一种2-羟基琥珀酸类化合物及其药物组合物和应用

1.本发明涉及一种化合物及其药物组合物和应用，具体涉及一种2-羟基琥珀酸类化合物及其药物组合物和应用。

背景技术：

2.心血管疾病是目前全球第一大疾病死亡原因，而高胆固醇引起的血脂异常是导致心血管疾病死亡的重大风险之一。他汀类药物是高血脂的一线药物，但是15％的患者存在他汀不耐受或者他汀降脂效果不佳等临床缺陷。因此，开发高效安全的高血脂药物具有重要的研究意义。
3.胞质柠檬酸盐是脂肪酸从头合成的关键前体和调节剂，被认为是连接葡萄糖代谢和脂质代谢的重要中间物质。胞浆中柠檬酸盐浓度直接影响脂肪合成速率。胞质中柠檬酸主要有三个来源：(1)由slc13a5基因编码的胞质柠檬酸转运体(nact)将血浆中柠檬酸摄取到胞浆中。(2)由slc25a1基因编码的线粒体内膜柠檬酸转运体(pmct)将三羧酸循环中过量的柠檬酸转运到胞浆中。(3)由谷氨酰胺代谢生成α-酮戊二酸(α-kg)进入三羧酸循环代谢生成柠檬酸。这三种来源的柠檬酸均需要在胞浆atp-柠檬酸裂解酶(acly)的作用下生成乙酰辅酶a和草酰乙酸，随后由乙酰辅酶a为起始物质进行脂质从头合成途径(dnl)。因此抑制柠檬酸摄取的关键转运蛋白和柠檬酸分解代谢的关节酶是脂代谢疾病的重要靶点。
4.由slc13a5基因编码的柠檬酸转运体又被称为质膜柠檬酸转运体/钠离子依赖的柠檬酸转运体(nact)，该载体蛋白定位于细胞膜上，负责将血浆中的柠檬酸摄取到胞浆中。slc13a5基因在哺乳动物的肝脏中高表达，在肾、睾丸、大脑中也有一定分布。在肥胖、非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病等患者体内slc13a5基因表达水平显著上调。敲除slc13a5基因的小鼠可避免由高脂饮食诱导的相关代谢性疾病的发生和发展，nact已成为调控能量代谢和脂质代谢的理想靶点。
5.目前尚无用于高血脂症的nact抑制剂成功上市，仅有辉瑞公司报道了pf-06649298和pf-06761281，以及百时美施贵宝公司报道了bi-01383298，pf-06761281会增加血浆和尿液中柠檬酸浓度，因此安全性需进一步考究，此外成药性有待进一步改善。

技术实现要素：

6.发明目的：本发明旨在提供一种抑制nact的2-羟基琥珀酸类化合物，能有效解决现有化合物存在的nact抑制活性不足及成药性不佳等问题；本发明的另一目的在于提供一种以所述2-羟基琥珀酸类化合物为活性成分的药物组合物；本发明的另一目的在于提供一种所述2-羟基琥珀酸类化合物在制备na
+
依赖的柠檬酸转运体相关疾病的药物中的应用。细胞外柠檬酸盐摄取抑制剂
7.技术方案：本发明所述的2-羟基琥珀酸类化合物，其为具有式ⅰ或ⅱ结构化合物或其异构体、药学上可接受的盐或它们的混合物：
[0008][0009]
r1为氢、卤素、氰基、c
1-c4烷基、c
1-c4卤代烷基、c
1-c4烷氧基、c
1-c4卤代烷氧基、吡唑基或苯基；
[0010]
r2为1-4个氢被r
2a
取代的6-10元芳基、5-10元杂芳基或四氢喹啉基、苯并噻唑基、苯并恶唑基；
[0011]r2a
为氢、卤素、氰基、c
1-c4烷基、c
1-c4卤代烷基、c
1-c4烷氧基或c
1-c4卤代烷氧基；
[0012]
l、m选自-ch
2-、-nh-或-o-；
[0013]
所述5-10元杂芳基中的杂原子为n、o或s，杂原子的个数为1～4个。
[0014]
优选地，所述结构中：
[0015]
r1为氢、氟、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、异丙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、吡唑基或苯基；
[0016]
r2为1-4个氢r
2a
取代的苯基、吡唑基、吡啶基或四氢喹啉基、苯并噻唑基、苯并恶唑基；
[0017]r2a
为氢、氟、氰基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、二恶茂、甲氧基、乙氧基或异丙氧基。
[0018]
优选地，所述2-羟基琥珀酸类化合物选自以下任一化合物：
[0019]
[0020]
[0021][0022]
优选地，所述药学上可接受的盐为上述化合物与酸或碱形成的盐，所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸，所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱。
[0023]
上述抑制剂以及药学上可接受的载体形成药物组合物，制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。
[0024]
上述抑制剂及其药物组合物可制备为与na
+
依赖的柠檬酸转运体相关疾病的药物，具体用于高脂血症、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎或癌症。
[0025]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该类化合物及其药物
组合物可有效抑制slc13a5基因编码的nact活性，有效抑制hek293t细胞对柠檬酸的摄取，细胞水平抑制ic50值最优小于60nm；(2)该类化合物及其药物组合物应用广泛，可制备为高脂血症等代谢性疾病的药物，在分子水平可以发挥药效，并且效果更优异，最优可达到纳摩尔浓度水平；(3)化合物制备方法简便、易操作。
