一种长链非编码RNA分子标志物组合及其应用

一种长链非编码rna分子标志物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤生物技术领域，具体涉及一种长链非编码rna分子标志物组合及其应用。

背景技术：

2.喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，lscc)在头颈部恶性肿瘤中排位第二，特别在中国北方地区高发。我国每年的患病人数约为一万三千人左右。喉鳞癌发病隐匿，早期症状不显著，或不易发现，加之喉鳞癌具有颈部淋巴结转移的特性，因此大约60％的喉鳞癌患者在确诊时就已处于晚期(临床分期ⅲ或ⅳ期)，错过最佳时机。尽管临床技术不断进步，但在过去的40年里，全世界喉鳞癌患者的5年生存率是却呈下降趋势(steuer ce,el-deiry m,parks jr,higgins ka,saba nf.an update on larynx cancer[j].ca cancer j clin,2017,67(1):31-50)。因此寻有效且精准的临床诊疗以及预后评估手段对于喉鳞癌临床诊疗工作十分迫切。
[0003]
长链非编码rna是一类长度大于200nt且不具有蛋白编码潜力的基因序列，其在细胞的增殖、代谢、分化和周期等生命过程发挥了重要的作用。近年来，随着人们对恶性肿瘤发生机制的深入研究，逐渐发现长链非编码rna对恶性肿瘤的发生和发展起到了重要的作用。另外长链非编码rna数量庞大，存在的介质多样，同时具有组织以及时空的特异性，因此长链非编码rna被认为极具有成为恶性肿瘤诊断标志物和靶标的潜力。
[0004]
随着高通量测序和实时荧光定量pcr技术的发展，我们可以对基因组和转录组进行全面的筛选，并使用实时荧光定量pcr进行目的基因的定向检测和验证。这对恶性肿瘤发生机制的深入研究和基因转录产物作为诊断标志物带来了可能。
[0005]
目前单个长链非编码rna作为诊疗标志物的研究比较常见，但是其检测的特异性和敏感性随着肿瘤类型的不同或者患者所处的不同各阶段并不尽如人意。有研究表明，在部分恶性肿瘤中不同的长链非编码rna标志物组合已经被尝试性地用来进行辅助诊断和预后判断，这类组合具有较好的适用性以及检测的敏感性与特异性，但喉鳞癌中缺乏相关的研究与应用。申请人通过对喉鳞癌以及所对应的癌旁正常黏膜组织(adjacent normal mucosa，anm)的高通量测序数据进行深入挖掘分析，并结合临床信息，经过实时荧光定量pcr验证，构建了由ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2七种长链非编码rna组成的诊断与预后评估的标志物组合，并提出这个组合在喉鳞癌辅助预后评估试剂盒中的应用。

技术实现要素：

[0006]
针对上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种长链非编码rna分子标志物组合及其在喉鳞癌辅助预后评估试剂盒中的应用。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008]
一种长链非编码rna分子标志物组合，该长链非编码rna分子标志物组合包括
ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2共计七种，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna的核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7所示。
[0009]
进一步地，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna任何一种在喉鳞癌组织中均为显著高表达，其结果能够促进喉鳞癌细胞的增殖、转移和侵袭，且与喉鳞癌的不良预后呈正相关；将所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna在喉鳞癌组织表达量中的任意几种进行组合分析，其结果使所述正相关的趋势增强。上述七种长链非编码rna组成的标志物组合对喉鳞癌进行诊断和预后的判断依赖七种长链非编码rna在喉鳞癌中的表达水平，表达水平的检测由实时荧光定量pcr完成。上述七种长链非编码rna共同组合分析显示喉鳞癌患者预后最差。
[0010]
再进一步地，所述的组合分析是总和ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna在喉鳞癌组织表达量，由基于r语言的survival::coxph()和glmnet::predict.glmnet函数执行综合加权分进行预后生存分析并形成预后生存分析模型。
[0011]
