案的制定提供参考数据。
30.具体地，本发明的有益效果在于：
31.1、本发明通过高通量转录组测序，与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析，并通过qpcr验证。结果发现vsig4在肝衰竭转归不良(死亡)患者中呈特异性高表达，与肝衰竭疾病转归(死亡、存活)有很好的相关性，稳定可靠。
32.2、本发明的一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的vsig4检测试剂盒可检测各类样本，如细胞样本、组织样本、体液样本等，易于提取，创伤性小，可操作性强。
33.3、本发明的一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的vsig4检测试剂盒方法简便，检测过程简单、易于重复，具备专业资格的技术人员均可以完成，可行性强。
34.4、本发明的一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的vsig4检测试剂盒能够提供准确的肝衰竭疾病转归预警预测结果，及时反映肝衰竭患者的疾病状态，可实现肝衰竭患者疾病转归预警预测，并指导医生对其制定针对性方案，实现早期，降低短期病死率。
附图说明
35.图1是vsig4 mrna在肝衰竭短期转归不良(死亡)组(n＝8)、肝衰竭短期转归良好(存活)组(n＝12)的外周血单个核细胞转录组测序数据表达图；
36.图2是vsig4 mrna外周血单个核细胞转录组测序数据对肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者的区分情况；
37.图3是vsig4 mrna在肝衰竭短期转归不良(死亡)组(n＝26)、肝衰竭短期转归良好(存活)组(n＝57)外周血单个核细胞qrt-pcr验证结果对照图表；
38.图4是vsig4 mrna外周血单个核细胞qrt-pcr数据对肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者的区分情况；
39.图5是肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者vsig4 mrna外周血单个核细胞qrt-pcr数据的分布图；
40.图6是在大鼠模型中，肝衰竭组、肝硬化组和正常对照组的vsig4的检测结果对照图表。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术
人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
42.本发明实验方法包括：
43.1、基于肝衰竭多中心、前瞻性队列，前期收集肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者的外周血单个核细胞，通过高通量转录组测序建立转录组数据，与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析，结果发现在肝衰竭不同转归患者中表达具有显著差异的分子—vsig4。
44.2、对肝衰竭疾病短期不同转归(死亡、存活)患者的外周血单个核细胞进行qpcr验证，证实vsig4在肝衰竭短期转归不良(死亡)组中特异性高表达。
45.3、vsig4分子定量检测试剂盒的制作工艺和操作流程主要是基于pcr技术。通过实验1和实验2步骤筛选出vsig4分子作为预测肝衰竭患者疾病不同转归(死亡、存活)的特异性指标。通过实验2步骤筛选出所述vsig4扩增引物对序列如seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的引物对，内参引物对如seq id.no.7前引物和seq id no.8后引物的内参引物对所示。
46.下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地说明：
47.实施例一
48.实验方法
49.一、外周血单个核细胞分离
50.1.抽取8ml患者全血，静置约30分钟，离心机常规预冷至4℃。
51.2.采用密度梯度离心机，在4℃，3500转/分钟条件下离心10分钟。血细胞沉淀用5ml无菌0.1m pbs缓冲液将血细胞沉淀充分重悬，混匀，形成血细胞悬液后缓慢加入ficoll-paquetm plus medium淋巴细胞分离液的离心管中，使其自然形成分层。设置离心机温度20℃，转速为2500转/分钟，升速9，降速1，离心20分钟。
52.3.吸取中间白膜层，加入pbs缓冲液10ml，4℃1400转/分钟离心4分钟后弃上清。该步骤重复3次。
53.4.用移液吸干残留pbs缓冲液，加入1ml细胞裂解液trizol使细胞完全裂解。
54.二、总mrna抽提
55.1.将pbmcs-trizol样本于4℃3000转/分钟离心3分钟后取出，加入200μl，剧烈摇荡混匀后静置5分钟使其自然分层。
56.2.将上述样本于4℃12000转/分钟条件下离心15分钟后取出，吸取上清约400μl左右，转移至另一清洁1.5ml离心管中。加入500μl异丙醇，缓慢颠倒混匀至澄清液体，静置10分钟。
57.3.将上述样本于4℃12000转/分钟条件下离心10分钟后取出，弃去上清。加入1ml 75％乙醇溶液，轻轻吹起白羽毛状沉淀物。
58.4.将上述样本于4℃7500转/分钟条件下离心5分钟后取出，弃去上清。
59.5.将上述样本于4℃7500转/分钟条件下离心5分钟后取出，用移液吸干上清。
60.7.加入30μl depc水溶液mrna。
61.三、高通量转录组测序
62.1.rna质检：取1ul rna溶液于nanodrop仪器定量。
63.2.根据nanodrop仪器定量结果，取500ng 1％琼脂糖电泳检测。
64.3.依次进行ds cdna合成、末端补平、加a、加接头、pcr富集和qubit定量
65.4.簇生成：稀释至10nm后取4ul 10nm文库，加1ul 2n naoh，加15ul tris.cl，混匀，室温放置5min；取6ul上述溶液，加994ul冷的杂交buffer；取140ul上述溶液，放在8连管中，置于cbot的template栏中；启动cbot仪器，开始簇生成。
66.5.illumina hiseq2500测序