附图说明
[0026]
图1为化合物la-33对aml12细胞脂质蓄积影响图；
[0027]
图2为化合物la-33对aml12细胞slc13a5、acly的影响图；
[0028]
图3为化合物la-33对小鼠原代肝细胞脂质蓄积影响图；
[0029]
图4为化合物la-33对小鼠原代肝细胞slc13a5、acly的影响图；
[0030]
图5为化合物la-33对饥饿诱导小鼠血浆脂质水平的影响图；
[0031]
图6为化合物la-33对饥饿诱导小鼠肝脏脂质蓄积的影响图；
[0032]
图7为化合物la-33对饥饿诱导小鼠肝脏脂质蓄积相关mrna的影响图。
具体实施方式
[0033]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0034]
实施例1
[0035]
la-1的合成：
[0036][0037]
步骤1：将碘化亚铜(0.2g，1.05mmol)加入60ml thf中，加入三乙胺(1.13g，44.32mmol)，反应液由灰白浑浊变为淡灰略澄清状，氮气置换三次，于冰浴下缓慢滴加对溴苯乙炔(4g，22.09mmol)和草酰氯单乙酯(6g，43.94mmol)，反应液变为淡黄混浊，随后变为土黄浑浊。反应液于室温下反应16h后停止反应。向反应液中加入60ml饱和碳酸氢钠溶液，分出有机层，水层使用乙酸乙酯萃取三次，有机层合并，使用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂，使用pe：ea＝60:1柱层析得到淡黄油状物4g。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.62
–
7.53(m,4h),4.37(s,2h),1.34(s,3h).hr-ms(esi):calculated for c
12h10
bro3[m+h]
+
:280.9813,found280.9803.
[0038]
步骤2：将乙酸乙酯(5.01g，56.9mmol)溶于thf中，降温至-78℃，逐滴加入双(三甲基硅基)氨基锂(56.9ml，56.9mmol)反应液保持-78℃反应30min后将1-1溶于thf并滴加入
反应液中。保持-78℃反应1.5h后tlc监测反应完全。停止反应，使用饱和氯化铵淬灭反应，ea萃取，有机层合并，无水硫酸钠干燥。使用pe:ea＝15:1柱层析得8g黄油状物。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ7.52
–
7.42(m,2h),7.37
–
7.27(m,2h),4.39(qd,j＝7.1,1.3hz,2h),4.22
–
4.15(m,2h),3.28(d,j＝16.5hz,1h),3.14(d,j＝16.5hz,1h),1.38(t,j＝7.1hz,3h),1.29(t,j＝7.1hz,3h).hr-ms(esi):calculated for c
16h18
bro5[m+h]
+
:369.0338,found 369.0366.
[0039]
步骤3：将1-2(0.50g，1.35mmol)和2-甲氧基吡啶-4-硼酸频哪醇酯(0.36g，1.62mmol)溶于7ml溶剂中(二氧六环:水＝6:1)，加入无水碳酸钠(0.43g，4.06mmol)，氮气置换三次后加入pd(dppf)cl2(0.10g，0.14mmol)，氮气置换三次后与95℃下反应5h后tlc检测反应完全。反应液冷却至室温后抽滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯，水洗两次，饱和食盐水洗一次，有机层使用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，使用pe:ea＝10:1柱层析得淡黄油状物200mg。
[0040]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.23(d,j＝5.0hz,1h),7.80
–
7.70(m,2h),7.61
–
7.51(m,2h),7.51(dd,j＝5.1,1.0hz,1h),7.08(d,j＝1.0hz,1h),4.31(s,2h),4.10(s,2h),3.89(s,3h),2.82(d,j＝0.4hz,2h),1.25(d,j＝15.6hz,6h).hr-ms(esi):calculated for c
22h24
no6[m+h]
+
:398.1604,found 398.1600.
[0041]
步骤4：将中间体1-3溶于30ml无水乙醇中，加入5ml雷尼镍催化剂，氢气置换三次后反应过夜。tlc检测反应完全后将反应液抽滤，滤液浓缩,使用硅胶柱纯化得无油状物120mg。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.23(d,j＝5.0hz,1h),7.58
–
7.47(m,3h),7.27
–
7.16(m,2h),7.08(d,j＝1.0hz,1h),4.17(d,j＝0.5hz,2h),4.09(s,2h),3.88(s,3h),2.83
–
2.67(m,2h),2.53(dt,j＝3.1,1.0hz,2h),2.13(d,j＝0.8hz,2h),1.22(s,3h),1.14(s,3h).c
22h28
no6[m+h]
+
:402.1917,found 402.1933.
