一种桔小实蝇抗药性相关的SNP位点及等位基因型分离方法

一种桔小实蝇抗药性相关的snp位点及等位基因型分离方法
技术领域
1.本发明属于桔小实蝇防治技术领域，具体涉及一种桔小实蝇抗药性相关的snp位点及等位基因型分离方法。

背景技术：

2.桔小实蝇(bactrocera dorsalis hendel)属双翅目、实蝇科、果实蝇属，是一种钻蛀果蔬的非常具有破坏性的检疫性害虫，可危害46科250多种经济水果和蔬菜。该虫原产于亚热带地区，近年来由于适应能力增强、全球气候变化、贸易交流增多，入侵范围逐渐加大，已经在六大洲至少65个国家被发现，对果蔬产业的安全构成巨大威胁。
3.化学防治是当前桔小实蝇防控的重要措施，其中，有机磷杀虫剂和毒死蜱由于低毒、高效及价格便宜，在我国常单独或者联合新型杀虫剂和引诱剂大量用于桔小实蝇的防治。而有机磷杀虫剂大量使用会使桔小实蝇产生抗药性，严重制约了桔小实蝇的可持续治理。监测发现2020年我国南北11个桔小实蝇田间种已对毒死蜱和产生了中高等抗性，严重制约了桔小实蝇的防治有效性，而且对环境和食品安全造成严重威胁。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种桔小实蝇抗药性相关的snp位点及等位基因型分离方法，所提供的snp位点为乙酰胆碱酯酶ache基因的突变位点，为h645l和t659l，同时提供等位基因型分离方法。
5.本发明首先提供一种与桔小实蝇抗药性相关的snp位点，所述的snp位点是位于核苷酸序列为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1934位核苷酸由a突变为t,其编码的643位组氨酸(h)突变为亮氨酸；
6.所述的snp位点还包含有核苷酸序列为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1975位核苷酸由a突变为g,其编码的659位苏氨酸(t)突变为天冬酰胺(a)；
7.所述的seq id no:1，其核苷酸序列信息如下：
8.atggctcacacgacgtccttgctgtcgggcgcgtcgtcagccgcggcgtcgcctctgtcatcgcgtcaatacagtgtcgcatcgtcgcctaggctgagcggcgacatcggtcgtggtctattcgccattgttgtgctgctgttgcgtatgtcctccgtgtatggcgtcatcgatcgtttggtggtgcagacatcgagcggtccggtgcgcggtcgctccgtcaccgtgcagggtcgagaagtgcacgtctacacaggcataccgtatgccaagccaccattagatgatttacgatttcgcaaaccggtgccagcggaaccctggcacggtgtgttggatgcaacgcgactgccggcaacctgtgtgcaagaaagatatgaatattttcccggtttctccggcgaagagatatggaatcctaacacaaatgtctccgaagattgcctctacataaacgtttgggcgccagcgaaagcgcgtttgcggcacggacgtggtgccaatggtggtgagcactccaataaagccgacactgatcatttgatacacaacggaaatccgcagaacaccacaaatggcttacccgtgctcatttggatttacggtggtggcttcatgaccggcactgccacactcgatatatacaatgcggacataatgtcggctgtgggtaatgtcattgtggcatcgtttcaatatcgtgtgggcgcttttggtttcctgcacctgtcacccgctatgcctggctacgaggaggaggcacccggcaatgtggggttgtgggatcaggcattggctatacgttggctgaaaacgaatgctcatgcttttggcggtaa
tcccgagtggatgacacttttcggtgaatcggctgg
