一种检测靶核酸的方法和试剂盒与流程

1.本公开属于核酸检测领域，具体涉及一种检测靶核酸的方法和试剂盒。

背景技术：

2.天性耳聋导致的原因有：遗传、药物、感染、疾病、环境噪声污染及意外事故等，其中遗传因素导致的听力丧失占了50％以上。遗传性听力丧失根据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合征性听力丧失(syndromic hearing loss，shl)和非综合征性听力丧失(nonsyndromic hearing loss，nshl)，其中nshl占70％以上。nshl根据遗传方式可分为：常染体隐形遗传性耳聋、常染体显性遗传性耳聋、x连锁遗传性耳聋、y连锁遗传性耳聋和线粒体遗传性耳聋，其中75％-80％为常染体隐形遗传，10-20％为常染体显性遗传，x连锁和线粒体遗传不到2％。迄今为止，158个非综合征性耳聋位点已定位，包括57个常染体显性位点、77个常染体隐性位点、7个x染体连锁位点、2个修饰位点、1个y染体位点和14个线粒体位点。通过位置克隆的方法已确定53个致病基因，包括27个常染体隐性基因、21个常染体显性基因、1个x染体连锁基因和4个线粒体基因。在这些基因中gjb2、slc26a4和线粒体12s rrna基因的研究比较深入，不同人存在不同的突变形式和突变频率，是我国最主要的致聋基因。新生儿耳聋基因检测辅助诊断先天性耳聋和遗传性耳聋。
3.目前对于多重基因检测，常见的技术主要包括基因芯片技术、荧光定量pcr技术、高通量测序技术及熔解曲线技术。基因芯片技术通量较高，但其存在着优化困难、易污染、灵敏度低、仪器不普及等缺点；荧光定量pcr技术是目前较为常见的技术，该技术在检测位点少时有着明显优势，但在检测位点多时通量低的缺点就暴露出来；高通量测序技术，通量高信息丰富，但其高额成本及较长的检测时间制约该技术的普及。熔解曲线技术与荧光定量pcr技术类似，非常节省标本，但是通量不高仍是目前最大的缺点。
4.因此，如果低成本、高通量地检测目标基因，例如高通量地检测耳聋基因，将在众多多重基因检测方法中显示出明显优势。