如上所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，用于制备喉鳞癌辅助预后评估试剂盒，以及制备喉鳞癌的制剂或试剂盒；所述长链非编码rna分子标志物组合包括七种，具体为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2；所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna的核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7所示。
[0012]
进一步地，所述喉鳞癌辅助预后评估试剂盒是针对所述长链非编码rna分子标志物组合的针对性引物用于实时荧光定量pcr检测所述长链非编码rna表达量的试剂盒。
[0013]
再进一步地，所述针对性引物为：
[0014]
ensg00000233397正向引物序列如seq id no：8所示；
[0015]
ensg00000233397反向引物序列如seq id no：9所示；
[0016]
barx1-dt正向引物序列如seq id no：10所示；
[0017]
barx1-dt反向引物序列如seq id no：11所示；
[0018]
lsamp-as1正向引物序列如seq id no：12所示；
[0019]
lsamp-as1反向引物序列如seq id no：13所示；
[0020]
hoxb-as4正向引物序列如seq id no：14所示；
[0021]
hoxb-as4反向引物序列如seq id no：15所示；
[0022]
mnx1-as1正向引物序列如seq id no：16所示；
[0023]
mnx1-as1反向引物序列如seq id no：17所示；
[0024]
linc01385正向引物序列如seq id no：18所示；
[0025]
linc01385反向引物序列如seq id no：19所示；
[0026]
al513318.2正向引物序列如seq id no：20所示；
[0027]
al513318.2反向引物序列如seq id no：21所示。
[0028]
更进一步地，所述喉鳞癌的制剂或试剂盒中包括ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的特异性干扰rna的一种或几种，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的特异性干扰rna能够在喉鳞癌细胞中相应敲降ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的表达水平。
[0029]
更进一步地，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的特异性干扰rna序列依次为：
[0030]
ensg00000233397-1号正向干扰rna序列如seq id no：22所示；
[0031]
ensg00000233397-1号反向干扰rna序列如seq id no：23所示；
[0032]
ensg00000233397-2号正向干扰rna序列如seq id no：24所示；
[0033]
ensg00000233397-2号反向干扰rna序列如seq id no：25所示；
[0034]
barx1-dt-1号正向干扰rna序列如seq id no：26所示；
[0035]
barx1-dt-1号反向干扰rna序列如seq id no：27所示；
[0036]
barx1-dt-2号正向干扰rna序列如seq id no：28所示；
[0037]
barx1-dt-2号反向干扰rna序列如seq id no：29所示；
[0038]
lsamp-as1-1号正干扰rna序列如seq id no：30所示；
[0039]
lsamp-as1-1号反向干扰rna序列如seq id no：31所示；
[0040]
lsamp-as1-2号正干扰rna序列如seq id no：32所示；
[0041]
lsamp-as1-2号反向干扰rna序列如seq id no：33所示；
[0042]
hoxb-as4-1号正向干扰rna序列如seq id no：34所示；
[0043]
hoxb-as4-1号反向干扰rna序列如seq id no：35所示；
[0044]
hoxb-as4-2号正向干扰rna序列如seq id no：36所示；
[0045]
hoxb-as4-2号反向干扰rna序列如seq id no：37所示；
[0046]
mnx1-as1-1号正向干扰rna序列如seq id no：38所示；
[0047]
mnx1-as1-1号反向干扰rna序列如seq id no：39所示；
[0048]
mnx1-as1-2号正向干扰rna序列如seq id no：40所示；
[0049]
mnx1-as1-2号反向干扰rna序列如seq id no：41所示；
[0050]
linc01385-1号正向干扰rna序列如seq id no：42所示；
[0051]
