一个调控大豆根瘤菌选择的基因GmSSA1的克隆与应用

一个调控大豆根瘤菌选择的基因gmssa1的克隆与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一个调控大豆根瘤菌选择的基因gmssa1的克隆与应用。

背景技术：

2.研究指出大豆可以与土壤中的快生型根瘤菌（ensifer spp.）和慢生型根瘤菌（bradyrhziobium spp.）进行共生固氮。大豆与根瘤菌的共生固氮作用能够为大豆的生长提供大量的氮素。然而。这两类不同类型的根瘤菌具有明显的地理分布特征，表现为：快生型根瘤菌（ensifer spp.）主要分布与碱性土壤（石灰性土壤）区域，而慢生型根瘤菌（bradyrhziobium spp.）则主要分布于酸性土壤区域。 因此，在不同土壤类型上生长的大豆需要与不同的根瘤菌结瘤固氮。但是，调控大豆与这两类根瘤菌的相互作用以及与共生菌亲和性的遗传位点或者关键基因仍不清楚。挖掘调控根瘤菌选择的关键基因，能为根据大豆基因型，土壤类型选择合适的根瘤菌菌剂，增加生物固氮提高大豆产量提供理论依据。

技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一个调控大豆根瘤菌选择的基因gmssa1的克隆与应用。
4.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：gmssa1基因在调控大豆与快生型根瘤菌和慢生型根瘤菌的亲和性方面的应用，所述的gmssa1基因存在gmssa1
sc
和gmssa1
hh
2种单倍型，gmssa1
sc
单倍型的核苷酸序列如seq id no.1所示，gmssa1
hh
单倍型的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.其中，相对于快生型根瘤菌，gmssa1
sc
单倍型遗传背景的大豆与慢生型根瘤菌具有更强的亲和性。
6.其中，gmssa1
hh
单倍型遗传背景的大豆对慢生型和快生型两种根瘤菌上的亲和性不存在明显差异。
7.一种gmssa1
sc
遗传背景大豆促生增产的方法，所述方法包括：对所述的gmssa1
sc
遗传背景大豆接种慢生型根瘤菌。
8.一种提高gmssa1
sc
遗传背景大豆在碱性土壤中的结瘤能力的方法，所述方法包括：通过基因编辑方法敲除所述gmssa1
sc 遗传背景大豆的gmssa1基因，从而提高大豆对快生型根瘤菌的亲和力，增强大豆在碱性土壤的结瘤能力。
9.本发明的显著优点在于：本发明所述的一个调控大豆根瘤菌选择基因gmssa1是通过gwas分析得到的，其是调控大豆与不同共生菌互利共生的关键基因，其包括gmssa1
sc
和gmssa1
hh
2种单倍型。其自然变异gmssa1
sc
单倍型的大豆具有较高慢生型根瘤菌亲和性，根瘤内慢生型根瘤菌的占比远远高于快生型根瘤菌，因此gmssa1
sc
赋予大豆与慢生型根瘤菌更强的亲和性。而gmssa1的另一种单倍型gmssa1
hh
基因型对快生型和慢生型两种根瘤菌均具有一定的亲和力。在碱性土壤条件下，对gmssa1
sc
基因型的大豆接种慢生型根瘤菌能明显的提高其根瘤数，增加生物
固氮，以及最终的生物量。通过基因改造手段，敲除gmssa1
sc
遗传背景的大豆的gmssa1基因，能明显促进大豆与快生型根瘤菌的结瘤能力，促进大豆对碱性土壤的适应性，增加在碱性土壤下大豆的产量。
附图说明
10.图1：gmssa1基因gwas定位结果。
11.图2：快生型和慢生型根瘤菌在不同大豆根瘤内的占比。
12.图3：接种慢生型根瘤菌促进gmssa1
sc
大豆结瘤和生物量累积。
“‑
r”表示不接种慢生型根瘤菌，“+r”表示接种慢生型根瘤菌。
13.图4：接种慢生型根瘤菌促进gmssa1
sc
大豆结瘤和生物量累积。b中的大豆为种植于碱性土壤的成熟期大豆，左边三株大豆为野生型大豆（gmssa1
sc
基因型），右边三株大豆为gmssa1
sc
基因敲除的突变体大豆。
具体实施方式