技术实现要素：

5.本公开的目的在于提供一种能够高通量检测目标基因的方法，能够实现高灵敏度和准确度地检测包括耳聋基因等的目标基因。
6.本公开为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：
7.本公开第一方面提供了一种检测靶核酸的方法，其包括：
8.(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；(ii)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(iii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过
所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；
9.(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；
10.(c)对步骤(b)孵育结束的反应混合物在对应检测信号通道进行熔解曲线分析。
11.本公开第二方面提供了一种用于检测靶核酸的试剂盒，其包括：(i)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(ii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；以及任选地(iv)核酸聚合酶。
12.本公开所提供的检测靶核酸的方法和试剂盒，通过采用含有封闭基团的引物，提高靶核酸扩增的特异性和准确度，进一步结合连接有不同检测信号基团的探针，完成熔解曲线，实现不同靶核酸在不同检测信号通道检测，进一步提高了检测通量，从而实现了高通量、高灵敏度和高准确度检测靶核酸。
附图说明
13.图1a至图1r为实施例1的国家参考品多重pcr-熔解曲线结果。
14.图2a至图2e为实施例2的样品的多重pcr-熔解曲线结果。
具体实施方式
15.为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
16.定义
17.如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
18.如本文所用，术语“约”、“基本上”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。
19.本公开中使用的术语“核酸”是指核苷酸碱基的生物聚合物，并且可以包括但不限于脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、微小rna(mirna)，以及肽核酸(pna)、修饰的寡核苷酸(例如，包含对生物rna或dna来说不常规的核苷酸的寡核苷酸，如2
′‑
o-甲基化寡核苷酸)等。所述核苷酸可以是天然的或非天然的，取代的或未取代的，修饰的或未修饰的。所述核苷酸可以通过磷酸二酯键连接，或通过硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、磷酸酯键等连接。所述多核苷酸可另外包含非核苷酸元件如标签、猝灭剂、封闭基团等。所述核酸可以是例如单链或双链的。
20.本公开中使用的术语“靶核酸”或“靶区域”是指有意要扩增的核酸的任何区域或序列。
21.本公开中使用的术语“dna”是指脱氧核糖核酸，其是形成遗传指令的长链聚合物
生物大分子。dna的亚基是核苷酸。dna中的每个核苷酸由含氮碱基、五碳糖(2-脱氧核糖)和磷酸基团组成。相邻的核苷酸通过由脱氧核糖和磷酸形成的二酯键连接，从而形成长链框架。通常，dna核苷酸中有四种类型的含氮碱基，即腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)和胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)。两条dna长链上的碱基经由氢键配对，其中腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)配对，鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)配对。
22.本公开中使用的“无细胞dna”是指从细胞释放并存在于循环系统(例如血液)中的dna，其来源通常被认为是在细胞凋亡中释放的基因组dna。
23.本公开中使用的“循环肿瘤dna”是指源自肿瘤细胞的无细胞dna。在人体中，肿瘤细胞由于诸如细胞凋亡和免疫应答等原因，会将其基因组dna释放到血液中。由于正常细胞也可以将其基因组dna释放到血液中，因此循环肿瘤dna通常仅占无细胞dna中的很小一部分。
24.本公开第一方面提供了一种检测靶核酸的方法，其包括：
25.(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；(ii)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(iii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；
26.(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；
27.(c)对步骤(b)孵育结束的反应混合物在对应检测信号通道进行熔解曲线分析。
28.本公开中使用的术语“核酸样品”是指含有核酸的任何样品，包括但不限于细胞、组织和体液等。在一些实施方案中，所述核酸样品是组织，例如，活检组织或石蜡包埋的组织。在一些实施方案中，所述核酸样品是细菌或者动物或植物的细胞。在一些其他实施方案中，所述核酸样品是体液，例如，血液、血浆、血清、唾液、羊膜穿刺液、胸腔积液、腹腔积液等。在一些实施方案中，所述核酸样品是血液、血清或血浆。
29.在一些实施方案中，所述核酸样品包含或疑似包含所述靶核酸。
30.在一些具体实施方案中，所述靶核酸是dna、rna或杂合体或其混合物。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是基因组dna。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是无细胞dna(cfdna)。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是循环肿瘤dna(ctdna)。
31.在一些实施方案中，所述靶核酸为单链dna(如cdna)或双链dna(如基因组dna)。
32.在一些实施方案中，所述靶核酸还可以是单链dna和双链dna的混合物，例如其中一部分靶核酸为单链dna分子，另一部分靶核酸为双链dna分子。
33.在一些实施方案中，所述靶核酸来源于蛋白突变体。
34.在一些实施方案中，所述靶核酸包括野生型和/或突变型。
35.在一些实施方案中，其中所述靶核酸选自野生型或突变型的耳聋基因gjb2、gjb3、slc26a4、线粒体12s rrna或其片段的至少一种。
36.在一些实施方案中，所述突变型的gjb2基因包含35delg、176_191del16、235delc突变的一个或多个。
