用于医学用途的包含三种OspA融合蛋白的组合物的制作方法

用于医学用途的包含三种ospa融合蛋白的组合物
技术领域
1.本发明涉及包含seq id no:1(lips1d1-s2d1)的ospa融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的ospa融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的ospa融合蛋白的组合物，其用于疫苗或用于在人中诱发针对莱姆病(lyme disease)的免疫应答的方法。

背景技术：

2.莱姆疏螺旋体病(lyme borreliosis)(本文中也称为“lb”)，也称为莱姆病(本文中也称为“ld”)，是由螺旋体广义伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi sensu lato)(s.l)的数种基因种引起的新发的、蜱传播的动物原性疾病(tick-borne zoonotic disease)。其是欧洲和北美最常见的病媒生物传播的疾病[mead p.s.,epidemiology of lyme disease,infect dis clin n am 29(2015)187-210]。在欧洲，每年有65,000至85,000个病例被通报，然而，由于病例报告不一致和lb经常未被诊断的事实，这个数字无疑是低估的[rizzoli a,et al.lyme borreliosis in europe.euro surveill 16.(2011)；lindgren e,jaenson tgt,organization who europe(2006)lyme borreliosis in europe:influences of climate and climate change,epidemiology,ecology and adaptation measures,http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0006/96819/e89522.pdf,last assessed march 2016]。美国疾病控制和预防中心(centers for disease control，cdc)估计美国每年约有300,000个病例，该数字是报告的病例的近10倍高[hinckley af,et al.lyme disease testing by large commercial laboratories in the united states.clin infect dis.2014sep 1；59(5):676-81.doi:10.1093/cid/ciu397.epub 2014may 30；nelson ca,et al.incidence of clinician-diagnosed lyme disease,united states,2005-2010.emerg infect dis.2015sep；21(9):1625-31.doi:10.3201/eid2109.150417]。lb的发病率相对于年龄呈双峰分布。两个主要的目标体是年龄为5至14岁的儿童和年龄为50至64岁的成人[rizzoli a,et al.2011,supra；http://www.cdc.gov/lyme/stats/graphs.html,last assessed march 2016]。
[0003]
在欧洲，大多数人感染是由四种疏螺旋体(borrelia)基因种引起的，呈现六种ospa血清型(st)：阿氏疏螺旋体(b.afzelii)(st2)、伽氏疏螺旋体(b.garinii)(st3、st5和st6)、狭义伯氏疏螺旋体(s.s)(st1)和巴伐利亚疏螺旋体(b.bavariensis)(st4)。在美国，伯氏疏螺旋体s.s.(st1)几乎存在于100％的病例中。最近，已描述了命名为梅奥疏螺旋体(borrelia mayonii)的新基因种，其在美国上中西部分离的少数临床标本中发现[pritt bs,et al.identification of a novel pathogenic borrelia species causing lyme borreliosis with unusually high spirochaetaemia:a descriptive study,lancet infect dis 2016；16:556
–
64]。
[0004]
ld最常见的临床表现是称为游走性红斑(erythema migrans，em)的逐渐扩大的红斑性皮疹，即早期局部疏螺旋体感染的明显体征。em在数天至数周内出现在蜱叮咬的位置，并通常伴有疲劳、发热、头痛、颈部轻度僵硬、关节痛或肌痛的症状[mead et al.,2015，同
上]。在大约70％至80％的ld病例中，患者会发生em[stanek g,et al.lyme borreliosis,lancet2012；379:461
–
73；wormser gp,et al,the clinical assessment,treatment,and prevention of lyme disease,human granulocytic anaplasmosis,and babesiosis:clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america,clinical infectious diseases 2006；43:1089
–
134.]。
[0005]
如果未经或用抗生素不充分，则感染可播散至身体的其他部位，并且可引起影响神经系统(面瘫、脑膜炎、脊髓炎和脑炎)、关节(复发性或持续性大关节滑膜炎)或心脏(例如传导异常和心脏炎)的严重晚期表现。
[0006]
大约30％的患者中发生的lb最常见的晚期临床表现包括肌肉骨骼的表现，例如莱姆关节炎。莱姆关节炎包含通常在一个或数个关节(最常见是膝)中反复发作或长期持续的关节肿胀(滑膜炎)，其在蜱叮咬之后数月发生。神经系统的表现包括莱姆神经疏螺旋体病(lyme neuroborreliosis)，在感染的数周内最常见表现为颅神经病变伴面神经麻痹，可能伴有双侧受累(双侧贝尔麻痹(bell’s palsy))。在成人中，所述疾病通常表现为疼痛性脑膜神经根炎和面瘫。相比之下，儿童最频繁地发生由于脑膜炎引起的头痛以及面瘫。在儿童中，症状持续时间较短，并且结果较好。ld的心脏表现似乎不常见，并且莱姆心肌炎通常在感染的两个月内表现为心肌炎伴急性间歇性房室性心脏传导阻滞。在欧洲，更严重的皮肤表现(例如慢性萎缩性肢端皮炎(acrodermatitis chronica atrophicans，aca)、疏螺旋体淋巴细胞瘤)可由播散性感染引起，作为晚期并发症[stanek,et al.2012，同上]。
[0007]
当存在于未饲喂的蜱中时，外表面蛋白a(outer surface protein a，ospa)是由伯氏疏螺旋体s.l.表达的显性蛋白(dominant protein)之一。在蜱饲喂期间，到来的血液发出ospa表达下调的信号，使螺旋体穿透肠道上皮，迁移至唾液腺，并进一步进入到宿主的血液中[schwan tg and piesman j.temporal changes in outer surface proteins a and c of the lyme disease-associated spirochete,borrelia burgdorferi,during the chain of infection in ticks and mice.j clin microbiol 2000,38:382
–
8]。基于ospa的lb疫苗诱导这样的抗体：其作用于蜱肠道内表达ospa的螺旋体，阻断螺旋体传播至唾液腺并随后传播至脊椎动物宿主[de silva am and telford sr 3rd,brunet lr,barthold sw,fikrig e.,j exp med.1996,183(1):271-5]。
[0008]
两种含有来自伯氏疏螺旋体s.s.(st1)的ospa的疫苗先前已显示出在人中对预防lb是有效的：lymerix(smithkline beecham)[steere ac,et al.,lyme disease vaccine study group,vaccination against lyme disease with recombinant borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein a with adjuvant,n engl j med.1998；339(4):209-15]和imulyme(pasteur m
é
rieux connaught)[sigal lh,et al.,a vaccine consisting of recombinant borrelia burgdorferi outer-surface protein a to prevent lyme disease,n engl j med.1998；339(4):216-22]，lymerix自1998至2002年被许可并供消费者使用，当时其自愿从市场退出。在许可lymerix之后，由于疫苗中的ospa st1与据称在自然感染的患者亚中诱发抗生素难治性莱姆关节炎的hlfa-1(人白细胞功能相关抗原-1)的部分同源性，假设了莱姆疫苗与关节反应之间可能的关系[gross dm,et al.,identification of lfa-1as a candidate autoantigen in treatment-resistant lyme arthritis,science.1998jul 31；281(5377):703-6]。然而，所述假设无法被证实。相
比之下，在疫苗许可之后的前19个月期间在分配了超过1,400,000剂量之后，向疫苗不良事件报告系统(vaccine adverse event reporting system，vaers)报告的联合投诉的回顾性研究表明，这样的投诉的数量并不罕见[lathrop sl,et al.,adverse event reports following vaccination for lyme disease:december 1998
–
july 2000,vaccine 20(2002)1603
–
1608]。在所述疫苗的iii期研究中，短暂性关节痛的发病率在疫苗接种者中无显著提高，但与安慰剂组相比，关节炎的发病率没有提高[steere,et al.,1998，同上]。
[0009]
最近，baxter进行了类似的基于多价ospa的疫苗候选物的i/ii期研究，该疫苗候选物已显示出是安全的，耐受性良好和高度免疫原性的[wressnigg n,et al.；safety and immunogenicity of a novel multivalent ospa vaccine against lyme borreliosis in healthy adults:a double-blind,randomised,dose-escalation phase 1/2trial,lancet infect dis.2013aug；13(8):680-9；wressnigg n,et al.,a novel multivalent ospa vaccine against lyme borreliosis is safe and immunogenic in an adult population previously infected with borrelia burgdorferi sensu lato,clin vaccine immunol.2014nov；21(11):1490-9]。然而，这种疫苗目前没有被进一步开发。目前，市场上没有lb疫苗，并且也没有其他lb疫苗候选物处于进行临床开发中。
[0010]
本发明的多价莱姆疏螺旋体病疫苗包含存在于欧洲(st1至st6)和美国(st1)的六种最常见的ospa血清型的免疫显性c端部分，并且旨在诱导抗ospa抗体以中和蜱肠道内的疏螺旋体，阻断其向宿主的传播。已在小鼠模型中使用感染的蜱或体外培养的螺旋体进行攻击表明所述多聚体疏螺旋体疫苗针对四种疏螺旋体基因种(伯氏疏螺旋体s.s.、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体)，包括五种临床相关的ospa血清型(st1、st2、st4至st6)具有高度保护性。
[0011]
基于ospa的疫苗在过去已显示出在人中是有效的。valneva的多价疏螺旋体疫苗可以预防存在于欧洲和美国最常见的伯氏疏螺旋体s.l.和ospa血清型的感染。
[0012]
基于ospa的疫苗由于其作用机制(在体外)因此需要高且持续的抗体效价。
[0013]
附图简述
[0014]
图1.用作体外功能测定的血清杀菌测定(参见材料和方法)。
[0015]
图2.研究设计(首次在人中(first-in-human)1期研究)，包括在第13个月时在从高剂量组中选择的对象中的加强剂(加强剂延伸)。
[0016]
图3a至3b.1期数据：每种血清型的符合方案(per-protocol，pp)体(即根据方案以正确剂量和正确时间接受所有三次免疫接种的对象)在第84天时的免疫原性数据，图3a)igg几何平均效价(geometric mean titer，gmt)和图3b)血清转换率，其被定义为igg效价自基线起达到≥4倍提高的对象的百分比。
[0017]
图4a至4d.1期数据：对于每种血清型，在图4a)d84、图4b)m13、图4c)m14和图4d)m19时加强剂pp体(即招募在加强剂延伸期并根据方案在正确的时间接受正确的加强剂量的对象)的igg gmt值。