67.图1是肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)组(n＝8)、肝衰竭疾病短期转归良好(存活)组(n＝12)的外周血单个核细胞测序数据对照图表；经分析所得在肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)组特征性高表达的的vsig4 mrna。图2是vsig4mrna外周血单个核细胞转录组测序数据对肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者的区分情况；
68.实施例二
69.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)组、肝衰竭疾病短期转归良好(存活)组vsig4分子表达情况。
70.vsig4引物对序列设计与筛选：基于引物与非特异性扩增序列的同源性不超过70％或有连续8个互补碱基同源；避开产物的二级结构区；寡核苷酸引物长度为15～30bp；g+c含量为40％～60％等原则，设计出vsig4引物序列对seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的引物对、seq id no.3前引物和seq id no.4后引物所示的引物对、seq id no.5前引物和seq id no.6后引物所示的引物对、seq id no.7前引物和seq id no.8后引物所示的引物对、seq id no.9前引物和seq id no.10后引物所示的引物对。
71.试剂盒包含：vsig4扩增引物seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示引物对或seq id no.3前引物和seq id no.4后引物所示的引物对或seq id no.5前引物和seq id no.6后引物所示的引物对。根据各引物对序列的特异性、灵敏度、实验重复性、观察扩增曲线、观察溶解曲线等，筛选出seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的引物对为vsig4最优扩增引物序列对。以seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的引物对为具体实施例；内参如seq id.no.11前引物和seq id no.12后引物所示引物对；2.5u/μlpolya聚合酶、逆转录酶、5
×
逆转录缓冲液、rt混合液、去rna酶水5ml、2
×
qpcr混合液、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。
72.实验步骤
73.qrt-pcr采用两步法进行实验操作。同实施例一方法进行患者外周血单个核细胞分离、总rna抽提，mrna经浓度测试后进行下一步实验操作。
74.1.反转录：将总rna样本1000ng与逆转录酶1μl、5
×
逆转录缓冲液5μl、rt混合液1μl与去rna酶水充分混合后进行反转录反应。反转录采用quantitect reverse transcription kit(qiagen,ca,usa)试剂盒，按照试剂盒说明进行操作，得到cdna。
75.2.取上述cdna模板进行pcr扩增：取cdna样本2μl与0.2μl polya聚合酶、7.8ml qpcr混合液充分混匀后进行pcr扩增。pcr试剂采用takara公司tb green试剂，按照试剂盒说明进行操作。
76.pcr扩增条件：检测样本提取rna、逆转录酶0.01-10μl、rt混合液0.01-10μl、polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl。
77.图3是肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)组(n＝26)、肝衰竭疾病短期转归良好(生存)组(n＝57)的外周血单个核细胞qrt-pcr验证结果对照图表，表明vsig4在肝衰竭短期内
转归不良(死亡)的患者中表达水平显著高于短期转归良好(存活)患者。图4是vsig4 mrna外周血单个核细胞qrt-pcr数据对肝衰竭不同转归(死亡、生存)患者的区分情况，经分析可知，vsig4 mrna表达水平在肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)患者中特异性高表达，可作为区分肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)患者的指标。图5是肝衰竭不同转归(死亡、存活)患者vsig4 mrna外周血单个核细胞qrt-pcr数据的分布图，表明vsig4 mrna表达水平大于15时，患者被预测为短期死亡的高危人。
78.实施例三
79.试剂盒包含：vsig4扩增引物如seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示引物对或seq id no.3前引物和seq id no.4后引物所示的引物对或seq id no.5前引物和seq id no.6后引物所示的引物对，其中以seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的引物对为具体实施例；内参如seq id.no.7前引物和seq id no.8后引物所示引物对；2.5u/μlpolya聚合酶、逆转录酶、5
×
逆转录缓冲液、rt混合液、去rna酶水5ml、2
×
qpcr混合液、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。
80.动物模型：60只雄性sd大鼠(60-80g)随机分成三组，每组20只。
81.肝衰竭组：每只大鼠腹腔注射d-gal 800mg/kg和lps 100μg/kg，造成肝衰竭模型。
82.肝硬化组：每只大鼠腹腔注射猪血清2ml/kg，每周两次，持续12周，造成肝硬化模型。
83.对照组：每只大鼠腹腔注射等量生理盐水。
84.分别分离肝衰竭组、肝硬化组和对照组外周血全血样本，分离血浆后提取总rna。
85.将总rna样本1000ng与逆转录酶1μl、5
×
逆转录缓冲液5μl、rt混合液1μl与去rna酶水充分混合后进行反转录反应，形成cdna。
86.上述cdna样本2μl与0.2μl polya聚合酶、7.8ml qpcr混合液充分混匀后进行pcr扩增。
87.pcr扩增条件为：检测样本提取rna、逆转录酶0.01-10μl、rt混合液0.01-10μl、polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl。