37.在一些实施方案中，所述突变型的gjb3基因包含538c》t和547g》a突变的一个或多
个。
38.在一些实施方案中，所述突变型的slc26a4基因包含281c》t、589g》a、1174a》t、1226g》a、1229c》t、1975g》c、2027t》a、2162c》t、2168a》g、ivs7-2a》g、ivs15+5g》a突变的一个或多个。
39.在一些实施方案中，所述突变型的线粒体12s rrna基因包含1095t》c、1494c》t、1555a》g突变的一个或多个。
40.在一些实施方案中，所述靶核酸的种类至少为1、2、5、10、15或20种。可以理解的是，在一些实施方案中，所述靶核酸的种类包括基因的种类和/或基因中突变的数量和/或种类。示例性的，在一些实施方案中，当需要检测同一个基因中的两个不同的突变，可以理解为所述样品中存在两种靶核酸。
41.在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的量不超过1个拷贝，2个拷贝，3个拷贝、4个拷贝、5个拷贝、6个拷贝、7个拷贝、8个拷贝、9个拷贝、10个拷贝、12个拷贝、15个拷贝、18个拷贝、20个拷贝、30个拷贝、50个拷贝、80个拷贝或100个拷贝。在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的摩尔百分比(摩尔/摩尔)小于50％、20％、10％、8％、6％、5％、3％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的摩尔数与非靶核酸的摩尔数的比小于50％、20％、10％、8％、6％、5％、3％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。
42.本公开中使用的术语“引物”是指寡核苷酸，所述寡核苷酸当被放置在引发引物延伸的条件下时能够充当合成起始点。引物可以包含天然核糖核酸、脱氧核糖核酸或其他形式的天然核酸。引物还可包含非天然核酸(例如，lna、zna等)。
43.本公开中，引物可以通过使用任何合适的方法制得，例如磷酸三酯和磷酸二酯法或其自动化实施方案。在一个这样的自动化实施方案中，将二乙基亚磷酰胺用作原料并且其可以如beaucage et al.，tetrahedron letters，22：1859-1862(1981)所述进行合成。美国专利号4，458，006中描述了一种在改性固体载体上合成引物的方法。还可以使用已经从生物来源分离出的引物，例如限制性内切核酸酶消化物。在一些实施方案中，可以用末端转移酶(gibco brl)合成在3
′
末端具有封闭核苷酸的引物(nuc aci res 2002，30(2))。
44.本公开中使用的术语“引物对”是指由正向引物和反向引物组成的一对引物，其分别与待扩增序列的一部分互补，其中所述正向引物定义所述扩增序列的起始点并且所述反向引物定义所述扩增序列的终止点。当用于描述引物和待扩增序列之间的关系时，术语“互补的”是指所述引物与所述待扩增序列互补或与所述待扩增序列的互补序列互补。
45.可以基于靶核酸的序列设计引物对。在一些实施方案中，每种类型的引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补。
46.在一些实施方案中，每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团。在一些实施方案中，每个引物对中的两个引物都是包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团的封闭引物。
47.本公开中使用的术语“封闭引物”是指具有封闭基团的引物。
48.本公开中使用的术语“封闭基团”是指在核酸链中共价连接并且能够阻断聚合酶延伸的任何化学基团。在一些实施方案中，具有封闭基团的所述核苷酸是在每个封闭引物的3
′
末端处或附近的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，具有封闭基团的所述核苷酸与所
features and applications of pna，lna，and morpholino.appl microbiol biotechnol71(5)：575-586，2006和vester b et al.，lna(locked nucleic acid)：high-affinity targeting of complementary rna and dna.biochemistry43(42)：13233-13241，2004。
60.在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少5、10或20组引物对；优选10-50组。
61.在一些实施方案中，所述至少一组引物对互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。
62.在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50％的序列互补性；
63.在一些实施方案中，在任两组引物对的任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对。
64.在一些实施方案中，在任两组引物对的任何两个引物之间存在不超过45％、40％、35％、30％、25％或20％的序列互补性。
65.本公开中当提及核苷酸时所使用的术语“核苷酸互补性”或“互补性”是指核酸链上的能够与另一核酸链上的另一核苷酸发生碱基配对的核苷酸。例如，在dna中，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)互补，鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)互补。又例如，在rna中，腺嘌呤(a)与尿嘧啶(u)互补，鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)互补。
66.本公开中使用的术语“互补百分比”是指，当一个核酸分子与另一个核酸分子退火时，在该核酸分子中与所述另一个核酸分子的核苷酸残基具有互补性的核苷酸残基的百分比。通过将所述第一核酸中与所述第二核酸中相应位置处的核苷酸互补的核苷酸的数目除以所述第一核酸的总长度来计算互补百分比。
67.还可以常规地使用blast程序(基本局部比对搜索工具)和本领域已知的powerblast程序(altschul等)确定核酸的互补百分比或核酸中与另一个核酸互补的核苷酸的数目(altschul et al.，j.mol.biol.，215，403-410，1990；zhang and madden，genomeres.，7，649-656,1997)。
68.本公开中使用的术语“x个核苷酸配对”是指核酸分子中核苷酸残基的数目，当所述核酸分子与另一个核酸分子退火时，所述核苷酸残基与所述另一个核酸分子中的相应核苷酸互补。例如，“18个核苷酸配对”是指第一核酸分子的18个核苷酸残基与第二个核酸分子的18个核苷酸残基具有互补性。在这个例子中，所述互补的核苷酸可以彼此邻接或与非互补性核苷酸穿插。