9.ttcgagttcggtgaatgcgcaacttgtatcgccagtgacggcgggtttggtcaagcgtggcatgatgcaatcgggcacaatgaatgcgccctggagtcatatgacgtcggagaaggccgtagagattggcaaggcgttaatcaacgactgcaattgtaatgcgtcgctgttgtcggaaaatccacaggctgtgatggcctgcatgcgcgccgtcgatgccaaaacgatttcggtgcagcagtggaactcctactcgggcattttaagttttccatctgcgccgactattgatggcgcatttttgccagatcatcccatgaaaatgatggagacagccgatctacgtggctatgacatactgatgggaaatgtcagagacgaaggcacctactttctgctttacgattttatcgattatttcgataaggatgaggcgacttcattgccgcgtgataaatatttggaaattatgaataacatttttggcaaagtaacacaagcggaacgcgaagcaatcatttttcggcacaccagctgggttggtaatcccggtttggagaatcagcagcaaatcggacgcgcagttggcgatcacttcttcacctgccctactaatgagtatgcccaagcgttggccgaacggggagcttccgtgcactactactactttacacaccgcactagcacctcactatggggtgagtggatgggcgtactgcacggcgatgagatcgagtacttctttggtcagccattgaatacatcgctacagtatcggcaagttgaacgagagctgggcaagcggatgctgaatgccgttattgaatttgctaaaactggcaatcccgccacagatggcgaagaatggccaaattttacaaagaaagatcccgtgtattatgtcttttcaaccgatgataaagaggagaagctgcaacgtggtccactggagggacgttgcgcattctggaatgaatatttgcgcgaagtccgaaaatggggatcgcaatgcgaactaaaaccatcatccgcttcctctctgcaacaaaagcaacaactcttgctgctgcaacaaagaagcatcgtgacgttcatgttggcgctgtcactggtcttaggcattccgtcagtaaatgcatttttctaa(seq id no：1)。
10.本发明还提供一种筛选具有抗药性的桔小实蝇的方法，所提供的方法，是筛选具有上述snp位点的桔小实蝇；
11.所述的方法，为pcr扩增测序方法，其中使用的引物对为
12.ace645-659f：5
′‑
accatcatccgcttcctctc-3
′
(seq id no：2)、
13.ace645-659r：5
′‑
atttttgcatttattgcctgtctg-3
′
(seq id no：3)；
14.所述的方法，其中检测的基因组dna是通过活体条件下取未交配的桔小实蝇的中足中提取的；
15.所述的未交配的桔小实蝇，是用塑料头作为单头饲养桔小实蝇容器，除中足的桔小实蝇分别单头放入塑料头中，用吸水和透气能力较好的纸团，塞住管口；纸团吸入10％的蔗糖水后，放入养虫室饲养。
16.本发明发现了桔小实蝇的有机磷抗性种存在新的靶标突变h645l和t659a，并多以杂合子形式存在。同时本发明针对靶标抗性基因为不完全隐性遗传的特点，提供了一种快速高效分离等位基因纯合子的方法，实现即使携带抗性等位基因的桔小实蝇个体较少，也可以在室内稳定的连代扩繁，快速获得纯合子个体，对明确桔小实蝇抗药性机制和制定治理方案具有重要意义。
附图说明
17.图1为乙酰胆碱酯酶h645l(t/a)和t659l(g/a)突变区域的直接测序谱图；
18.图2为单头饲养桔小实蝇的装备的示意图；
19.图3为足对雌雄桔小实蝇死亡率的影响图，其中对照表示未去足的桔小实蝇组；前足、中足、后足分别表示去除前足、中足和后足桔小实蝇组；
20.图4为去足对雌雄桔小实蝇产卵量的影响图，其中对照表示未去足的完整雌雄交
配组；雌前足表示去前足雌性与完整的雄性交配组；雌中足表示去中足雌性与完整的雄性交配组；雌后足表示去后足雌性与完整的雄性交配组；雄前足表示去前足雄性与完整的雌性交配组；雄中足表示去中足雄性与完整的雌性交配组；雄后足表示去后足雄性与完整的雌性交配组；
21.图5为桔小实蝇乙酰胆碱酯酶抗性等位基因pcr扩增结果图，其中h645l和t659l表示使用去中足的桔小实蝇提取的基因组dna，pcr扩增检测桔小实蝇乙酰胆碱酯酶h645l和t659l等位基因的电泳图谱。m表示2000bp dna ladder。