[0042]
步骤5：将中间体1-4溶于5ml无水乙醇中，加入1.5ml 1n naoh溶液，室温反应过夜，hplc检测反应完全后，减压蒸除溶剂，使用1mol/l盐酸调节ph至2-3。水层使用乙酸乙酯萃取(3
×
5ml)，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后抽滤，滤液减压蒸除溶剂，得70mg白固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.23(d,j＝5.0hz,1h),7.58
–
7.47(m,3h),7.27
–
7.16(m,2h),7.08(d,j＝1.0hz,1h),5.14(s,1h),3.88(s,3h),2.82
–
2.66(m,2h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h).hr-ms(esi):calculated for c
18h20
no6[m+h]
+
:346.1291,found 346.1308.
[0043]
采用与实施例1相似的操作，制得下列化合物：
[0044][0045]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.59(d,j＝8.1hz,2h),7.37(t,j＝7.9hz,1h),7.31
–
7.04(m,4h),6.93(ddd,j＝8.1,2.6,1.0hz,1h),3.83(s,3h),2.79(t,j＝12.1hz,2h),2.57
(d,j＝15.7hz,1h),2.45(dd,j＝13.5,5.3hz,1h),2.01
–
1.83(m,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h21
o6[m+h]
+
:345.1338,found 345.1372.
[0046][0047]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.60
–
7.50(m,2h),7.40(dt,j＝7.4,2.0hz,1h),7.35
–
7.16(m,4h),6.96(dt,j＝7.4,2.0hz,1h),5.14(s,1h),4.08(s,2h),2.82
–
2.66(m,2h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h),1.40(s,3h).hr-ms(esi):calculated for c
20h23
o6[m+h]
+
:359.1495,found 359.1507
[0048][0049]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.26(q,j＝8.2 hz,4h),6.86(dd,j＝7.4,1.6 hz,1h),6.76(dd,j＝7.5,1.7 hz,1h),6.52(t,j＝7.4 hz,1h),3.16(t,j＝5.5 hz,2h),2.85
–
2.69(m,4h),2.58(d,j＝15.6 hz,1h),2.45(dd,j＝13.3,5.4 hz,1h),2.04
–
1.74(m,4h).hr-ms(esi):calculated for c
21h24
no5[m+h]
+
:370.1654,found 370.1660.
[0050][0051]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.50
–
7.41(m,3h),7.30(d,j＝7.9 hz,2h),6.37(d,j＝1.9 hz,1h),3.85(s,3h),2.87
–
2.75(m,2h),2.61(s,1h),1.94(qt,j＝14.0,6.3 hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
16h19
n2o5[m+h]
+
:319.1294,found 319.1300.
[0052]
[0053]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ8.14(s,1h),7.82(s,1h),7.48(d,j＝7.9 hz,2h),7.15(d,j＝7.9 hz,2h),4.15(q,j＝7.3 hz,2h),2.80(d,j＝15.7 hz,1h),2.73
–
2.64(m,1h),2.59(s,1h),2.40(dd,j＝13.5,5.5 hz,1h),2.01
–
1.77(m,2h),1.41(t,j＝7.3 hz,3h).hr-ms(esi):calculated for c
17h22
n2o5[m+h]
+
:333.1450,found 333.1455.
[0054][0055]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.70(dd,j＝6.5,1.0 hz,3h),7.23
–
7.13(m,2h),6.82(s,1h),5.14(s,1h),2.71(d,j＝12.4 hz,1h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h).hr-ms(esi):calculated for c
15h17
n2o5[m+h]
+
:305.1137,found 305.1144.
[0056][0057]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.80
–
7.70(m,2h),7.63(s,1h),7.28
–
7.18(m,2h),6.80(s,1h),5.14(s,1h),4.52(s,1h),2.71(d,j＝12.4 hz,1h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h),1.44(d,j＝15.1 hz,5h).hr-ms(esi):calculated for c
18h23
n2o5[m+h]
+
:347.1607,found 347.1618.
[0058][0059]1h nmr(300 mhz,methanol-d4)δ7.98(s,1h),7.58(s,1h),7.50(d,j＝8.6 hz,1h),7.28(dd,j＝8.7,1.6 hz,1h),3.10
–
2.86(m,2h),2.81
–
2.56(m,2h),2.09(dtd,j＝26.0,13.5,6.7 hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
13h15
n2o5[m+h]
+
:279.0981,found279.0996.
[0060][0061]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.60
–
7.50(m,2h),7.42
–
7.30(m,2h),7.27
–
7.16(m,2h),6.89(d,j＝7.5 hz,1h),6.04(d,j＝0.7 hz,2h),5.14(s,1h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h19
o7[m+h]
+
:359.1131,found359.1144.