69.在一些实施方案中，所述引物对选自表1的引物对的至少一组；优选至少5组；优选至少10组；其中，不同引物对可用于扩增不同靶核酸或相同靶核酸的包含不同突变的片段；
70.示例性的，所述引物对可用于扩增的靶核酸或具有突变的靶核酸(或靶核酸的不同突变)如下表1所示。
71.[0072][0073]
在一些实施方案中，所述引物对中，至少一条引物的3
′
末端处存在2
′
，3
′‑
双脱氧核苷酸封闭基团。
[0074]
在一些实施方案中，所述引物对中的两条引物的3
′
末端处各自存在2
′
，3
′‑
双脱氧核苷酸封闭基团。
[0075]
可以根据封闭引物中包含的封闭基团来选择去封闭剂。去封闭剂可以是任何这样的试剂：当封闭引物中具有封闭基团的核苷酸与靶核酸中相应的核苷酸互补时，其在扩增所述靶核酸的条件下可以导致所述封闭引物中的封闭基团的去封闭。在一些实施方案中，所述去封闭剂选自cs5 dna聚合酶，所述cs5 dna聚合酶具有选自g46e、l329a、q601r、d640g、i669f、s671f、e678g的突变或这些突变的组合；在一些实施方案中，所述去封闭剂选自具有f667y突变的amplitaq或klentaq聚合酶、焦磷酸盐或rnase h2。
[0076]
在一些实施方案中，当所述封闭基团是2
′
，3
′‑
双脱氧核苷酸时，所述去封闭剂是焦磷酸盐。在一些实施方案中，当所述封闭基团是2
′‑
o-po3核苷酸时，所述去封闭剂是cs5 dna聚合酶，所述cs5 dna聚合酶具有选自g46e、l329a、q601r、d640g、i669f、s671f、e678g的突变或其组合(例如，美国专利号20070154914中显示的dna聚合酶)。在一些实施方案中，当所述封闭基团是2
′‑
o-po3核苷酸时，所述去封闭剂是具有f667y突变的amplitaq或klentaq聚合酶。在一些实施方案中，当所述封闭基团是核糖核苷酸残基时，所述去封闭剂是rnase h2。
[0077]
在一些实施方式中，所述检测信号基团包括荧光基团和/或淬灭集团。
[0078]
在一些实施方案中，所述探针的3’端一侧的末端碱基上连接淬灭基团，探针的5’端一侧的末端碱基上连接荧光基团。
[0079]
在一些实施方案中，所述淬灭基团和荧光基团各自独立地通过化学键、连接基团或1-3个核苷酸构成的接头与碱基连接；
[0080]
在一些实施方案中，所述探针具有如下的结构：
[0081]
z1-z2-z3
[0082]
其中，z1为荧光基团；
[0083]
z2为特异性互补核酸序列；
[0084]
z3为淬灭基团；
[0085]
“‑”
为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
[0086]
在一些实施方案中，所述荧光基团z1选自fam、vic、joe、ned、tet、hex、tamra、rox、texasred、cy3、cy5、cy5.5或cy7；
[0087]
在一些实施方案中，所述淬灭基团z3选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、mgb或tamara；
[0088]
在一些实施方案中，所述反应混合物包含1-20条探针；优选10-20条。
[0089]
在一些实施方案中，所述探针序列选自seq id no.61～80的至少一种。示例性的，所述探针可用于检测的靶核酸或具有突变的靶核酸(或靶核酸的不同突变)如下表2所示。需要说明的是，本公开中涉及的“探针的序列”，指的是探针中的特异性互补核酸的序列，其中不涉及检测信号基团；当提及“探针”时，其包含了检测信号基团。
[0090]
表2
[0091][0092][0093]
在一些实施方案中，所述探针序列的3’端一侧的末端碱基上连接淬灭基团，探针的5’端一侧的末端碱基上连接荧光基团。
[0094]
在一些实施方式中，通过探针tm值与探针上荧光基团提供的不同检测通道的组合，能够在同一体系中同时实现多种靶核酸的熔解曲线检测，即高通量熔解曲线检测。
[0095]
在一些实施方式中，反应体系中，相同检测通道中的任意两条探针的tm值相差至少为0.1℃，至少0.5℃，至少1℃，至少2℃，至少3℃，或至少5℃。
[0096]
在一些实施方式中，反应体系中，相同检测通道中的任意两条探针的tm值相差不超过5℃，不超过3℃，不超过2℃，或不超过0.5℃。
[0097]
相同检测通道中的任意两条探针的tm值相差越大，检测的准确度越高，相应地，可检测的目标数量越少；tm值相差越小，检测的准确度下降，可检测的目标数量相应增多，本领域技术人员可根据检测需要设计探针的tm值，本公开在此不做限定。在一些实施方案中，当采用本公开的方法检测某特定的靶核酸时，选用的引物对和探针需要配套使用，即例如，将用于扩增某靶核酸或突变的引物对，与用于检测该靶核酸或突变的探针配套使用。
[0098]
在另一些实施方案中，可采用相同的探针用于检测同一靶核酸的野生型和突变型；在一些实施方案中，同一靶核酸的野生型和突变型不在同一反应体系中检测。
[0099]
在另一些实施方案中，所述探针选自表3所示的探针的至少一种。
[0100]
表3
[0101][0102][0103]
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶可以选自dna聚合酶家族如大肠杆菌dna聚合酶i(例如大肠杆菌dna聚合酶i、taq dna聚合酶、tthdna聚合酶、tfi dna聚合酶等)。该聚合酶可含有天然存在的野生型序列或其修饰变体及其片段。
[0104]
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶可以选自dna聚合酶家族(例如大肠杆菌dna聚合酶i)的修饰的dna聚合酶，例如n-末端缺失的dna聚合酶(如大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段)、n-末端缺失的taq聚合酶(包括taq dna聚合酶的stoffel片段、klentaq-235和klentaq-278)等。
[0105]
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶包括，但不限于，热稳定dna聚合酶。热稳定dna聚合酶的实例包括，但不限于：tth dna聚合酶、tfi dna聚合酶、taq dna聚合酶、n-末端缺失的taq聚合酶(例如，dna聚合酶的stoffe1片段、klentaq-235和klentaq-278)。其他dna
聚合酶包括klentaqi、taquenase
tm
(amersham)、ad-vantaq
tm
(clontech)、gotaq、gotaq flexi(promega)和klentaq-s dna聚合酶。
[0106]
在一些实施方案中，核酸聚合酶可以是市售的dna聚合酶混合物，包括但不限于，taqla、tthla或expand high fidelitypius enzyme blend(roche)；tthxl klen taqla(perkin-elmer)；(takara shuzo)；(life technologies)；advantage
tm klentaq，advantage
tm tth和advantage2