22.图6为配对饲养桔小实蝇的装备的示意图。
具体实施方式
23.乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ache)是有机磷类杀虫剂在昆虫体内的主要靶标，研究表明其基因变异是害虫对杀虫剂产生抗性的主要原因。发明人对桔小实蝇毒死蜱抗性种的ache全长序列进行分析，发现存在除已报道的4个突变(i214v、g420a、g488s和q643r)外，还存在h645l和t659a两个新突变，并多以杂合子的形式存在。杀虫剂的靶标抗性基因常为不完全隐性遗传，即抗性水平为抗性纯合子》抗性杂合≥野生纯合子。因此，分离发现的新突变的等位基因纯合子，测定其抗性水平，对明确桔小实蝇抗药性的产生和确定治理方案具有重要意义。另外，为适应外界压力，生物体常伴随着基因序列变异，等位基因型的分离，也为明确桔小实蝇种遗传结构分析(迁移和扩散)和适应性进化(气候)具有重要指导。
24.分离等位基因纯合子，常采用非致死的方法提取基因组dna，同时需保证试虫的存活力和繁殖能力，例如需要建立携带感兴趣等位基因的桔小实蝇品系，一种有效的方法是先对桔小实蝇个体的基因型进行鉴定，用候选基因型的雄雌个体配对以产生具有目标基因型的后代。然而，目前桔小实蝇基因组dna提取方法对生物样品是致死的、并且操作步骤繁琐、费时费力。另外，携带感兴趣等位基因除常在候选个体中的比例小，还具有适合度代价(如个体繁殖力弱)，以往的饲养装置很难满足个体较少的扩繁。
25.发明人在我国2020年桔小实蝇田间种中发现了与有机磷杀虫剂抗性相关的ache的两个新突变h645l和t659a，并且多以杂合子的形式存在。杀虫剂的靶标抗性基因常为不完全隐性遗传，即抗性水平为抗性纯合子》抗性杂合≥野生纯合子。因此，分离发现的新突变的等位基因纯合子，测定其抗性水平，对明确桔小实蝇抗药性的产生和确定治理方案具有重要意义
26.同时，为了满足试验需要，本发明公开了耐ache抑制剂的桔小实蝇h645l和t659a新突变及其等位基因型分离方法，实现即使携带等位基因的桔小实蝇个体较少，也可以在室内稳定的连代扩繁。新的方法操作简单方便、省时省力、操作组装方便，制作成本低，所占空间小，可重复利用。
27.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
28.实施例1：筛选桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因突变检测
29.通过对11个桔小实蝇田间种进行对有机磷杀虫剂毒死蜱和抗性监测，首次发现了桔小实蝇的抗性种的ache存在抗性相关的突变h645l和t659a，并且多以杂合子的形式存在。
30.在2020年7月采自广东惠州番石榴果园对毒死蜱具有高水平抗性的桔小实蝇种，检测其乙酰胆碱酯酶基因。根据桔小实蝇乙酰胆碱酯酶基因序列(genbank：ay155500.1)，设计引物扩增完整cds序列，目的片段为2200bp，突变检测引物序列如下：
31.正向引物l-f:gttacatttggcgcacgtcg
32.反向引物l-r:ttgcctgtctgtagctacttgtgc
33.使用reagent(invitrogen)提取15头桔小实蝇成虫的总rna，采用takara公司反转录试剂盒(rt reagent kit with gdna eraser)进行cdna合成。以cdna为模板，使用上述引物对目的片段进行pcr扩增。
34.表1：pcr扩增体系表
[0035][0036]
pcr程序：95℃5min；34
ⅹ
(95℃30s，55℃30sec,72℃ 2min 30sec)；72℃，10min；4℃保存。
[0037]
使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将清晰单一目的条带的pcr原液送至上海生工公司进行测序。将测序结果与乙酰胆碱酯酶野生型参考序列(genbank:aj251838.1)进行比对，根据比对发现发抗性种的乙酰胆碱酯酶存在除了已知的i214v、g488s突变外，还存在新的突变h645l和t659a，检测种中存在新的乙酰胆碱酯酶h645l和t659l突变,如图1所示，图中箭头所示即为突变位点。
[0038]
其中snp位点h645l是位于核苷酸序列为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1934位核苷酸由a突变为t,其编码的645位组氨酸(h)突变为亮氨酸；