linc01385-1号反向干扰rna序列如seq id no：43所示；
[0052]
linc01385-2号正向干扰rna序列如seq id no：44所示；
[0053]
linc01385-2号反向干扰rna序列如seq id no：45所示；
[0054]
al513318.2-1号正向干扰rna序列如seq id no：46所示；
[0055]
al513318.2-1号反向干扰rna序列如seq id no：47所示；
[0056]
al513318.2-2号正向干扰rna序列如seq id no：48所示；
[0057]
al513318.2-2号反向干扰rna序列如seq id no：49所示。
[0058]
我们通过高通量测序技术和实时荧光定量pcr技术发现上述七种长链非编码rna在喉鳞癌组织中显著高表达，并且与喉鳞癌患者的预后生存密切相关，七种长链非编码rna高表达的喉鳞癌患者生存时间显著减少，这提示上述七种长链非编码rna可以作为喉鳞癌辅助预后生存评估的分子标记物。此外，我们通过细胞功能实验，发现在人喉鳞癌细胞中将
上述七种长链非编码rna表达量分别敲降后，人喉鳞癌细胞的增殖能力、迁移能力以及侵袭能力被遏制。本发明为喉鳞癌在临床水平辅助预后生存评估以及拮抗喉鳞癌的精准提供了有效分子靶点。
[0059]
一种长链非编码rna分子标志物组合在喉鳞癌辅助诊断、预后判断及中的应用的建立过程包括以下步骤：
[0060]
步骤1：使用高通量测序技术(二代测序)进行107对喉鳞癌组织及其对应的癌旁正常黏膜组织进行高通量测序，建立喉鳞癌组织基因转录表达谱，并进行差异分析。
[0061]
步骤2：通过表达量差异分析，我们得到了喉鳞癌组织相对于正常组织的差异基因列表，然后使用cox和lasso算法进行差异基因表达量和临床信息的综合分析，最终我们得到了在喉鳞癌组织中显著高表达且和患者临床信息密切相关的七种长链非编码rna。
[0062]
步骤3：我们根据得到的七种差异表达的长链非编码rna建立喉鳞癌辅助诊断和预后生存预测的标志物组合，并使用实时荧光定量pcr技术进行了表达量
[0063]
验证。
[0064]
步骤4：我们根据高通量测序技术得到的七种长链非编码rna标志物组合和算法，进行喉鳞癌组织实时荧光定量pcr表达量测定的喉鳞癌辅助诊断及预后判断。
[0065]
一种长链非编码rna分子标志物组合在喉鳞癌试剂或试剂盒的应用建立包括一下步骤:
[0066]
步骤1：针对上述七种长链非编码rna分子进行特异性干扰sirna的设计；
[0067]
步骤2：对人喉鳞癌细胞系分别进行上述sirna干扰序列转染；
[0068]
步骤3：检测上述转染细胞的长链非编码rna分子表达，验证被敲降的效果及水平；
[0069]
步骤4：通过细胞功能实验分别检测被敲降的人喉鳞癌细胞系；
[0070]
步骤5：被敲降上述七种长链非编码rna分子的喉鳞癌细胞系出现增殖能力、迁移能力以及侵袭能力的下降。
[0071]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0072]
1、本发明的长链非编码rna分子标志物组合在喉鳞癌患者组织中均显著高表达，可作为喉鳞癌诊断的一种新型分子标记物，可以应用于制备针对上述七种长链非编码rna分子的检测制剂或试剂盒，通过七种分子的表达量来高效、便捷以及精准地进行喉鳞癌辅助预后评估，从而为临床诊断提供参考。
[0073]
2、本发明利用ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna形成的组合分子，进一步检测上述七种长链非编码rna在喉鳞癌组织中的表达量，进而执行组合分析，可以筛选到七个分子皆高表达的患者，而具备该特征的患者预后最差。因此本发明所涉及的上述七种长链非编码rna分子组合可以作为喉鳞癌辅助预后评估标志物，具有检测特异性好、灵敏度高的优势。
[0074]
3、利用本发明所述的七种长链非编码rna分子sirna干扰序列，可制备拮抗喉鳞癌的制剂或相应试剂盒。
附图说明
[0075]
图1为高通量测序技术检测到的ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna在喉鳞癌组织和对应的癌旁正常黏
膜组织中的表达量；
[0076]
图2为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2共计七个长链非编码rna经过综合加权分析后与喉鳞癌患者总的生存时间(overall survival)之间的关系；
[0077]
图3为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2共计七个长链非编码rna经过综合加权分析后与喉鳞癌患者总的无进展间期(progression free interval)之间的关系；
[0078]
图4为实时荧光定量pcr技术检测到的ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna在喉鳞癌组织和对应的癌旁正常黏膜组织中的相对表达水平。