[0062][0063]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.50(h,j＝4.6,3.8 hz,4h),7.39(d,j＝7.8 hz,2h),7.28(d,j＝7.8 hz,2h),2.81(d,j＝15.6 hz,2h),2.60(s,1h),2.44(d,j＝5.1 hz,1h),1.94(dq,j＝12.4,6.9,6.0 hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h19
o7[m+h]
+
:399.1055,found 399.1068.
[0064][0065]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.39(d,j＝8.0 hz,2h),7.30(dd,j＝15.3,7.6 hz,2h),7.20(d,j＝7.8 hz,2h),7.15
–
6.97(m,2h),3.76(s,3h),2.87(d,j＝19.9 hz,1h),2.81
–
2.69(m,2h),2.60(s,1h),1.93(qd,j＝14.0,13.0,5.9 hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h21
o6[m+h]
+
:345.1338,found 345.1372.
[0066]
[0067]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.54(d,j＝7.8 hz,2h),7.37(d,j＝7.9 hz,1h),7.28(d,j＝7.8 hz,2h),7.22
–
7.10(m,2h),6.91(dd,j＝8.2,2.5 hz,1h),4.12(q,j＝6.9hz,2h),3.16(d,j＝17.0 hz,1h),2.93(q,j＝11.1 hz,2h),2.68(t,j＝12.3 hz,1h),2.15(t,j＝12.0 hz,2h),1.48(d,j＝13.9 hz,3h).hr-ms(esi):calculated for c
20h23
o6[m+h]
+
:359.1495,found 359.1508.
[0068][0069]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.61(dd,j＝7.5,2.0 hz,1h),7.54
–
7.45(m,2h),7.40(td,j＝7.5,2.0 hz,1h),7.25
–
7.16(m,2h),7.11(td,j＝7.5,2.0 hz,1h),6.95(dd,j＝7.5,2.0 hz,1h),5.14(s,1h),4.68(s,1h),2.82
–
2.66(m,2h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h),1.35(d,j＝14.9 hz,5h).hr-ms(esi):calculated for c
21h25
o6[m+h]
+
:373.1651,found 373.1673.
[0070][0071]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.58(d,j＝8.2 hz,2h),7.35(t,j＝7.9 hz,1h),7.29
–
7.11(m,4h),6.91(dd,j＝8.2,2.4 hz,1h),4.00(t,j＝6.5 hz,2h),2.84
–
2.68(m,2h),2.60(s,1h),2.01
–
1.81(m,2h),1.75(p,j＝7.1 hz,2h),1.01(t,j＝7.4 hz,3h).hr-ms(esi):calculated for c
21h25
o6[m+h]
+
:373.1651,found 373.1679.
[0072][0073]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.84(dd,j＝7.5,2.0 hz,1h),7.69(td,j＝7.3,2.0 hz,1h),7.63(dd,j＝7.5,2.4 hz,1h),7.58
–
7.45(m,3h),7.25
–
7.14(m,2h),5.14(s,1h),2.82
–
2.66(m,2h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h).hr-ms(esi):calculated forc
19h18
f3o5[m+h]
+
:383.1106,found 383.1116.c16h30
nao4si[m+na]
+
:337.1811,found 337.1816.
[0083]
中间体2-4的合成：
[0084]
将中间体2c(1.3g，3.95mmol)溶于15ml无水乙醚中，与冰浴下滴加四丁基氟化铵(5.94ml，5.94mmol)，1.5h后tlc监测反应完全。使用10ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，反应液分层后，水层使用乙醚萃取三次，有机层合并经无水硫酸钠干燥后抽滤，减压除去溶剂，粗品经柱层析得淡黄油状物0.63g，收率74％。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ6.66(s,1h),4.31(s,2h),4.10(s,2h),3.65(s,1h),2.76(d,j＝0.3hz,3h),1.25(d,j＝15.6hz,6h).hr-ms(esi):calculated for c
10h14
nao5[m+na]
+
:237.0739,found 237.0749.
[0085]
中间体2-5的合成：
[0086]
将4-(4-碘苯基)吗啉(0.50g，1.73mmol)溶于5ml四氢呋喃中，加入碘化亚铜(33mg，0.17mmol)、0.7ml三乙胺，氮气置换三次后加入pd(pph3)4(200mg，0.17mmol)，再次进行氮气置换，待反应液温度升至60℃后向反应液中滴加中间体2d(440mg，2.07mmol)，1.5h后tlc监测反应完全。反应液冷却至室温后抽滤，滤液加水分液，水层使用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗两次，经无水硫酸钠干燥后抽滤，减压除去溶剂，粗品经柱层析得到0.64g淡黄固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.52
–
7.42(m,2h),7.04
–
6.94(m,2h),4.31(s,2h),4.10(s,2h),3.74(d,j＝3.6hz,4h),3.18(d,j＝1.1hz,4h),2.82(d,j＝0.4hz,2h),1.25(d,j＝15.6hz,6h).hr-ms(esi):calculated for c
20h26
no6[m+h]
+
:376.1760,found 376.1772.