[0039]
所述的snp位点还包含有核苷酸序列为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1975位核苷酸由a突变为g,其编码的659位苏氨酸(t)突变为天冬酰胺(a)。
[0040]
实施例2：构建活体取中足提取基因组dna方法
[0041]
桔小实蝇足肌属于横纹肌，肌纤维一个细胞就几百个核，dna含量比率高，且成分较简单，便于分离杂质，因此使用足作为提取基因组dna的组织。另外，在确定桔小实蝇的基因型前，需对待测虫体单头饲养，待感兴趣基因型确定后，候选基因型的雄雌个体配对以产生具有目标基因型的后代。因此，发明人首先调查了去足对桔小实蝇的死亡率和繁殖力的影响。
[0042]
死亡率测定具体方法为：用剪刀分别去除未交配的雌雄桔小实蝇(羽化2-7日)一
条足，并将其单头放入塑料头(长14.9cm,插口处内径1.3cm)中饲养，10％蔗糖水作为食物。塑料管统一放于海绵块的孔中(直径小于1.3cm)。其中海绵长30cm,宽20cm,高2cm，其孔数和排列方式与pcr 96孔板保持一致(8排12列)(图2)。共6个处理(雌去前足、雌去中足、雌去后足、雄去前足、雄去中足、雄去后足)。未去足雌雄分别作为对照组。每个处理10头，3个重复，将塑料滴管置于养虫室内，48h后检查死亡率。
[0043]
去足对雌雄桔小实蝇存活影响结果表明，雌性去足与雄性去足的死亡率结果相似，均为去中足与对照组的死亡率没有显著性差异(p》0.05)，而去除后足的死亡率(雌性为33.33％，雄性为26.67％)显著性的高于对照和去中足组(图3)，说明去中足对雌雄性桔小实蝇的存活率无影响，有利于获得足够数量的成虫建立种。
[0044]
繁殖力测定具体方法为：使用二氧化碳将桔小实蝇麻醉后，用剪刀去除成虫的一只足，将去足的成虫与未去足的异性单对饲养，共6个处理(去前足
♀×
未去足
♂
、去中足
♀×
未去足
♂
、去后足
♀×
未去足
♂
、未去足
♀×
去前足
♂
、未去足
♀×
去中足
♂
、未去足
♀×
去后足
♂
)，未去足的雌雄单对饲养作为对照组。将配对桔小实蝇放入含有成虫饲料和水的两个塑料杯和集卵杯组合(下塑料杯的容量为200ml，上口直径为7cm，下底直径为4.7cm，杯高为7.5cm；上塑料杯的容量为340ml，上口直径为8cm，下底直径为5.6cm，杯高为10cm；所述集卵纸杯的上口直径为4.5cm，下底直径为3.2cm，杯高为4cm，杯底高为5mm；上塑料杯用纱网取代，纱网为200目。)中饲养。利用涂有木瓜的小纸杯取卵，每2天更换木瓜并统计产卵量，总共调查14天。
[0045]
去足对雌雄桔小实蝇繁殖力影响结果表明，去前足、中足、后足成虫(雌和雄)与未去足的异性单对饲养的产卵量均与对照组的产卵量之间没有显著性差异(图4)。说明去足对雌雄性桔小实蝇的产卵量无影响。
[0046]
实施例3：抗性相关乙酰胆碱酯酶h645l和/或t659l等位基因纯合子建立
[0047]
为了确定乙酰胆碱酯酶各个突变的组合形式，发现测定了40个桔小实蝇个体的均存在突变杂合子，因此，为了准确评估这些新的抗性等位基因对杀虫的抗性水平，需要建立纯合子品系。
[0048]
随机检测96个广东惠州桔小实蝇种个羽化2日龄成虫，分别包括48头雌和雄。设计引物序列如下：
[0049]
ace645-659f：5
′‑
accatcatccgcttcctctc-3
′
(seq id no：2)、
[0050]
ace645-659r：5
′‑
atttttgcatttattgcctgtctg-3
′
(seq id no：3)；
[0051]
使用二氧化碳将待测桔小实蝇麻醉后，用剪刀去除桔小实蝇1条中足，并放入200μl pcr管中。向含有中足的pcr管中放入3粒2-3mm的硅珠，并加入10μl 0.2m的naoh。将样品用涡旋振捣器2000rpm匀浆2min，再70℃孵育10min后，每个离心管中加入10μl中和液(360mm tris-hcl,ph7.5,10mm edta)和80μl ddh2o，混匀即获得基因组dna。
[0052]
每个个体的基因组dna使用上述突变的检测引物，进行pcr扩增，pcr扩增体系如下表2所示：
[0053]
表2：pcr扩增体系组成表
[0054]
[0055][0056]