[0018]
图5a至5f.1期数据：图5a)st1、图5b)st2、图5c)st3、图5d)st4、图5e)st5、图5f)st6的加强剂pp体随时间推移的血清型特异性igg gmt值。
[0019]
图6a至6c.1期数据：elisa效价与sba效价的比较。图6a)血清型1(serotype 1，st1)——具有elisa效价低于100u/ml的样品在sba中很少测试出阳性。总计收集了116个有
效的sba数据点。st1 sba的定量下限(lower limit of quantification，lloq)设定为20，并且阴性样品给定的值为10。图6b)st2——具有elisa效价低于200u/ml的样品在sba中很少测试出阳性。总计收集了48个有效的sba数据点。st2sba lloq设定为20，并且阴性样品给定的值为10。图6c)st3——具有elisa效价低于100u/ml的样品在sba中很少测试出阳性。总计收集了122个有效的sba数据点。st3 sba lloq设定为160，并且阴性样品给定的值为80。
[0020]
图7.第一2期研究：用于本发明多价疏螺旋体疫苗的研究设计(第一2期试验的研究设计)，其研究了在“导入期(run-in phase)”中的3个佐剂化疫苗a剂量(90μg、135μg和180μg)，以及在“主要研究期”中的2个选定剂量组(135μg、180μg)。
[0021]
图8.第二2期研究：用于本发明多价疏螺旋体疫苗的第二2期试验的研究设计，其研究了替代免疫接种方案。
[0022]
图9a至9f.相关elisa
–
sba效价，第208天，合并的多聚体疏螺旋体疫苗处理组，pp体w/o基线sba血清阳性对象。(图9a)斯皮尔曼相关系数(spearman correlation coefficient)：0.7083，p值：《.0001；(图9b)斯皮尔曼相关系数：0.8217，p值：《.0001；(图9c)斯皮尔曼相关系数：0.9131，p值：《.0001；(图9d)斯皮尔曼相关系数：0.6487，p值：《.0001；(图9e)斯皮尔曼相关系数：0.6554，p值：《.0001；(图9f)斯皮尔曼相关系数：0.7818，p值：《.0001。
[0023]
图10：ospa特异性igg的血清转换率，每种血清型，d85，pp体。括号表示组间的显著性差异。135μg与180μg处理组之间没有观察到显著性差异。
[0024]
图11：ospa特异性igg的血清转换率，每种血清型，d208，pp体。括号表示组间的显著性差异。135μg与180μg处理组之间没有观察到显著性差异。
[0025]
图12：elisa-st1的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0026]
图13：elisa-st2的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0027]
图14：elisa-st3的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0028]
图15：elisa-st4的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0029]
图16：elisa-st5的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0030]
图17：elisa-st6的反向累积分布曲线。每次对象vs.ospa特异性igg的百分比。上图：135μg处理组。下图：180μg处理组。
[0031]
图18a至18b：每种血清型随时间推移的elisaospa特异性igg抗体(gmt)，pp体。图18a)135μg组；图18b)180μg组。
[0032]
图19：用于多价疏螺旋体疫苗的2期临床试验的对象招募，其研究了以年龄递减、交错的方式对三个年龄组进行的三个剂量或两个剂量的初次免疫接种方案。
[0033]
图20：用于多价疏螺旋体疫苗的2期临床试验的研究设计，其研究了在年龄为5至65岁的研究体中疫苗的三个剂量或两个剂量的初次免疫接种方案以及加强剂量。
[0034]
发明详述
[0035]
因此，在第一方面中，本发明提供了这样的组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用作疫苗，其中所述疫苗i)待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或更优选每剂120至200μg施用于成人至少三次，或者ii)待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂120至200μg或每剂60至100μg施用于人儿童至少三次。或者，本发明提供了这样的组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用作疫苗，其中所述疫苗i)待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或更优选每剂120至200μg施用于成人至少两次，或者ii)待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂120至200μg或每剂60至100μg施用于人儿童至少两次。包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的所述组合物在本文中也可互换地被称为“疫苗a”或多聚体疏螺旋体疫苗(multimeric borrelia vaccine，“mbv”)。
[0036]
上述融合蛋白(有时也被称为异二聚体)来源于疏螺旋体外表面蛋白a(ospa)。ospa仅由这样的疏螺旋体表达，当疏螺旋体在蜱病媒生物的肠道中时。因此，通过疫苗接种产生的ospa抗体不能对抗体内的感染，而是在蜱“进食”血液时进入其肠道。在那里，抗体可中和螺旋体并阻断细菌从蜱的中肠迁移至唾液腺(疏螺旋体进入脊椎动物宿主的途径)。因此，ospa特异性抗体防止疏螺旋体从蜱病媒生物传播至人宿主。
[0037]
上述蛋白质是脂化的突变体ospa片段融合蛋白，其包含杂合c端ospa片段，其中所述杂合片段由疏螺旋体的ospa的c端结构域(其包含来源于不同于伽氏疏螺旋体菌株pbr的疏螺旋体菌株的ospa的片段和来自伽氏疏螺旋体菌株pbr的ospa的第二片段)组成，并且至少通过引入至少一个二硫键而与相应野生型序列不同。所述二硫键为1型二硫键，其中在183+/-3和270+/-3位插入了半胱氨酸残基(对于另外的细节参见wo 2015/104396a1)。s3hyb表示法雷斯疏螺旋体(b.valaisiana)的氨基酸125至176和伽氏疏螺旋体菌株pbr的氨基酸177至274的融合体。lip意指脂化并表示n端添加甘油和脂肪酸残基。“ln1”肽接头是来自伯氏疏螺旋体s.s.菌株b31的ospa的n端一半的两个单独的环状区域(aa 65至74和aa 42至53，在d53s的第53位具有氨基酸置换)的融合体，其具有以下序列：gtsdknngsgskeknkdgkys(seq id no:7)。
[0038]
特别地，lip-s1d1-s2d1是具有1型二硫键的ospa血清型1和ospa血清型2的融合蛋白，并且包含用于添加脂质的n端css，ln1接头序列和n端脂化。ospa血清型1的氨基酸164至174被非hlfa-1样序列nftlegkvand(seq id no：8)替代。所述序列如下seq id no:1所示：
[0039][0040]
lip-s4d1-s3hybd1是具有1型二硫键的ospa血清型4和ospa血清型3的融合蛋白，其包含法雷斯疏螺旋体菌株vs116的氨基酸125至176和伽氏疏螺旋体菌株pbr血清型3的氨
基酸177至274，并包含用于添加脂质的n端css、ln1接头序列和n端脂化。所述序列如下seq id no:2所示：
[0041][0042]
lip-s5d1-s6d1是具有1型二硫键的ospa血清型6二者的融合蛋白，用于添加脂质的n端css、ln1接头序列和n端脂化。所述序列如下seq id no:2所示：
[0043][0044]
编码上述融合蛋白的核酸序列如下：
[0045][0046]
[0047][0048][0049]
有关融合蛋白及其产生的进一步信息源自wo 2015/104396 a1，其中lip-s1d1-s2d1、lip-s4d1-s3hybd1和lip-s5d1-s6d1分别对应于seq id no:29、27和33。
[0050]
如上所述，融合蛋白是脂化蛋白，其中脂质分子与甘油基团一起也被称为“lip”。根据本发明，lip包含1至3个脂质，例如与本发明多肽的n端半胱氨酸的甘油和氨基连接的c
14
至
20
烷基和/或c
14
至
20
烯基，或者优选地其中lip是下式(i)的部分，
[0051][0052]
其中r1、r2或r3中一者是c
14
至c
20
烷基或烯基，并且其他各自独立地是c
14
至c
20
烷基
或c
14
至c
20
烯基，并且x是与式(i)中所示半胱氨酸残基连接的氨基酸序列。更优选地，lip加多肽的n端半胱氨酸是n-棕榈酰基-s-(2rs)-2,3-双-(棕榈酰氧基)丙基半胱氨酸(在本文中称为“pam3cys”)并通过半胱氨酸的羰基c与本发明的所述氨基酸序列相连。在上述式(i)中，r1、r2和r3将是棕榈酰基部分，并且x是与半胱氨酸残基连接的氨基酸序列。
[0053]
融合蛋白涵盖在组合物中。该组合物是可药用的，其允许施用于人。其可任选地包含任何可药用的载体或赋形剂，例如缓冲物质、稳定剂或另外的活性成分，尤其是已知与药物组合物和/或疫苗产生有关的成分。该组合物在6.7+/-0.2的ph下可包含磷酸钠、氯化钠、l-甲硫氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯20(吐温20)。优选地，该药物组合物还包含氢氧化铝，优选浓度为0.15％。另外，该组合物可包含5mm至50mm的磷酸钠、100至200mm的氯化钠、5mm至25mm的l-甲硫氨酸、2.5％至10％的蔗糖、0.01％至0.1％的吐温20和0.1％至0.2％(w/v)的氢氧化铝。更优选地，该制剂在6.7
±
0.2的ph下包含10mm磷酸钠、150mm氯化钠、10mm l-甲硫氨酸、5％蔗糖、0.05％吐温20和0.15％(w/v)氢氧化铝。在一个优选实施方案中，赋形剂是l-甲硫氨酸。
[0054]
在一些实施方案中，包含融合蛋白的组合物以约0.25毫升(ml)至约1.0ml或更多(例如0.25ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1.0ml)的体积施用于对象。在一个实施方案中，施用于对象的体积是0.25ml至1.0ml，或0.25ml至0.5ml，或0.5ml至1.0ml。在一个实施方案中，施用于对象的体积是约0.25ml、约0.5ml或约1.0ml。在一个实施方案中，施用于对象的体积是0.25ml、0.5ml或1.0ml。在一个实施方案中，施用于对象的体积是0.25ml。在一个实施方案中，施用于对象的体积是0.5ml。在一个实施方案中，施用于对象的体积是1.0ml。在一个优选实施方案中，施用于5岁或更大(例如5至17岁、5至11岁、12至17岁、18岁或更大、18至65岁、或50岁或更大)的对象的体积是0.5ml或1.0ml。在一个优选实施方案中，施用于5岁或更大(例如5至17岁、5至11岁、12至17岁、18岁或更大、18至65岁、或50岁或更大)的对象的体积是1.0ml。在另一个优选实施方案中，施用于5岁或更大(例如5至17岁、5至11岁、12至17岁、18岁或更大、18至65岁、或50岁或更大)的对象的体积是0.5ml。在另一个优选实施方案中，施用于0至4岁(例如1至4岁或2至4岁)的对象的体积是0.25ml。
[0055]
根据本发明，所述组合物用作疫苗，特别是针对由以下引起的感染：疏螺旋体种，更优选本文中公开的致病性疏螺旋体种，更优选包含伯氏疏螺旋体s.s.、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体，和/或疫苗中已包含的抗原所针对的其他病原体。优选地，疏螺旋体种选自伯氏疏螺旋体s.s.、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体(b.andersoni)、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体(b.bissettii)、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体(b.lusitaniae)、斯柏曼疏螺旋体(b.spielmanii)、日本疏螺旋体(b.japonica)、坦尼基疏螺旋体(b.tanukii)、土德疏螺旋体(b.turdi)或西尼伽疏螺旋体(b.sinica)感染，优选伯氏疏螺旋体s.s.、阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体。
[0056]
已经发现，特定的施用方案是有利的，特别是在获得针对所有疏螺旋体ospa血清型的持续保护作用。这涉及到最小的施用次数以及剂量范围。根据这一点，该疫苗待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或更优选每剂120至200μg施用于成人至少三次，或者以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂120至200μg或每剂60至100μg施用于人儿童至少三次。在一些实施方案中，该疫苗待以每剂60至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或更优选每剂120至200μg施用于成人至少两次，或者以每剂60至200μg所述3