tm
(clontech)；taqextender
tm
(stratagene)；expand
tm long template和expandt
m high fidelity(boehringer mannheim)；以及triplemaster
tm enzyme mix (eppendorf)。
[0107]
为了进一步减少不需要的核酸的扩增，可以将一种或多种其它聚合酶添加到反应混合物中。在一些实施方案中，所述反应混合物包含高保真聚合酶。在一些实施方案中，所述高保真聚合酶是pfu dna聚合酶、klentaq-1、vent或deepvent。
[0108]
本公开所述反应混合物的孵育可以在多循环过程中进行，所述多循环过程采用几个交替的加热和冷却步骤来扩增dna(参见美国专利号4,683,202和美国专利号4,683,195)。在一些实施方案中，所述孵育包括以下步骤：使靶核酸变性；使引物与靶核酸退火，以允许形成靶-引物杂合体；并且孵育所述靶核酸-引物杂合体以允许核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
[0109]
以下简要描述扩增过程的实例。首先，将反应混合物加热至足以使双链靶dna变性为其两条单链的温度。然后降低反应混合物的温度以使特定的单链引物、探针与它们各自的互补性单链靶dna退火。在退火步骤之后，将温度维持或调节至所用dna聚合酶的最佳温度，这允许在所述退火的寡核苷酸引物的3
′
末端掺入互补的核苷酸，从而重建双链靶dna。通过使用热稳定的dna聚合酶，可以根据需要将由变性、退火和延伸组成的循环重复多次以产生所需产物，并且在每次热变性后不添加聚合酶(参见“current protocols in molecular biology”，f. m.ausubel et al.，john wiley and sons，inc.，1998)。
[0110]
在一些实施方案中，在约90℃-100℃下进行约10秒至10分钟(优选对于第一次循环进行约1至8分钟)的靶核酸变性。在一些实施方案中，在约5℃-60℃下进行约3秒至10分钟的引物与靶核酸的退火。在一些实施方案中，孵育核酸-引物杂合体，使得在约60℃-90℃下进行约1分钟至15分钟的核酸聚合酶对靶核酸的扩增。在一些实施方式中，靶核酸变性后，在约60℃下反应90s至150s，同时完成退火和延伸(扩增)。
[0111]
在一些实施方案中，所述孵育步骤重复至少1次、5次、10次、15次、20次、25次、30次、35次或40次。在一些实施方案中，所述孵育步骤重复约20次至约50次。
[0112]
在一些实施方式中，所述扩增条件包括：90-95℃，8-10min；95℃，10-15s，60℃100-150s，35-42个循环。
[0113]
在一些实施方案中，基本上不在步骤(b)中扩增除所述靶核酸以外的核酸。在一些实施方案中，在所述孵育步骤后获得的产物中不需要的核酸的摩尔百分比小于20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。
[0114]
发明人在研究中发现，本公开的反应混合物中所包含的探针不会影响扩增反应，或者说不会降低扩增过程的特异性或灵敏度。
[0115]
在一些实施方式中，所述探针通过与扩增产物的特异性结合，从而用于检测所述靶核酸的扩增产物。
[0116]
本公开第二方面提供了一种用于检测靶核酸的试剂盒，其包括：(i)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(ii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；以及任选地(iv)核酸聚合酶；
[0117]
在一些实施方案中，所述引物对选自以下组的至少一组，优选至少5组，优选至少10组；
[0118]
引物对组上游引物下游引物引物对组上游引物下游引物引物对1seqidno.1seqidno.3引物对21seqidno.31seqidno.32引物对2seqidno.2seqidno.3引物对22seoidno.31seqidno.33引物对3seqidno.4seqidno.6引物对23seqidno.34seqidno.35引物对4seqidno.5seqidno.6引物对24seoidno.34seqidno.36引物对5seqidno.7seqidno.9引物对25seqidno.37seqidno.38引物对6seqidno.8seqidno.9引物对26seqidno.37seqidno.39引物对7seqidno.10seqidno.11引物对27seqidno.40seqidno.42引物对8seqidno.10seqidno.12引物对28seqidno.41seqidno.42引物对9seqidno.13seqidno.15引物对29seqidno.43seqidno.44引物对10seqidno.14seqidno.15引物对30seqidno.43seqidno.45引物对11seqidno.16seqidno.18引物对31seqidno.46seqidno.47引物对12seqidno.17seqidno.18引物对32seoidno.46seqidno.48引物对13seqidno.19seqidno.20引物对33seqidno.49seqidno.51引物对14seqidno.19seqidno.21引物对34seqidno.50seqidno.51引物对15seqidno.22seqidno.23引物对35seqidno.52seqidno.53引物对16seqidno.22seqidno.24引物对36seqidno.52seqidno.54引物对17seqidno.25seqidno.27引物对37seqidno.55seqidno.57引物对18seqidno.26seqidno.27引物对38seqidno.56seqidno.57引物对19seqidno.28seqidno.30引物对39seqidno.58seqidno.59引物对20seqidno.29seqidno.30引物对40seqidno.58seqidno.60
[0119]
在一些实施方案中，所述探针序列选自seq id no.61～80的至少一种，优选至少5种，优选至少10种。
[0120]
在一些实施方案中，所示探针选自表3的探针的至少一种，优选至少5种，优选至少10种。
[0121]
在一些实施方案中，所述试剂盒中包含的引物对或其组合所对应的靶核酸，与探针或其组合对应的靶核酸相同。
[0122]
在一些实施方案中，通过探针的tm与探针上的荧光通道的组合，实现高通量熔解曲线检测。
[0123]
在一些实施方案中，所述试剂盒中包含如下的引物对的组合：
[0124]
引物对组上游引物下游引物引物对组上游引物下游引物
引物对5seqidno.7seqidno.9引物对22seoidno.31seqidno.33引物对7seqidno.10seqidno.11引物对25seqidno.37seqidno.38引物对11seqidno.16seqidno.18引物对28seqidno.41seqidno.42引物对15seqidno.22seqidno.23引物对34seqidno.50seqidno.51引物对20seqidno.29seqidno.30引物对38seqidno.56seqidno.57