14.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
15.实施例1（1）基因定位与克隆将快生型根瘤菌ensiferrbc80在yma液体培养基中28
°
c，150 rpm培养48小时。之后通过离心（7000 rpm，15 min）收集菌体，将菌体用无菌水悬浮起来，将od
600
调整至0.5）分别接种到无菌基质种植的275份大豆品系的根部，置于大豆生长间（光照/黑暗：14 h / 10 h，26 ℃ / 24 ℃；60 % rh，光照强度为80
ꢀµ
moles/m
²
/s（光量子通量密度）），并提供低氮（500
ꢀµ
m n）营养液，将大豆和根瘤菌共培养30天，于30天后挖出大豆的根系，统计每个大豆品系根系上形成的根瘤数目，并记录。
16.gwas分析：利用获得的每个大豆品系与快生型根瘤菌ensiferrbc80结瘤的根瘤数和核心种质资源体的snp(单核苷酸多态性)变异数据，利用混合线性模型进行全基因组关联分析。结果如图1 所示，在大豆基因组的16号染体上，鉴定到了一个显著的关联区间。通过进一步分析，发现曼哈顿图上最显著关联的两个snp位点落在了glyma.16g212300 蛋白质的编码区，因此将该基因（gmssa1基因）锁定为重要的候选基因（图1）。
17.通过gmssa1基因的编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息分析，发现该基因编码一个含有tir-nbs-lrr结构域的r（resistant, 抗性）蛋白。根据先前的研究结果，认为该类蛋白一般是参与植物对病原微生物的识别。同时根据gwas的分析结果，最显著关联的位点进行基因的单倍型分类。根据基因的自然变异，gmssa1基因可以分成两个单倍型：一类是能与ensifer rbc80 高效结瘤的（gmssa1
hh
）单倍型的大豆，另一类是不能与ensiferrbc80 高效结瘤的（gmssa1
sc
）单倍型的大豆。
18.其中，gmssa1
sc
的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；gmssa1
hh
的核苷酸序列如seq id no.3所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
19.（2）基因功能验证
尽管gwas的结果表明大豆对共生菌的选择可能是由gmssa1调控的，但是缺乏直接证据。为了进一步证明gmssa1基因的功能，首先我们利用crispr方法在gmssa1
sc
的背景下，对该基因进行敲除，获得两个独立的突变体株系 gmssa1
sc
_ko1 和gmssa1
sc
_ko2（图2a）。之后将野生型大豆gmssa1
sc
和突变体大豆（gmssa1
sc
_ko1 和gmssa1
sc
_ko2）种植在土壤中，然后检测根瘤内的微生物组成。结果显示，gmssa1
sc
基因型的大豆根瘤内的共生菌主要是慢生型根瘤菌（bradyrhizobium），而该基因的突变（敲除）之后，大豆根瘤内的除了慢生型根瘤菌（bradyrhizobium）外还出现了较多的快生型根瘤菌（ensifer），而且表现为慢生型根瘤菌的占比显著低于野生型大豆（华春6号）（图2b），说明gmssa1基因功能的丧失导致大豆对慢生型根瘤菌（bradyrhizobium）的亲和力大大降低，因此证明了大豆对共生菌的亲和力是由gmssa1调控的。
20.实施例2对gmssa1
sc
基因型的大豆，接种慢生型根瘤菌能显著提高根瘤数，增加大豆生物量和产量。
21.先前的研究表明，碱性土壤中大豆的共生菌主要以快生型的根瘤菌（ensifer）为主，缺乏慢生型根瘤菌（bradyrhizobium）。为了探讨在碱性土壤下对gmssa1
sc
基因型的大豆接种慢生型根瘤菌（bradyrhizobium）是否能促进其在碱性土壤下的结瘤固氮能力，进一步评价了在碱性土壤下对不同基因型大豆对接种慢生型根瘤菌（bradyrhizobium bxyd3）的响应。具体操作如下：分别选取了具有gmssa1