[0087]
中间体2-6的合成：
[0088]
将中间体2-5(0.60g，1.60mmol)溶于30ml溶剂中(甲醇：四氢呋喃＝6:1)，加入3ml雷尼镍，氢气置换三次，室温反应过夜，tlc监测反应完全后将反应液抽滤，减压除去溶剂，得到0.6g灰白固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.16
–
7.05(m,2h),6.87
–
6.77(m,2h),4.17(d,j＝0.6hz,2h),4.09(s,2h),3.74(d,j＝3.6hz,4h),3.19(d,j＝1.7hz,4h),2.83
–
2.67(m,2h),2.59
–
2.40(m,2h),2.13(d,j＝0.8hz,2h),1.22(s,3h),1.14(s,3h).hr-ms(esi):calculated for c
20h30
no6[m+h]
+
:380.2073,found 380.2079.
[0089]
la-18的合成：
[0090]
将中间体2-6(0.50g，1.32,mmol)溶于8ml无水乙醇中，加入5ml 1mol/l naoh溶液，室温搅拌16h后tlc监测反应完全。减压蒸除溶剂，加入1mol/l hcl溶液调至ph2-3，使用乙酸乙酯萃取三次(3
×
5ml)，有机层合并水洗两次，饱和食盐水洗一次，经无水硫酸钠干燥后减压蒸除溶剂得到白固体300mg。1h nmr(300mhz,deuterium oxide)δ7.15(d,j＝8.3hz,2h),7.00
–
6.91(m,2h),3.79(dd,j＝6.2,3.4hz,4h),3.07
–
2.98(m,4h),2.68
–
2.52(m,2h),2.41
–
2.21(m,2h),1.76(dtd,j＝41.7,13.3,4.8hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
16h22
no6[m+h]
+
:324.1447,found 324.1459.
[0091]
采用与实施例2相似的操作，制得下列化合物：
[0092]
[0093]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.10(t,j＝0.5hz,4h),5.14(s,1h),2.82
–
2.63(m,4h),2.55
–
2.46(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h),1.23(s,3h).hr-ms(esi):calculated for c
14h19
o5[m+h]
+
:267.1232,found 267.1246.
[0094][0095]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.10(tdt,j＝7.7,6.9,0.9hz,4h),5.14(s,1h),2.90(t,j＝0.9hz,1h),2.74(d,j＝5.5hz,2h),2.59
–
2.42(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h),1.25(d,j＝15.1hz,6h).hr-ms(esi):calculated for c
15h21
o5[m+h]
+
:281.1389,found 281.1366.
[0096][0097]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.70
–
7.60(m,2h),7.49
–
7.39(m,2h),5.14(s,1h),2.82
–
2.66(m,2h),2.59
–
2.41(m,2h),2.20
–
2.02(m,2h).hr-ms(esi):calculated for c
13h14
f3o5[m+h]
+
:307.0793,found 307.0801.
[0098][0099]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.26
–
7.09(m,4h),5.14(s,1h),2.77(d,j＝12.4 hz,1h),2.71(d,j＝12.4 hz,1h),2.59
–
2.46(m,2h),2.46(dt,j＝7.7,1.0 hz,1h),2.20
–
2.02(m,2h),1.73(dd,j＝16.9,13.0 hz,4h),1.59(dd,j＝13.0,10.1 hz,4h).hr-ms(esi):calculated for c
17h23
o5[m+h]
+
:307.1575,found 307.1554.
[0100][0101]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.16
–
7.06(m,2h),6.84
–
6.74(m,2h),3.43
–
3.29(m,4h),2.89
–
2.71(m,2h),2.59(dt,j＝12.4,1.0 hz,1h),2.51(dt,j＝12.4,1.0 hz,
1h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.08
–
1.98(m,3h).hr-ms(esi):calculated for c
16h22
no5[m+h]
+
:308.1498,found 308.1495.
[0102][0103]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.26
–
7.09(m,4h),2.89
–
2.71(m,2h),2.61
–
2.42(m,3h),2.19(d,j＝12.3 hz,1h),2.08(s,1h),1.80(d,j＝13.1 hz,2h),1.70(d,j＝13.0 hz,2h),1.61
–
1.31(m,6h).hr-ms(esi):calculated for c
18h25
o5[m+h]
+
:321.1702,found 321.1718.
[0104][0105]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.16
–
7.06(m,2h),6.84
–
6.74(m,2h),3.22(d,j＝4.8 hz,4h),2.98(d,j＝9.7 hz,4h),2.89
–
2.71(m,2h),2.55(qt,j＝12.4,1.0 hz,2h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.03(d,j＝12.4 hz,1h).hr-ms(esi):calculated for c
16h23
n2o5[m+h]
+
:323.1607,found 323.1608.
[0106][0107]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.17
–
7.06(m,2h),6.84
–
6.74(m,2h),3.19(d,j＝13.0 hz,4h),2.84(d,j＝12.4 hz,1h),2.76(d,j＝12.4 hz,1h),2.56(dd,j＝12.0,3.8hz,7h),2.29(s,3h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.03(d,j＝12.4 hz,1h).hr-ms(esi):calculated for c
17h25
n2o5[m+h]
+
:337.1763,found 337.1766.