[0125]
和如下的探针的组合：
[0126]
名称序列编号序列(5
’‑3’
)p3seqidno.635`-rox-agtcgtaacatggtaagtgtactgga-bhq2-3`p4seqidno.645`-fam-ttatctcccccttgatgaacttcctcttcttc-bhq1-3`p6seqidno.665`-fam-cgatgagcaggccgactttgtctgcaacaccctg-bhq1-3`p8seqidno.685`-vic-cctccgccgtctgcatcgtactcaccatctgt-bhq1-3`p10seqidno.705`-vic-cgctagtggccacgctgcaaggtaag-bhq1-3`p11seqidno.715`-rox-cgtcctgattgccagtgccctgactct-bhq2-3｀p13seqidno.735｀-cy5-cgccaccactgctctttcccgca-bhq3-3`p14seqidno.745`-vic-tctttcctccagtgctctcctg-bhq1-3`p17seqidno.775`-fam-tgtggagctatatctttcctggac-bhq1-3`p19seqidno.795`-cy5-tgatgctatactctatctacagaaccaagt-bhq3-3`
[0127]
在一些实施方式中，所述试剂盒中包含如下的引物对的组合：
[0128]
引物对组上游引物下游引物引物对组上游引物下游引物引物对6seqidno.8seqidno.9引物对21seqidno.31seqidno.32引物对8seqidno.10seqidno.12引物对26seqidno.37seqidno.39引物对12seqidno.17seqidno.18引物对27seqidno.40seqidno.42引物对16seqidno.22seqidno.24引物对33seqidno.49seqidno.51引物对19seqidno.28seqidno.30引物对37seqidno.55seqidno.57
[0129]
和如下的探针的组合：
[0130][0131]
在一些实施方式中，所述试剂盒中包含如下的引物对的组合：
[0132][0133][0134]
和如下的探针的组合：
[0135]
名称序列编号序列(5
’‑3’
)p1seqidno.615`-fam-cgccagaacactacgagccacagcttaaaactc-bhq1-3`p2seqidno.625`-vic-cgacatttaactaaaacccctacgcattta-bhq1-3`p5seqidno.655`-fam-ccatagccggatgtgggagat-bhq1-3`p7seqidno.675`-cy5-cgatctttccaatgctggtggagtgtttgttca-bhq3-3、p9seqidno.695`-rox-aacatcgtggactgctacattgc-bhq2-3`p12seqidno.725`-cy5-agacaaacaaggaattattaaaaccaatggag-bhq3-3`p15seqidno.755`-vic-tgttttgtggccaccactgctctttcccgc-bhq1-3`p16seqidno.765`-vic-ccagtcctattttctatggcaatgtcgatggt-bhq1-3`p18seqidno.785`-rox-cgcttgactgtggagctatatctttcctggacg-bhq2-3`p20seqidno.805`-fam-ttctttgacgacaacattagaaaggacacattc-bhq1-3`
[0136]
在一些实施方式中，所述试剂盒中包含如下的引物对的组合：
[0137]
引物对组上游引物下游引物引物对组上游引物下游引物引物对1seqidno.1seqidno.3引物对23seqidno.34seqidno.35引物对4seqidno.5seqidno.6引物对30seqidno.43seqidno.45引物对10seqidno.14seqidno.15引物对31seqidno.46seqidno.47引物对14seqidno.19seqidno.21引物对35seqidno.52seqidno.53引物对18seqidno.26seqidno.27引物对39seqidno.58seqidno.59
[0138]
和如下的探针的组合：
[0139]
名称序列编号序列(5
’‑3’
)p1seqidno.615`-fam-cgccagaacactacgagccacagcttaaaactc-bho1-3`p2seqidno.625`-vic-cgacatttaactaaaacccctacgcattta-bhq1-3`p5seqidno.655`-fam-ccatagccggatgtgggagat-bhq1-3`p7seqidno.675`-cy5-cgatctttccaatgctggtggagtgtttgttca-bhq3-3、p9seqidno.695`-rox-aacatcgtggactgctacattgc-bhq2-3`p12seqidno.725`-cy5-agacaaacaaggaattattaaaaccaatggag-bhq3-3`p15seqidno.755`-vic-tgttttgtggccaccactgctctttcccgc-bhq1-3`p16seqidno.765`-vic-ccagtcctattttctatggcaatgtcgatggt-bhq1-3`p18seqidno.785`-rox-cgcttgactgtggagctatatctttcctggacg-bhq2-3`p20seqidno.805`-fam-ttctttgacgacaacattagaaaggacacattc-bhq1-3`
[0140]
在一些实施方式中，所述试剂盒中包含上述4组引物对的组合和探针的组合。
[0141]
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶为高保真聚合酶。
[0142]
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下组的试剂：dntps、mg2+(例如mgcl2)、牛血清白蛋白、ph缓冲液(例如tris hcl)、甘油、dnase抑制剂、rna酶、so
42-、cl-、k
+
、ca
2+
、na
+
和(nh4)
+
。
[0143]
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含说明书，所述说明书示出了如何进行所述靶核酸的扩增(例如示出了本公开所述的方法)。
[0144]
在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测耳聋基因突变。
[0145]