种融合蛋白的总蛋白含量或每剂120至200μg或每剂60至100μg施用于人儿童至少两次。
[0057]
第一数据表明，以剂量为每剂135μg和180μg融合蛋白的总蛋白含量的本发明的疫苗(例如疫苗a)比90μg的剂量更有效(参见实施例2)。因此，3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人是每剂120至200μg(成人剂量)。对于儿童，可施加以上剂量的一半，即60至100μg(半剂量)，但成人剂量也可以是合适的，即120至200μg(成人剂量)。在施用半剂量的情况下，人儿童通常是从出生直至4岁(0至4岁)、1至4岁或2至4岁的幼儿(young child)。大龄儿童(5至17岁)，包括青少年(12至17岁)接受成人的剂量。
[0058]
鉴于这种疫苗的发生在人体之外的特殊作用方式，因此在整个蜱季需要持续地相对高的抗体效价是极度重要的。另外，可以预期在天然感染之后，目前的ospa特异性抗体没有天然加强作用，因为只要疏螺旋体在蜱的中肠中，ospa就仅存在于疏螺旋体表面上，而不是在抗体可能已进入人宿主之后。因此，需要高抗体效价，而且该组合物待至少被施用三次，或或者是两次。根据这一点，该组合物可以施用两次、三次、四次、五次或甚至更多次。
[0059]
第一次初次免疫接种在本文中被称为第0-2-6月免疫接种系列。再次施用是用于再暴露于疫苗的加强剂量，并且通常在初次免疫接种的第3次免疫接种之后每12个月施加(即在第18个月时第一次加强剂)。或者，第一次初次免疫接种在本文中称为第0-6月的免疫接种系列。再次施用是用于再暴露于疫苗的加强剂量，并且通常在初次免疫接种的第2次免疫接种之后每12个月施加(即在第18个月时第一次加强剂)。在效价随时间下降之后，加强剂量将免疫力提高回到保护水平(参见实施例1)。已经表明，在根据本发明的组合物的情况下需要加强剂，以维持提供保护所需的高ospa抗体水平。
[0060]
虽然加强剂量通常每12个月施加，但加强剂量可以在12个月时间的数月内施用，例如在初次免疫接种的最终剂量之后的9至15个月(例如在9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月时)，或后续加强剂量之后的9至15个月(例如在第一次或后续加强剂量之后的9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月或15个月时)。
[0061]
根据本发明的组合物可以作为可注射组合物(例如作为无菌水性分散体，优选等张的)施用于人。该组合物可通过全身或黏膜途径施用。这些施用可包括通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过黏膜施用于口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。尽管本发明的疫苗可以作为3种融合蛋白的组合施用，但其组分(即单独融合蛋白)也可以同时或顺序地单独施用，或者仅作为一种组分的疫苗(即仅为lip-s1d1-s2d1)单独施用。
[0062]
在第二方面中，本发明提供了这样的组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用于在人中引发针对莱姆疏螺旋体病的免疫应答的方法，该方法包括对于成人或人儿童以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量将所述组合物施用于人至少三次，或者在人儿童的情况下(特别是0至4岁、1至4岁或2至4岁的幼儿)仅施用一半的剂量，例如如以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用至少三次。或者，本发明提供了这样的组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用于在人中引发针对莱姆疏螺旋体病的免疫应答的方法，该方法包括对于成人或人儿童以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量将所述组合物施用于人至少两次，或者在人儿童(特别是0至4岁、1至4岁或2至4岁的幼儿)的情况下，仅施用一半的
剂量，例如如以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用至少两次。
[0063]
上述关于本发明第一方面的定义和作出的说明也适用于本发明的第二方面。
[0064]
在第二方面中，该组合物用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答的方法，所述莱姆病由以下引起：疏螺旋体种，更优选如本文中所公开的致病性疏螺旋体种，更优选包含伯氏疏螺旋体s.s.、阿氏疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体和伽氏疏螺旋体、和/或组合物中已包含的抗原针对的其他病原体。优选的，该组合物用于引发针对以下的免疫应答的方法：伯氏疏螺旋体s.s.、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、安德森疏螺旋体、巴伐利亚疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼亚疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、日本疏螺旋体、坦尼基疏螺旋体、土德疏螺旋体或西尼伽疏螺旋体感染，优选伯氏疏螺旋体s.s.、阿氏疏螺旋体和/或伽氏疏螺旋体。
[0065]
莱姆疏螺旋体病或莱姆病是欧洲和北美最常报道的蜱传播的疾病。该疾病由节肢动物传播的革兰氏阴性样螺旋体广义伯氏疏螺旋体(伯氏疏螺旋体s.l.)的感染引起，并且可涉及多个器官或组织，导致皮肤、心脏、肌肉骨骼和神经病症。在大多数国家，莱姆疏螺旋体病不是须申报的疾病；因此，没有获得关于年度发生率的确切数据。在美国，病原体(causative agent)是狭义伯氏疏螺旋体(b.burgdorferi s.s)，并且莱姆疏螺旋体病定位于东北部、大西洋中部和中北部上部各州。2010年，美国疾病控制和预防中心(cdc)报道了总共约30,000例莱姆疏螺旋体病。2013年，cdc的更新报道考虑到来自其他来源的诊断数据，估计美国每年新病例的实际数目接近300,000(http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html)。在欧洲，阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体是莱姆疏螺旋体病的主要病原体，以及伯氏疏螺旋体s.s.和巴伐利亚疏螺旋体，其贡献在较小程度上取决于地理位置。莱姆疏螺旋体病的患病率在不同的欧洲国家变化很大，从西至东的患病率总体提高。在欧洲大部分地区，自20世纪90年代初以来，报道的莱姆疏螺旋体病病例的数目提高(例如捷克共和国(czech republic)、爱沙尼亚(estonia)、立陶宛(lithuania)；参见欧洲的莱姆疏螺旋体病，2006年的who报告)，并且病例的地理分布也有所扩大。
[0066]
如上文所详述的，在初次免疫接种之后和加强剂量之后需要高的抗体效价以维持高ospa抗体水平。特别地，在本发明的背景下，已经发现广泛的初次免疫接种方案(例如第0-2-6月)是合适的(参见实施例3)。或者，也可以使用两剂量的初次免疫接种方案(例如第0-6月)。
[0067]
因此，根据本发明应用的上述组合物优选的特征在于，第二次施用在第一次施用之后至少4至6周至至多3个月的期间进行，和/或第三次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。根据这一点，第一次施用发生在时间点0(第1天)，第二次施用在此后至少6周至至多3个月的期间进行，并且第三次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。另外的加强剂可以在第三次疫苗施用之后(即在第6个月免疫接种之后)每年，例如12个月、24个月、36个月等进行。或者，第二次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。根据这一点，第一次施用发生在时间点0(第1天)，第二次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。另外的加强剂可以在第二次疫苗施用之后(即在第6个月免疫接种之后)每年，例如12个月、24个月、36个月等进行。因此，根据本发明应用的组合物优选的特征在于，再次施用在第三次施用(或者作为替代，在第0-6月的两剂量初次免疫接种方案中的第二次施用)之后每年，特别是在1年之后、2年之后和3之
年之后等进行。所述加强剂量一般可在蜱季(即在北半球的2月至6月左右和在南半球的9月至12月左右)之前施用。
[0068]
更优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，第二次施用在第一次施用之后至少40天至至多80天的期间，特别是在至少50天至至多70天的期间，更特别是在至少50天至至多60天的期间，尤其是在56天进行。
[0069]
同样更优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，第三次施用在第一次施用之后至少120天至至多240天的期间，在至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。或者，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，第二次施用在第一次施用之后至少120天至至多240天的期间，至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。
[0070]
在一些情况下，可需要或期望一次或更多次再次施用。根据这一点，该组合物的第四次施用(或者作为替代，在第0-6月的两剂量初次免疫接种方案中的第三次施用)可以在第一次施用之后至少15个月至至多21个月的期间，特别是在至少17个月至至多19个月的期间，尤其是在18个月进行。
[0071]
优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，对于成人(年龄为18岁或更大，包括18至65岁)，所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂135μg至180μg，特别地为每剂135μg或180μg。所述3种融合蛋白的总蛋白含量为135μg和180μg的剂量特别地适合于针对所有疏螺旋体ospa血清型实现持续的保护作用(参见实施例2和3)。因此，可以得出这样的结论，每剂量所述3种异二聚体的总蛋白含量在135μg至180μg的完整范围内都存在作用。如上所详述的，对于幼儿(出生至4岁)可施加一半的剂量(但全剂量也可以是合适的)。因此，对于人儿童(特别是出生至4岁(例如1至4岁或2至4岁)的幼儿)，所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂67.5μg至90μg，特别地为每剂67.5μg或90μg。对于大龄儿童(5至17岁)，包括青少年(12至17岁)，可以使用每剂135μg至180μg所述3种异二聚体的总蛋白含量的全剂量。
[0072]
优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，3种融合蛋白占组合物中所有蛋白质的至少60％，优选至少70％，更优选80％。对本领域技术人员明显的是，根据本发明应用的组合物也可以涵盖与seq id no:1、2和3的融合蛋白不同的另一些蛋白。然而，基于重量，融合蛋白的比率不应低于上述限制。其他蛋白质可具有例如稳定组合物的功能，或者可以是杂质。
[0073]
在一个实施方案中，药物组合物包含3种融合蛋白，优选lip-s1d1-s2d1(seq id no:1)、lip-s4d1-s3hybd1(seq id no:2)和lip-s5d1-s6d1(seq id no:3)的重量比为1:2:1、1:3:1、1:1:2、1:1:3、1:2:2、1:2:3、1:3:2、1:3:3、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:2:3、2:2:1、2:3:1、2:3:2、2:3:3、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:3:1或3:3:2。优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，该组合物包含重量比为1:1:1(lip-s1d1-s2d1:lip-s4d1-s3hybd1:lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白。
[0074]
优选地，根据本发明应用的上述组合物的特征在于，该组合物包含佐剂，更优选铝佐剂。
[0075]
选择合适的佐剂以与使用本发明的方法制备的细菌蛋白混合在本领域技术人员的知识范围内。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是其他金属盐，例如钙、镁、铁或锌的金属盐，或者可以是酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖类、或聚磷腈或酰化酪氨酸的不溶性悬浮液。在一个优选实施方案中，该组合物用铝佐剂，例如氢氧化铝佐剂