[0108][0109]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.15
–
7.05(m,2h),6.86
–
6.76(m,2h),3.78(s,3h),2.89
–
2.71(m,2h),2.55(qt,j＝12.4,1.0 hz,2h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.03(d,j＝12.4 hz,1h).hr-ms(esi):calculated for c
13h17
o6[m+h]
+
:269.1025,found 269.1033.
[0110][0111][0112]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.17
–
7.06(m,2h),6.85
–
6.74(m,2h),4.08(s,2h),2.84(d,j＝12.4 hz,1h),2.76(d,j＝12.4 hz,1h),2.55(qt,j＝12.4,1.0 hz,2h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.03(d,j＝12.4 hz,1h),1.42(s,3h).hr-ms(esi):calculated forc
14h19
o6[m+h]
+
:283.1182,found 283.1189.
[0113][0114]1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ7.15(d,j＝7.4 hz,1h),6.94(dtt,j＝7.5,2.0,1.0hz,1h),6.88
–
6.76(m,2h),3.81(s,3h),2.89
–
2.71(m,2h),2.57(dt,j＝12.4,1.0 hz,1h),2.47(dt,j＝12.4,1.0 hz,1h),2.16(d,j＝12.4 hz,1h),2.04(d,j＝12.4 hz,1h).hr-ms(esi):calculated for c
13h17
o6[m+h]
+
:269.1025,found 269.1033.
[0115][0116]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ7.18(t,j＝7.4 hz,1h),6.95(dtt,j＝7.6,2.0,1.0 hz,1h),6.88
–
6.75(m,2h),4.07(s,2h),2.82
–
2.66(m,2h),2.56(dt,j＝12.4,1.0 hz,1h),2.47(dt,j＝12.3,1.0 hz,1h),2.10(d,j＝12.4 hz,1h),2.00(d,j＝12.4 hz,1h),1.39(s,3h).hr-ms(esi):calculated for c
14h19
o6[m+h]
+
:283.1182,found 283.1185.
[0117][0118]1h nmr(300 mhz,dmso-d6)δ8.14(d,j＝7.9 hz,1h),8.03(dd,j＝11.4,8.0 hz,3h),7.55(t,j＝7.6 hz,1h),7.46(t,j＝7.5 hz,1h),7.38(d,j＝7.9 hz,2h),2.81(s,1h),2.76(s,1h),2.58(d,j＝15.5 hz,2h),1.95(dq,j＝12.4,7.0,6.2 hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h18
no5s[m+h]
+
:372.0906,found 372.0916.
[0119][0120]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.14(d,j＝7.9hz,1h),8.01(dd,j＝11.4,8.0hz,3h),7.55(t,j＝7.6hz,1h),7.48(t,j＝7.5hz,1h),7.38(d,j＝7.9hz,2h),2.81(s,1h),2.76(s,1h),2.58(d,j＝15.5hz,2h),1.95(dq,j＝12.4,7.0,6.2hz,2h).hr-ms(esi):calculated for c
19h18
no6[m+h]
+
:356.1134,found 356.1155.
[0121][0122]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.69
–
7.54(m,4h),7.46(t,j＝7.6hz,2h),7.36(dd,j＝8.4,6.2hz,1h),7.27(d,j＝8.1hz,2h),2.82(d,j＝15.7hz,2h),2.61(s,1h),2.51
–
2.40(m,1h),2.05
–
1.81(m,2h)..hr-ms(esi):calculated for c
18h19
o5[m+h]
+
:315.1232,found 315.1239.
[0123]
[0124]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.89(d,j＝5.1hz,3h),7.50(d,j＝5.1hz,3h),7.28(d,j＝0.6hz,1h),2.78
–
2.54(m,5h),2.11(d,j＝12.4hz,1h),2.00(d,j＝12.3hz,1h).hr-ms(esi):calculated for c
16h17
o5[m+h]
+
:289.1076,found 289.1077.