88.图6是在大鼠模型中，肝衰竭组、肝硬化组和正常对照组的vsig4的检测结果对照图表，各组于造模后12小时取肝组织检测vsig4 mrna水平，结果显示，肝衰竭组肝组织vsig4 mrna的表达量显著高于肝硬化组和对照组。
89.上述实验结果表明：vsig4 mrna在肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)患者中的表达水平显著高于肝衰竭疾病短期转归良好(存活)患者，通过检测vsig4的表达水平可检测出肝衰竭疾病短期转归不良(死亡)的高危患者，从而能帮助该类患者及时进行，实现预警预测，具有很好的临床应用前景。本发明开发的用于肝衰竭疾病转归预警预测的vsig4检测试剂盒能够提供准确的评估结果，且能够及时准确反映肝衰竭患者的疾病状态，实现对患者预后转归的预警预测，便于临床医生及时诊断，并采取及时有效的。
90.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
91.vsig4引物对序列：seq id no.1：前引物tcctggaagtgccagagagt；
92.seq id no.2:后引物ctttgcctgctggatatggt
93.vsig4引物对序列：seq id no.3：前引物tccgtgtccagaaacactcc；
94.seq id no.4:后引物catgtcagtggtccagtccc
95.vsig4引物对序列：seq id no.5：前引物tccgtgtccagaaacactcc；
96.seq id no.6:后引物ccatgtcagtggtccagtcc
97.vsig4引物对序列：seq id no.7：前引物tccgtgtccagaaacactcc；
98.seq id no.8:后引物cagcactggtctctccaagg
99.vsig4引物对序列：seq id no.9：前引物tccgtgtccagaaacactcc；
100.seq id no.10:后引物ccagcactggtctctccaag
101.内参引物对序列：seq id no.11:前引物ctctctgctcctcctgttcg；
102.seq id no.12:后引物acgaccaaatccgttgactc。

技术特征：

1.生物标志物vsig4分子在制备肝衰竭转归预后试剂中的应用。2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的预后包括预测肝衰竭患者短期的存活、死亡情况。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂通过检测细胞、组织或体液等临床样本中所述的肝衰竭转归预后vsig4分子标志物的含量，来判断肝衰竭转归预后效果。4.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述试剂通过测序、qrt-pcr对vsig4分子在细胞、组织或体液临床样本中的表达量进行定量检测。5.一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测vsig4分子表达量的检测试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为实时荧光定量pcr引物，序列如seq id no.1所示的前引物和如seq id no.2所示的后引物；所述的vsig4分子表达量相关的阈值为15。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒预测肝衰竭预后的步骤如下：1)患者试剂盒检测细胞、组织或体液等临床样本中vsig4分子表达量；2)当检测到的vsig4分子表达量大于15时，患者被预测为短期死亡的高危人。8.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包含：1)如seq id no.1前引物和seq id no.2后引物所示的用于扩增vsig4的引物对；和/或2)对mrna进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性pcr扩增的试剂；和/或3)如seq id.no.3前引物和seq id no.4后引物所示的内参引物对；和/或4)完成pcr实验所需的必要溶剂和完成pcr实验所需的扩增核酸和完成rna抽提的试剂。9.一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒的应用方法，其特征在于：1)所需检测样本，进行rna提取；2)将rna样本1ng-100μg与逆转录酶0.01-10μl，rt混合液0.01-10μl混合后进行反转录；3)所得产物cdna与0.2μl polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl充分混匀后进行pcr扩增。10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述的pcr扩增的条件为:检测样本提取rna、逆转录酶0.01-10μl、rt混合液0.01-10μl、polya聚合酶0.01-10μl、qpcr混合液0.01-100μl，所述疾病的检测样本来自于肝衰竭患者或肝衰竭高危人，所述疾病检测细胞样本为外周血单个核细胞样本；疾病检测组织样本为肝组织样本；所述疾病检测体液样本优选为血液样本，所述疾病检测血液样本为血清样本或血浆样本。

技术总结

本发明公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法。本发明通过高通量转录组测序，与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析，并通过qPCR验证。结果发现VSIG4在肝衰竭转归不良(死亡)患者中呈特异性高表达，与肝衰竭疾病转归(死亡、存活)有很好的相关性，稳定可靠。本发明公开的试剂盒检测过程简单、易于重复，具备专业资格的技术人员均可以完成，可行性强，能够提供准确的肝衰竭疾病转归预警预测结果，及时反映肝衰竭患者的疾病状态，可实现肝衰竭患者疾病转归预警预测，并指导医生对其制定针对性方案，实现早期，降低短期病死率。降低短期病死率。降低短期病死率。