hemorrhagic fever)、q型热病(q fever)、鄂木斯克出血热(omsk hemorrhagic fever)、科萨努尔森林病(kyasanur forest disease)、波瓦生脑炎(powassan encephalitis)、哈特兰病毒病(heartland virus disease)或巴贝西虫病(babesiosis)。在另一个方面中，所述疾病是日本脑炎(japanese encephalitis)。在另一个实施方案中，至少一种另外的抗原来源于病媒生物传播的病原体，优选是蜱传播的病原体，其选自包含以下的组：赫姆斯疏螺旋体(borrelia hermsii)、帕克氏疏螺旋体(borrelia parkeri)、达氏疏螺旋体(borrelia duttoni)、宫本疏螺旋体(borrelia miyamotoi)、特里蜱疏螺旋体(borrelia turicatae)、立氏立克次氏体(rickettsia rickettsii)、澳洲立克次氏体(rickettsia australis)、康氏立克次体(rickettsia conori)、海维提卡立克次氏体(rickettsia helvetica)、土拉热弗朗西斯氏菌(francisella tularensis)、嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocytophilum)、腺热埃里希体(ehrlichia sennetsu)、查菲埃立克体(ehrlichia chaffeensis)、米库伦斯新立克体(neoehrlichia mikurensis)、贝纳柯克斯体(coxiella burnetii)和孤星疏螺旋体(borrelia lonestari)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，tbev亦称fsme病毒)、科罗拉多蜱热病毒(colorado tick fever virus，ctfv)、克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congo hemorrhagic fever virus，cchfv)、鄂木斯克出血热病毒(omsk hemorrhagic fever virus，ohfv)、日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus，jev)和巴贝西虫属(babesia spp)。
[0084]
在一个实施方案中，根据本发明应用的组合物在年长对象中提供了与如在年轻对象中具有相似免疫原性谱的用途。包含其中所述成人是年长于50岁的年长对象。本发明出人意料地提供了，与年轻的成人(18至49岁年龄组)相比，老年成人(50至65岁年龄组)显示出类似的免疫应答，而没有统计学上显著的差异。参考实验部分。
[0085]
在一个实施方案中，根据本发明应用的组合物包含小于1.25ppb的铜或足量的l-甲硫氨酸。铝是经常用于疫苗接种的佐剂。铝佐剂通常包含杂质，特别是重金属，例如铜、镍和铁。这些(特别是铜)的存在，降低了疫苗中ospa蛋白的生物利用度。在不受理论约束的情况下，假设ospa蛋白与铝和重金属(特别是铜)结合，阻止了其释放，从而降低了疫苗中ospa蛋白的生物利用度。因此，该组合物，并且特别是铝佐剂包含少于1.25ppb的铜。单位ppb(十亿分之一)在质谱领域中经常用于量化杂质。在水溶液的情况下，1ppb意味着1g溶液中存在1ng的物质(杂质)，其意味着1ppb等于1μg/l(假设1升溶液的重量为1kg)。通常来说，铜是离子(特别是作为cu
+
或cu
2+
)的形式。在一个优选实施方案中，基于水性组合物的重量，该组合物包含少于1.00ppb、少于0.75ppb或少于少于0.50ppb的铜。已知l-甲硫氨酸能够与铜结合。所需的l-甲硫氨酸的量将明显取决于组合物中铜的量。本领域技术人员将能够选择合适量的l-甲硫氨酸。l-甲硫氨酸可用于复合本发明中应用的组合物中过量的铜。组合物中l-甲硫氨酸的典型合适浓度为至少10mmol/l。根据组合物中铜的量，浓度甚至可以更高，例如至少20mmol/l、至少30mmol/l、至少40mmol/l或至少50mmol/l，或者更低，例如至多10mmol/l、至多5mmol/l或至多1mmol/l。或者，l-甲硫氨酸的浓度基于组合物中铜的浓度来确定。特别地，以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少与组合物中铜的浓度等同。或者，以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少为组合物中铜浓度的两倍、三倍、四倍、五倍，或甚至十倍。
[0086]
在一个实施方案中，所应用的组合物还包含反应性化合物，其中反应性化合物选自氧化还原活性化合物、自由基构建化合物、稳定化合物及任意其组合。在不受理论约束的
情况下，蛋白质疫苗在包含存在于铝盐(例如氢氧化铝)中的重金属离子的水性组合物中的抗原降解可以用假设自由基(例如如亚硫酸盐的自由基)的潜在降解途径来解释。重金属催化的氧化是导致蛋白质共价修饰的降解途径。经氧化/经修饰的蛋白质或抗原的经修饰物理化学特性可导致生物活性的损失。氧化还原活性化合物适合于防止这种修饰。优选地，所述反应性化合物选自甲醛、乙醇、氯仿、三氯乙烯、丙酮、triton-x-100、脱氧胆酸盐、二乙基焦碳酸盐、亚硫酸盐、na2s2o5、β-丙内酯、聚山梨醇酯例如吐温吐温o2、苯酚、普朗尼克型共聚物及任意其组合。
[0087]
本发明的另一些实施方案如下：
[0088]
1.用于对人进行疫苗接种的方法，所述方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：
[0089]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人至少三次；或者
[0090]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂60至100μg施用于人儿童至少三次。
[0091]
2.用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答的方法，所述方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：
[0092]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人至少三次；或者
[0093]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂60至100μg施用于人儿童至少三次。
[0094]
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中第二次施用在第一次施用之后至少6周至至多3个月的期间进行，和/或第三次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。
[0095]
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中第二次施用在第一次施用之后至少50天至至多70天的期间，特别是在至少55天至至多60天的期间，尤其是在56天进行；和/或
[0096]
其中第三次施用在第一次施用之后至少170天至至多190天的期间，至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。
[0097]
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述组合物在第一次施用之后至少15个月至至多21个月的期间，特别是在至少17个月至至多19个月的期间，尤其是在18个月进行第四次施用。
[0098]
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂135μg至180μg，特别是对于成人或人儿童为每剂135μg或180μg，或者其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂67.5μg至90μg，特别是对于幼儿为每剂67.5μg或90μg。
[0099]
7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白占所述组合物中所有蛋白质的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％。
[0100]
8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含重量比为1:1:1(lip-s1d1-s2d1:lip-s4d1-s3hybd1:lip-s5d1-s6d1)的所述融合蛋白。
[0101]
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含佐剂。
[0102]
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述组合物包含铝佐剂。
[0103]
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0104]
12.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0105]
13.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0106]
14.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0107]
15.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0108]
16.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0109]
17.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0110]
18.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0111]
19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中再次施用在最后一次初次免疫接种之后每年或在每个蜱季开始时，特别是在1年之后、2年之后和3年之后等进行。
[0112]
20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中所引发的免疫应答包含具有杀菌活性的抗ospa血清型1、抗ospa血清型2、抗ospa血清型3、抗ospa血清型4、抗ospa血清型5和/或抗ospa血清型6抗体应答。
[0113]
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所引发的免疫应答包含针对表
达ospa血清型1、2、3、4、5和6的螺旋体具有杀菌活性的抗体。
[0114]
22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法，其中针对ospa血清型1、2、3、4、5和6的所述免疫应答持续至少约60天、持续至少约180天、持续至少约365天或持续至少约540天。
[0115]
23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述组合物包含低于1.25ppb的铜或足量的l-甲硫氨酸。
[0116]
24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其中铜为离子的形式，特别是作为cu
+
或cu
2+
的形式。
[0117]
25.根据实施方案1至24中任一项所述的方法，其中l-甲硫氨酸以至少10mmol/l的浓度存在。
[0118]
26.根据实施方案23至25中任一项所述的方法，其中以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少与所述组合物中铜的浓度等同。
[0119]
27.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含反应性化合物，其中所述反应性化合物选自氧化还原活性化合物、自由基构建化合物、稳定化合物及任意其组合，尤其是其中所述反应性化合物选自甲醛、乙醇、氯仿、三氯乙烯、丙酮、triton-x-100、脱氧胆酸盐、二乙基焦碳酸盐、亚硫酸盐、na2s2o5、β-丙内酯、聚山梨醇酯例如吐温吐温o2、苯酚、普朗尼克型共聚物及任意其组合。
[0120]
28.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述成人是18岁或更大，例如18至65岁的对象。
[0121]
29.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述成人是50岁或更大的年长对象。
[0122]
30.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述人儿童是5至17岁，例如12至17岁或5至11岁的对象。
[0123]
31.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述人儿童是0至4岁，例如1至4岁或2至4岁的对象。
[0124]