[0079]
图5为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna对喉鳞癌细胞fd-lsc-1及tu-177增殖能力的影响图，检测方法为edu荧光法。
[0080]
图6为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna对喉鳞癌细胞fd-lsc-1及tu-177的迁移能力影响图，检测方法为transwell小室法。
[0081]
图7为ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna对喉鳞癌细胞fd-lsc-1及tu-177的侵袭能力影响图，检测方法为transwell小室加基质胶法。
具体实施方式
[0082]
结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的具体实施方式及技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0083]
实施例1：
[0084]
一种长链非编码rna分子标志物组合包括：ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2，共计七个长链非编码rna组合，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna的核苷酸序列分别如seq id no：1-7所示。
[0085]
实施例2：
[0086]
一种长链非编码rna分子标志物组合及其应用于制备喉鳞癌辅助预后评估试剂盒的建立过程。
[0087]
1.喉鳞癌患者样本的收集与rna提取。
[0088]
收集107例喉鳞癌组织和对应的癌旁正常黏膜组织，使用trizol试剂(ambion公司)提取总rna。
[0089]
1)将组织样本快速从液氮罐中取出，放入无rna酶ep管中，并加入trizol及钢柱，然后整体放入提前负80摄氏度预冷的组织研磨机中75hz研磨85秒。
[0090]
2)按照每1毫升trizol试剂加入200微升的比例加入氯仿，剧烈震荡15秒，充分混匀后室温静置5分钟。
[0091]
3)4摄氏度下，14000g离心15分钟，转移上清至新无rna酶ep管中，加入与上清等体积的异丙醇后，轻轻摇匀，室温下静置10分钟或负20摄氏度过夜。
[0092]
4)4摄氏度条件下12000g离心10分钟，离心管底部的白沉淀即为rna，弃去上清。
[0093]
5)向ep管中键入75％的乙醇洗涤沉淀，4摄氏度下，12000rpm离心5分钟，弃去上清，瞬时离心后用移液吸尽残留乙醇。
[0094]
6)将装有沉淀的ep管置于风机开启的超净台中，干燥5分钟。最后将沉淀溶于适量的无rna酶纯水中，溶解rna，负80摄氏度保存。
[0095]
2.测序建库
[0096]
按照每个组织样品3微克的标准进行高通量测序的建库准备。
[0097]
1)使用epicentre ribo-zero
tm rrna removal kit试剂(epicentre公司)除去核糖体rna(rrna)，然后使用75％乙醇洗去无rrna残留的rna。
[0098]
2)按照标准操作说明，使用ultra
tm directional rna library prep kit for(neb公司)试剂对无rrna的rna进行建库。
[0099]
3)最后使用ampure xp beads筛选200bp左右的cdna，进行pcr扩增并再次使ampure xp beads纯化pcr产物，最终获得文库。
[0100]
3.上机测序
[0101]
上机测序前进行文库质检，质检合格后测序。
[0102]
1)首先进行成簇反应，将文库固定在flowcell上，进行桥式扩增。
[0103]
2)桥式扩增完成后使用illumina hiseq 2000系统进行测序。
[0104]
4.数据分析
[0105]
1)首先进行读取片段接头的移除和数据质量控制。
[0106]
2)使用bowtie(v2.0.6)建立参考基因组和比对索引，再使用tophat(v2.0)将读取片段对比到参考基因组。
[0107]
3)使用scripture(beta2)和and cufflinks(v2.1.1)进行比对片段的组装。
[0108]
4)使用cnci(v2)、cpc(0.9-r2)、pfam-scan(v1.3)和phylocsf(v20121028)进行rna的蛋白质编码潜力预测。
[0109]
5)使用cuffdiff进行基因差异分析。
[0110]
6)使用基于r语言的cox和lasso算法进行临床相关性长链非编码rna分析标记物筛选，最终确定由ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2七种长链非编码rna组成标志物制备喉鳞癌诊断制剂或试剂盒，根据该诊断试剂或试剂盒的检测结果进行喉鳞癌辅助诊断和预后生存判断。也可以选用ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna中任意一种或几种的组合作为标记物制备喉鳞癌诊断制剂或试剂盒