在一些实施方案中，所述的耳聋基因突变选自下组：1095t＞c、1494c＞t、1555a＞g、299_300delat、235delc、176_191del16、35delg、538c＞t、547g＞a、281c＞t、589g＞a、ivs7-2a＞g、1174a＞t、1226g＞a、1229c＞t、ivs15+5g＞a、1975g＞c、2027t＞a、2162c＞t、2168a＞g的至少一种。
[0146]
本公开发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，提供了一种多靶核酸扩增结合熔解曲线检测的方法，通过优化引物及相应探针，获得的特异性引物对组及探针集合，在扩增阶段可以高效特异地扩增靶核酸，进一步将所得扩增产物在对应通道进行熔解曲线分析。具体地，每管加入不同与待测靶核酸对应的引物对和探针，其中靶核酸数目可以大于1、2、5、10、20，每管多重扩增后获得的靶核酸丰度提高的扩增产物，再结合多通道熔解曲线，在不同通道上的不同温度范围与探针tm相对应，判断待测样本中含有哪些待测核酸。本公开的一管多重扩增及熔解曲线检测特异性好灵敏度高，解决了熔解曲线技术检测上通量的问题。
[0147]
以下结合具体实施例对本公开的检测靶核酸的方法进行详细说明。
[0148]
实施例
[0149]
实施例1耳聋突变基因国家参考品检测
[0150]
(1)国家参考品处理
[0151]
耳聋基因突变检测国家参考品(批号360013-201701)，样本类型为干血片，采用干血片dna抽提试剂盒(天根)，在全自动核酸提取仪ssnp-9600a全自动核酸提取仪(硕世)抽提，得到待测样本核酸，采用qubit2.0(life invitrogen)定量抽提核酸，抽提浓度如下表4：
[0152]
表4
[0153]
国家参考品编号qubit浓度(ng/ul)参考品突变型n0114.8野生型p011235delgp0212.9176_191del16p0316.1235delcp0410.8299_300delat/176_191del16p0515538c》tp0626.7547g＞ap0719.8281c＞tp0815589g＞ap099.5ivs7-2a＞gp1020.5ivs7-2a＞g/1174a＞t
p115.3ivs7-2a＞g/1226g＞ap129.8ivs15+5g＞ap139.11975g＞cp1415.12027t＞a/1555a＞g(～2.5％)p15122162c》tp16142168a》gp1713.31095t》c/ivs7-2a＞gp1815.91494c》t
[0154]
(2)扩增反应混合物的配制
[0155]
用含有表1的引物对及表3的探针配置成扩增反应混合物，加入不含dna酶/rna酶的水至50μl终体积，所述扩增反应混合物含有0.2mm dntp、3mm mgcl2、90nm焦磷酸盐和2个单位的klentaq-s dna聚合酶。各管中引物对和探针如下所示：
[0156]
a管：采用表1中的引物对5、7、11、15、20、22、25、28、34、38和表3中的探针p3、p4、p6、p8、p10、p11、p13、p14、p17和p19。
[0157]
b管：采用表1中的引物对2、3、9、13、17、24、29、32、36、40和表3中的探针p1、p2、p5、p7、p9、p12、p15、p16、p18、p20。
[0158]
c管：采用表1中的引物对6、8、12、16、19、21、26、27、33、37和表3中的探针p3、p4、p6、p8、p10、p11、p13、p14、p17和p19。
[0159]
d管采用表1中的引物对1、4、10、14、18、23、30、31、35、39和表3中的探针p1、p2、p5、p7、p9、p12、p15、p16、p18、p20。
[0160]
(3)进行扩增反应
[0161]
对表4中的每一个样品，各自分别采用上述扩增反应混合物执行多重聚合酶链式反应(多重pcr)以选择性地扩增每管相应的靶核酸。将pcr管置于美国abi veriti 96孔梯度pcr仪上并运5行以下温度曲线以获得rna多靶核酸扩增的扩增子库：25℃5分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃120秒，40个循环；保持在4℃。
[0162]
(4)熔解曲线分析
[0163]
再次将pcr管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量pcr仪(上海宏石，slan-96p)的托盘中。所用程序为：55-90℃溶解曲线分析，升温速率为每秒0.03℃。
[0164]
(5)数据分析
[0165]
表4中样品获得的熔解曲线如图1a-图1r所示，对熔解曲线中的检测通道、tm值与表5至表8中探针通道和tm值进行对比，获得目标基因的检测结果。
[0166]
表5
[0167][0168]
表6
[0169][0170]
表7
[0171][0172]
表8
[0173][0174]
其中，图1a-图1r分别显示了35delg杂合(样品p01)、176_191del16杂合(样品p02)、235delc杂合(样品p03)、299_300delat/176_191del16杂合(样品p04)、538c》t杂合(样品p05)、547g＞a杂合(样品p06)、281c》t杂合(样品p07)、589g》a杂合(样品p08)、ivs7-2a》g杂合(样品p09)、ivs7-2a》g/1174a＞t杂合(样品p10)、ivs7-2a》g/1226g》a杂合(样品p11)、ivs15+5g》a杂合(样品p12)、1975g＞c杂合(样品p13)、2027t》a/1555a》g杂合(样品p14)、2168a》g杂合(样品p16)、1095t》c/ivs7-2a》g杂合(样品p17)、1494c》t杂合(样品p18)、野生型(样品n01)的检测结果，结果与参考品突变型一致。
[0175]
结果表明，采用本公开的方法，能够同时检测不同基因及突变的存在与否，从而可以用于高通量检测耳聋基因，检测结果准确度高。
[0176]
实施例2耳聋突变基因检测检测灵敏度
[0177]
(1)标准浓度梯度dna制备
[0178]
以购买hela细胞系dna(100ng/ul，new england biolabs0051603)为母液，用te缓冲液梯度稀释至以下梯度，作为灵敏度参考品：
[0179]
20ng/μl灵敏度参考品；
[0180]
10ng/μl灵敏度参考品；
[0181]
5ng/μl灵敏度参考品；
[0182]
2ng/μl灵敏度参考品；
[0183]
1ng/μl灵敏度参考品；
[0184]
(2)进行扩增反应、熔解曲线分析、数据分析如同实施例1
[0185]
熔解曲线结果如图2a-图2e所示。其中，图2a-e分别显示了20ng/μl灵敏度参考品检测结果、10ng/μl灵敏度参考品检测结果、5ng/μl灵敏度参考品检测结果、2ng/μl灵敏度参考品检测结果、1ng/μl灵敏度参考品检测结果。从结果中可以看出，本技术的耳聋基因检测试剂灵敏度可达2ng/ul。相比于目前市场上同类试剂盒检测灵敏度(25ng/ul左右)提高了10倍以上。
[0186]
以上所述仅为本公开的较佳实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开保护的范围之内。