32.根据实施方案1至31中任一项所述的方法，其中所述组合物以0.25毫升(ml)至1.0ml，例如0.25ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。
[0125]
33.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述组合物以0.25ml、0.5ml或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。
[0126]
34.用于对人进行疫苗接种的方法，所述方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：
[0127]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人至少两次；或者
[0128]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂60至100μg施用于人儿童至少两次。
[0129]
35.用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答的方法，所述方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：
[0130]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人至少两次；或者
[0131]-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量或每剂60至100μg施用于人儿童至少两次。
[0132]
36.根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中第二次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。
[0133]
37.根据实施方案34至36中任一项所述的方法，其中第二次施用在第一次施用之后至少170天至至多190天的期间，在至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。
[0134]
38.根据实施方案34至37中任一项所述的方法，其中所述组合物的第三次施用在第一次施用之后至少15个月至至多21个月的期间，特别是在至少17个月至至多19个月的期间，尤其是在18个月进行。
[0135]
39.根据实施方案34至38中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂135μg至180μg，特别地为每剂135μg或180μg，或者其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂67.5μg至90μg，特别是对于幼儿为每剂67.5μg或90μg。
[0136]
40.根据实施方案34至39中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白占所述组合物中所有蛋白质的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％。
[0137]
41.根据实施方案34至40中任一项所述的方法，其中所述组合物包含重量比为1:1:1(lip-s1d1-s2d1:lip-s4d1-s3hybd1:lip-s5d1-s6d1)的所述融合蛋白。
[0138]
42.根据实施方案34至41中任一项所述的方法，其中所述组合物包含佐剂。
[0139]
43.根据实施方案34至42中任一项所述的方法，其中所述组合物包含铝佐剂。
[0140]
44.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0141]
45.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0142]
46.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0143]
47.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0144]
48.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0145]
49.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0146]
50.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其
中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0147]
51.根据实施方案34至43中任一项所述的方法，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。
[0148]
52.根据实施方案34至51中任一项所述的方法，其中再次施用在最后一次初次免疫接种之后每年或在每个蜱季开始时，特别是在1年之后、2年之后和3年之后等进行。
[0149]
53.根据实施方案34至52中任一项所述的方法，其中所引发的免疫应答包含具有杀菌活性的抗ospa血清型1、抗ospa血清型2、抗ospa血清型3、抗ospa血清型4、抗ospa血清型5和/或抗ospa血清型6抗体应答。
[0150]
54.根据实施方案34至53中任一项所述的方法，其中所引发的免疫应答包含针对表达ospa血清型1、2、3、4、5和6的螺旋体具有杀菌活性的抗体。
[0151]
55.根据实施方案34至54中任一项所述的方法，其中针对ospa血清型1、2、3、4、5和6的所述免疫应答持续至少约60天、持续至少约180天、持续至少约365天或持续至少约540天。
[0152]
56.根据实施方案34至55中任一项所述的方法，其中所述组合物包含低于1.25ppb的铜或足量的l-甲硫氨酸。
[0153]
57.根据实施方案34至56中任一项所述的方法，其中铜为离子的形式，特别是作为cu
+
或cu
2+
的形式。
[0154]
58.根据实施方案34至57中任一项所述的方法，其中l-甲硫氨酸以至少10mmol/l的浓度存在。
[0155]
59.根据实施方案56至58中任一项所述的方法，其中以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少与所述组合物中铜的浓度等同。
[0156]
60.根据实施方案34至59中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含反应性化合物，其中所述反应性化合物选自氧化还原活性化合物、自由基构建化合物、稳定化合物及任意其组合，尤其是其中所述反应性化合物选自甲醛、乙醇、氯仿、三氯乙烯、丙酮、triton-x-100、脱氧胆酸盐、二乙基焦碳酸盐、亚硫酸盐、na2s2o5、β-丙内酯、聚山梨醇酯例如吐温吐温o2、苯酚、普朗尼克型共聚物及任意其组合。
[0157]
61.根据实施方案34至60中任一项所述的方法，其中所述成人是18岁或更大，例如18至65岁的对象。
[0158]
62.根据实施方案34至60中任一项所述的方法，其中所述成人是50岁或更大的年长对象。
[0159]
63.根据实施方案34至60中任一项所述的方法，其中所述人儿童是5至17岁，例如12至17岁或5至11岁的对象。
[0160]
64.根据实施方案34至60中任一项所述的方法，其中所述人儿童是0至4岁，例如1至4岁或2至4岁的对象。
[0161]
65.根据实施方案34至64中任一项所述的方法，其中所述组合物以0.25毫升(ml)至1.0ml，例如0.25ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。
[0162]
66.根据实施方案34至65中任一项所述的方法，其中所述组合物以0.25ml、0.5ml
或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。
[0163]
在任何情况下，本发明人意在将本文中的术语“包含”及其变化形式分别任选地替换为术语“由
……
组成”及其变化形式。术语“包含”意指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变化形式将理解为暗指包含所述化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗体)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其他的化合物、组合物、步骤或其组。缩写“例如(e.g.)”源于拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
[0164]
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学中常用术语的定义可存在于benjamin lewin,genes v,发表于oxford university press,1994(isbn 0-19-854287-9)；kendrew et al.(eds.),the encyclopedia of molecular biology,发表于blackwell science ltd.,1994(isbn 0-632-02182-9)；和robert a.meyers(ed.),molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,发表于vch publishers,inc.,1995(isbn 1
ꢀ‑
56081
ꢀ‑
569-8)。
[0165]
除非上下文另外明确指示，否则没有数量词限定的名词包括复数指代。类似地，除非上下文另外明确指示，否则词语“或/或者”旨在包括“和”。术语“多个/种”是指两个/种或更多个/种。还应理解的是，针对核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸，以及所有分子量或分子质量值均是近似的，并且出于描述而提供。另外，关于物质(例如抗原)的浓度或水平给出的数字限制可以是近似的。
[0166]
本发明通过以下图、表和实施例进一步举例说明，从中可以采取另外的特征、实施方案和优点。因此，所讨论的具体修饰不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员而言明显的是可以在不偏离本发明范围的情况下进行多种等同方案、改变和修改，并且因此应理解，这样的等同实施方案将包括在本文中。
实施例
[0167]
材料和方法
[0168]
蜱攻击法蜱攻击法通过以下进行：将至少一个感染有疏螺旋体(例如阿氏疏螺旋体菌株is1)的蜱蛹(例如i.ricinus)施加至用本发明的多价疏螺旋体疫苗免疫接种或用人血清预处理的小鼠；以及b)将至少一个被感染的蜱蛹施加至用适当的安慰剂(阴性)对照，例如单独的缓冲剂或佐剂处理的第二只小鼠；以及c)通常在攻击之后4至6周比较两只小鼠中的感染率。优选地，小鼠组(例如5至10只小鼠/组)用于每种处理。感染状态的评估可以使用如wo2014006226中所述的对血清进行vlse elisa和/或对收集的组织进行qpcr，或者使用其他合适的方法来完成。
[0169]
针攻击法针攻击法针对期望的疏螺旋体菌株(例如，伯氏疏螺旋体菌株n40)进行，其通过将疏螺旋体以20至50倍感染剂量(id)
50
的剂量皮下引入至用本发明的多价疏螺旋体疫苗免疫接种或用人血清预处理，或者用合适的安慰剂(阴性)对照(例如单独的缓冲剂或佐剂)免疫接种的小鼠，以及比较受攻击小鼠中的感染率。以细菌数目测量的id
50
被限定为50％未经处理的受攻击小鼠被感染的剂量。攻击剂量可以广泛变化，并且是菌株依赖性的；因此，必须首先通过攻击实验评估菌株的毒力以用于确定id
50
。在针攻击之后四周，收集血
液和组织用于读出方法以确定感染状况。读出方法可以是例如如wo2014006226中所述的用于鉴定疏螺旋体的对血清进行vlse elisa和/或对收集的组织进行qpcr，或者其他方法。
[0170]
螺旋体抗体结合测定将螺旋体1
×
105至1
×
106与等体积的4％多聚甲醛混合，并将其在96孔板(nunclon 96u，nunc)中于室温下孵育20分钟。将板在2,000g下离心5分钟并弃去上清液。用150μl含2％ bsa的汉克斯平衡盐溶液(hanks’balanced salt solution with 2％ bsa，hbss-b)洗涤细胞，如上进行离心并弃去上清液。通过在56℃下孵育血清35分钟使其热灭活。将热灭活的血清于hbss-b中稀释，并通过使用costar spin-x离心管过滤器(0.22μm，corning，usa)在17,000g下离心3分钟进行无菌过滤。将螺旋体悬浮在100μl血清中并将其在室温下孵育45分钟。将板在2,000g下离心5分钟并弃去上清液。将细胞用150μlhbss-b洗涤一次，并将其重悬于100μl含有1:150稀释的pe缀合的二抗的hbss-b中。将一微升合适的二抗(例如pe缀合的抗小鼠或抗人igg，可从beckman coulter，usa获得)添加至细胞，并将其在室温下在黑暗中孵育45分钟。将螺旋体用150μl hbss-b洗涤一次，并将其重悬于200μl含有10ug lds 751dna染料的hbss中，并将其在室温下在黑暗中孵育10分钟。将经染的螺旋体通过在2,000g下离心5分钟来沉淀，并随后将其重悬于200μl hbss中。用cytoflex(beckman coulter)流式细胞仪测量标记的螺旋体，对lds 751阳性事件进行设门。
[0171]