[0111]
7)ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2七种长链非编码rna在喉鳞癌组织中的表达量显著高于对应的癌旁正常黏膜组织(如图1所示)。
[0112]
8)七种长链非编码rna表达量经过综合加权分析后与喉鳞癌患者总的生存时间(overall survival)之间进行生存分析，显示上述七种长链非编码rna均高表达喉鳞癌患者的预后生存最差(如图2所示)。
[0113]
9)七种长链非编码rna表达量经过综合加权分析后与喉鳞癌患者总的无进展间期(progression free interval)之间进行生存分析，显示上述七种长链非编码rna均高表达的喉鳞癌患者的无进展间期预后生存最差(如图3所示)。
[0114]
实施例3：
[0115]
一种长链非编码rna分子标志物组合在喉鳞癌辅助预后评估试剂盒的应用过程。
[0116]
1.喉鳞癌患者样本的收集与rna提取。
[0117]
我们收集47例喉鳞癌组织和对应的癌旁正常黏膜组织，使用trizol试剂(ambion公司)提取总rna。
[0118]
1)将组织样本快速从液氮罐中取出，放入无rna酶ep管中，并加入trizol及钢柱，然后整体放入提前负80摄氏度预冷的组织研磨机中75hz研磨85秒。
[0119]
2)按照每1毫升trizol试剂加入200微升的比例加入氯仿，剧烈震荡15秒，充分混匀后室温静置5分钟。
[0120]
3)4摄氏度下，14000g离心15分钟，转移上清至新无rna酶ep管中，加入与上清等体积的异丙醇后，轻轻摇匀，室温下静置10分钟或负20摄氏度过夜。
[0121]
4)4摄氏度条件下12000g离心10分钟，离心管底部的白沉淀即为rna，弃去上清。
[0122]
5)向ep管中键入75％的乙醇洗涤沉淀，4摄氏度下，12000rpm离心5分钟，弃去上清，瞬时离心后用移液吸尽残留乙醇。
[0123]
2.实时荧光定量pcr检测表达量
[0124]
1)实时荧光定量pcr分别检测ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2七种长链非编码rna的表达量。
[0125]
2)cdna合成，反应体系由10微升2
×
rt mix、2微升hiscript ii enzyme mix、1微升oligo(dt)23vn(50微摩)、1微升random hexamers(50ng/微升)、1微升rna和无rna酶纯水添加至总体系20微升。反应条件为：25摄氏度5分钟，50摄氏度15分钟，85摄氏度2分钟。
[0126]
3)实时荧光定量pcr引物为：
[0127]
ensg00000233397正向引物(seq id no：8)：5
’‑
cctcacagagaagaaggttgtg-3’；
[0128]
ensg00000233397反向引物(seq id no：9)：5
’‑
gggtcatatggaaccaaggatac-3’；
[0129]
barx1-dt正向引物(seq id no：10)：5
’‑
ctacgctgaactcctctctttg-3’；
[0130]
barx1-dt反向引物(seq id no：11)：5
’‑
actgagttctcacagtctctct-3’；
[0131]
lsamp-as1正向引物(seq id no：12)：5
’‑
caagagaggcctcagaagaatc-3’；
[0132]
lsamp-as1反向引物(seq id no：13)：5
’‑
tagtttgctagggttgccataa-3’；
[0133]
hoxb-as4正向引物(seq id no：14)：5
’‑
gcaacaagagaggagtcaagag-3’；
[0134]
hoxb-as4反向引物(seq id no：15)：5
’‑
cagcaagtacccggcaataa-3’；
[0135]
mnx1-as1正向引物(seq id no：16)：5
’‑
ctctgcaggtcgaaccttatc-3’；
[0136]
mnx1-as1反向引物(seq id no：17)：5
’‑
agtgtctatctggagggtagtt-3’；
[0137]
linc01385正向引物(seq id no：18)：5
’‑
ggaacctaggctattccttgtg-3’；
[0138]
linc01385反向引物(seq id no：19)：5
’‑
cactatcgcaatacagccttcta-3’；
[0139]
al513318.2正向引物(seq id no：20)：5
’‑
cctgttgatagtgaggtaccaag-3’；
[0140]