pcr程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30sec,72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min。
[0057]
使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图5)，将清晰单一目的条带的pcr原液送至上海生工公司进行测序。根据dna测序结果判断突变类型：若1934位碱基为a/a则为野生型纯合子，标注为645ss，若为a/t则为杂合子，标注为645sr,若为t/t，则为突变纯合子，标注为645rr；若1975位碱基为a/a则为野生型纯合子，标注为659ss，若为a/g则为杂合子，标注为659sr,若为g/g，则为突变纯合子，标注为659rr。
[0058]
将携带感兴趣等位基因的5个桔小实蝇雌性和4个雄性转移至配对扩繁饲养装备，在塑料杯底面放入含有水的脱脂棉小塑料杯，作为成虫饮用水来源，底部并放入成虫饲料。待纱网上可见卵时，放入用箭头镊子扎有小孔的大枣诱集产卵，待5-7d后，取出水果，并掰开大枣放入铺设有灭菌沙土的塑料盒内，桔小实蝇老熟幼虫将依靠自身弹跳力转移到沙土中化蛹。待化蛹后，使用铁网(15目)从灭菌沙土中将蛹筛出。其中，配对扩繁饲养装备制作方法为：使用电烙铁在一次性塑料杯(体积1l,上口径11.8cm,杯底8.0cm，杯高约15.3cm)的底部烙1个圆孔(直径7.5cm)，用胶将200目纱网封住圆孔(作为底部)，得到饲养塑料杯(图6)。
[0059]
通过基因型的测定和个体的交配，分离获得了h645l+t659l突变杂合子、纯合子品系。经杀虫剂毒力测定，发现纯合子品系比杂合子品系具有更高的杀虫剂抗性水平。

技术特征：

1.一种与桔小实蝇抗药性相关的snp位点，其特征在于，所述的snp位点是位于核苷酸序列为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1934位，其核苷酸由a突变为t。2.如权利要求1所述的与桔小实蝇抗药性相关的snp位点，其特征在于，所述的snp位点为seq id no:1的乙酰胆碱酯酶ache基因的1975位，其核苷酸由a突变为g。3.一种筛选具有抗药性的桔小实蝇的方法，其特征在于，所述的方法是筛选具有权利要求1或2所述的snp位点的桔小实蝇。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过为pcr扩增测序的方式来检测snp位点。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增测序，其使用的引物对的序列为seq id no：2和seq id no：3。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增测序，其中检测的基因组dna是通过活体条件下取未交配的桔小实蝇的中足提取的。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的未交配的桔小实蝇，是用塑料头作为单头饲养桔小实蝇容器，除中足的桔小实蝇分别单头放入塑料头中，用吸水和透气能力较好的纸团，塞住管口；纸团吸入10％的蔗糖水后，放入养虫室饲养。8.一种用于筛选具有抗药性的桔小实蝇的pcr扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于检测权利要求1或2所述的snp位点的引物对。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物对的序列为seq id no：2和seq id no：3。

技术总结

本发明提供一种桔小实蝇抗药性相关的SNP位点及等位基因型分离方法，所提供的SNP位点是位于核苷酸序列为SEQ ID NO:1的乙酰胆碱酯酶AChE基因的1934位核苷酸由A突变为T,第1975位核苷酸由A突变为G。本发明发现了桔小实蝇的有机磷抗性种存在新的靶标突变H645L和T659A，并多以杂合子形式存在。同时本发明针对靶标抗性基因为不完全隐性遗传的特点，提供了一种快速高效分离等位基因纯合子的方法，实现即使携带抗性等位基因的桔小实蝇个体较少，也可以在室内稳定的连代扩繁，快速获得纯合子个体，对明确桔小实蝇抗药性机制和制定治理方案具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。