血清杀菌测定(serum bactericidal assay，sba)测量疫苗诱导的抗体的连同外源性添加的补体杀伤细菌的能力(图1)。疫苗诱导的抗体识别螺旋体上的表面暴露的抗原，并招募主要通过经典途径而激活的补体，从而形成膜攻击复合物、溶菌并最终使靶细菌死亡。将血清样品用bsk-ii培养基连续稀释2倍，随后在白96孔测定板中在bsk-ii培养基中与从过夜培养物中获得的疏螺旋体和豚鼠或幼兔补体(来源和最终浓度取决于血清型，1至25％)混合。然后将该板在+32℃、5％ co2下孵育3至6天(取决于疏螺旋体血清型)。在测定结束时，通过测量基于萤光素酶的反应(bactiter-glo，promega)下的atp依赖性光发射来确定活(代谢活跃)疏螺旋体的量。人血清合并物用作阳性品质对照(qc)，而市售的原初人血清则用作阴性对照(negative control，nc)。为了计算样品效价，将每个样品的稀释度与相对光单位设定为100％的阴性人血清(nc)的相应稀释度进行比较。测试样品的sba效价是诱导≤50％生存力的最高血清稀释度的倒数。对于血清型1、2、4、5、6，低于sba定量限(效价为20)的值用效价为10代替。对于血清型3，低于sba定量限(效价为160)的值用效价为80代替。
[0172]
ospa血清型特异性人血清igg酶联免疫吸附测定(elisa)通过elisa来确定ospa血清型特异性抗体的igg几何平均效价。将板用来自st1、st2、st3、st4、st5或st6的全长脂化的ospa进行包被。由人血清合并物制备试验血清的系列稀释、参考物质(reference substance，rs)和qc样品。还使用了空白对照。用人igg特异性二抗缀合物检测结合的抗体。使用softmax pro 5.2gxp软件来计算ospa特异性igg的浓度。针对参考物质测试的每个样品单独创建了平行线分析曲线。与参考物质浓度曲线相比，这些曲线中给出的相对效力用于计算样品的igg浓度(u/ml)。在elisa测定中从1期试验修改为2期试验(参见表a-1)。1期试验(实施例1)中使用的elisa的定量限是20个elisa单位(eu)/ml(在本文中也称为u/ml)；值《20eu/ml被10eu/ml的值替代。第一2期试验(实施例2)中使用的轻微改变的elisa的定量限为40eu/ml；值《40eu/ml被20eu/ml的值替代。
[0173]
表a-1. 1期和2期临床试验中igg测定(elisa)的差异
[0174][0175]
实施例1.多价疏螺旋体疫苗的1期临床试验
[0176]
1期临床试验设计和免疫原性结果
[0177]
开始进行了首次在人中、观察者不知情、部分随机、多中心剂量递增的i期临床研究，其旨在研究在有和没有氢氧化铝的情况下不同剂量的本发明多聚体疏螺旋体疫苗(“mbv”)的安全性和免疫原性。该研究在年龄为18至39岁的健康成人中进行，其对广义伯氏疏螺旋体呈基线血清阴性(即先前未感染疏螺旋体的对象)。试验设计示于图2中。简言之，在179名健康对象(即约30名对象/处理组)中，使用6种不同的处理(3种剂量水平，其各自具有佐剂和不具有佐剂)来评价间隔28天递送的三次肌内疫苗接种的安全性特征和免疫原性。所有制剂均含有1:1:1重量比的ospa片段多肽(seq id no:1、2和3)中的每一种(例如，低剂量(12μg)含有由seq id no:1、2和3限定的脂化多肽中的每一种4μg)。
[0178]
1期试验剂量组(第0天、第28天、第56天i.m.疫苗接种)：
[0179]-12μg具有铝(n＝29)
[0180]-12μg不具有铝(n＝29)
[0181]-48μg具有铝(n＝31)
[0182]-48μg不具有铝(n＝29)
[0183]-90μg具有铝(n＝31)
[0184]-90μg不具有铝(n＝30)
[0185]
在第0、28、57、84、180、236和365天在所有组中评估免疫原性，预计在第84天(即第三次疫苗接种之后4周，主要终点分析)达到峰值抗体效价。图3a中示出了在第84天时针对每种ospa血清型的几何平均效价。图3b示出了每组的血清转换率(即血清转换的对象率)，其中血清转换定义为自基线起igg效价≥4倍提高。
[0186]
加强剂延伸期基于来自第84天分析的结果，选择具有或不具有佐剂的48μg和90μg剂量组以在大约第13个月时接受加强疫苗接种，并针对安全性和抗体持久性进一步随访6个月。施用的加强剂量与用于致敏的剂量和制剂相同。本研究的加强剂延伸部分仅在三个
研究点中的一处进行，导致加强期中对象数量显著降低，为n＝64名对象。
[0187]
1期试验加强剂延伸剂量组(第13个月i.m.加强)。
[0188]-48μg具有铝(n＝15)
[0189]-48μg不具有铝(n＝16)
[0190]-90μg具有铝(n＝16)
[0191]-90μg不具有铝(n＝17)
[0192]
在第13个月(加强前)、第14个月和第19个月在加强剂延伸组中评估免疫原性。加强剂延伸的目的是研究在初次方案最后一次免疫接种之后大约一年施加加强剂量的疫苗a至多至施加加强剂量之后6个月的安全性和免疫原性。加强剂延伸的另一个用途是产生高效价血清以用于功能测定开发和潜在的概念验证(proof-of-concept，poc)研究。此外，加强剂允许在临床开发早期收集加强剂量的安全性和免疫原性数据。
[0193]
在第84天和第13、14和19个月，包括在加强剂延伸期的主要分析(primary analysis)中的对象(加强剂pp体)的igg gmt值分别在图4a至d和下表1中示出。表2和表3中分别提供了与加强前时间点(第13个月)相比和与初次疫苗接种系列(第84天)之后的峰值效价相比，igg效价的几何平均倍数上升(geometric mean fold rise，gmfr)，以及第84天、第13个月和第14个月的血清转换率。为了在整个研究持续时间期间相对于六种血清型中每一种的免疫应答对组进行比较，图5a至f中提供了在研究持续时间期间包括在加强剂延伸期中的对象(加强剂pp体，即参与了加强剂延伸期并根据方案在正确的时间接受正确加强剂量的对象)的gmt值。
[0194]
表1.在第84天、m13、m14和m19，加强剂pp体的血清型特异性igg效价的gmt。
[0195][0196]
表2.与第13个月(加强前)和第84天(初次免疫接种系列之后的峰值抗体效价)相比，在第14个月和第19个月加强剂pp体的血清型特异性igg效价的几何平均倍数上升(gmfr)。
[0197][0198]
表3.在第84天、m13、m14和m19加强剂pp体的每种血清型的血清转换率(scr)。
[0199][0200]
1期血清样品中elisa和sba效价的相关性血清型特异性血清杀菌测定(sba-参见材料和方法)(用于临床样品保护的体外相关性)，产生的值与个体对象血清中血清型1、2和3的elisa值密切相关，如图6a、b和c中分别所示。
[0201]
总之，在1期中研究的所有剂量和制剂均能诱导血清型特异性igg抗体，其中对于高剂量组和对于佐剂化制剂观察到了更高的免疫原性。在终止初次免疫接种系列之后大约一年施加的加强剂量对所有六种ospa血清型均产生了显著的加强剂应答(即与完成初次免疫接种之后4周相比，在加强剂剂量之后4周，igg效价显著更高)并且在19个月内维持了较高的水平(表3)。由于持续的循环抗体水平对于基于ospa的疫苗的效力是高度重要的，因此在2期中引入了进一步的剂量提高和替代方案，其旨在诱导更早、更高和更持久的免疫应答。
[0202]
实施例2.多价疏螺旋体疫苗的研究疫苗的更高剂量的2期临床试验2期临床试验设计和来自导入期的初步描述性免疫原性数据的总结
[0203]
目前正在进行观察者不知情、随机的、安慰剂对照的、多中心2期研究，其旨在研究一系列较高剂量的用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗在年龄为18至65岁的健康成人中的安全性和免疫原性。将对广义伯氏疏螺旋体呈基线血清阴性的对象(即先前未感染疏螺旋体的对象)和对广义伯氏疏螺旋体呈基线血清阳性的对象(即先前感染疏螺旋体的对象)招募在该研究中。该研究由安全性导入期(年龄18至40岁，n＝120名对象)组成，以便在开始135μg和180μg两个较高剂量组的主要研究期(年龄18至65岁，n＝450名对象)之前，在较小体中研究在具有铝和不具有铝的情况下，90μg、135μg和180μg三个剂量水平的本发明的多聚体疏螺旋体疫苗(“mbv”)的安全性(参见图7)。对象间隔一个月接受三次i.m.疫苗接种(即第0-1-2月)。在主要研究期，对象以约2:1的比例招募在两个年龄组(18至49岁和50至65岁)中。2期试验的主要目的是评估与首次在人中的试验相比，多聚体疏螺旋体疫苗在较高的剂量水平下在年龄18至65岁健康成人中的免疫原性和安全性，并确定疫苗的最佳剂量。所有制剂均含有重量比为1:1:1的ospa片段多肽(seq id no:1、2和3)中的每一种(例如，低剂量(90μg)含有由seq id no:1、2和3限定的脂化多肽中的每一种30μg，高剂量(180μg)含有由seq id no:1、2和3限定的脂化多肽中的每一种60μg)。
[0204]
导入期将共计120名年龄为18至40岁的健康对象招募到四个处理组(d1、d29、d57 i.m.疫苗接种)中：90μg具有铝的本发明多聚体疏螺旋体疫苗(“mbv”)、135μg具有铝的mbv、180μg具有铝的mbv、安慰剂(pbs)，约30名对象/处理组。在数据安全性监督委员会(data safety monitoring board，dsmb)对多达第85天的安全性数据进行审查之后，选择这两个较高剂量组(即135μg和180μg)以用于主要研究期中的进一步研究。在第1、29、57、85(主要免疫原性分析)、180、236和365天收集血清，并将其通过elisa和sba(在代表性的对象亚中选定的时间点)评估免疫原性。
[0205]
对来自导入期的免疫原性数据进行的初步描述性分析揭示了，多价疏螺旋体疫苗在导入期中测试的所有剂量水平下均具有免疫原性。90μg w/铝组中的初步gmt效价(elisa)与相同剂量水平下1期试验中获得的gmt效价相当。观察到剂量应答，其中对于所有血清型，在90μg剂量组中igg效价最低，而在180μg剂量组中igg效价最高。如所预期的，与1期相比，剂量提高导致在初次免疫接种之后峰值免疫应答提高。然而，在所有剂量组中抗体水平长达第180天相对显著下降。鉴于在2期导入期中主要系列之后观察到抗体效价下降，因此多聚体疏螺旋体疫苗的未来开发应考虑更广泛的第0-2-6月方案。基于其他疫苗的经验，预计这将导致甚至更高的峰值效价和极好的持久性，并且还可提高抗体品质。
[0206]
主要期将共计450名年龄为18至65岁的健康对象将招募到三个处理组(d1、d29、d57 i.m疫苗接种)中：135μg具有铝(n＝约180)、180μg具有铝(n＝约180)、安慰剂(pbs)(n＝约90)。进行第一数据分析，其包括来自主要研究期和导入期的第85天的合并免疫原性数据(通过elisa的ospa血清型特异性igg的gmt)。使用血清杀菌测定(sba)来评估第85天抗体的功能。数据确定了在初次免疫接种系列完成之后导入期在较高抗体效价方面的初步数据分析，即与在导入期研究的90μg剂量组(gmt范围为74.3[st1]至267.4[st3])相比，在第85天在135μg(gmt范围为101.1[st1]至282.2[st3])和180μg剂量组(gmt范围为115.8[st1]至308.6[st3])下达到了更高的抗体水平。数据揭示了，作为获得莱姆病的高风险组之一的老年成人(50至65岁年龄组)也表现出令人鼓舞的免疫应答，两个年龄组之间没有统计学上显著的差异。对免疫原性数据的总结参考表4。
[0207]
此外，以1:1:1的重量比的如上所述的疏螺旋体疫苗(ospa片段多肽(seq id no:1、2和3)(例如，低剂量(90μg)包含由seq id no:1、2和3所限定的脂化多肽中的每一种30μg，高剂量(180μg)包含由seq id no:1、2和3所限定的脂化多肽中的每一种60μg)在所有测试的剂量组中都具有免疫原性。与1期相比，本试验中使用的较高剂量在所有血清型中均引发了更高的抗体应答。最高剂量中的血清转换率(scr)范围为81.5％(st1)至95.8％(st2)。在与1期研究的年龄组(18至49岁)相当的年龄组中，scr范围为：85.6％至97％(先前的研究：71.4％至96.4％)。莱姆疫苗的主要目标组之一的老年成人的免疫应答特别令人鼓舞。结果并未表明之前暴露于莱姆(血清阳性)对免疫原性或安全性具有影响。
[0208]
所述疏螺旋体疫苗在测试的所有剂量和年龄组中均通常是安全的。在本研究中，在任何处理组中都没有观察到与疏螺旋体疫苗有关的严重不良事件(sae)。反应原性随着随后的疫苗接种而降低。
[0209]
总体而言，耐受性谱(包括发热率)显示与其他脂化重组疫苗或含脂制剂相当。
[0210]
表4：
[0211]
第85天gmt，第一2期研究(方案第0-1-2月)，pp体
[0212]
[0213][0214]
表12中示出了第85天时的血清转换率(scr)。在90μg剂量中，scr范围为65.4％(st1)至96.2(st3)，在135μg剂量中，scr范围为80.9％(st1)至98.4(st2)，以及在180μg组中，scr范围为81.5％(st1)至95.8％(st3)。
[0215]
表12：第85天scr(elisa)，第一2期研究(方案第0-1-2月)，pp体
[0216][0217]
已使用血清杀菌测定(sba-参见材料和方法)表明了针对所有血清型的抗体的功能。表13中总结了第85天时的gmt。
[0218]
表13：第85天时(方案第0-1-2月)如通过sba测量的功能抗体的gmt。
[0219][0220]