al513318.2反向引物(seq id no：21)：5
’‑
cgagactcttcggaggttaatg-3’；
[0141]
内参基因18s正向引物(seq id no：50)：5
’‑
cctggataccgcagctagga-3’；
[0142]
内参基因18s反向引物(seq id no：51)：5
’‑
gcggcgcaatacgaatgcccc-3’。
[0143]
4)向pcr管中加入10微升sybr green master mix溶液、0.4微升正向引物(10微摩)、0.4微升反向引物(10微摩)和1微升模板cdna，最后用无rna酶纯水添加至总体系20微升。
[0144]
5)反应程序为：95摄氏度5分钟；，95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，40个循环；95摄氏度15秒，60摄氏度60秒，0.5摄氏度/循环升温至95摄氏度，95摄氏度15秒。
[0145]
6)反应结束后，按照2-δδt
方式计算目的长链非编码rna的表达量。
[0146]
7)ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2七种长链非编码rna在喉鳞癌组织中高表达由实时荧光定量pcr验证(如图4所示)。由图4可以发现实时荧光定量pcr验证了七种长链非编码rna在喉鳞癌组织显著的高表达。
[0147]
8)将七种长链非编码rna表达量进行综合加权分析，得到喉鳞癌分子标志物的表达量，依照该表达量进行喉鳞癌辅助诊断和预后生存判断。
[0148]
实施例4：
[0149]
本实施例是对一种长链非编码rna分子标志物组合中任一个长链非编码rna被敲降后对喉鳞癌细胞的增殖、转移和侵袭能力的验证：
[0150]
1)转染：使用lipofectamine3000(invitrogen公司)转染特异性干扰rna，转染时使用opti-mem(invitrogen公司)培养基制备转染体系。孵育6小时后转换为细胞生长培养基。
[0151]
2)细胞增殖检测(edu法)：首先用培养液制备1000:1比例稀释edu溶液，细胞培养板每孔加入100微升50微摩edu培养基孵育2小时。吸去培养液，每孔加入100微升细胞固定液(4％多聚甲醛缓冲液)室温孵育15-30分钟，接下来，依次使用甘氨酸孵育10分钟，缓冲液清洗2次，100微升渗透剂通透细胞膜，缓冲液洗涤1次。之后于培养板孔内加入染反应液，避光室温孵育30分钟，缓冲液洗涤1次，沉淀细胞，弃上清，图像获取及分析。最终，发现七种长链非编码rna分别被敲降的人喉鳞癌细胞的增殖能力均减弱(如图5所示)。
[0152]
3)细胞迁移能力检测(transwell法)：首先将细胞培养液换为无血清培养基并加入0.5微克每毫升的秋水碱处理1小时，用200微升无血清培养基重悬，加入transwell培养板小室上室，在下室加入500微升完全培养基。孵育24小时后取出小室，用棉签轻轻擦去上室的残留细胞，细胞固定液固定细胞，缓冲液洗涤1次，结晶紫溶液染10分钟，缓冲液洗涤1次，图像获取及分析。最终，发现七种长链非编码rna分别被敲降的人喉鳞癌细胞的迁移能力均减弱(如图6所示)。
[0153]
4)细胞侵袭能力检测(transwell法)：4摄氏度溶解matrigel胶过夜，使用无血清培养基1:3的体积稀释matrigel胶，向预冷的transwell小室中加入40微升，37摄氏度孵育2小时。使matrigel胶凝固。接下来，向上室和下室中分别加入100微升和600微升的无血清培养基。将0.5微克每毫升秋水仙碱处理的细胞加入上室，在下室中加入500微升完全培养基。孵育34小时候，取出小室，棉签擦拭上室多余细胞，缓冲液洗涤1次，结晶紫染10分钟，缓冲液洗涤1次，图像获取及分析。最终，发现七种长链非编码rna被敲降的人喉鳞癌细胞的侵袭能力均减弱(如图7所示)。
[0154]
5)根据本发明所述的七种长链非编码rna，任何一种被sirna敲降其表达量后，均
3’；
[0173]
mnx1-as1-1号正向干扰rna序列(seq id no：38)：5
’‑
ggucgaaccuuaucugcuatt-3’；
[0174]
mnx1-as1-1号反向干扰rna序列(seq id no：39)：5
’‑
uagcagauaagguucgacctt-3’；
[0175]
mnx1-as1-2号正向干扰rna序列(seq id no：40)：5
’‑
gcuacgugagucuugcaaatt-3’；
[0176]
mnx1-as1-2号反向干扰rna序列(seq id no：41)：5
’‑
uuugcaagacucacguagctt-3’；
[0177]
linc01385-1号正向干扰rna序列(seq id no：42)：5
’‑
ccaugaacgugaacaugaacguguu-3’；
[0178]
linc01385-1号反向干扰rna序列(seq id no：43)：5
’‑