sc
基因型的大豆品系bx10 和具有gmssa1
hh
基因型的大豆品系bd2，在碱性土壤区域（试验地点：河北省农科院粮油所试验基地，土壤ph 为8.6）。将选定的大豆品系种植于田间（行距40 cm，株距20 cm），每个小区行长3 m。实验设置接种与不接种慢生根瘤菌（bxyd3），每个品系、每个处理种植三个小区。在大豆的结荚期，收获大豆的，统计不同处理下不同基因型大豆的根瘤菌和生物量。结果如图所示：在不接种慢生型根瘤菌（bradyrhizobium bxyd3）的条件下，bx10大豆的根瘤数显著低于bd2基因型的大豆（图3a）。而在接种慢生型根瘤菌（bxyd3）之后，bx10的根瘤数相比其不接种处理显著提高，并且接种慢生型根瘤菌之后bx10和bd2之间的根瘤数差异将明显缩小。说明接种慢生型根瘤菌能提高gmssa1
sc
基因型大豆的结瘤固氮能力。进一步分析发现，gmssa1
sc
基因型大豆在接种了慢生型根瘤菌之后不仅其根瘤数量明显增加，其生物量也显著增加（图3b），表明接种慢生型根瘤菌能够促进gmssa1
sc
基因型大豆结瘤固氮能力，有助于提高其在碱性土壤的适应性。
22.实施例3在gmssa1
sc
的背景下，敲除大豆gmssa1基因提高大豆在碱性土壤下的结瘤数量，有助于提高其对碱性土壤的适应性。
23.先前结果表明，对gmssa1
sc
基因型大豆接种慢生型根瘤菌（bradyrhizobium）能够明显促进其结瘤固氮能力。推测通过crispr方法敲除gmssa1
sc
基因是否会提高gmssa1
sc
基因型大豆在碱性土壤的结瘤固氮能力。为此，将野生型大豆（gmssa1
sc
）和基因敲除的大豆（gmssa1
sc
_ko1）种植于碱性土壤上，然后分析敲除gmssa1
sc
其对结瘤固氮和生物量的影响（田间试验设计如前面所述）。结果显示：野生型大豆（gmssa1
sc
）在碱性土壤的根瘤数显著低于gmssa1
sc
_ko1基因型的大豆（图4a），且gmssa1
sc
_ko1的大豆荚数，单株粒数和单株粒重均高于野生型大豆（gmssa1
sc
）（图4b，图4c，图4d，图4e）。说明了改造gmssa1可改变大豆对根瘤
菌的亲和性，能用于提高对快生型根瘤菌的亲和性，促进大豆适应碱性土壤。
24.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.gmssa1基因在调控大豆与快生型根瘤菌和慢生型根瘤菌的亲和性方面的应用，其特征在于：所述的gmssa1基因存在gmssa1
sc
和gmssa1
hh 2种单倍型，gmssa1
sc
单倍型的核苷酸序列如seq id no.1所示，gmssa1
hh
单倍型的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：相对于快生型根瘤菌，gmssa1
sc
单倍型遗传背景的大豆与慢生型根瘤菌具有更强的亲和性。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：gmssa1
hh
单倍型遗传背景的大豆对慢生型和快生型两种根瘤菌上的亲和性不存在明显差异。4.一种gmssa1
sc
遗传背景大豆促生增产的方法，其特征在于：对所述的gmssa1
sc
遗传背景大豆接种慢生型根瘤菌。5.一种提高gmssa1
sc
遗传背景大豆在碱性土壤中的结瘤能力的方法，其特征在于：通过基因编辑方法敲除所述gmssa1
sc 遗传背景大豆的gmssa1基因，从而提高大豆对快生型根瘤菌的亲和力，增强大豆在碱性土壤的结瘤能力。

技术总结

本发明公开了一个调控大豆根瘤菌选择的基因GmSSA1的克隆与应用。所述基因GmSSA1是通过GWAS分析克隆到的，其存在GmSSA1

技术研发人员：

钟永嘉 廖红 李艳君

受保护的技术使用者：

福建农林大学

技术研发日：

2022.09.22

技术公布日：

2023/3/3