elisa效价与每种ospa血清型的相应sba效价和个体对象血清显著相关，如图9a至9f中所示。斯皮尔曼相关系数范围为对于血清型4的0.5737(p值《0.0001)至对于血清型3的0.9030(p值《0.0001)。
[0221]
实施例3.多价疏螺旋体疫苗的研究疫苗的更高剂量和更广泛的免疫接种方案的2期临床试验
[0222]
总的来说，将246名年龄为18至65岁的健康对象招募到该研究中，即以替代的、更广泛的免疫接种方案研究了与实施例2中测试的相同剂量组的观察者不知情的、随机的、安慰剂对照的、多中心2期研究。对象在第0、2和6个月(第1-57-180天)接受135μg或180μg配制有w/铝的多聚体疏螺旋体疫苗(每组约100名对象)或安慰剂(约50名对象)的三次i.m.免疫接种(即，重量比为1:1:1的ospa片段多肽(seq id no:1、2和3)，(例如，低剂量(135μg)包含由seq id no:1、2和3所限定的脂化多肽中每一种45μg，高剂量(180μg)包含由seq id no:1、2和3所限定的脂化多肽中每一种60μg)。对象以约2:1的比例招募到两个年龄组(18至49岁和50至65岁)中。此外，将对于广义伯氏疏螺旋体呈基线血清阴性的对象(即先前未感染疏螺旋体的对象)以及对广义伯氏疏螺旋体呈基线血清阳性的对象(即先前感染疏螺旋体的对象)招募到该研究中。2期试验的主要目的是评估与首次在人中试验相比，多聚体疏螺旋体疫苗在较高剂量水平下在年龄为18至65岁健康成人中的免疫原性和安全性，以及施加上述实施例中使用的更广泛的免疫接种方案。与实施例2获得的结果一起，数据将用于确定后期临床开发的疫苗的最佳剂量和方案。试验设计示于图8中。
[0223]
在第1、29、57、85、180、208(主要免疫原性分析)、365和545天收集血清，并将其通过elisa和sba(选定的时间点)评估免疫原性。
[0224]
在第85天(即在第二次疫苗接种之后)，在135μg剂量组中，抗体水平(gmt)范围为64.1[st1]至166.4[st3]，以及在180μg剂量组中，范围为75.2[st1]至217.7[st3]。表10提供了第二2期研究的几何平均效价(gmt)的概述，以及表11、图10提供了第二2期研究的第85天的血清转换率的概述。另见图12至17。
[0225]
总的来说，在较高的180μg剂量下免疫应答的开始显示稍微更快一些，即与135μg组相比，在180μg剂量组下，在第85天的gmt更高。对于135μg与180μg处理组之间的gmt比较参考图18a和18b，第85天的gmt值参考表10。
[0226]
表10：第85天gmt，第二2期研究(方案第0-2-6月)，pp体
[0227][0228]
表11：第85天scr，第二2期研究(方案第0-2-6月)，pp体
[0229]
[0230][0231]
包括第208天(即在第三次疫苗接种之后1个月)免疫原性和安全性数据的初始数据分析揭示了使用更广泛的免疫接种方案(方案第0-2-6月)进一步提高了抗体效价。在135μg剂量组中在第208天的峰值抗体水平(gmt)的范围为276.4[st1]至539.0[st2]，以及在180μg剂量组中范围为274.7[st1]至596.8[st3](参见表5)，其是与使用第0-1-2月的疫苗接种方案的相同处理组下获得的相应效价相比的1.7至2.7倍高(参见表6)。与elisa数据一致，与m 0-1-2方案相比，使用第0-2-6月方案的sba效价的gmt也提高了1.4至3.1倍(表14)。表5提供了第二2期研究的几何平均效价(gmt)的概述，并在表6中对使用不同疫苗接种方案的gmt进行了比较。
[0232]
表5：第208天gmt(elisa)，第二2期研究(方案第0-2-6月)，pp体
[0233][0234]
如表5中所示出的，莱姆疫苗主要目标组之一的老年成人中的免疫应答特别令人鼓舞。另外，结果并未表明先前暴露于莱姆(血清阳性)对免疫原性或安全性具有影响(数据未示出)。
[0235]
表6：使用不同免疫接种方案的gmt(elisa)的比较
[0236][0237][0238]
如在第一2期研究中，作为获得莱姆病的高风险组之一的老年成人(50至65岁年龄组)也显示出令人鼓舞的免疫应答，两个年龄组之间的gmt没有统计学上显著的差异(表5)。
[0239]
表7和图11中示出了第208天时的血清转换率(scr)。在135μg剂量中，scr范围为89.6％(st6)至98.7(st3)，以及在180μg组中，scr范围为93.8％(st1)至98.8％(st2，st4)。
[0240]
表7：第208天scr(elisa)，第二2期研究(方案第0-2-6月)，pp体
[0241][0242]
已使用血清杀菌测定(sba-参见材料和方法)表明了针对所有血清型的抗体的功能。表8中总结了第208天的gmt。
[0243]
表8：在第208天如通过sba测量的功能性抗体的gmt。
[0244][0245]
elisa效价与每种ospa血清型的相应sba效价和个体对象血清显著相关，如图9a至9f中所示。斯皮尔曼相关系数范围为对于血清型4的0.6487(p值《0.0001)至对于血清型3的0.9131(p值《0.0001)。
[0246]
表14：使用不同免疫接种方案的gmt(sba)的比较
[0247][0248]
多聚体疏螺旋体疫苗(“mbv”)在测试的所有剂量和年龄组中均通常是安全的。在这项研究或任何研究中均未观察到相关的严重不良事件(sae)。在第一次疫苗接种之后反应原性下降。总体而言，耐受性谱(包括发热率)与其他脂化重组疫苗或含脂制剂相当。表9提供了所述疫苗的2期研究之间的安全性数据比较，以及与其他脂化重组疫苗或含脂制剂的比较。
[0249]
表9：与其他脂化重组疫苗或含脂制剂的征求的局部和全身不良事件的比较。
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255][0256]1trumenba处方信息要点9/2017(trumenba highlights of prescribing information 9/2017)，2bexsero处方信息要点10/2017(bexsero highlights of prescribing information 10/2017)，3pi lymerix(征求的ae率)。
[0257]
a“任何”被限定为在疫苗接种7天内报道反应为“轻度”、“中度”或“严重”的对象的累积频率。轻度(2.5至5.0cm)；中度(》5.0至10.0cm)；严重(》10.0cm)。
[0258]
总之，临床研究已表明，多聚体疏螺旋体疫苗在所测试的所有剂量和年龄组中均通常是安全的。在2期使用更高的疫苗剂量(135μg，180μg)和替代的免疫接种方案(第0-2-6月)，提高了免疫原性。
[0259]
实施例4：多价疏螺旋体疫苗的在年龄为5至65岁的研究体中研究疫苗的三剂量或两剂量初次免疫接种方案和加强剂量的2期临床试验
[0260]
本研究是在年龄为5至65岁的健康对象中进行的随机的、观察者不知情的、安慰剂对照的、多中心2期研究。该研究以两个研究部分(a部分：主要研究期，b部分：加强期)进行。该研究以前哨组(sentinel cohort)的年龄递减招募开始。招募到a部分中的对象以成人组开始，其允许在开始儿童组之前产生和审查适当的安全性数据。
[0261]
a部分(主要研究期)中的对象招募：
[0262]
针对三个年龄组以年龄递减、交错的方式进行招募(参见图19)。
[0263]
招募组1(18至65岁)：
[0264]
招募以30名年龄为18至65岁的前哨成人对象开始(组1)。将对象以1:1:1随机化成三个研究组之一以接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗(“mbv”)(组1和组2)或安慰剂(组3)的疫苗接种。在这30名前哨对象接受第1次疫苗接种并完成疫苗接种之后7天的安全性随访访视(访视1a)(包括审查7天的电子日记数据)之后，由独立的内部审查委员会(internal review committee，irc)以非盲的方式审查安全性数据。基于该数据，irc对是否可以启动青少年年龄组(12至17岁，组2)的招募作出建议。在irc审查期间，组1剩余的270名成人对象的招募继续进行，而没有限制。
[0265]
招募组2(12至17岁)：
[0266]
在irc准许之后，招募30名年龄为12至17岁的前哨青少年对象(组2)。将对象以1:1:1随机化成三个研究组之一以接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗(组1和组2)或安慰剂(组3)的疫苗接种。同样，在这些对象在第一次疫苗接种之后7天完成其安全性随访访视(访视1a)(包括审查7天的电子日记数据)之后，由irc审查安全性数据。irc建议是
否可以启动最年轻年龄组(5至11岁)的招募。在该年龄组中，剩余的120名青少年对象的招募仅在irc准许之后才启动。
[0267]
招募组3(5至11岁)。
[0268]
在irc准许之后，招募30名年龄为5至11岁的前哨对象(组3)。将对象以1:1:1随机化成三个研究组之一以接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗(组1和组2)或安慰剂(组3)的疫苗接种。同样，在这30名对象在第一次接种之后7天完成其安全性随访访视(访视1a)(包括审查7天的电子日记数据)之后，由irc审查安全性数据。只有在irc准许之后，才启动该年龄组中剩余120名对象的招募。外部独立的数据安全性监督委员会(dsmb)以非盲的方式以规则的间隔审查积累的安全性数据，并且可在任何时间建议调整、暂停或中止研究。
[0269]
b部分(加强期)中的对象招募：
[0270]
多聚体疏螺旋体疫苗加强剂(组1或组2)
[0271]
根据选择用于进一步开发的初次免疫接种方案接受了所有免疫接种的研究组(组1或组2)中所有符合条件的对象(至多200名；参见表15)继续b部分，并在第18个月时接受另外的mbv疫苗接种。
[0272]
安慰剂加强剂(组1或组2)
[0273]
根据替代的初次方案(即，未选择用于进一步开发的方案)接受了所有免疫接种并且符合加强期条件的研究组(组1或组2)中约一半的对象(即至多100名，保持2:1:1的年龄分层；参见表15)继续b部分。出于该目的，前50名符合条件的成人对象(18至65岁年龄组)、前25名符合条件的青少年对象(12至17岁年龄组)以及前25名符合条件的对象，(5至11岁年龄组)在他们出席其第8次访视/第18个月访视时被包含在加强期内。这些对象在第18个月时接受安慰剂注射。来自该研究组的剩余对象则中止。
[0274]
安慰剂加强剂(组3)
[0275]
根据方案接受了所有注射并且符合加强期条件的安慰剂研究组(组3)内约一半的对象(即至多100名，保持2:1:1的年龄分层；参见表15)继续b部分。出于该目的，前50名符合条件的成人对象(18至65岁年龄组)、前25名符合条件的青少年对象(12至17岁年龄组)以及前25名符合条件的对象(5至11岁年龄组)在他们出席其第8次访视/第18个月访视时被包含在加强期内。这些对象在第18个月时接受另外的安慰剂注射。来自该研究组的剩余对象则中止。在进行主要终点分析时，即在将对象招募到b部分中之前，研究发起人和研究统计人员是知情的。一旦达到b部分登记的符合条件的对象数量，就通过电子系统通知研究点。
[0276]
研究设计
[0277]
该研究以两个研究部分(a部分：主要研究期，b部分：加强期)进行。对于研究设计参考图20。
[0278]
在a部分(主要研究期)中，将共计约600名年龄为5至65岁的对象以1:1:1随机化成三个研究组：组1(约200名对象)在第0-2-6月时接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗的三次疫苗接种。组2(约200名对象)在第0-6月时接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗的两次疫苗接种，并在第2月时接受安慰剂注射以保持不知情。组3(约200名对象)在第0-2-6月时接受三次安慰剂注射。在每个研究组中，对象以2:1:1招募到三个年龄组(18至65岁、12至17岁和5至11岁)中。
[0279]
在a部分中，所有对象在第0-2-6月(即第1-57-180天)时接受mbv或安慰剂的三次i.m.注射。在第8天/访视1a(即在第一次疫苗接种之后7天)，进行安全性访视(对年龄为18至65岁的对象进行电话访问，对年龄为5至17岁的对象进行亲自访视)。在每次疫苗接种之后一个月对于所有年龄组，均安排了亲自访视。在筛查访视第85天、第180天、第194天(在成人对象的亚中)、第208天、第365天/第12个月和第18个月时收集用于免疫原性评估的血液样品。
[0280]
基于来自a部分第208天/第6次访视(即在第三次免疫接种之后1个月)的安全性和免疫原性数据，数据用于指导对b部分加强剂的决定。
[0281]
在b部分(加强期)中，来自a部分中接受选定的初次方案的组(组1或组2)的符合条件的对象在第18个月时接受用氢氧化铝佐剂化的多聚体疏螺旋体疫苗的加强剂量。
[0282]
为了进行安全性比较，将安慰剂注射施用于大约100名对象，所述对象被招募在根据替代疫苗接种方案在a部分中进行疫苗接种的组(即根据未选择用于进一步疫苗开发的初次免疫接种方案接受疫苗接种的组1或组2)中，以及施用于组3的大约100名对象。目标是在所有研究组中保持2:1:1的年龄分层(18至65岁、12至17岁和5至11岁)。b部分中涉及的所有对象再随访3年(即直至第54个月)，其中在第19、23、26、30、36、42、48和54个月时进行研究访视。
[0283]
表15示出了研究组和处理的概述。施用的处理具有0.5ml的注射量。
[0284]
表15-研究组和疫苗接种
[0285]
[0286][0287]
*为了保持知情，分配到组2的对象将在第2个月时接受安慰剂。