aacacguucauguucacguucaugg-3’；
[0179]
linc01385-2号正向干扰rna序列(seq id no：44)：5
’‑
ggugaaguggguaucuccaugugau-3’；
[0180]
linc01385-2号反向干扰rna序列(seq id no：45)：5
’‑
aucacauggagauacccacuucacc-3’；
[0181]
al513318.2-1号正向干扰rna序列(seq id no：46)：5
’‑
ccuucucacuuucugccuutt-3’；
[0182]
al513318.2-1号反向干扰rna序列(seq id no：47)：5
’‑
aaggcagaaagugagaaggtt-3’。
[0183]
al513318.2-2号正向干扰rna序列(seq id no：48)：5
’‑
ccgagccuguucagucuuutt-3’；
[0184]
al513318.2-2号反向干扰rna序列(seq id no：49)：5
’‑
aaagacugaacaggcucggtt-3’。
[0185]
所述ensg00000233397的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中ensg00000233397表达量进行敲降；所述barx1-dt的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中barx1-dt表达量进行敲降；所述lsamp-as的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中lsamp-as1表达量进行敲降；所述hoxb-as4的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中hoxb-as4表达量进行敲降；所述mnx1-as1的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中mnx1-as1表达量进行敲降；所述linc01385的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中linc01385表达量进行敲降；所述al513318.2的特异性干扰rna可以对喉鳞癌细胞中al513318.2表达量进行敲降。

技术特征：

1.一种长链非编码rna分子标志物组合，其特征在于：该长链非编码rna分子标志物组合包括ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2共计七种；所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2长链非编码rna的核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7所示。2.根据权利要求书1所述的一种长链非编码rna分子标志物组合，其特征在于：所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2任何一种在喉鳞癌组织中均为显著高表达，并与喉鳞癌的不良预后呈正相关；上述七种长链非编码rna共同组合分析显示喉鳞癌患者预后结局最差。3.根据权利要求书2所述的一种长链非编码rna分子标志物组合，其特征在于：所述的组合分析是总和ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2共计七种长链非编码rna在喉鳞癌组织表达量，由基于r语言的survival::coxph()和glmnet::predict.glmnet函数执行综合加权分进行预后生存分析并形成预后生存分析模型。4.如权利要求1-3任一项所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，其特征在于：用于制备喉鳞癌辅助预后评估试剂盒，以及制备喉鳞癌的制剂或试剂盒。5.根据权利要求4所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，其特征在于：所述喉鳞癌辅助预后评估试剂盒是针对所述长链非编码rna分子标志物组合的针对性引物用于实时荧光定量pcr检测所述长链非编码rna表达量的试剂盒。6.根据权利要求5所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，其特征在于：所述针对性引物为：ensg00000233397正向引物序列如seq id no：8所示；ensg00000233397反向引物序列如seq id no：9所示；barx1-dt正向引物序列如seq id no：10所示；barx1-dt反向引物序列如seq id no：11所示；lsamp-as1正向引物序列如seq id no：12所示；lsamp-as1反向引物序列如seq id no：13所示；hoxb-as4正向引物序列如seq id no：14所示；hoxb-as4反向引物序列如seq id no：15所示；mnx1-as1正向引物序列如seq id no：16所示；mnx1-as1反向引物序列如seq id no：17所示；linc01385正向引物序列如seq id no：18所示；linc01385反向引物序列如seq id no：19所示；al513318.2正向引物序列如seq id no：20所示；al513318.2反向引物序列如seq id no：21所示。