[0125]
实施例3
[0126]
本发明部分化合物对高表达slc13a5的hek-293t胞外d4-柠檬酸摄取抑制实验：
[0127]
1、实验方法
[0128]
(1)细胞复苏与培养：将从液氮中取出的hek293t细胞迅速放入37℃水浴锅中解冻1min左右，然后转移至盛有5ml培养基的离心管中，1100rpm，离心3min，弃去上清，加入2ml 10％fbs dmem高糖培养基重悬，取1ml接种到含7ml培养基的细胞培养皿中，放入5％co2，37℃的细胞培养箱中，细胞呈单层贴壁生长。细胞融合至90％左右时，弃去培养基，用37℃预热的pbs洗2次，加入2ml 0.25％胰蛋白酶室温消化，轻轻摇晃30s，弃去胰蛋白酶，加入2ml新鲜培养基终止反应，移液器轻轻反复吹打，将含有细胞的培养基转移至灭菌的ep管中，800rpm，离心3min，离心完成后弃去上清，加入2ml 10％fbs dmem高糖培养基重悬，接种到细胞培养皿中，放入5％ co2，37℃的细胞培养箱中进行培养。
[0129]
(2)转染：弃去原培养基更换成无双抗无血清高糖dmem培养基，用opti-mem无血清培养基依次稀释slc13a5过表达质粒和lipofectamine
tm
2000转染试剂。将过表达质粒和lipofectamine
tm
2000加入24孔细胞培养板中，轻轻摇晃混匀，放置于细胞培养箱中培养；
[0130]
(3)摄取：转染成功24h后，将24孔板中的原培养基吸出，每孔加入1ml sodium buffer洗三次，然后加入250μl含不同浓度化合物的sodium buffer，放入振荡培养箱中，摄取温度37℃，预温孵30min；吸出含化合物的sodium buffer，加入1ml sodium buffer洗三次；每孔加250μl含上述不同浓度的化合物和200μm d4-柠檬酸的sodium buffer，37℃，摄取30min；弃去含d4-柠檬酸的sodium buffer，每孔加入1ml choline buffer洗三次终止摄取；反应结束后，每孔加200μl双蒸水，放置于-80℃冰冻30min，在室温中解冻，如此反复冻融3次，超声10min，充分破碎细胞，把含破碎细胞的溶液转移至ep管中，加入含内标乙腈，12000rpm，离心10min，取上清用lc-ms/ms检测胞内d4-柠檬酸浓度，同时减去hek-293t-vector组胞内d4-citrate浓度计算净含量。
[0131]
2、数据处理
[0132]
(1)柠檬酸摄取实验计算公式
[0133]
％inhibition＝[1-(a_sample/a_max)]
[0134]
其中:a_sample表示样品中d4-citrate含量，a_max表示空白中d4-citrate含量。
[0135]
(2)拟合量效曲线以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpad prism5的log(inhibitor)vs.response-variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对柠檬酸摄取活性的ic
50
值。
[0136]
计算公式：
[0137]
y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((log ic
50-x)
×
hill slope))。
[0138]
ic
50
数据具体见表1。
[0139]
表1.化合物对hek293细胞柠檬酸摄取抑制活性
[0140]
编号柠檬酸摄取抑制活性编号柠檬酸摄取抑制活性la-1ala-2a
la-3ala-4ala-5ala-6ala-7ala-8ala-9bla-10cla-11ala-12bla-13ala-14ala-15ala-16ala-17ala-18ala-19bla-20ala-21bla-22ala-23cla-24ala-25ala-26ala-27bla-28cla-29ala-30bla-31bla-32cla-33cla-34c
[0141]
注：a：＜1μm，b：1-5μm，c：＞5μm。
[0142]
如表1所示，所有测试化合物对hek293细胞的柠檬酸转运体均有较好的抑制作用，所有化合物对nact均有微摩尔级抑制率，其中化合物la-33对hek293t细胞柠檬酸摄取抑制率最优，ic
50
＝60nm。
[0143]
实施例4
[0144]
本发明代表化合物la-33对aml12细胞体外药效实验
[0145]
实验步骤：
[0146]
aml12细胞在含10％fbs dmem/f12高糖培养基中培养并置于37℃含5％co2的细胞培养箱中。首先用含不同浓度化合物的无血清培养基预保护30min，后用pa和oa的混合物(指定为opa，pa/oa，1：4)在300μm中刺激肝细胞24小时以开发脂质蓄积模型。为了模仿生理状态的内源性细胞外基质，将200μm柠檬酸盐的等分试样补充到培养基中。将aml12细胞与opa孵育24小时，并将具有不同浓度的化合物la-33分别添加到培养基中24h后使用评估脂质积累和mrna表达。
[0147]
如图1所示，化合物la-33在10μm浓度下有效降低了opa刺激的aml细胞中tc、tg含量。图2表明acly显著下调，化合物la-33仅抑制slc13a5功能而不影响其表达。
[0148]
实施例5
[0149]
本发明代表化合物la-33对小鼠原代肝细胞体外药效实验
[0150]
实验步骤：
[0151]
小鼠肝原代细胞在含10％fbs dmem高糖培养基中培养并置于37℃含5％co2的细胞培养箱中。首先用含不同浓度化合物的无血清培养基预保护30min，后用pa和oa的混合物(指定为opa，pa/oa，1：4)在300μm中刺激肝细胞24小时以开发脂质蓄积模型。为了模仿生理状态的内源性细胞外基质，将200μm柠檬酸盐的等分试样补充到培养基中。将aml12细胞与opa孵育24小时，并将具有不同浓度的化合物la-33分别添加到培养基中24h后评估脂质积