技术特征：

1.组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用于疫苗，其中所述疫苗：-待以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人或人儿童至少三次；或者-待以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于人儿童至少三次。2.组合物，其包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白，所述组合物用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答的方法，所述方法包括将所述组合物：-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人或人儿童至少三次；或者-以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于人儿童至少三次。3.根据权利要求1或2所述应用的组合物，其中第二次施用在第一次施用之后至少6周至至多3个月的期间进行，和/或第三次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。4.根据权利要求1至3所述应用的组合物，其中第二次施用在第一次施用之后至少50天至至多70天的期间，特别是在至少55天至至多60天的期间，尤其是在56天进行；和/或其中第三次施用在第一次施用之后至少170天至至多190天的期间，至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。5.根据权利要求1至4中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物在第一次施用之后至少15个月至至多21个月的期间，特别是在至少17个月至至多19个月的期间，尤其是在18个月进行第四次施用。6.根据权利要求1至5中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂135μg至180μg，特别是对于成人或人儿童为每剂135μg或180μg，或者其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂67.5μg至90μg，特别是对于幼儿为每剂67.5μg或90μg。7.根据权利要求1至6中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白占所述组合物中所有蛋白质的至少60％，优选至少70％，更优选80％。8.根据权利要求1至7中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含重量比为1:1:1(lip-s1d1-s2d1:lip-s4d1-s3hybd1:lip-s5d1-s6d1)的所述融合蛋白。9.根据权利要求1至8中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含佐剂。10.根据权利要求1至9中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含铝佐剂，优选具有低铜含量、优选低于1.25ppb铜的铝佐剂。11.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。12.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进
行。13.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。14.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后56天进行，其中第三次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。15.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月之日进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。16.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。17.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。18.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后2个月之日进行，其中第三次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第四次施用在第一次施用之后18个月进行。19.根据权利要求1至18中任一项所述应用的组合物，其中在第三次施用之后每年再次施用，特别是在1年之后、2年之后和3年之后进行。20.根据权利要求1至19中任一项所述应用的组合物，其中所引发的免疫应答包含具有杀菌活性的抗ospa血清型1、抗ospa血清型2、抗ospa血清型3、抗ospa血清型4、抗ospa血清型5和/或抗ospa血清型6抗体应答。21.根据权利要求1至20中任一项所述应用的组合物，其中所引发的免疫应答包含针对疏螺旋体血清型1、2、3、4、5和6的抗体。22.根据权利要求1至21中任一项所述应用的组合物，其中针对疏螺旋体血清型1、2、3、4、5和6的所述免疫应答持续至少约60天、持续至少约180天、持续至少约365天或持续至少约540天。23.权利要求1至22中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含低于1.25ppb的铜或足量的l-甲硫氨酸。24.权利要求1至23中任一项所述应用的组合物，其中铜为离子的形式，特别是作为cu
+
或cu
2+
的形式。25.权利要求1至24中任一项所述应用的组合物，其中l-甲硫氨酸以至少10mmol/l的浓
度存在。26.权利要求23至25中任一项所述应用的组合物，其中以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少与所述组合物中铜的浓度等同。27.权利要求1至26中任一项所述应用的组合物，其还包含反应性化合物，其中所述反应性化合物选自氧化还原活性化合物、自由基构建化合物、稳定化合物及任意其组合，尤其是其中所述反应性化合物选自甲醛、乙醇、氯仿、三氯乙烯、丙酮、triton-x-100、脱氧胆酸盐、二乙基焦碳酸盐、亚硫酸盐、na2s2o5、β-丙内酯、聚山梨醇酯例如吐温吐温o2、苯酚、普朗尼克型共聚物及任意其组合。28.根据权利要求1至27中任一项所述应用的组合物，其中所述成人是18岁或更大，例如18至65岁的对象。29.根据权利要求1至27中任一项所述应用的组合物，其中所述成人是50岁或更大的年长对象。30.根据权利要求1至27中任一项所述应用的组合物，其中所述人儿童是5至17岁，例如12至17岁或5至11岁的对象。31.根据权利要求1至27中任一项所述应用的组合物，其中所述人儿童是0至4岁，例如1至4岁或2至4岁的对象。32.根据权利要求1至31中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物以0.25毫升(ml)至1.0ml，例如0.25ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。33.根据权利要求1至32中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物以0.25ml、0.5ml或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。34.组合物，其用于对人进行疫苗接种，该方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人或人儿童至少两次；或者-以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于人儿童至少两次。35.组合物，其用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答，该方法包括将包含seq id no:1(lip-s1d1-s2d1)的融合蛋白、seq id no:2(lip-s4d1-s3hybd1)的融合蛋白和seq id no:3(lip-s5d1-s6d1)的融合蛋白的组合物：-以每剂120至200μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于成人或人儿童至少两次；或者-以每剂60至100μg所述3种融合蛋白的总蛋白含量施用于人儿童至少两次。36.根据权利要求34或权利要求35所述应用的组合物，其中第二次施用在第一次施用之后至少5个月至至多7个月的期间进行。37.根据权利要求34至36中任一项所述应用的组合物，其中第二次施用在第一次施用之后至少170天至至多190天的期间，在至少175天至至多185天的期间，尤其是在180天进行。38.根据权利要求34至37中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物的第三次施用
在第一次施用之后至少15个月至至多21个月的期间，特别是在至少17个月至至多19个月的期间，尤其是在18个月进行。39.根据权利要求34至38中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂135μg至180μg，特别是对于成人或人儿童为每剂135μg或180μg，或者其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量为每剂67.5μg至90μg，特别是对于幼儿为每剂67.5μg或90μg。40.根据权利要求34至39中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白占所述组合物中所有蛋白质的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％。41.根据权利要求34至40中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含重量比为1:1:1(lip-s1d1-s2d1:lip-s4d1-s3hybd1:lip-s5d1-s6d1)的所述融合蛋白。42.根据权利要求34至41中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含佐剂。43.根据权利要求34至42中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含铝佐剂。44.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。45.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。46.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。47.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后180天进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。48.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂135μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。49.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂67.5μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。50.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于成人或人儿童为每剂180μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。51.根据权利要求34至43中任一项所述应用的组合物，其中所述3种融合蛋白的总蛋白含量对于幼儿为每剂90μg，其中第二次施用在第一次施用之后6个月进行，并且其中任选的第三次施用在第一次施用之后18个月和任选的此后每12个月进行。52.根据权利要求34至51中任一项所述应用的组合物，其中再次施用在最后一次初次免疫接种之后每年或在每个蜱季开始时，特别是在1年之后、2年之后和3年之后等进行。53.根据权利要求34至52中任一项所述应用的组合物，其中所引发的免疫应答包含具有杀菌活性的抗ospa血清型1、抗ospa血清型2、抗ospa血清型3、抗ospa血清型4、抗ospa血
清型5和/或抗ospa血清型6抗体应答。54.根据权利要求34至53中任一项所述应用的组合物，其中所引发的免疫应答包含针对表达ospa血清型1、2、3、4、5和6的螺旋体具有杀菌活性的抗体。55.根据权利要求34至54中任一项所述应用的组合物，其中针对ospa血清型1、2、3、4、5和6的所述免疫应答持续至少约60天、持续至少约180天、持续至少约365天或持续至少约540天。56.权利要求34至55中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物包含低于1.25ppb的铜或足量的l-甲硫氨酸。57.权利要求34至56中任一项所述应用的组合物，其中铜为离子的形式，特别是作为cu
+
或cu
2+
的形式。58.权利要求34至57中任一项所述应用的组合物，其中l-甲硫氨酸以至少10mmol/l的浓度存在。59.权利要求56至58中任一项所述应用的组合物，其中以mol/l计的l-甲硫氨酸的浓度至少与所述组合物中铜的浓度等同。60.权利要求34至59中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物还包含反应性化合物，其中所述反应性化合物选自氧化还原活性化合物、自由基构建化合物、稳定化合物及任意其组合，尤其是其中所述反应性化合物选自甲醛、乙醇、氯仿、三氯乙烯、丙酮、triton-x-100、脱氧胆酸盐、二乙基焦碳酸盐、亚硫酸盐、na2s2o5、β-丙内酯、聚山梨醇酯例如吐温吐温o2、苯酚、普朗尼克型共聚物及任意其组合。61.根据权利要求34至60中任一项所述应用的组合物，其中所述成人是18岁或更大，例如18至65岁的对象。62.根据权利要求34至60中任一项所述应用的组合物，其中所述成人是50岁或更大的年长对象。63.根据权利要求34至60中任一项所述应用的组合物，其中所述人儿童是5至17岁，例如12至17岁或5至11岁的对象。64.根据权利要求34至60中任一项所述应用的组合物，其中所述人儿童是0至4岁，例如1至4岁，或2至4岁的对象。65.根据权利要求34至64中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物以0.25毫升(ml)至1.0ml，例如0.25ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。66.根据权利要求34至65中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物以0.25ml、0.5ml或1.0ml的体积施用于成人或人儿童。

技术总结

本发明涉及包含SEQ ID NO:1(LipS1D1-S2D1)的OspA融合蛋白、SEQ ID NO:2(Lip-S4D1-SShybD1)的OspA融合蛋白和SEQ ID NO:3(Lip-S5D1-S6D1)的OspA融合蛋白的组合物，其用于疫苗或用于在人中引发针对莱姆病的免疫应答的方法。方法。

技术研发人员：

妮科尔

受保护的技术使用者：

辉瑞大药厂

技术研发日：

2021.04.09

技术公布日：

2023/2/3