7.根据权利要求4所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，其特征在于：所述喉鳞癌的制剂或试剂盒中包括ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的特异性干扰rna的一种或几种，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的
特异性干扰rna序列能够在喉鳞癌细胞中相应敲降ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的表达水平。8.根据权利要求7所述的一种长链非编码rna分子标志物组合的应用，其特征在于，所述ensg00000233397、barx1-dt、lsamp-as1、hoxb-as4、mnx1-as1、linc01385和al513318.2的特异性干扰rna序列依次为：ensg00000233397-1号正向干扰rna序列如seq id no：22所示；ensg00000233397-1号反向干扰rna序列如seq id no：23所示；ensg00000233397-2号正向干扰rna序列如seq id no：24所示；ensg00000233397-2号反向干扰rna序列如seq id no：25所示；barx1-dt-1号正向干扰rna序列如seq id no：26所示；barx1-dt-1号反向干扰rna序列如seq id no：27所示；barx1-dt-2号正向干扰rna序列如seq id no：28所示；barx1-dt-2号反向干扰rna序列如seq id no：29所示；lsamp-as1-1号正干扰rna序列如seq id no：30所示；lsamp-as1-1号反向干扰rna序列如seq id no：31所示；lsamp-as1-2号正干扰rna序列如seq id no：32所示；lsamp-as1-2号反向干扰rna序列如seq id no：33所示；hoxb-as4-1号正向干扰rna序列如seq id no：34所示；hoxb-as4-1号反向干扰rna序列如seq id no：35所示；hoxb-as4-2号正向干扰rna序列如seq id no：36所示；hoxb-as4-2号反向干扰rna序列如seq id no：37所示；mnx1-as1-1号正向干扰rna序列如seq id no：38所示；mnx1-as1-1号反向干扰rna序列如seq id no：39所示；mnx1-as1-2号正向干扰rna序列如seq id no：40所示；mnx1-as1-2号反向干扰rna序列如seq id no：41所示；linc01385-1号正向干扰rna序列如seq id no：42所示；linc01385-1号反向干扰rna序列如seq id no：43所示；linc01385-2号正向干扰rna序列如seq id no：44所示；linc01385-2号反向干扰rna序列如seq id no：45所示；al513318.2-1号正向干扰rna序列如seq id no：46所示；al513318.2-1号反向干扰rna序列如seq id no：47所示；al513318.2-2号正向干扰rna序列如seq id no：48所示；al513318.2-2号反向干扰rna序列如seq id no：49所示。

技术总结

本发明涉及肿瘤生物技术领域，公开了一种长链非编码RNA分子标志物组合及其应用。所述长链非编码RNA分子标志物组合包括七个分子，包括ENSG00000233397、BARX1-DT、LSAMP-AS1、HOXB-AS4、MNX1-AS1、LINC01385和AL513318.2；上述七种长链非编码RNA在喉鳞癌组织中均为显著高表达，每个分子能够促进喉鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且与喉鳞癌的不良预后呈正相关。该长链非编码RNA分子标志物组合应用于制备喉鳞癌辅助预后评估试剂盒，以及喉鳞癌的制剂；所述喉鳞癌辅助预后评估试剂盒采用实时荧光定量PCR检测上述七种长链非编码RNA表达量，合并七种表达量结果进行便捷、高效地判断喉癌患者的病情及预后评估；所述喉鳞癌的制剂包括上述七种长链非编码的特异性干扰RNA中的至少一种或七种。干扰RNA中的至少一种或七种。干扰RNA中的至少一种或七种。