累和mrna表达。
[0152]
如图3所示，化合物la-33有效降低了opa刺激的aml细胞中tc、tg含量。图4表明acly显著下调，化合物la-33仅抑制slc13a5功能而不影响其表达，与aml12细胞株展现出相同的结果。
[0153]
实施例6
[0154]
本发明代表化合物la-33体内药效实验
[0155]
1.实验步骤
[0156]
c57bl/6j小鼠购自江苏艾菱菲生物科技有限公司，适应性喂养1周后，随机分为四组。空白组正常给食，其余三组禁食48h。在禁食结束后，低剂量组和高剂量组分别以10mg/kg剂量和30mg/kg剂量进行腹腔注射。1.5h后将动物用腹膜内的钠(50mg/kg)麻醉，以收集血液样本或肝组织。使用游离脂肪酸试剂盒测量血浆和肝脏中的脂肪酸(nefa)；使用甘油三酯测试盒测量血浆和肝脏中甘油三酯(tg)含量；使用总胆固醇测试盒测量血浆和肝脏中甘油三酯(tc)含量；血浆中的hdl-c和ldl-c分别使用低密度脂蛋白胆固醇测试盒和高密度脂蛋白胆固醇测试盒进行测量。血浆样品直接测定，组织样品使用9倍体积的生理盐水匀浆后进行测定。
[0157]
2.数据处理：
[0158]
血浆样本计算公式：
[0159]
胆固醇(tc)含量(mmol/l)＝(a
样本-a
空白
)/(a
标准-a
空白
)
×c标准
[0160]
甘油三酯(tg)含量(mmol/l)＝(a
样本-a
空白
)/(a
标准-a
空白
)
×c标准
[0161]
nefa含量(mmol/l)＝(δa
样本-δa
空白
)/(δa
标准-δa
空白
)
×c样本
；
[0162]
ldl-c和hdl-c含量(mmol/l)＝(δa样本-δa空白)/(δa标准-δa空白)
×
c样本；
[0163]
如图5所示，化合物la-33能显著降低小鼠血浆中总胆固醇、总甘油三酯和游离脂肪酸含量且具有明显的剂量依赖性,同时在30mg/kg剂量下显著降低饥饿诱导小鼠血浆低密度脂蛋白含量。
[0164]
如图6所示，化合物la-33能显著降低小鼠肝脏中总胆固醇、总甘油三酯和游离脂肪酸含量且具有明显的剂量依赖性。
[0165]
如图7所示，化合物la-33能显著降低小鼠肝脏中acly的mrna表达量和dnl途径acc1、fasn的mrna表达量，但tc合成途径关键酶hmgcr的mrna表达量无显著变化，该结论与肝脏tc、tg的测定结果一致。

技术特征：

1.一种2-羟基琥珀酸类化合物，其特征在于，其为具有式ⅰ或ⅱ结构化合物或其异构体、药学上可接受的盐或它们的混合物：r1为氢、卤素、氰基、c
1-c4烷基、c
1-c4卤代烷基、c
1-c4烷氧基、c
1-c4卤代烷氧基、吡唑基或苯基；r2为1-4个氢被r
2a
取代的6-10元芳基、5-10元杂芳基、四氢喹啉基、苯并噻唑基或苯并恶唑基；r
2a
为氢、卤素、氰基、c
1-c4烷基、c
1-c4卤代烷基、c
1-c4烷氧基或c
1-c4卤代烷氧基；l、m选自-ch
2-、-nh-或-o-；所述5-10元杂芳基中的杂原子为n、o或s，杂原子的个数为1～4个。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述结构中：r1为氢、氟、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、三氟甲基、异丙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、吡唑基或苯基；r2为1-4个氢r
2a
取代的苯基、吡唑基、吡啶基或四氢喹啉基、苯并噻唑基、苯并恶唑基；r
2a
为氢、氟、氰基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、二恶茂、甲氧基、乙氧基或异丙氧基。3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，选自以下任一化合物：la-1la-18la-2la-19la-3la-20la-4la-21la-5la-22
la-6la-23la-7la-24la-8la-25la-9la-26la-10la-27la-11la-28la-12la-29la-13la-30la-14la-31la-15la-32la-16la-33
la-17la-344.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐为上述化合物与酸或碱形成的盐，所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸，所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱。5.一种含有权利要求1-4任一所述化合物的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以该化合物作为活性成分并包含药学上可接受的载体。6.一种权利要求1-4任一所述的化合物或者权利要求5所述的药物组合物在制备na
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依赖的柠檬酸转运体相关疾病的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述na
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依赖的柠檬酸转运体相关疾病为代谢性疾病或癌症，具体为高脂血症或非酒精性脂肪性肝病。

技术总结

本发明公开了一种2-羟基琥珀酸类化合物及其药物组合物和应用，该化合物为具有式Ⅰ或Ⅱ结构化合物或其异构体、药学上可接受的盐或它们的混合物。该类化合物及其药物组合物可有效抑制HEK293细胞对柠檬酸转运活性，用于代谢疾病和/或心血管疾病，在分子水平可以发挥药效，并且效果更优异，最优可达到纳摩尔浓度水平。此外，化合物制备方法简便、易操作。作。作。作。