技术特征：

1.检测靶核酸的方法，其包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；(ii)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(iii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；(c)对步骤(b)孵育结束的反应混合物在对应检测信号通道进行熔解曲线分析；优选地，所述靶核酸为单链dna或双链dna；优选地，所述靶核酸的种类至少为1、2、5、10、15或20种。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处或其附近；优选地，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'sh核苷酸或2'-o-po3核苷酸；优选地，所述封闭引物被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增；优选地，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸；优选地，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18bp；优选地，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp；优选地，所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧；优选地，所述修饰是这样的修饰：其用以提升所述封闭引物和所述靶核酸之间的tm；优选地，所述修饰是这样的修饰：其用以形成额外桥，所述额外桥连接所述封闭引物的至少一个核苷酸的2'氧和4'碳。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含至少5、10或20组引物对；优选10-50组。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物中的每一个的长度各自为8至100个核苷酸；优选地，8至80个核苷酸；优选地，8至60个核苷酸；优选地，8至40个核苷酸；优选地，8至20个核苷酸。5.根据权利要求1所述的方法，其中在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50％的序列互补性；优选地，在任两组引物对的任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述去封闭剂选自cs5 dna聚合酶、具有f667y突变的amplitaq或klentaq聚合酶、焦磷酸盐或rnase h2，所述cs5 dna聚合酶具有选自g46e、l329a、q601r、d640g、i669f、s671f、e678g的突变或这些突变的组合。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针的3’端一侧的末端碱基上连接淬灭基团，探针的5’端一侧的末端碱基上连接荧光基团；优选地，所述淬灭基团和荧光基团各自独立地通过化学键、连接基团或1-3个核苷酸构成的接头与碱基连接；优选地，所述荧光基团选自fam、vic、joe、ned、tet、hex、tamra、rox、texasred、cy3、cy5、cy5.5或cy7；优选地，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、mgb或tamara；优选地，所述反应混合物包含1-20条探针；优选10-20条。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸选自野生型或突变型的gjb2、gjb3、slc26a4、线粒体12srrna基因或其片段的至少一种；优选地，所述突变型的gjb2基因包含35delg、176_191del16、235delc突变的一个或多个；优选地，所述突变型的gjb3基因包含538c>t和547g>a突变的一个或多个；优选地，所述突变型的slc26a4基因包含281c>t、589g>a、1174a>t、1226g>a、1229c>t、1975g>c、2027t>a、2162c>t、2168a>g、ivs7-2a>g、ivs15+5g>a突变的一个或多个；优选地，所述突变型的线粒体12s rrna基因包含1095t>c、1494c>t、1555a>g突变的一个或多个。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述引物对选自以下组的至少一组；优选至少5组；优选至少10组：
优选地，所述引物对中，至少一条引物的3'末端处存在2'，3'-双脱氧核苷酸封闭基团；优选地，所述引物对中的两条引物的3'末端处各自存在2'，3'-双脱氧核苷酸封闭基团。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述探针序列选自seq id no.61～80的至少一种。11.一种用于检测靶核酸的试剂盒，其包括：(i)至少一组引物对，其中每组引物对中的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每组引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；(ii)至少一条探针，所述探针部分或全部与所述靶核酸互补，所述探针上连接有检测信号基团，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；以及任选地(iv)核酸聚合酶；优选地，所述引物对选自以下组的至少一组，优选至少5组，优选至少10组；
优选地，所述探针序列选自seq id no.61～80的至少一种，优选至少5种，优选至少10种；优选地，所述核酸聚合酶为高保真聚合酶；优选地，所述试剂盒用于检测耳聋基因突变。

技术总结

本公开提供了一种检测靶核酸的方法和试剂盒，通过采用含有封闭基团的引物，提高靶核酸扩增的特异性和准确度，进一步结合连接有不同检测信号基团的探针，完成熔解曲线，实现不同靶核酸在不同检测信号通道检测，进一步提高了检测通量，从而实现了高通量、高灵敏度和高准确度检测靶核酸。准确度检测靶核酸。

技术研发人员：

王欣昶 朱苗骏 王海龙 谭若颖

受保护的技术使用者：

上海翔琼生物技术有限公司

技术研发日：

2022.09.28

技术公布日：

2023/3/3